Summary
Descrevemos aqui um simples fluorescência de hibridação in situ (FISH), o método para a localização de vírus e bactérias, em tecidos de plantas e de insectos. Este protocolo pode ser estendido para a visualização de mRNA em toda montagem e cortes microscópicos.
Abstract
Hibridização fluorescente in situ (FISH) é um nome dado a uma variedade de técnicas vulgarmente utilizadas para a visualização de transcritos de genes em células eucarióticas e pode ser ainda modificado para visualizar os outros componentes da célula, tais como a infecção com os vírus e as bactérias. Localização espacial e visualização de vírus e bactérias, durante o processo de infecção é um passo essencial que complementa a expressão profiling experiências como microarrays e RNAseq em resposta a diferentes estímulos. Compreender as infecções espaço-temporais com esses agentes complementa experiências biológicas destinadas a compreender a sua interação com componentes celulares. Várias técnicas para visualizar os vírus e as bactérias, tais como sistemas de gene repórter ou métodos imuno-histoquímicos são demoradas, e alguns estão limitados a trabalhar com organismos modelo e as metodologias complexas. PEIXES que tem como alvo de RNA ou DNA de espécies na célula é um me relativamente fácil e rápidoCTO para o estudo de localização espaço-temporal de genes e para fins de diagnóstico. Este método pode ser robusto e relativamente simples de implementar quando os protocolos empregar curto hibridação, as sondas comercialmente adquiridos, que não são caros. Isto é particularmente robusto, quando a preparação da amostra, a fixação, a hibridação, e a visualização microscópica não envolvem etapas complexas. Aqui nós descrevemos um protocolo para a localização de bactérias e vírus em tecidos de insetos e plantas. O método baseia-se na preparação simples, a fixação, e hibridação de insectos montagens inteiras e órgãos ou partes de plantas dissecadas feitos à mão, com 20 pares de bases de DNA sondas curtas conjugados com corantes fluorescentes na sua 5 'ou 3'. Este protocolo foi aplicado com sucesso a um número de tecidos de insecto e vegetais, e pode ser usada para analisar a expressão de ARNm ou de outras espécies de RNA ou de DNA na célula.
Introduction
Ao estudar as interacções entre os vírus de plantas e outros organismos patogénicos com as suas plantas hospedeiras infectadas, é importante para visualizar os patógenos e seus respectivos ácidos nucleicos in situ, independentemente de causar efeitos negativos sobre os seus hospedeiros. Isto é muito importante quando se estuda o movimento patógeno dentro e entre as células de plantas. Localização in situ de produtos de genes do agente patogénico é um passo essencial que complementa outras abordagens para estudar o processo de patogenicidade. Muitos patógenos de plantas, principalmente os vírus, são transmitidas por insetos, com interações complexas e íntimas com seus vetores. A localização destes vírus em seus vectores é importante para estudar o caminho para a transmissão, e os possíveis locais de interacção no interior do vector. A transmissão de alguns vírus de plantas vetorizado por insetos é auxiliado por bactérias endosymbiotic que residem dentro desses insetos. Para melhor estudar a transmissão desses vírus de plantas by seus vectores, é também essencial para visualizar as bactérias endosymbiotic em geral, e aqueles que estão envolvidos na transmissão do vírus, em particular. Co-localização das bactérias e vírus endosymbiotic é assim desejado para investigar as possíveis relações entre esses organismos dentro de seu exército de insetos. Além da transmissão de vírus, bactérias endosymbiotic influenciar vários aspectos da biologia dos vectores de insecto, assim, a localização espacial destas bactérias dentro de insectos é de grande interesse e importância.
Tomato virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) é o complexo de doença viral mais importante do tomateiro cultivado em todo o mundo 1-4. TYLCV é um vírus limita-floema e é exclusivamente vetorizado pela mosca branca Bemisia tabaci 5,6. Um modelo que descreve a translocação de begomovirus nos seus vectores de mosca branca tem sido proposto 6-9. Duas barreiras específicas estão ativamente cruzou durção esta transmissão circulativa: o intestino médio / hemolinfa e as barreiras da glândula hemolinfa / salivares. Este processo de transmissão é a hipótese de ser mediada pelos receptores desconhecido, que reconhecem a cápside do vírus. TYLCV é pensado para atravessar B. tabaci intestino 6,10, e é absorvida através da glândula salivar primário 6 antes de ser injectado para dentro da fábrica. Na hemolinfa mosca branca, TYLCV interage com uma proteína GroEL produzido pela bactéria endossimbiótica secundária inseto Hamiltonella. Essa interação garante o transporte seguro de TYLCV na hemolinfa, e protege-lo de um ataque pelo sistema imunológico do inseto 11. Hamiltonella e Portiera, o endosymbiont primário de moscas brancas, estão alojados em bacteriocytes, células de insetos encontrados na hemolinfa e casa endosymbiotic bactérias 11. B. tabaci abriga bactérias endosymbiotic adicionais, incluindo Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia e FritschEA, que pode ser localizada no interior ou no exterior das bacteriocytes, e têm efeitos diversos sobre a biologia do insecto 12.
Vários relatórios têm tentado estudar a localização de TYLCV em plantas e moscas brancas, usando protocolos demorados e dispendiosos, como a microscopia eletrônica de transmissão (TEM), anticorpos e RNA in situ na seção de espessura microscópica 10,13, um estudo recente descreveu a localização de vírus de plantas dentro de suas plantas hospedeiras e de vetor usando um protocolo simples 14. Aqui nós descrevemos um protocolo simples para a localização de TYLCV em B. tabaci dissecado intestino médio e glândulas salivares, e nas seções preparados a partir de plantas TYLCV infectados. Descrevemos ainda mais a localização de Portiera, o endosymbiont primária de B. tabaci, e seus endossimbiontes secundárias Hamitonella, Rickettsia e Arsenophonus. Este protocolo é baseado no uso de sondas de DNA curtas, quesão marcadas por fluorescência em sua extremidade 5 ', e hibridam especificamente com sequências complementares em sequências de genes virais ou bacterianas. O processamento das amostras é relativamente fácil e que o sinal obtido é altamente específico. O protocolo descrito pode ser utilizado para localizar os vírus, bactérias e outros organismos patogénicos nas plantas, animais e insectos hospedeiros, e ainda pode ser utilizado para localizar o ARNm em qualquer dado tecido.
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Protocol
1. Preparativos Geral Whitefly, Flora, e vírus para análise FISH
- B traseiro e Q whiteflies biótipo de plântulas de algodoeiro (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) e manter dentro de gaiolas à prova de insetos e salas de crescimento sob condições padrão de 25 ± 2 ° C, 60% de umidade relativa, e uma luz de 14 horas / fotoperíodo escuro de 10 horas.
- Executar PCR para testar a infecção com endosimbiontes utilizando iniciadores específicos de endossimbiontes como anteriormente descrito 15-19.
- Compre mudas de tomate (Solanum esculentum cv. Beefsteak) a partir de um viveiro comercial ou de plantas de tomate sementes.
- Manter sob as mesmas condições de criação descritos acima até que as plantas atingem o estágio de quatro folhas verdadeiras, a idade mais adequada para a inoculação mediada por mosca branca de TYLCV 15 (ver secção 4.1 abaixo).
2. Manipulação de insetos, Fixação, Probe projeto, hibridização e visualização para Endosimbionte FISH
- Colete 10 whiteflies adultos por aspiração de plantas de algodão, ou pegar 10 3 ª ou 4 ª ninfas de folhas de algodão.
- Mergulhar imediatamente em fixador de Carnoy (ácido clorofórmio-etanol-ácido acético glacial, 06:03:01, v / v) em tubos Eppendorf. Correção para 2 horas durante a noite (de preferência durante a noite).
- Remover completamente o fixador e descolorir em 6% de H 2 O 2 em etanol durante 2 horas.
- Preservar as amostras em etanol absoluto por vários dias a várias semanas à temperatura ambiente, ou prosseguir para a próxima etapa.
- Conceber sondas de DNA primers reversos como complementares com base nos genes de ARN ribossomal 16s de cada bactéria. Para projetar os testes, levar em conta as mesmas considerações para a concepção de iniciadores de PCR. Utilizar as sondas oligonucleotídicas BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', 5'-Rb1 Cy3 TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', 5'-Cy3 BTH-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'e 5'-Ars2 Cy3TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'para o direcionamento específico de Portiera, Rickettsia, Hamilonella e Arsenophonus, respectivamente.
- Hibridizam amostras durante a noite, no escuro, em tampão de hibridação (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,9 M de NaCl, 0,01% [peso / vol] de sulfato de dodecilo de sódio a 30% [vol / vol] formamida) contendo 10 pmol de sonda fluorescente por ml . Combinar mais do que uma sonda com diferentes corantes fluorescentes, se necessário. Use whiteflies não infectadas com a bactéria alvo e amostras não-sonda como controles negativos.
- Monte as amostras de todo, numa lâmina de microscópio, em tampão de hibridação contido com um bloqueador de líquido, cubra com uma lamela, selar com unha polonês, e vista sob um microscópio confocal de fluorescência ou.
3. Mosca branca Órgão Dissection, Fixação, hibridização e visualização para TYLCV FISH
- Colete whiteflies adultos permanentemente criados em plantas de tomate TYLCV infectados por aspiração e anesthetize por exposição a toalha de papel impregnado com acetona. Expor whiteflies apenas para 1-2 min como demasiado longa exposição à acetona pode consertar tecidos moscas brancas. Use whiteflies nonviruliferous criados em plantas de tomate não infectadas e nenhuma amostra de sonda para controles para confirmar a hibridação específica.
- Mount whiteflies sobre depressão lâminas de microscópio para dissecção de órgãos usando um microscópio estéreo.
- Puxe a cabeça inseto do protórax e dissecar as glândulas salivares em 1x PBS suplementado com 1% de azul de toluidina mancha para melhor visualização, devido ao seu pequeno tamanho. Permitir que a absorção da mancha para 2-3 min.
- Puxe o inseto além na junção entre o tórax eo abdômen para observar e expulsar o intestino médio. Expulse o conteúdo do abdômen, empurrando com uma pinça na ponta do abdome.
- Remova cuidadosamente o PBS e azul de toluidina a partir de dissecações de sucesso e adicione delicadamente 300 ml de fixador de Carnoy para corrigir os órgãos para 5 min.
- Add fixador de um dos lados do poço deprimido e não a partir do topo para evitar o movimento não controlado dos órgãos dissecados. Uma vez que tocar no fixador, os órgãos vai aderir ao vidro, e ao longo do processo que não se move.
- Remover fixador e adicionar 500 ul de tampão de hibridação suplementadas com 10 pmoles da sonda de DNA fluorescente Cy5 5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', que é complementar a uma sequência no gene de proteína de revestimento de TYLCV.
- Hibridizar durante a noite à temperatura ambiente no escuro por incubação da lâmina com a amostra no interior de uma pequena câmara húmida, composta de pequena caixa de plástico com toalha de papel húmido no fundo.
- Após a hibridização, pegar os órgãos com uma ferramenta de dissecção fina e rapidamente movê-los para uma lâmina de microscópio fresco contendo 30 mL de novo tampão de hibridação suplementadas com DAPI (0,1 mg / ml em PBS 1x) e contidos com bloqueador de líquido.
- Cubra as amostras com uma lamela, selar sagacidadeh unha polonês e vista sob um microscópio confocal de fluorescência ou.
4. Manipulação de Plantas, Mão-corte, fixação e hibridização para TYLCV FISH
- Inocular mudas de tomate com TYLCV usando inoculação mediada por mosca branca viróticas. O vírus pode ser detectado utilizando este método de FISH em plantas sem sintomas de uma semana após a inoculação. O sintoma típico são visíveis três semanas após a inoculação. Use plantas de tomate não infectadas e nenhuma amostra de sonda para controles para confirmar a hibridação específica.
- Use uma lâmina de barbear histológica afiada para preparar 2-4 longos cortes longitudinais ou transversais cm cortados à mão de tomate caules e folhas.
- Em tubos Eppendorf, fixar as secções em fixador de Carnoy, durante 2 horas a durante a noite à temperatura ambiente.
- Remover fixador e preservar as seções em etanol absoluto por vários dias a várias semanas à temperatura ambiente, ou prosseguir para a próxima etapa.
- Lavar as secçõestrês vezes, 1 min cada, em tampão de hibridação.
- Hibridar as secções com 500 ul de tampão de hibridação suplementadas com 10 pmol do oligonucleótido sonda fluorescente Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', que é complementar a uma sequência no gene de proteína de revestimento de TYLCV.
- Lavar as secções três vezes, 1 min cada, em tampão de hibridação.
- Mount seções inteiras em tampão de hibridação suplementadas com DAPI (0,1 mg / ml em PBS 1x) e contidos com bloqueador de líquido, cubra com uma lamela, selar com unha polonês e vista sob um microscópio confocal de fluorescência ou.
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Representative Results
O sistema estudado neste manuscrito é mostrado na Figura 1 e inclui uma planta infectada com TYLCV, um adulto e uma ninfa da mosca branca B. tabaci, ea anatomia interna da mosca-branca, mostrando o caminho para a translocação TYLCV no inseto. Figura 2 mostra dupla FISH em uma mosca adulta para o simbionte primário Portiera eo simbionte secundário Arsenophonus. Figura 3 mostra dupla FISH para Portiera e Hamiltonella e A Figura 4 mostra dupla FISH para Portiera e Rickettsia, ambos os valores em B. tabaci 4 ° estádio ninfa. Figura 5 mostra de FISH para TYLCV e coloração com DAPI em uma mosca branca dissecados intestino, e Figura 6 mostra uma FISH para TYLCV e coloração com DAPI numa dissecados glândulas salivares principais da mosca-branca. Figura 7 mostra de FISH para TYLCV e coloração com DAPI nasseções de plantas infectadas por TYLCV cortados à mão.
Figura 1. Visão geral do sistema estudado neste manuscrito. A) os sintomas da doença típicos causados pela infecção por Tomato virus (TYLCV). B) Vista externa de uma mosca adulta. C) Visão externa da 4 ª fase de ninfa no ciclo de vida do desenvolvimento da mosca-branca. Outros estágios de ninfa são semelhantes na visão externa em geral, mas em tamanho menor. D) Representação esquemática da anatomia interna de um adulto B. tabaci mostrando o caminho da aquisição TYLCV dos elementos crivados de plantas, circulação e transmissão (setas pretas). Partículas vermelhas referem-se a viriões TYLCV. p: floema; s: s tylet; e: esôfago; fc: câmara do filtro; dm: descendente do intestino médio; sou: ascendente do intestino médio; ca: ceco; hg: hindgut; bc: bacteriocytes; psg:. glândula salivar principal Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. PEIXES dupla de Portiera e Arsenphonus em B. Q tabaci biótipo adulto (A) e aumentar a área marcada (B), ambos sob brilhante canal campo e secções ópticas de detecção combinados os sinais fluorescentes emitidos por cada sonda da sonda. Portiera-specific (vermelho) conjugado com Cy5 e uma sonda específica Arsenphonus-( amarela) conjugado com Cy3 foram usadas. e: ovo."target =" _blank pg "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. FISH dupla de Portiera e Hamiltonella em B. Foram utilizados sonda tabaci ninfa. Portiera específicas de (vermelho) conjugado com Cy5 e sonda Hamiltonella específicas de (verde) conjugado com Cy3. sinal de hibridização A) Hamiltonella obtidos a partir de secções ópticas combinadas e visto sob campo escuro. B) sinal de hibridização Portiera obtidos a partir de combinado secções ópticas e visto sob campo escuro. C) Portiera e Hamiltonella fundiu sinais em campo claro. D) Portiera e Hamiltonella sinais combinados visto sob dacampo rk. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 4. FISH dupla de Portiera e Rickettsia em B. Foram utilizados sonda tabaci ninfa. Portiera específicas de (vermelho) conjugado com Cy5 e sonda Rickettsia específicas de (azul) conjugado com Cy3. A) sinal de hibridização Rickettsia obtidos a partir de secções ópticas combinadas e visto sob campo escuro. B) sinal de hibridização Portiera obtidos a partir de sinais combinados secções ópticas e visto sob campo escuro. C) Portiera e Rickettsia combinadas sob campo claro. D)
Figura 5. FISH de TYLCV no intestino médio dissecado de um adulto B. tabaci fêmea que tinha adquirido o vírus durante 48 horas a partir de uma planta de tomate infectadas sonda. específico do TYLCV (vermelho) conjugado com Cy3 foi utilizado, e o intestino médio foi corado com DAPI, antes de montagem e de visualização. A) O intestino médio dissecados como pode ser visto a partir de combinados secções ópticas sob campo claro. B) sinal TYLCV FISH (vermelho) e DAPI núcleos corados (azuis) como visto de secções ópticas combinadas sob campo escuro. fc: câmara do filtro; dm: descendi ng intestino médio; sou: ascendente do intestino médio; ca: ceco; hg: hindgut. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 6. FISH de TYLCV em dissecados glândula salivar primário de um adulto B. tabaci fêmea que tinha adquirido o vírus durante 48 horas a partir de uma planta de tomate infectadas sonda. específico do TYLCV (vermelho) conjugado com Cy3 foi utilizado, e a glândula salivar corados com DAPI antes da montagem e visualização. A) O salivar primário dissecados e corados DAPI glândula, como visto a partir de secções combinadas sob campo claro. B) sinal TYLCV FISH (vermelho) e núcleos DAPI manchadas (azul) como pode ser visto a partir de secções combinadas sob campo escuro.s :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 7. FISH de TYLCV em seção longitudinal cortado à mão através de uma haste da planta TYLCV-infectados. Sonda TYLCV específicas de (vermelho) conjugado com Cy3 foi usado e combinado com coloração DAPI antes Uma seção mostrado com vermelho de montagem e visualização. A) sinal TYLCV em um elemento de peneira floema, e núcleos DAPI manchadas visto de seções combinadas sob campo escuro. b) as mesmas seções combinadas mostrados em (A), sob campo claro para a orientação. ph: floema; xy:. xilema Clique aqui para ver maior imidade.
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Discussion
O protocolo aqui descrito para a localização de um vírus de plantas, na sua planta hospedeira e vector de insecto, bactérias e endosymbiotic no seu hospedeiro mosca branca específico, pode ser adaptado para a localização de outros vírus em plantas e até mesmo em tecidos animais. Além disso, o protocolo pode ser utilizado para localizar bactérias endosymbiotic e patogénicos e outros micro-organismos em sistemas de plantas e animais. Os métodos descritos dependem de conceito simples de hibridação entre uma sonda de DNA fluorescente curto-oligonucleótido marcado e o DNA alvo ou uma molécula de ARN na célula. O resultado é uma hibridação específica, com o fundo mínimo, e um sinal de fluorescência detectado utilizando microscópios ou confocal. Várias sondas com diferentes corantes fluorescentes, que têm como alvo mais do que um gene, podem ser usados simultaneamente. Isto permite a visualização de mais do que um alvo numa única célula ou tecido. Os procedimentos descritos nestes protocolos são simples e o tempo de processamento da amostraé mínima. Os problemas associados com outros protocolos, como sinal de fundo elevado, o tempo de processamento longo para os espécimes e a utilização de vários materiais e dispendiosos para a análise, não são limitações no protocolo aqui descrito.
Os biótipos de B. B e Q whiteflies tabaci foram usados para descrever os protocolos neste manuscrito, no entanto, a criação condições se aplicam a qualquer biótipo mosca branca, com a respectiva planta hospedeira. A mosca-branca completa o seu ciclo de vida em três semanas, nas condições indicadas. Cada indivíduo da população biótipo B utilizado foi infectado com o endosymbiont primário Portiera, e as bactérias endosymbiotic secundárias Hamiltonella e Rickettsia. Os indivíduos biótipo Q foram infectados com Portiera e Arsenophonus. Outras populações de mosca-branca em todo o mundo mostraram-se infectados com estes ou outras espécies de bactérias endosymbiotic, e com diferentes localizati espaciaisnos padrões do corpo 16-20.
Plantas infectadas TYLCV mostrar sintomas típicos da doença três semanas após a inoculação. Para TYLCV localização, das plantas com sintomas pode ser usado para a aquisição do vírus pela mosca branca durante 24 horas e o vírus pode ser detectado nas plantas e insectos infectados com o protocolo descrito acima FISH. Enquanto em insectos as sondas utilizadas podem ser conjugados com muitos fluoróforo que pode excisada com diferentes comprimentos de onda, incluindo a Cy3 e Cy5, Cy3 em plantas é o mais adequado e não fluoresce a comprimentos de onda similares como cloroplastos, os organelos mais abundantes nas células da planta.
A implementação bem sucedida dos protocolos descritos para a localização de bactérias e vírus em plantas e insetos depende da boa fixação das amostras, para melhor visualização e penetração da sonda, bom design de sonda para a especificidade e limpando com H 2 O 2 no caso de insetos inteiros para bvisualização sinal Etter. No caso de peixes em plantas, seções feitos à mão deve ser o mais fino possível para uma boa penetração da sonda e uma melhor visualização do sinal. Isto pode ser melhorado colocando a folha entre duas placas de esferovite para ajudar com corte e usando lâminas de barbear profissionais, que podem ser adquiridos para este efeito a partir de vários fornecedores.
O protocolo não é adequado para a localização subcelular de alvos, no entanto, tem o potencial de ser desenvolvido, utilizando o formato de sonda descrevem aqui, para um método adequado para a localização subcelular. Por exemplo, as sondas curtas aqui descritos podem ser conjugados com moléculas tais como as moléculas de biotina e não fluorescentes, que por sua vez podem ser segmentados utilizando as partículas de ouro conjugadas com estreptavidina que podem ser visualizadas sob MET. Esta modificação posterior pode ser adequado para a localização subcelular de vários objectivos, incluindo os transcritos do gene e microorganismos. Finalmente, o protocolo descritos são adequados para a hibridação com os ácidos nucleicos, tais como ADN e ARN, mas não proteínas.
Para obter os melhores resultados nos protocolos de FISH descritas aqui, é melhor usar o inseto novos e de materiais de planta, bem como frescos fixador e hibridização buffers. As sondas devem sempre ser mantidos em -20 º C em pequenas alíquotas para evitar congelamento e descongelamento repetidos. O tempo de processamento de cada passo descrito pode ser calibrado de acordo com os organismos estudados. Como mencionado no protocolo, após fixação e descoloração, amostras de plantas e moscas brancas pode ser preservado por um longo tempo em etanol absoluto à temperatura ambiente. Esta etapa é particularmente útil quando o envio de amostras para o processamento de um local para outro, ou quando a realização de experimentos de curso longo tempo. A qualidade do sinal de hibridação não foi afectada a seguir esta preservação a longo tempo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Pesquisa no laboratório Ghanim foi apoiado por bolsa de pesquisa no. 908-42.12/2006 da Fundação Alemã-Israelense (GIF), conceder nenhuma. IS-4062-07 dos Estados Unidos-Israel Binacional Fundo das Nações Agrícola Pesquisa e Desenvolvimento (BARD) e bolsa de pesquisa no. 884/07 da Fundação para a Ciência Israel (ISF) para MG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
References
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