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Immunology and Infection

Fluorescenza doi: 10.3791/51030 Published: February 24, 2014

Summary

Descriviamo qui un semplice ibridazione in situ fluorescente (FISH) metodo per la localizzazione di virus e batteri nei tessuti insetti e vegetali. Questo protocollo può essere esteso per la visualizzazione di mRNA in tutto il monte e le sezioni microscopiche.

Abstract

Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è un nome dato a una varietà di tecniche comunemente utilizzate per la visualizzazione trascritti genici in cellule eucariotiche e può essere ulteriormente modificato per visualizzare altri componenti della cellula come l'infezione con virus e batteri. Localizzazione spaziale e la visualizzazione di virus e batteri durante il processo di infezione è un passo essenziale che integra espressione profiling esperimenti come microarrays e RNAseq in risposta a diversi stimoli. Comprendere le infezioni spazio-temporali con questi agenti integra esperimenti biologici volti a comprendere la loro interazione con componenti cellulari. Diverse tecniche di visualizzazione dei virus e batteri come sistemi gene reporter o metodi immunoistochimici richiedono molto tempo, e alcuni sono limitati a lavorare con organismi modello e coinvolgere metodologie complesse. FISH destinato RNA o DNA specie nella cella è un me relativamente facile e veloceThOD per studiare la localizzazione spazio-temporale di geni e per scopi diagnostici. Questo metodo può essere robusto e relativamente facile da attuare quando i protocolli impiegano breve ibridazione, sonde commercialmente acquistati, che non sono costosi. Ciò è particolarmente robusto quando la preparazione del campione, la fissazione, ibridazione, e la visualizzazione microscopica non comportano passaggi complessi. Qui si descrive un protocollo per la localizzazione di batteri e virus nei tessuti insetti e vegetali. Il metodo si basa sulla preparazione semplice, fissazione, e l'ibridazione dei monti interi insetti e organi sezionati o parti di impianti fatti a mano, con 20 paia di basi sonde di DNA brevi coniugati con coloranti fluorescenti sul loro 5 'o 3' finisce. Questo protocollo è stato applicato con successo per un certo numero di tessuti insetti e vegetali, e può essere utilizzato per analizzare l'espressione di mRNA o altre specie di RNA o DNA nella cellula.

Introduction

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Quando studio delle interazioni tra virus vegetali e altri patogeni con i loro ospiti vegetali infetti, è importante visualizzare i patogeni e relativi acidi nucleici in situ, indipendentemente dal fatto che causano effetti negativi sulla loro ospiti. Questo è molto importante quando si studia il movimento patogeno all'interno e tra le cellule vegetali. Nella localizzazione in situ di prodotti genici del patogeno è un passo essenziale che integra altri approcci per studiare il processo di patogenicità. Molti agenti patogeni delle piante, in particolare virus, vengono trasmessi da insetti, avendo interazioni complesse e intime con i loro vettori. La localizzazione di questi virus nei loro vettori è importante per studiare il percorso per la trasmissione, e le possibili siti di interazione all'interno del vettore. La trasmissione di alcuni virus delle piante insetto-vectored è aiutata da batteri endosimbiontica che risiedono all'interno di questi insetti. Per studiare meglio la trasmissione di questi virus vegetali by loro vettori, è anche indispensabile per visualizzare i batteri endosimbiontica in generale, e quelli coinvolti nella trasmissione del virus, in particolare. Colocalizzazione dei batteri virus e endosimbiontica è quindi desiderato per indagare le possibili relazioni tra questi organismi, nel loro ospite insetti. A parte la trasmissione del virus, batteri endosimbiontica influenzano diversi aspetti della biologia di insetti vettori, la localizzazione così spaziale di questi batteri all'interno di insetti è di grande interesse e importanza.

Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) è il più importante complesso malattia virale di pomodoro coltivata in tutto il mondo 1-4. TYLCV è un virus floema limitata ed è vectored esclusivamente dalla mosca bianca Bemisia tabaci 5,6. Un modello che descrive la traslocazione di begomoviruses nei loro vettori mosche bianche è stato proposto 6-9. Due ostacoli specifici sono attivamente attraversati duranteing questa trasmissione circulative: midgut / emolinfa e le barriere ghiandole emolinfa / salivari. Questo processo di trasmissione si ipotizza essere mediata da recettori sconosciute che riconoscono il capside del virus. TYLCV è pensato per attraversare B. tabaci midgut 6,10, e viene assorbito attraverso la ghiandola salivare primario 6 prima di essere iniettato nella pianta. Nel emolinfa mosca bianca, TYLCV interagisce con una proteina GroEL prodotta dal batterio insetto endosimbiontica secondario Hamiltonella. Questa interazione garantire un trasporto sicuro del TYLCV nella emolinfa, e lo protegge dagli attacchi del sistema immunitario degli insetti 11. Hamiltonella e Portiera, il endosymbiont primario di mosche bianche, sono alloggiati in bacteriocytes, cellule di insetto si trovano nelle emolinfa e la casa endosimbiontica batteri 11. B. tabaci ospita batteri endosimbiontica aggiuntive, tra cui Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, e FritschEA, che può essere localizzata all'interno o all'esterno dei bacteriocytes, e hanno diversi effetti sulla biologia dell'insetto 12.

Diversi studi hanno cercato di studiare la localizzazione di TYLCV in piante e whiteflies utilizzando protocolli in termini di tempo e costosi quali microscopia elettronica a trasmissione (TEM), anticorpi e RNA in situ su sezione di spessore microscopico 10,13, uno studio recente ha descritto la localizzazione dei virus delle piante all'interno delle loro piante e vettoriali padroni di casa utilizzando un semplice protocollo 14. Qui si descrive un protocollo semplice per la localizzazione di TYLCV in B. tabaci sezionato midguts e delle ghiandole salivari, e nelle sezioni preparato da piante TYLCV da HIV. Descriviamo ulteriormente la localizzazione della Portiera, il endosymbiont primario di B. tabaci, e le sue endosimbionti secondarie Hamitonella, Rickettsia e Arsenophonus. Questo protocollo si basa sull'utilizzo di sonde di DNA corti, chesono fluorescente sulla loro estremità 5 ', e specificamente ibridarsi sequenze complementari a sequenze di geni virali o batterici. Il campione di trasformazione è relativamente facile e il segnale ottenuto è altamente specifico. Il protocollo descritto può essere utilizzato per localizzare virus, batteri e altri agenti patogeni nel loro vegetali, animali e insetti host, e può inoltre essere utilizzato per localizzare mRNA in un dato tessuto.

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Protocol

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1. Preparazioni Generale Whitefly, Flora e virus per l'analisi FISH

  1. Posteriore B e Q aleurodidi biotipo su piantine di cotone (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) e mantenere all'interno di gabbie a prova di insetti e camere di crescita in condizioni standard di 25 ± 2 ° C, 60% di umidità relativa, e una luce di 14 ore / 10-hr fotoperiodo scuro.
  2. Eseguire PCR per testare infezione con endosimbionti utilizzando primer specifici endosymbiont come precedentemente descritto 15-19.
  3. Acquistare Piantine di pomodoro (Solanum esculentum cv. Bistecca) da un vivaio commerciale oppure semi di pomodoro pianta.
  4. Mantenere nelle stesse condizioni di allevamento sopra descritte fino a quando le piante raggiungono il quattro stadi true-foglia, l'età più adatta per whitefly-mediata inoculazione di TYLCV 15 (vedere paragrafo 4.1).

2. Manipolazione Insetto, Fissazione, Probe Design, ibridazione e visualizzazione per Endosimbionte FISH

  1. Raccogliere 10 aleurodidi adulti per aspirazione da piante di cotone, o scegliere 10 3 ° o 4 ° ninfe instar da foglie di cotone.
  2. Immergere immediatamente in fissativo di Carnoy (acido cloroformio-etanolo-acetico glaciale, 06:03:01, vol / vol) all'interno di tubi Eppendorf. Fix per 2 ore a notte (preferibilmente durante la notte).
  3. Rimuovere completamente il fissativo e decolorare nel 6% H 2 O 2 in etanolo per 2 ore.
  4. Conservare i campioni in etanolo assoluto per diversi giorni a diverse settimane a temperatura ambiente, o procedere al passo successivo.
  5. Sonde di progettazione complementari primer DNA temporanee basate sui 16S ribosomiale geni RNA di ciascun batterio. Per progettare le sonde, tenere il conto delle stesse considerazioni per la progettazione di primer PCR. Utilizzare le sonde oligonucleotidiche BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', Rb1 5'-Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', 5'-BTH Cy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'e Ars2 5'-Cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'per la gestione mirata di Portiera, Rickettsia, Hamilonella, e Arsenophonus, rispettivamente.
  6. Ibridare campioni notte al buio in tampone di ibridazione (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,9 M NaCl, 0,01% [peso / vol] sodio dodecil solfato, 30% formammide [vol / vol]) contenente 10 pmol sonda fluorescente per ml . Combinare più di una sonda con differenti coloranti fluorescenti se necessario. Utilizzare aleurodidi non infette con il batterio mirati e campioni non-probe come controlli negativi.
  7. Montare i campioni di tutto, su un vetrino da microscopio, in tampone di ibridazione contenuta con un bloccante liquido, coprire con un vetrino, sigillare con smalto, e vista sotto una fluorescenza o microscopio confocale.

3. Whitefly Organo Dissection, Fissazione, ibridazione e visualizzazione per TYLCV FISH

  1. Raccogliere aleurodidi adulti allevati con continuità su piante di pomodoro TYLCV infettati mediante aspirazione e anesthetize dall'esposizione a tovagliolo di carta impregnata con acetone. Esporre aleurodidi solo per 1-2 min come troppo lunga esposizione di acetone può risolvere aleurodidi tessuti. Utilizzare aleurodidi nonviruliferous allevati su piante di pomodoro non infette e non campioni sonda per i controlli per confermare l'ibridazione specifica.
  2. Aleurodidi Montare su microscopio depressione scivoli per la dissezione degli organi utilizzando un microscopio stereo.
  3. Tirare via la testa dell'insetto dal protorace e sezionare ghiandole salivari in 1x PBS completato con l'1% di toluidina blu macchia per una migliore visualizzazione, a causa delle loro piccole dimensioni. Consentire l'assorbimento del colorante per 2-3 min.
  4. Estrarre l'insetto parte alla confluenza tra il torace e l'addome per osservare ed espellere il midgut. Espellere il contenuto dell'addome spingendo con una pinza sulla punta addome.
  5. Rimuovere delicatamente il PBS e blu di toluidina da dissezioni di successo e aggiungere lentamente 300 ml di fissativo di Carnoy per risolvere gli organi per 5 min.
  6. Ladd il fissativo da un lato del bene depresso e non dalla parte superiore per impedire movimenti incontrollati degli organi sezionati. Una volta che tocca il fissativo, gli organi aderiranno al vetro, e tutto il processo che non si muovano.
  7. Rimuovere fissativo e aggiungere 500 ml di tampone di ibridazione supplementato con 10 pmol della sonda di DNA fluorescente Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', che è complementare ad una sequenza in TYLCV gene della proteina di rivestimento.
  8. Ibridare notte a temperatura ambiente al buio incubando il vetrino con il campione all'interno di una piccola camera umida composta piccola scatola di plastica con carta asciugamano bagnato sul fondo.
  9. Dopo l'ibridazione, raccogliere gli organi con uno strumento di dissezione fine e rapidamente spostarli in un vetrino da microscopio fresco contenente 30 ml di nuovo tampone di ibridazione integrati con DAPI (0,1 mg / ml in 1x PBS) e contenuti con bloccante liquido.
  10. Coprire i campioni con un vetrino, sigillare spiritoh smalto per unghie e vista sotto una fluorescenza o microscopio confocale.

4. Manipolazione pianta, a mano sezionamento, Fissazione e ibridazione per TYLCV FISH

  1. Seminare piantine di pomodoro con TYLCV utilizzando viruliferous inoculazione mosca bianca-mediata. Il virus può essere rilevato usando questo metodo FISH in piante asintomatiche una settimana dopo l'inoculazione. I sintomi della malattia tipici sono visibili tre settimane dopo l'inoculazione. Utilizzare piante di pomodoro infette e nessun campione sonda per i controlli per confermare l'ibridazione specifica.
  2. Utilizzare una lama di rasoio istologico affilata per la preparazione tagliate a mano 2-4 cm di lunghezza sezioni longitudinali o trasversali di pomodoro steli e foglie.
  3. In provette Eppendorf, fissare le sezioni in fissativo di Carnoy per 2 ore durante la notte a temperatura ambiente.
  4. Rimuovere fissativo e preservare le sezioni in etanolo assoluto per diversi giorni a diverse settimane a temperatura ambiente, o procedere al passo successivo.
  5. Lavare le sezionitre volte, 1 min ciascuno, in tampone di ibridazione.
  6. Ibridare le sezioni con 500 microlitri di tampone di ibridazione supplementato con 10 pmol di oligonucleotide sonda fluorescente Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 'che è complementare ad una sequenza in TYLCV gene della proteina di rivestimento.
  7. Lavare le sezioni tre volte, 1 min ciascuno, in tampone di ibridazione.
  8. Mount intere sezioni in tampone di ibridazione integrato con DAPI (0,1 mg / ml in 1x PBS) e contenuti con blocker liquido, coprire con un vetrino, sigillare con smalto e vista sotto una fluorescenza o microscopio confocale.

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Representative Results

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Il sistema studiato in questo manoscritto è mostrato in Figura 1 e comprende una pianta infetta con TYLCV, un adulto e una ninfa del whitefly B. tabaci, e l'anatomia interna della mosca bianca che mostra il percorso per TYLCV traslocazione nella insetto. Figura 2 mostra doppia FISH in una mosca bianca adulta per il simbionte primario Portiera e il simbionte secondario Arsenophonus. figura 3 mostra doppia FISH per Portiera e Hamiltonella, e La figura 4 mostra doppia FISH per Portiera e Rickettsia, entrambe le figure in B. tabaci 4 ° instar ninfa. Figura 5 mostra FISH per TYLCV e colorazione DAPI in un whitefly sezionato intestino medio, e la figura 6 mostra un pesce per TYLCV e colorazione DAPI in sezionati mosca bianca ghiandole salivari primarie. Figura 7 mostra FISH per TYLCV e colorazione DAPI intagliate a mano sezioni d'impianto TYLCV infettati.

Figura 1
Figura 1. Panoramica generale del sistema studiato in questo manoscritto. A) tipici sintomi della malattia causata da infezione da Tomato yellow leaf virus ricciolo (TYLCV). B) Vista esterna di una mosca bianca adulta. C) Vista esterna della 4 ^ tappa ninfe nel ciclo di vita di sviluppo mosche bianche. Altre tappe ninfali sono simili nella vista esterna generale, ma di dimensioni più ridotte. D) Rappresentazione schematica dell'anatomia interna di un adulto B. tabaci mostra il percorso di acquisizione TYLCV dagli elementi setaccio della pianta, la circolazione e la trasmissione (frecce nere). Particelle rosse si riferiscono a virioni TYLCV. p: floema; s: s tylet, e: esofago; fc: camera filtrante; dm: in ordine decrescente midgut; am: ascendente midgut; ca: caeca; hg: hindgut; bc: bacteriocytes; psg:. ghiandola salivare primario Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2
Figura 2. Doppio FISH di Portiera e Arsenphonus su B. tabaci Q biotipo adulto (A) e zoom sull'area marcato (B) sia sotto canale in campo chiaro e sezioni ottiche combinate di rivelazione dei segnali fluorescenti emessi da ciascuna sonda. sonda Portiera-specifico (rosso) coniugato con Cy5 e sonda Arsenphonus-specifico ( giallo) coniugata con Cy3 stati utilizzati. e: uovo.pg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3
Figura 3. Doppio FISH di Portiera e Hamiltonella su B. tabaci ninfa. sonda Portiera-specifico (rosso) coniugata con Cy5 e sonda Hamiltonella-specifico (verde) coniugata con Cy3 sono stati utilizzati. segnale di ibridazione A) Hamiltonella ottenuto da sezioni ottiche combinate e visualizzato in campo scuro. B) segnale di ibridazione Portiera ottenuto da combinato sezioni ottiche e visualizzati sotto campo scuro. C) Portiera e Hamiltonella fuse segnali in campo chiaro. segnali combinati D) Portiera e Hamiltonella hanno visualizzato sotto dacampo rk. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 4
Figura 4. Doppio FISH di Portiera e Rickettsia su B. tabaci ninfa. sonda Portiera-specifico (rosso) coniugata con Cy5 e Rickettsia-specifica sonda (blu) coniugata con Cy3 sono stati utilizzati. A) segnale di ibridazione Rickettsia ottenuto da sezioni ottiche combinati e visualizzati in campo scuro. B) segnale di ibridazione Portiera ottenuto da segnali combinati sezioni ottiche e visualizzati sotto campo scuro. C) Portiera e Rickettsia uniti sotto campo chiaro. D) Rickettsia segnali combinati inferiore a campo scuro. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 5
Figura 5. FISH di TYLCV su midgut sezionato di un adulto B. tabaci femmina che aveva acquisito il virus per 48 ore da una pianta di pomodoro infetto. sonda specifica per TYLCV (rosso) coniugata con Cy3 è stato utilizzato, e midgut era macchiato con DAPI prima del montaggio e visualizzazione. A) Il midgut sezionato come si è visto dal combinato sezioni ottiche sotto campo chiaro. B) Segnale TYLCV FISH (rosso) e DAPI macchiato nuclei (blu) visto dalla sezioni ottiche combinata nel campo scuro. fc: camera filtrante; dm: descendi ng midgut; am: ascendente midgut; ca: caeca; hg: hindgut. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 6
Figura 6. FISH di TYLCV su sezionato ghiandola salivare principale di un adulto B. tabaci femmina che aveva acquisito il virus per 48 ore da una pianta di pomodoro infetto. sonda specifica per TYLCV (rosso) coniugata con Cy3 è stato utilizzato, e la ghiandola salivare colorate con DAPI prima del montaggio e visualizzazione. A) Il salivare primario sezionato e DAPI macchiato ghiandola come si è visto dalle sezioni unite sotto campo chiaro. B) Segnale TYLCV FISH (rosso) e nuclei DAPI colorati (blu), come si è visto dalle sezioni unite sotto campo scuro.s :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 7
Figura 7. FISH di TYLCV sulla sezione longitudinale tagliati a mano attraverso un fusto della pianta TYLCV-infettati. TYLCV specifica sonda (rosso) coniugata con Cy3 è stato utilizzato e combinato con colorazione DAPI prima Una sezione indicata con il rosso di montaggio e visualizzazione. A) segnale TYLCV in un elemento setaccio floema, e nuclei DAPI macchiati visto dalle sezioni unite sotto campo scuro. B) le stesse sezioni combinate mostrati in (A) sotto campo chiaro per l'orientamento. ph: floema; xy:. xylem Clicca qui per ingrandire imetà.

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Discussion

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Il protocollo descritto qui per la localizzazione di un virus vegetale nella sua pianta ospite e dell'insetto vettore, e batteri endosimbiontica nel loro ospite whitefly specifico, può essere adattato per la localizzazione di altri virus in piante e anche nei tessuti animali. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato per localizzare batteri endosimbiontica e patogeni e altri microrganismi in sistemi vegetali e animali. I metodi descritti si basano sul semplice concetto di ibridazione tra breve, fluorescenza marcata oligonucleotide sonda di DNA e il DNA bersaglio o RNA nella cellula. Il risultato è una ibridazione specifica, con sfondo minimo, e un segnale rilevato mediante fluorescenza o confocale microscopi. Diverse sonde con differenti coloranti fluorescenti, che colpiscono più di un gene, possono essere utilizzati contemporaneamente. Ciò consente la visualizzazione più di una destinazione in una singola cellula o tessuto. Le procedure descritte in questi protocolli sono semplici e il tempo di trattamento del campioneè minimo. Problemi associati con altri protocolli come segnale di alta sfondo, lungo tempo di elaborazione per campioni e l'impiego di numerosi e costosi materiali per l'analisi, non sono vincoli nel protocollo qui descritto.

I B e Q biotipi di B. whiteflies tabaci sono stati usati per descrivere i protocolli in questo manoscritto, tuttavia, allevamento condizioni si applicano a qualsiasi biotipo whitefly, con il rispettivo pianta ospite. La mosca bianca completa il suo ciclo di vita in tre settimane alle condizioni indicate. Ogni individuo della popolazione biotipo B utilizzato è stato infettato con il endosymbiont primario Portiera, ed i batteri endosimbiontica secondarie Hamiltonella e Rickettsia. Gli individui biotipo Q sono stati infettati con Portiera e Arsenophonus. Altre popolazioni mosche bianche di tutto il mondo hanno dimostrato di essere infettati da questi o altre specie batteriche endosimbiontica, e con differenti localizati spazialisui modelli del corpo 16-20.

TYLCV piante infette presentano sintomi tipici della malattia tre settimane che seguono l'inoculazione. Per la localizzazione TYLCV, piante infette possono essere usate per l'acquisizione da virus whiteflies per 24 ore e il virus può essere rilevato in piante infette e insetti utilizzando il protocollo FISH sopra descritto. Mentre negli insetti sonde utilizzate possono essere coniugati con molti fluoroforo che può escisso con differenti lunghezze d'onda, comprese Cy3 e Cy5, nelle piante Cy3 è il più adatto e non fluorescenza a lunghezze d'onda simili a quelli di cloroplasti, organelli più abbondanti nella cellula vegetale.

Efficace attuazione dei protocolli descritti per la localizzazione di batteri e virus nelle piante e insetti dipende buon fissaggio dei campioni per una migliore visualizzazione e la penetrazione della sonda, buona progettazione sonda per la specificità e la compensazione con H 2 O 2 in caso di insetti interi per bvisualizzazione del segnale Etter. Nel caso della FISH nelle piante, sezioni fatte a mano devono essere il più sottile possibile per una buona penetrazione della sonda e una migliore visualizzazione del segnale. Questo può essere migliorato mettendo il foglio tra due pezzi di polistirolo per aiutare con il taglio e usando lame di rasoio professionali che possono essere acquistati per questo scopo da diversi fornitori.

Il protocollo non è adatto per la localizzazione subcellulare di bersagli, ma ha il potenziale da sviluppare, utilizzando il formato sonda descrivere qui, in un metodo adatto per la localizzazione subcellulare. Ad esempio, le sonde brevi qui descritti possono essere coniugati a molecole come la biotina e molecole non fluorescenti, che a sua volta può essere catturato utilizzando particelle di oro coniugati a streptavidina che possono essere visualizzati sotto TEM. Questa modifica successiva può essere adatto per la localizzazione subcellulare di più target compresi trascritti genici e microrganismi. Infine, il protocollo descrittos sono adatti per l'ibridazione con acidi nucleici come DNA e RNA, ma non le proteine.

Per ottenere i migliori risultati nei protocolli FISH qui descritti, è meglio usare insetti freschi e materiale vegetale, così come fissativo e ibridazione freschi buffer. Le sonde devono essere sempre tenuti in -20 º C in piccole aliquote per evitare ripetuti di congelamento e scongelamento. Il tempo di lavorazione di ogni passo descritto può essere calibrata a seconda organismi studiati. Come menzionato nel protocollo, dopo fissazione e decolorazione, campioni mosche bianche e vegetali possono essere conservati per lungo tempo in etanolo assoluto a temperatura ambiente. Questo passaggio è particolarmente utile quando l'invio di campioni per la lavorazione da una posizione a un'altra, o quando si esegue esperimenti corso lungo tempo. La qualità del segnale di ibridazione non è stata influenzata seguendo questo conservazione a lungo tempo.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

La ricerca in laboratorio Ghanim è stato supportato da assegno di ricerca n. 908-42.12/2006 dal tedesco-israeliano Foundation (GIF), Grant no. IS-4062-07 dagli Stati Uniti e Israele binazionale agricolo di Ricerca e Sviluppo Fund (BARD), e assegno di ricerca n. 884/07 da Israele Science Foundation (ISF) per MG

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescently labeled  Probes Metabion 20 bp HPLC purified Sequence designed by customer
Toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Formamide Sigma-Aldrich F9037 Molecular Biology Grade
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941 Molecular Biology Grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Liquid Blocker Ted Pella Inc. 22309

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References

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Fluorescenza<em&gt; In situ</em&gt; Ibridazioni (FISH) per la localizzazione di virus e batteri endosimbiontica a Plant e Insetti tessuti
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Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).More

Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).

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