Summary
Vi beskriver her en enkel fluorescens in situ hybridisering (FISH) Fremgangsmåte for lokalisering av virus og bakterier i insekt-og plantemateriale. Denne protokollen kan utvides for visualisering av mRNA i hele fjellet og mikroskopiske deler.
Abstract
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er navnet gitt til en rekke teknikker som vanligvis brukes for visualisering av gentranskriptene i eukaryote celler og kan bli ytterligere modifisert for å visualisere andre komponenter i cellen slik som infeksjon med virus og bakterier. Romlig lokalisering og visualisering av virus og bakterier under infeksjonen prosessen er et viktig skritt som utfyller uttrykk profilering eksperimenter som mikromatriser og RNAseq i respons på ulike stimuli. Forstå Spatiotemporal infeksjoner med disse agentene utfyller biologiske eksperimenter som tar sikte på å forstå deres interaksjon med cellulære komponenter. Flere teknikker for å visualisere virus og bakterier, som reporter gene systemer eller immunohistokjemiske metoder er tidkrevende, og noen er begrenset til å arbeide med modellorganismer, og involverer komplekse metoder. FISH som er rettet RNA-eller DNA-materiale i cellen er en relativt enkel og rask method for å studere tid og rom lokalisering av gener og for diagnostiske formål. Denne metoden kan være robust og forholdsvis lett å gjennomføre når protokollene anvende korte hybridiserende, kommersielt innkjøpte prober, som ikke er kostbart. Dette er særlig robust når prøvepreparering, fiksering, hybridisering, og mikroskopisk visualisering ikke innebærer kompliserte trinn. Her beskriver vi en protokoll for lokalisering av bakterier og virus i insekt-og plantemateriale. Metoden er basert på enkle forberedelser, fiksering, og hybridisering av insekt hele mounts og dissekerte organer eller håndlagde plante seksjoner, med 20 basepar korte DNA prober konjugert til fluorescerende fargestoffer på sin 5 'eller 3' slutter. Denne protokollen har blitt brukt på en rekke insekt-og plantemateriale, og kan brukes til å analysere ekspresjonen av mRNA eller annet RNA eller DNA-materiale i cellen.
Introduction
Ved studering av interaksjonen mellom plante-virus og andre patogener med sine infiserte plante-verter, er det viktig å visualisere de patogener og deres respektive nukleinsyrene in situ, uansett om de forårsaker negative effekter på deres verter. Dette er det viktigste når en skal studere patogen bevegelse innenfor og mellom planteceller. In situ lokalisering av genprodukter av patogenet er et viktig skritt som utfyller andre tilnærminger for å studere patogenitet prosessen. Mange plante patogener, spesielt virus, blir overført av insekter, har komplekse og intime interaksjoner med sine vektorer. Lokalisering av disse virus i sine vektorer er viktig for å studere forløpet for overføring, og de mulige interaksjon steder inne i vektoren. Overføringen av noen insekt-vectored plante virus blir hjulpet av endosymbiotic bakterier som bor innenfor disse insektene. For bedre å studere overføring av disse plante-virus by sine vektorer, er det også viktig å visualisere de endosymbiotic bakterier generelt, og de som er involvert i virusoverføring, spesielt. Colocalization av virus og endosymbiotic bakterier er derfor ønskelig for å undersøke mulige sammenhenger mellom disse organismene innenfor deres insekt vert. Bortsett fra virus overføring, endosymbiotic bakterier påvirker flere aspekter av biologi av insekt vektorer, er dermed romlig lokalisering av disse bakteriene i løpet av insekter av stor interesse og betydning.
Tomat gul leaf curl virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) er den viktigste virussykdom kompleks av dyrket tomat på verdensbasis 1-4. TYLCV er en phloem begrenset virus og er utelukkende vectored av whitefly Bemisia tabaci 5,6. En modell som beskriver translokasjon av begomoviruses i sine whitefly vektorer har vært foreslått 6-9. To konkrete barrierer er aktivt krysset during dette circulative overføring: midgut / hemolymph og hemolymph / spyttkjertel barrierer. Denne overføringsprosess, er antatt å bli mediert av ukjente reseptorer som gjenkjenner virus capsid. TYLCV er antatt å krysse B. tabaci midgut 6,10, og absorberes gjennom den primære spyttkjertel 6 før den føres inn i anlegget. I whitefly hemolymph, samhandler med en GroEL protein som produseres av insekt sekundær endosymbiotic bakterien Hamiltonella TYLCV. Denne interaksjonen sikrer trygg transport av TYLCV i hemolymph, og beskytter den mot angrep av insekt immunsystemet 11. Hamiltonella og Portiera, den primære endosymbiont av whiteflies, er plassert i bacteriocytes, insektceller som finnes i hemolymph og huset endosymbiotic bakterier 11. B. tabaci havner ekstra endosymbiotic bakterier inkludert Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, og Fritschea, som kan lokaliseres innenfor eller utenfor bacteriocytes, og har forskjellige virkninger på insekt biologi 12..
Flere rapporter har forsøkt å studere lokalisering av TYLCV i planter og whiteflies ved hjelp av tidkrevende og kostbare protokoller som transmisjonselektronmikroskopi (TEM), antistoffer og RNA in situ på mikroskopisk tykke delen 10,13, en fersk studie beskrev lokalisering av plante virus i sine anlegg og vektor verter ved hjelp av en enkel protokoll 14. Her beskriver vi en enkel protokoll for lokalisering av TYLCV i B. tabaci dissekert midguts og spyttkjertlene, og i seksjoner forberedt fra TYLCV-infiserte planter. Vi beskriver lokalisering av Portiera, den primære endosymbiont av B. videre tabaci, og dets sekundære endosymbionts Hamitonella, Rikettsiearter og Arsenophonus. Denne protokollen er basert på bruk av korte DNA-prober, somer fluorescensmerkede på sin 5 'ende, og spesifikt hybridisere til komplementære sekvenser i virus-eller bakterie-gensekvenser. Denne type behandling er relativt enkelt og signalet som oppnås er svært spesifikk. Den beskrevne protokoll kan benyttes for å lokalisere virus, bakterier og andre patogener i sitt anlegg, dyre-og insekt verter, og kan videre brukes til å lokalisere mRNA i et gitt vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Generelt Whitefly, Plant, og Virus Forberedelser til FISH analyse
- Bak B og Q biotypen whiteflies på bomulls frøplanter (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) og vedlikeholde inne insektnett bur og vekst rom under standardbetingelser på 25 ± 2 ° C, 60% relativ fuktighet, og en 14-timers lys / 10-timers mørke daglengde.
- Utfør PCR for å teste infeksjon med endosymbionts hjelp endosymbiont-spesifikke primere som tidligere beskrevet 15-19.
- Kjøpe Tomato frøplanter (Solanum esculentum cv. Beefsteak) fra en kommersiell barnehage eller plante tomat frø.
- Oppretthold under samme oppdrettsforholdene beskrevet ovenfor til plantene nå fire sann-blad stadium, alder mest egnet for whitefly-mediert inokulering av TYLCV 15 (se punkt 4.1 nedenfor).
2. Insect Handling, Fiksering, Probe Design, Hybridisering, og visualisering for Endosymbiont FISH
- Samle 10 voksne whiteflies ved aspirasjon fra bomullsplanter, eller plukke 10 3. eller 4 th Instar nymfer fra bomulls blader.
- Umiddelbart nedsenkes i Carnoy sin fiksativ (kloroform-etanol-iseddik, 6:03:01, vol / vol) i Eppendorf-rør. Fix for 2 timer til over natten (gjerne over natten).
- Helt fjerne fiksativ og decolorize i 6% H 2 O 2 i etanol for 2 hr.
- Bevar prøvene i absolutt etanol i flere dager til flere uker ved romtemperatur, eller videre til neste trinn.
- Design sonder som komplementære reverse DNA primere basert på 16S ribosomal RNA gener av hver bakterie. For å designe sondene, ta inn på konto de samme hensynene for utforming av PCR primere. Bruk oligonukleotidprober BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', 5'RB1-Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', 5'BTH-Cy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'og 5'Ars2-Cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'for målretting av Portiera, Rickettsia, Hamilonella, og Arsenophonus, henholdsvis.
- Hybridisere prøvene over natten i mørket i hybridiserings-buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,9 M NaCl, 0,01% [vekt / volum] natriumdodecylsulfat, 30% [vol / vol] formamid) inneholdende 10 pmol fluorescerende probe pr ml . Kombiner mer enn en probe med forskjellige fluorescerende fargestoffer etter behov. Bruk noninfected whiteflies med målrettet bakterien og nei-probe prøvene som negative kontroller.
- Monter prøvene helhet, på et objektglass, i hybridisering buffer inneholdt med en flytende blocker, dekk med et dekkglass, forsegle med neglelakk, og utsikten under en fluorescens eller konfokalmikroskop.
Tre. Whitefly Organ Dissection, Fiksering, Hybridisering, og visualisering for TYLCV FISH
- Samle voksne whiteflies kontinuerlig oppdratt på TYLCV-infiserte tomatplanter ved aspirasjon og anesthetize ved eksponering for papirhåndkle impregnert med aceton. Expose whiteflies bare for 1-2 min så altfor lang eksponering for aceton kan fikse whiteflies vev. Bruk nonviruliferous whiteflies oppdratt på noninfected tomatplanter og ingen probe prøver for kontroller for å bekrefte spesifikk hybridisering.
- Mount whiteflies på depresjon objektglass for orgel disseksjon ved hjelp av en stereo mikroskop.
- Trekk bort insektet hodet fra prothorax og dissekere spyttkjertlene i 1x PBS supplert med 1% toluidinblått flekken for bedre visualisering, på grunn av sin lille størrelse. Tillat absorpsjon av flekken i 2-3 min.
- Trekk insektet fra hverandre ved forbindelsen mellom brystkassen og buken til å observere og utvise ut midgut. Utvise innholdet i magen ved å trykke med tang på magen spissen.
- Forsiktig fjerne PBS og toluidinblått fra vellykkede disseksjoner og tilsett 300 mL av Carnoy sin fiksativ å fikse organene for 5 min.
- Agg fiksativ fra den ene side av trykket godt og ikke fra toppen for å hindre ukontrollert bevegelse av de dissekerte organer. Når berøre bindemiddel, vil organene holder seg til glass, og gjennom hele prosessen de ikke vil bevege seg.
- Fjern bindemiddel og tilsett 500 ul av hybridiserings-buffer supplert med 10 pmol av den fluoriserende DNA-probe Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', som er komplementær til en sekvens i TYLCV belegge protein-genet.
- Hybridisere over natten ved romtemperatur i mørket ved inkubering av lysbildet med prøven inne i en lite fuktig kammer består av små plastboks med vått håndklepapir i bunnen.
- Etter hybridisering, plukke opp organene med en fin disseksjon verktøyet og hurtig flytte dem til en frisk objektglass inneholdende 30 pl av nye hybridiseringsbuffer supplert med DAPI (0,1 mg / ml i 1 x PBS), og som finnes med væske stopperen.
- Dekk prøvene med et dekkglass, forsegle viddh neglelakk og utsikten under en fluorescens eller konfokalmikroskop.
4. Plant Håndtering, Hand-seksjonering, Fiksering, og Hybridisering for TYLCV FISH
- Vaksinere tomat frøplanter med TYLCV hjelp viruliferous whitefly-mediert vaksinasjon. Viruset kan oppdages ved hjelp av denne FISH metoden i symptom planter en uke etter vaksinasjonen. Typiske sykdomssymptomer er synlige tre uker etter vaksinasjon. Bruk noninfected tomatplanter og ingen probe prøver for kontroller for å bekrefte spesifikk hybridisering.
- Bruk en skarp histologisk barberblad for å forberede hånd-kutt 2-4 cm lange langsgående eller tverrsnitt av tomat stilker og blader.
- I Eppendorf-rør, rette seksjoner i Carnoy sin fiksativ i 2 timer til over natten ved romtemperatur.
- Fjern bindemiddel og bevare seksjonene i absolutt etanol i flere dager til flere uker ved romtemperatur, eller videre til neste trinn.
- Vask delenetre ganger, 1 minutt hver, i hybridiserings-buffer.
- Hybridisere til avsnittene med 500 mL av hybridiserings-buffer supplert med 10 pmol av det fluorescerende oligonukleotid probe Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 'som er komplementær til en sekvens i TYLCV belegge protein-genet.
- Vask seksjonene tre ganger, 1 minutt hver, i hybridiserings-buffer.
- Mount seksjoner helhet i hybridiseringsbuffer supplert med DAPI (0,1 mg / ml i 1x PBS) og inneholdt med flytende blocker, dekk med et dekkglass, forsegle med neglelakk og utsikten under en fluorescens eller konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Systemet undersøkt i dette manuskriptet er vist i figur 1 og omfatter en infisert plante med TYLCV, en voksen og et hulder av whitefly B. tabaci, og den interne anatomi whitefly viser banen for TYLCV translokasjon i insektet. Figur 2 viser dobbelt FISH i en voksen whitefly for primær symbiont Portiera og sekundær symbiont Arsenophonus. Figur 3 viser dobbelt FISH for Portiera og Hamiltonella, og Figur 4 viser dobbelt FISH for Portiera og Rickettsia, begge tallene i B. tabaci 4 th instar nymfe. Figur 5 viser FISH for TYLCV og DAPI flekker i en whitefly dissekert midgut, og Figur 6 viser en FISH for TYLCV og DAPI flekker i en dissekert whitefly primære spyttkjertlene. Figur 7 viser FISH for TYLCV og DAPI flekker ihånd-kutt TYLCV-infisert plante seksjoner.
Figur 1. Generell oversikt over systemet studert i dette manuskriptet. A) Typiske symptomer sykdom forårsaket av infeksjon med Tomato gule blad curl virus (TYLCV). B) Ekstern visning av en voksen whitefly. C) Ekstern visning av 4 th nymphal scenen i whitefly utviklings livssyklus. Andre nymphal stadier er like i den generelle ekstern visning, men mindre i størrelse. D) Skjematisk oversikt over den interne anatomi av en voksen B. tabaci viser banen til TYLCV oppkjøpet fra anlegget sil elementer, sirkulasjon og overføring (svarte piler). Røde partikler referere til TYLCV virions. p: phloem; s: s tylet; e: spiserør, fc: filter kammer; dm: synkende midgut; er: stigende midgut; ca: caeca; hg: hindgut; bc: bacteriocytes; PSG:. primære spyttkjertel Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Dobbel FISH av Portiera og Arsenphonus på B. tabaci Q biotype voksen (A) og zoom på den merkede område (B), begge under lyse felt kanal og kombinerte optiske seksjoner som detekterer de fluorescerende signaler som sendes ut av hver sonde. Portiera-spesifikk probe (rød) konjugert til Cy5 og Arsenphonus-spesifikk probe ( gul) konjugert til Cy3 ble anvendt. e: egg.pg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 3. Double FISH av Portiera og Hamiltonella på B. tabaci nymfe. Portiera-spesifikk probe (rød) konjugert til Cy5 og Hamiltonella-spesifikk probe (grønn) konjugert til Cy3 ble brukt. A) Hamiltonella hybridisering signal hentet fra kombinerte optiske seksjoner og sett under mørke feltet. B) Portiera hybridisering signal hentet fra Kombinert optisk seksjoner og sett under mørke feltet. C) Portiera og Hamiltonella fusjonerte signaler i sterkt felt. D) Portiera og Hamiltonella kombinerte signaler sett under dark feltet. Klikk her for å se større bilde.
Figur 4 Dobbelt FISH av Portiera og Rickettsia på B.. tabaci hulder. Portiera-spesifikk probe (rød) konjugert til Cy5 og Rickettsia-spesifikk probe (blå) konjugert til Cy3 ble anvendt. A) Rickettsia hybridiseringssignal oppnådd fra kombinerte optiske seksjoner og sett under mørke felt. B) Portiera hybridiserings-signal som oppnås fra Kombinert optisk seksjoner og sett under mørke feltet. C) Portiera og Rickettsia kombinerte signaler i sterkt felt. D)
Figur 5. FISH av TYLCV på dissekert midgut av en voksen B. tabaci kvinne som hadde fått viruset i 48 timer fra en infisert tomatplante. TYLCV-spesifikk probe (rød) konjugert til Cy3 ble brukt, og midgut ble farget med DAPI før montering og visualisering. A) dissekert midgut sett fra kombinert optiske seksjoner i sterkt felt. B) TYLCV FISH signal (rød) og DAPI farget kjerner (blå) som sett fra kombinerte optiske seksjoner i henhold mørke feltet. fc: filter kammer; dm: descendi ng midgut; er: stigende midgut; ca: caeca; hg: hindgut. Klikk her for å se større bilde.
Figur 6. FISH av TYLCV på dissekert primære spyttkjertel på en voksen B. tabaci kvinne som hadde fått viruset i 48 timer fra en infisert tomatplante. TYLCV-spesifikk probe (rød) konjugert til Cy3 ble brukt, og spyttkjertel farget med DAPI før montering og visualisering. A) dissekert og DAPI farget primærspytt kjertel som sett fra kombinerte seksjoner i sterkt felt. B) TYLCV FISH signal (rød) og DAPI farget kjerner (blå) som sett fra kombinerte seksjoner under sparsomme felt.s :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 7. FISH av TYLCV på hånd skjære langsgående snitt gjennom en stamme av TYLCV-infisert plante. TYLCV-spesifikk probe (rød) konjugert til Cy3 ble brukt og kombinert med DAPI flekker før montering og visualisering. A) En utsnittet med rødt TYLCV signal i en phloem sil-element, og DAPI fargede kjerner sett fra kombinerte seksjoner i henhold til mørkt felt. B) de samme sammensatte profiler som er vist i (A) i sterkt felt til orientering. ph: phloem; xy:. xylem Klikk her for å se større imalder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokoll som er beskrevet her for lokalisering av en plante-virus i sitt anlegg vert og insektvektor, og endosymbiotic bakterier i deres spesifikke whitefly vert, kan tilpasses for lokalisering av andre virus hos planter og til og med i animalsk vev. Videre kan protokollen kan brukes for å lokalisere endosymbiotic og patogene bakterier og andre mikroorganismer i plante-og dyresystemer. De beskrevne fremgangsmåter basert på et enkelt konsept for hybridisering mellom et kort, fluorescensmerket-merket oligonukleotid-DNA-probe og target-DNA eller RNA-molekyl i cellen. Resultatet er en spesifikk hybridisering, med et minimum av bakgrunnen, og et signal som detekteres ved hjelp av fluorescens eller confocal mikroskoper. Flere av prober med forskjellige fluorescerende fargestoffer, som er rettet mot mer enn ett gen, kan anvendes samtidig. Dette gjør det mulig å visualisere flere mål i en enkelt celle eller vev. Fremgangsmåtene som beskrives i disse protokollene er enkle og prøven behandlingstider minimal. Problemer i forbindelse med andre protokoller som høy bakgrunnssignal, lang behandlingstid for prøvene og bruk av tallrike og kostbare materialer for analyse, er ikke begrensninger i protokollen beskrevet her.
The B og Q biotyper av B. tabaci whiteflies ble brukt for å beskrive protokollene i dette manuskriptet, men stell betingelser gjelder til enhver whitefly biotype, med sine respektive vertsplanten. Den whitefly fullfører sin livssyklus i tre uker under de angitte vilkår. Hver enkelt av B biotypen befolkningen brukt var infisert med den primære endosymbiont Portiera, og de sekundære endosymbiotic bakterier Hamiltonella og Rikettsiearter. Den Q biotypen personer ble smittet med Portiera og Arsenophonus. Andre whitefly bestander over hele verden ble vist å være infisert med disse eller andre endosymbiotic bakteriearter, og med forskjellige romlige localizatipå mønstre i kroppen 16-20.
TYLCV infiserte planter viser typiske sykdomssymptomer tre uker etter vaksinasjonen. For TYLCV lokalisering, kan symptoma planter anvendes for virus anskaffelse av whiteflies i 24 timer og virus kan detekteres i infiserte planter og insekter ved hjelp av FISH-protokoll beskrevet ovenfor. Mens i insekter probene som benyttes kan være konjugert med mange fluorofor som kan skjæres med forskjellige bølgelengder, inkludert Cy3 Cy5 og, i planter Cy3 er den mest egnede og som ikke fluorescerer ved tilsvarende bølgelengder som kloroplaster, de mest tallrike organeller i plantecellen.
Vellykket innføring av de beskrevne protokoller for lokalisering av bakterier og virus i planter og insekter avhenger av god fiksering av prøvene for bedre visualisering og probe penetrasjon, god probe design for spesifisitet og avskjære med H2O 2 i tilfelle av hel insekter for better nett signal visualisering. I tilfelle av fisk i planter, må hånd-laget seksjoner være så tynn som mulig for god probe penetrasjon og bedre visualiseringen av signalet. Dette kan forbedres ved å sette bladet mellom to isoporstykkene for å hjelpe til med skjæring og ved å bruke profesjonelle barberblad som kan kjøpes til dette formålet fra flere leverandører.
Protokollen er ikke egnet for subcellulære lokalisering av mål, men den har potensial til å bli utviklet ved hjelp av sonden format beskrives her, i en egnet metode for subcellulær lokalisering. For eksempel kan de korte prober er beskrevet her, være konjugert til molekyler slik som biotin og ikke fluorescerende molekyler, som i sin tur kan bli målrettet ved bruk av gullpartikler konjugert til streptavidin som kan visualiseres i henhold TEM. Denne senere endring kan være egnet for subcellulære lokalisering av flere mål inkludert gentranskriptene og mikroorganismer. Til slutt, den beskrevne protokolls er egnet for hybridisering med nukleinsyrer som DNA og RNA, men ikke proteiner.
For å oppnå de beste resultatene i fisken protokollen beskrevet her, er det best å bruke fersk insekt og plantemateriale, samt ferske festing og hybridisering buffere. Sondene skal alltid holdes i -20 º C i små porsjoner for å unngå gjentatt frysing og tining. Behandlingstiden i hvert trinn er beskrevet kan kalibreres avhengig av organismene som ble studert. Som nevnt i protokollen, etter fiksering og avfarging, whitefly og planteprøver kan bevares i lang tid i absolutt etanol ved romtemperatur. Dette trinnet er spesielt nyttig når du sender prøver for behandling fra ett sted til et annet, eller når du utfører lang tid kurs eksperimenter. Kvaliteten på hybridiserings-signal ble ikke påvirket etter denne lange tid bevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forskning i Ghanim lab ble støttet av forskningsmidler ingen. 908-42.12/2006 fra den tysk-israelske Foundation (GIF), gir ingen. IS-4062-07 fra USA-Israel Binational Agricultural Research and Development Fund (BARD), og forskningsstipend nei. 884/07 fra Israel Science Foundation (ISF) til MG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
References
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
- Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
- Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
- Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
- Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
- Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
- Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
- Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
- Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
- Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
- Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
- Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. , Springer. New York. 175-187 (2007).
- Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
- Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
- Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
- Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
- Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
