Summary
Vi beskriver här en enkel fluorescens in situ hybridisering (FISH) metod för lokalisering av virus och bakterier i insekts-och växtvävnader. Detta protokoll kan utvidgas för visualisering av mRNA i hela berget och mikroskopiska sektioner.
Abstract
Fluorescens in situ-hybridisering (FISH) är ett namn som ges till en mängd olika tekniker som vanligen används för att visualisera gentranskript i eukaryotiska celler och kan modifieras ytterligare för att visualisera andra komponenter i cellen, såsom infektion med virus och bakterier. Rumslig lokalisering och visualisering av virus och bakterier under infektionsprocessen är ett viktigt steg som kompletterar expression profiling experiment såsom microarrays och RNAseq som svar på olika stimuli. Förstå Spatiotemporal infektioner med dessa medel kompletterar biologiska experiment som syftar till att förstå deras interaktion med cellulära komponenter. Flera tekniker för att visualisera virus och bakterier, såsom reportergen system eller immunhistokemiska metoder är tidskrävande, och en del är begränsade till att arbeta med modellorganismer och omfatta komplicerade metoder. FISH som riktar RNA-eller DNA species i cellen är en relativt enkel och snabb migThOD för studium spatiotemporal lokalisering av gener och för diagnostiska ändamål. Denna metod kan vara robust och relativt lätt att genomföra när de protokoll använder korta hybridisering, kommersiellt köpta sonder, som inte är dyrt. Detta är särskilt robust när provpreparering, fixering, hybridisering, och mikroskopisk visualisering inte innebär komplicerade steg. Här beskriver vi ett protokoll för lokalisering av bakterier och virus i insekts-och växtvävnader. Metoden bygger på enkel beredning, fixering och hybridisering av insekts hela fästen och dissekerade organ eller handgjorda anläggningsdelar, med 20 baspar korta DNA-sonder konjugerade till fluorescerande färger på sina 5 'eller 3' slutar. Detta protokoll har tillämpats framgångsrikt på ett antal insekter och växtvävnader, och kan användas för att analysera uttrycket av mRNA eller andra RNA-eller DNA-arter i cellen.
Introduction
Vid studie av samverkan mellan växtvirus och andra patogener med sina infekterade växtvärdar, är det viktigt att visualisera patogener och deras respektive nukleinsyror in situ, oavsett om de orsakar negativa effekter på deras värdar. Detta är det viktigaste när man studerar patogen rörlighet inom och mellan växtceller. In situ lokalisering av genprodukter av patogenen är ett viktigt steg som kompletterar andra metoder för att studera sjukdomsframkallande förmåga processen. Många växtpatogener, särskilt virus, som överförs av insekter, som har komplexa och intima samspel med sina vektorer. Lokalisering av dessa virus i deras vektorer är viktigt för att studera utvecklingen för överföring, och de möjliga interaktionsställen inuti vektorn. Överföringen av vissa insektsvektorväxtvirus underlättas av endosymbiotiska bakterier som finns inom dessa insekter. För att bättre studera överföring av dessa växtvirus by deras vektorer, är det också viktigt att visualisera endosymbiotiska bakterier i allmänhet, och de som är involverade i virusöverföring, i synnerhet. Colocalization av virus och endosymbiotiska bakterier är därför önskvärt för att undersöka möjliga samband mellan dessa organismer inom sina insekts värd. Bortsett från virusöverföring, endosymbiotiska bakterier påverkar flera aspekter av biologin av insekter, är alltså rumslig lokalisering av dessa bakterier inom insekter av stort intresse och betydelse.
Tomato Yellow Leaf Curl-viruset (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) är den viktigaste virussjukdom komplex av odlade tomater i världen 1-4. TYLCV är en floem begränsad virus och är uteslutande vektoriserade av vita flygare Bemisia tabaci 5,6. En modell som beskriver sloka av begomoviruses i sina vita flygare vektorer har föreslagits 6-9. Två särskilda hinder aktivt korsas underning denna circulative växellåda: midgut / hemolymfa och hemolymfa / spottkörtel barriärer. Denna transmissionsmekanismen är en hypotes som medieras av okända receptorer som känner igen viruset kapsiden. TYLCV tros passera B. tabaci midgut 6,10, och absorberas genom primära spottkörteln 6 innan det sprutas in i anläggningen. I whitefly hemolymfa, TYLCV interagerar med en GroEL protein som produceras av insekts sekundär endosymbiotisk bakterie Hamiltonella. Denna interaktion garanterar säker transport av TYLCV i hemolymfa, och skyddar den från angrepp av insektsimmunsystemet 11. Hamiltonella och Portiera den primära endosymbiont av vita flygare, är inrymda i bacteriocytes, insektsceller funna i hemolymfa och gatu endosymbiotiska bakterier 11. B. tabaci hyser ytterligare endosymbiotiska bakterier inklusive Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia och Fritschea, som kan vara lokaliserade inuti eller utanför de bacteriocytes, och har olika effekter på insektens biologi 12.
Flera rapporter har försökt att studera lokalisering av TYLCV i växter och vita flygare med hjälp av tidskrävande och kostsamma protokoll såsom transmissionselektronmikroskop (TEM), antikroppar och RNA in situ på mikroskopisk tjock avsnitt 10,13, beskrev en färsk undersökning lokaliseringen av växtvirus inuti deras växt-och vektor värdar genom att använda ett enkelt protokoll 14. Här beskriver vi ett enkelt protokoll för lokalisering av TYLCV i B. tabaci dissekerade midguts och spottkörtlar samt i avsnitten framställs från TYLCV-infekterade plantor. Vi beskriver lokalisering av Portiera den primära endosymbiont av B. ytterligare tabaci, och dess sekundära endosymbionts Hamitonella, Rickettsia och Arsenophonus. Protokollet bygger på att använda korta DNA-sonder, somär fluorescensmärkt på sin 5'-ände, och specifikt hybridisera till komplementära sekvenser i virala eller bakteriella gensekvenser. Provet bearbetning är relativt lätt och den signal som erhålls är mycket specifika. Det beskrivna protokollet kan användas för att lokalisera virus, bakterier och andra patogener i deras växt-, djur-och insekts värdar, och kan vidare användas för att lokalisera mRNA i varje given vävnad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. General Whitefly, Plant, och Virus Förberedelser för FISH analys
- Bakre B och Q biotyp whiteflies på bomullsplantor (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) och underhålla inne insektsnät burar och växtkammare under standardförhållanden av 25 ± 2 ° C, 60% relativ fuktighet, samt en 14-timmars ljus / 10-hr mörk fotoperiod.
- Utför PCR för att testa infektion med endosymbionts använder endosymbiont specifika primers som tidigare beskrivits 15-19.
- Köp Tomat plantor (Solanum esculentum cv. Biffstek) från en kommersiell plantskola eller växttomatfrön.
- Behåll under samma uppfödningsförhållanden som beskrivits ovan tills växterna når fyra sanna-bladstadiet, åldern mest lämpade för vita flygare-medierad ympning av TYLCV 15 (se avsnitt 4.1 nedan).
2. Insect Hantering, Fixering, Probe Design, hybridisering, och visualisering för Endosymbiont FISK
- Samla 10 vuxna vita flygare genom aspiration från bomullsplantor, eller plocka 10 3: e eller 4: e instar nymfer av bomullsblad.
- Omedelbart sänk ned i Carnoys fixativ (kloroform-etanol-isättika, 06:03:01, vol / vol) inuti Eppendorfrör. Fix för 2 timmar till över natten (helst över natten).
- Avlägsna helt fixermedel och avfärga i 6% H 2 O 2 i etanol i 2 timmar.
- Bevara proverna i absolut etanol under flera dagar till flera veckor vid rumstemperatur, eller att fortsätta till nästa steg.
- Design sonder som kompletterande omvända DNA-primers baserade på 16s ribosomala RNA-gener av varje bakterie. För att utforma sonderna, ta in på kontot samma överväganden för att utforma PCR-primers. Använd oligonukleotidsonder BTP1 5'-Cy5-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', Rb1 5'-Cy3-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', BTH 5'-Cy3-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 'och Ars2 5'-Cy3-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 'för särskild inriktning på Portiera, Rickettsia, Hamilonella och Arsenophonus, respektive.
- Hybridisera proverna i mörker över natten i hybridiseringsbuffert (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,9 M NaCl, 0,01% [vikt / volym] natriumdodecylsulfat, 30% [vol / vol] formamid) innehållande 10 pmol fluorescerande prob per ml . Kombinera mer än en sond med olika fluorescerande färgämnen vid behov. Använd noninfected whiteflies med den målsökta bakterien och no-sondprover som negativa kontroller.
- Montera proverna helhet, på ett objektglas, i hybridisering buffert som finns med en flytande blockerare, täck med ett täckglas, tätning med nagellack, och utsikt under ett fluorescens eller konfokalmikroskop.
3. Whitefly Organ Dissection, Fixering, hybridisering, och visualisering för TYLCV FISK
- Samla vuxna vita flygare kontinuerligt uppfödda på TYLCV-infekterade tomatplantor genom aspiration och anesthetize genom exponering för pappershandduk som impregnerats med aceton. Exponera whiteflies endast för 1-2 minuter som för lång exponering för aceton kan fixa whiteflies vävnader. Använd nonviruliferous whiteflies uppfödda på noninfected tomatplantor och inga sondprover för kontroller för att bekräfta specifik hybridisering.
- Mount whiteflies på depression objektglas för orgel dissektion med hjälp av ett stereomikroskop.
- Dra bort insekten huvudet från prothorax och dissekera spottkörtlar i 1x PBS kompletterad med 1% toluidinblått fläck för bättre visualisering, på grund av sin ringa storlek. Tillåt absorption av fläcken i 2-3 min.
- Dra insekten isär vid övergången mellan bröstkorgen och buken för att observera och driva ut midgut. Häll innehållet i buken genom att trycka med pincett på buken spetsen.
- Ta försiktigt bort PBS och toluidinblått från framgångsrika dissektioner och försiktigt lägga 300 pl Carnoys fixativ för att fixa de organ i 5 min.
- ETTdd fixativ från ena sidan av deprimerade väl och inte från toppen för att förhindra okontrollerade rörelser av de dissekerade organ. När vidröra fixativ, kommer organen fastnar på glaset, och i hela den process som de inte kommer att röra sig.
- Ta bort fixativ och lägga 500 pl av hybridiseringsbuffert kompletterat med 10 pmol av det fluorescerande DNA-sond Cy5-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', som är komplementär till en sekvens i TYLCV höljeproteingenen.
- Hybridisera över natten i rumstemperatur i mörker genom att objektglaset odlas med provet inuti en liten fuktig kammare bestående av liten plastlåda med våt handduk papper i botten.
- Efter hybridisering, plocka upp de organ med en fin dissektion verktyg och snabbt flytta dem till ett färskt mikroskopobjektglas innehållande 30 | il av ny hybridiseringsbuffert kompletterat med DAPI (0,1 mg / ml i 1 x PBS) och som återfinns med vätska blockerare.
- Täck proverna med ett täckglas, täta with nagellack och utsikt under ett fluorescens eller konfokalmikroskop.
4. Växthantering, Handsnittning, Fixering, och hybridisering för TYLCV FISH
- Inokulera tomatplantor med TYLCV hjälp av virussmittat vita flygare-medierad ympning. Viruset kan detekteras med användning av denna FISH metoden i symptomfria växter en vecka efter inokulering. Typiska sjukdomssymptom är synliga tre veckor efter inokulering. Använd noninfected tomatplantor och inga sondprover för kontroller för att bekräfta specifik hybridisering.
- Använd en vass histologisk rakblad för att förbereda hand skär 2-4 cm långa längsgående eller tvärsektioner av tomat stjälkar och blad.
- I Eppendorfrör, fastställa de sektioner i Carnoys fixativ under 2 timmar till över natten vid rumstemperatur.
- Ta bort fixativ och bevara de avsnitt i absolut etanol i flera dagar till flera veckor i rumstemperatur, eller gå vidare till nästa steg.
- Tvätta sektionernatre gånger, 1 min vardera, i hybridiseringsbuffert.
- Hybridisera sektionerna med 500 | il hybridiseringsbuffert kompletterat med 10 pmol av den fluorescerande oligonukleotidsökfragment Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 'som är komplementär till en sekvens i TYLCV höljeproteingenen.
- Tvätta sektionerna tre gånger, 1 min vardera, i hybridiseringsbuffert.
- Mount avsnitten hela i hybridisering buffert kompletterat med DAPI (0,1 mg / ml i 1x PBS) och ingår med flytande blockerare, täck med ett täckglas, tätning med nagellack och utsikt under ett fluorescens eller konfokalmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Systemet studerades i detta manuskript visas i fig. 1 och innefattar en infekterad växt med TYLCV, en vuxen och en nymf av whitefly B. tabaci, och den interna anatomi vita flygare som visar vägen för TYLCV sloka i insekten. Figur 2 visar dubbel FISH i en vuxen whitefly för den primära symbiont Portiera och sekundär symbiont Arsenophonus. Figur 3 visar dubbel FISH för Portiera och Hamiltonella, och Figur 4 visar dubbel FISH för Portiera och Rickettsia, båda siffrorna i B. tabaci 4: e stadiet nymf. Figur 5 visar FISH för TYLCV och DAPI färgning i en flygare dissekeras midgut, och Figur 6 visar en FISH för TYLCV och DAPI färgning i en dissekerade vita flygare primära spottkörtlar. Figur 7 visar FISH för TYLCV och DAPI färgning ihandslipade TYLCV-infekterade anläggningsdelar.
Figur 1. Allmän översikt av systemet studeras i detta manuskript. A) Typiska sjukdomssymptom som orsakas av infektion med Tomato Yellow Leaf Curl-viruset (TYLCV). B) Utseende av en vuxen whitefly. C) Extern syn på 4: e nymphal skede i whitefly utvecklings livscykel. Andra nymphal stadier är liknande i de allmänna externa vyn men mindre i storlek. D) Schematisk bild av den inre anatomin av en vuxen B. tabaci visar vägen för TYLCV förvärv från växtsiktelement, cirkulation och transmission (svarta pilar). Röda partiklar avser TYLCV virioner. tfn: floem, s: s tylet, e: matstrupe, fc: filterkammaren; dm: fallande midgut; am: stigande midgut, ca: caeca Hg: hindgut; BC: bacteriocytes, psg:. primär spottkörtel Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Dubbel FISH av Portiera och Arsenphonus på B. tabaci Q biotyp vuxen (A) och zooma på den märkta området (B) både i starkt fält kanal och kombinerade optiska sektioner upptäcka de fluorescerande signaler som sänds ut av varje sond. Portiera-specifik prob (röd) konjugerat till Cy5 och Arsenphonus-prob ( gul) konjugerad till Cy3 användes. e: ägg.pg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Dubbel FISK av Portiera och Hamiltonella på B. tabaci nymf. Portiera-specifik prob (röd) konjugerat till Cy5 och Hamiltonella-specifik prob (grön) konjugerat till Cy3 användes. A) Hamiltonella hybridisering signal som erhålls från kombinerade optiska sektioner och betraktas under mörka fält. B) Portiera hybridisering signal som erhålls från kombinerade optiska sektioner och betraktas under mörka fält. C) Portiera och Hamiltonella fusione signaler under starkt fält. D) Portiera och Hamiltonella kombinerade signaler betraktas under dark fält. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 4. Dubbla FISH av Portiera och Rickettsia på B. tabaci nymf. Portiera-specifik prob (röd) konjugerat till Cy5 och Rickettsia-specifik prob (blå) konjugerat till Cy3 användes. A) Rickettsia hybridisering signal som erhålls från kombinerade optiska sektioner och ses under mörka fält B) Portiera hybridisering signal som erhålls från. kombinerade optiska sektioner och betraktas under mörka fält. C) Portiera och Rickettsia kombinerade signaler enligt ljusa fält. D)
Figur 5. FISK av TYLCV på dissekerade midgut av en vuxen B. tabaci hona som hade fått viruset i 48 timmar från en infekterad tomatplanta. TYLCV specifik sond (röd) konjugerat till Cy3 användes, och midgut färgades med DAPI innan montering och visualisering. A) Den dissekerade midgut sett från kombinerad optiska stycken under ljusa fält. B) TYLCV FISH-signal (röd) och DAPI färgade kärnor (blå) sett från kombinerade optiska stycken under mörka fält. fc: filterkammaren; dm: descendi ng midgut, am: stigande midgut, ca: caeca; hg: hindgut. Klicka här för att visa en större bild.
Figur 6. FISK av TYLCV på dissekerade primära spottkörtel av en vuxen B. tabaci hona som hade förvärvat viruset under 48 timmar från en infekterad tomatplanta. TYLCV-specifika sonden (röd) konjugerat till Cy3 användes och salivkörtel färgades med DAPI före montering och visualisering. A) dissekerades och DAPI-färgade primära saliv körtel sett från kombinerade stycken under ljusa fält. B) TYLCV FISH-signal (röd) och DAPI färgade kärnor (blå) sett från kombinerade stycken under mörka fält.s :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 7. FISK av TYLCV på handslipade längdsnitt genom en stam av TYLCV-smittade anläggningen. TYLCV-specifik prob (röd) konjugerat till Cy3 användes och kombinerades med DAPI färgning innan montering och visualisering. A) Ett avsnitt som visas med rött TYLCV signal i en floem såll inslag, och DAPI färgade kärnor sett från kombinerad stycken under mörka fält. B) Samma kombinerade sektioner som visas i (A) under starkt fält för orientering. ph: floem, xy:. xylem Klicka här för att visa en större imålder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här för lokalisering av ett växtvirus i sin växtvärd och insektsvektor och endosymbiotiska bakterier i deras specifika whitefly värd, kan anpassas för lokalisering av andra virus i växter och även i djurvävnader. Dessutom kan protokollet användas för att lokalisera endosymbiotiska och sjukdomsframkallande bakterier och andra mikroorganismer i växt-och djursystem. De beskrivna metoderna förlitar sig på enkelt koncept av hybridisering mellan en kort, fluorescensmärkt oligonukleotid DNA-prob och mål-DNA eller RNA-molekyl i cellen. Resultatet är en specifik hybridisering, med minimal bakgrund, och en signal detekteras med hjälp av fluorescens eller konfokala mikroskop. Flera sonder med olika fluorescerande färger, som riktar sig mer än en gen, kan användas samtidigt. Detta gör det möjligt att visualisera mer än ett mål i en enda cell eller vävnad. De förfaranden som beskrivs i dessa protokoll är enkla och tids urval bearbetningär minimal. Problem i samband med andra protokoll såsom hög bakgrundssignal, lång behandlingstid för prover och användningen av många och dyra material för analys, inte begränsningar i det protokoll som beskrivs här.
B-och Q biotoper i B. tabaci vita flygare användes för att beskriva de protokoll i detta manuskript, men uppfödningsförhållanden gälla varje whitefly biotyp, med sina respektive värdväxt. Den vita flygare bordar sin livscykel i tre veckor under de angivna förhållanden. Varje individ av B biotyp befolkningen använde var smittad med den primära endosymbiont Portiera, och de sekundära endosymbiotiska bakterier Hamiltonella och Rickettsia. Q biotyp personer smittades med Portiera och Arsenophonus. Andra vita flygare befolkningar runt om i världen visade sig vara infekterade med dessa eller andra endosymbiotiska bakteriearter, och med olika rumsliga localizatipå mönster i kroppen 16-20.
TYLCV infekterade plantor visar typiska sjukdomssymtom tre veckor efter ympning. För TYLCV lokalisering, kan symtomatisk växter användas för virus förvärv av vita flygare under 24 h och viruset kan påvisas i infekterade växter och insekter med hjälp av FISH protokoll som beskrivs ovan. Medan i insekter de sönder som används kan konjugeras med många fluorofor som kan skäras ut med olika våglängder, inklusive Cy3 och Cy5, i växter Cy3 är den mest lämpliga och inte fluorescerar vid samma våglängder som kloroplaster, de mest förekommande organeller i växtcellen.
Ett framgångsrikt genomförande av de beskrivna protokollen för lokalisering av bakterier och virus i växter och insekter är beroende av god fixering av proverna för bättre visualisering och sond penetration, bra sond design för specificitet och rensa med H 2 O 2 i det gäller hela insekter för bEtter signal visualisering. I fallet med FISH i växter, måste handgjorda sektioner vara så tunn som möjligt för god sond penetration och bättre visualisering av signalen. Detta kan förbättras genom att sätta bladet mellan två frigolitbitar för att hjälpa till med styckning och genom att använda professionella rakblad som kan köpas för detta ändamål från flera leverantörer.
Protokollet är inte lämplig för subcellulär lokalisering av mål, men det har potential att utvecklas med hjälp av sond formatet beskriver här, i en lämplig metod för subcellulär lokalisering. Till exempel kan de korta prober som beskrivs här vara konjugerad till molekyler såsom biotin och inte fluorescerande molekyler, som i sin tur kan riktas med användning av guldpartiklar är konjugerade till streptavidin som kan visualiseras i TEM. Denna senare modifiering kan vara lämpliga för subcellulära lokalisering av flera mål inklusive gentranskript och mikroorganismer. Slutligen har den beskrivna protokollets är lämpliga för hybridisering med nukleinsyror såsom DNA och RNA, men inte proteiner.
För att erhålla bästa resultat i fisken protokoll som beskrivs här, är det bäst att använda färsk insekt-och växtmaterial, samt färska fäst och hybridisering buffertar. Sonderna ska alltid förvaras i -20 ° C i små portioner för att undvika upprepad frysning och upptining. Bearbetningstiden för varje beskrivna steg kan kalibreras beroende på organismer som studeras. Som nämns i protokollet, efter fixering och avfärgning, vita flygare och växtprover kan bevaras under lång tid i absolut etanol vid rumstemperatur. Detta steg är särskilt användbart vid sändning av prover för bearbetningen från en plats till en annan, eller vid utförande av långa tidsförloppsexperiment. Kvaliteten på hybridiseringssignalen påverkades inte efter denna långa tid bevarande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Forskning i Ghanim labbet stöddes av forskningsanslag nr. 908-42.12/2006 från den tysk-israeliska Foundation (GIF), bevilja nej. IS-4062 till 07 från USA-Israel binationella jordbruksforskning och utvecklingsfonden (BARD), och forskningsanslag nr. 884/07 från Israel Science Foundation (ISF) till MG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
References
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
- Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
- Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
- Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
- Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
- Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
- Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
- Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
- Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
- Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
- Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
- Ghanim, M., Medina, V. Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. Czosnek, H. , Springer. New York. 175-187 (2007).
- Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
- Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
- Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
- Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
- Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
