Summary
ウイルス誘発性遺伝子サイレンシングは、植物の非宿主抵抗性に関与する遺伝子を同定するための便利なツールです。私たちは、非宿主病原体に感受性遺伝子沈黙植物を識別するのにGFPuvのを表現する細菌の病原体の使用方法を示しています。このアプローチは速く、容易であり、大規模なスクリーニングと同様のプロトコルは、様々な他の植物、微生物の相互作用を研究に適用することができる容易にする。
Abstract
細菌性病原体に対する植物の非宿主病抵抗性は、複雑な防御経路によって制御される。このメカニズムを理解することは、病原体の広い範囲に対して耐久性のある病害抵抗性植物を開発するために重要である。ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）ベースのフォワード遺伝スクリーニングは、非宿主抵抗性を付与する植物防御遺伝子の同定に有用なアプローチである。 タバコガラガラウイルス （TRV）ベースVIGSベクトルは、現在までに、最も効率的なVIGSベクトルでかつ効率的に使用されていベンサミアナタバコにおける内因性標的遺伝子をサイレンシングする。
本稿では、我々はNのcDNAライブラリーからの個々のクローンのサイレンシングのために前方の遺伝スクリーニングアプローチを実証ベンサミと非宿主病原体に対する妥協非宿主抵抗性の遺伝子沈黙植物の応答を評価し、 シュードモナスシリン PV。 トマトT1、P. syringaeのPV。glycinea、およびX.白葉。vesicatoria。これらの病原菌は、GFPuvのタンパク質を発現するように設計されており、標的遺伝子サイレンシングが非宿主性を付与に関与している場合、それらの緑色蛍光コロニーを接種した植物の非宿主病原体にUV光の下で肉眼で見ることができる。これは、非宿主病原体に感受性遺伝子沈黙植物の安定した高速の識別を容易にします。さらに、有望な候補遺伝子情報はTRVベクター中の植物遺伝子挿入物を配列決定することによって知ることができる。ここでは、非宿主抵抗性に関与する遺伝子を同定するためVIGS媒介フォワード遺伝学の高スループット能力を示しています。およそ、100 cDNAを個別に約2〜3週間で沈黙することができ、いくつかの非宿主細菌の病原体に対する非宿主抵抗性との関連性は、その後、週に研究することができる。本稿では、このスクリーニングに関わる詳細な手順を列挙。 VIGS媒介フォワード遺伝screeningのアプローチは、非宿主抵抗性に関与する遺伝子を特定するだけでなく、様々な植物種のいくつかの生物と非生物的ストレスの許容範囲を付与する遺伝子を研究するだけでなく、拡張することができます。
Introduction
非宿主抵抗は、特定の病原体1,2のレースに対するすべての植物種の抵抗である。これは、広いスペクトルおよび植物2,3における耐久性耐病性を付与する。しかし、特に細菌の病原体に対するそのメカニズムは、ウェル4を理解されていない。変異または沈黙植物その妥協非宿主抵抗性、および非宿主抵抗5-9間に差次的に発現する遺伝子を同定するためのハイスループット転写プロファイリングのためのスクリーニングは以前に細菌の非宿主抵抗性を解剖するために使用される2つの主要なアプローチである。非宿主抵抗が多くの遺伝子、遺伝子同定のためのハイスループット機能的ゲノムアプローチの関与を持つ複雑なメカニズム（S）4によって制御されているので、非宿主抵抗機構（s）を理解し、より良いために重要です。
ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）が成功裏に内因性の植物を沈黙するのに使用されています多くの植物種の遺伝子10,11。 ベンサミアナタバコは VIGS 10,12に最適な植物の一つで、そのドラフトゲノム配列は現在13入手可能です。 たばこガラガラウイルス （TRV）ベースVIGSが広く逆遺伝学ツールとして使用されてきた非宿主抵抗2,4,14に関与する遺伝子を特徴づける。このVIGSベクトルと誘導体はシロイヌナズナの生 物遺伝資源センター（ABRCを通じて利用可能になりましたhttp://www.arabidopsis.org/abrc/catalog/individ_cloned_gene_1.html ）。 VIGSはまた、植物免疫15-17、特に非宿主抵抗6,18に関与する遺伝子を同定するための順方向遺伝学ツールとして使用されている。過敏感反応（HR）媒介性の非宿主特異的病原体に対する植物によって誘導される細胞死を評価し、疾患誘発される細胞死を評価することidentifyin主に使用される2つの主要なアッセイであるgの影響を受けやすい遺伝子は、植物を沈黙。しかし、HR細胞死は、タイプ-IIの非宿主病原体に対するとしないタイプ-I非宿主病原体2に対して誘導される。したがって、HRアッセイは普遍的に、特に、I型非宿主病原体の広い範囲に対して、プラントで使用される非宿主抵抗戦略を識別するために使用することができない。また、遺伝子の沈黙植物における非宿主抵抗性の部分的な損失は、常に病気の症状6ひいては病気のスコアが非宿主抵抗性を損なう植物を識別するために使用することはできないにつながるものではない。逆に、遺伝子沈黙植物の非宿主病原体の成長を評価する遺伝子沈黙植物の非宿主抵抗性の損失を研究するための良い方法です。
従来の増殖アッセイ6,19に比べて、遺伝子サイレンシング植物に非宿主細菌の増殖を評価するための高速な方法は、フォワード遺伝スクリーニングに要する時間を短縮することができる。我々は以前にバクテリアを観察するための方法を報告紫外線の下で肉眼での葉の上にL病原体の成長（UV）は、ライトグリーン蛍光タンパク質（GFP） を発現している19細菌を用いた。この原稿では、非宿主抵抗を侵害された遺伝子沈黙植物の識別を容易にするための非宿主細菌性病原体を表現GFPuvのの有用性を実証する。この方法は、感受性植物を同定するための正確かつハイスループットスクリーニングに適している。
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Protocol
1。植物の成長とターゲット遺伝子サイレンシング
- 植物の成長条件：
- Nをまくbenthamianaのは、土壌レスポッティング混合、メトロミックス350上の種と成長室に種を発芽。他の土壌または土壌レス媒体はまた、メトロミックスの代わりに使用することができる。
- 移植3週齢の個々のポットに苗と21で維持温室でそれらを成長±2℃以前の文献12に記載されているような他の成長条件と一緒に。 2〜3日移植後に、植物をTRV接種に使用することができる。
- TRV2クローンを育てる：
TRVは二部ウイルスであり、そのゲノムはRNA1とRNA2から構成されています。 RNA1は、RNA依存性RNAポリメラーゼおよび移行タンパク質をコードする20,21。 RNA2は、コートタンパク質（CP）とサブゲノムRNAを21から2非構造タンパク質をコードしている。 RNA1とRNA2両方が成熟VIRの形成のために必要とされる私たちは、粒子とそのまん延20,21。 TRV2ベクター中のcDNAライブラリーの構築は、以前の文献22,23に記載されている。簡単に述べると、本研究で用いたVIGSライブラリは、様々な生物及び非生物的エリシターに露出葉組織から抽出したRNAから構築された。- 冷凍庫からTRV2ベクトル（96ウェルプレート）でcDNAクローンを含むアグロバクテリウム （GV2260ひずみ）を取り出す。徐々にそれを解凍し、文化が室温に達した後、96ピンレプリケータを使用リファンピシン（10μgの/ ml）とカナマイシン（50μgの/ ml）でルリア-ベルターニ（LB）寒天プレート上に個々のアグロバクテ文化を接種する。
- 二日間28℃でプレートをインキュベートする。十分なアグロバクテリウムの接種が2植物のプリック接種のために利用可能ですので、我々は通常、各クローンのための4つの複製コロニーを成長させる。無菌条件下ですべての手順を実行します。
- VIGS：
- 育つ28でTRV1を運んでアグロバクテリウム （GV2260）°上記の抗生物質を含むLB液体培地でC。一晩増殖させ培養液から遠心分離により細胞を回収し、接種緩衝液（10mM MES、pHが5.5; 200μMアセトシリンゴン）に再停止し、50 rpmでシェーカー上で、室温で3時間インキュベートする。
- 遠心分離により細胞を回収し、5 mMのMES緩衝液（pH 5.5）及び接種（OD 600 = 0.3）に再懸濁する3-4 Nの背軸側へbenthamianaのは、無針注射器を使用して残します。詳細な手順は、接種前の文献24に示されている。その後、TRV1接種部位で、つまようじで葉を刺すことによって、それぞれのTRV2コロニーを接種する。
- 活発な成長が効率的VIGS 12のために重要であるとして、十分な栄養と植物を維持する。約2週間、標的遺伝子の転写産物を減らすために開始され、植物が病原菌INOCの準備ができているポスト接種TRV接種後3週でulation。
2。非宿主病原体培養と植物接種の調製
- 本研究で用いた病原体の詳細：
シュードモナスシリン PV。 コナジラミ、P.シリン PV。 トマトT1、P. syringaeのPV。glycineaと白葉。vesicatoria、本研究で使用されています。 P.を育てるキングスB（KB）12時間28℃でリファンピシン（10μgの/ ml）を、カナマイシン（50μgの/ ml）で補足液体培地でシリン系統。 X.を育てる16時間LB液体培地で白葉。vesicatoria。すべての病原体は以前の文献19に記載されているようにGFPuvのを表現することができるプラスミドを抱く。 - 植物の接種のために病原体培養液の調製：
- 遠心分離により菌体を採取し、長いWAを使って緑色蛍光の存在を確認暗闇の中でvelength UVランプ。滅菌水で2回細胞を洗浄し、それらは、滅菌水を使用して所望の濃度に再懸濁する。
- スポット（約1.5cm直径）として標的遺伝子サイレンシングの葉（ 第 5〜8 番目 ）の背軸側にそれぞれの病原体（複数可）を接種する。いくつかの非宿主病原体が同時に標的遺伝子サイレンシング植物におけるそれらの成長のために試験することができる。これは植物体細菌の増殖を表示するための陽性コントロールとして用いることができると同時に、ホスト病原体を接種する。また、ベクトル制御（TRV :: 00）植物を接種。
3。細菌性病原体の植物体の成長での観察
- 暗闇の中で長波長のUV光に接種葉を公開します。細菌のコロニーを葉の表面から放出される赤色蛍光のバックグラウンドでの葉の背軸側に緑色蛍光ドットとして表示することができます。
- 病原体の成長を観察する2日後に接種（dpi）で5〜解像度。この時間間隔の間、毎日観察が必要である。
- 後の最初の画面、短いリストサイレン一つ以上の非宿主病原体（複数可）の成長の結果クローン。
- 選択されたクローンのためVIGSを繰り返し、再び非宿主病原体（S）への遺伝子沈黙植物の応答をテストします。スクリーニングのこの第二のレベルは、最初の画面の間に得られた偽陽性を取り除くために行われます。
4。危殆非宿主抵抗のため選考植物の確認
- 上記のような画面から選択されたcDNAクローンを沈黙。 5分 - 0.01％とそれぞれの病原体培養（v / v）のシルウェットL-77と植物を沈めると、3のために真空に沈水植物を施すことにより非宿主病原体（S）と植物全体に接種。後述するように、従来の増殖アッセイ6,18,19により細菌の増殖を定量化する。
- 0時間後に接種（HPI）で、3解像度と5円から、リーフパンチ（0.5 cm 2で ）を使って5生物学的には、各非宿主病原体（s）のために複製接種葉から2葉のサンプルを収集。葉のサンプルを、2日間28℃で適切な抗生物質やインキュベートを補っKB寒天培地上のシリアル希釈し、プレート樹液を挽く。コロニーカウンターを用いて細菌のコロニーをカウントし、前の文献6に記載されているように葉の中の細菌の成長を計算します。
- 非宿主病原体（S）の影響を受けやすい植物は、ベクトル制御に比べて病原体の成長より高い数値を示すべきである。
5。標的遺伝子の挿入と識別をシーケン
- attB1とattB2プライマーを用いたりTRV2ベクター内クローニング部位に隣接するプライマーを使用して、選択したクローンについてコロニーPCRを行います。ゲル上でPCR産物を実行し、単一バンドの増幅を確認してください。
- TRV2ベクター中の植物遺伝子インサートのattBを用いて配列決定することができるプライマーまたはクローニング部位に隣接するプライマー。
- シーケンスを使用してBLASTを実行し、遺伝子の詳細情報を識別します。
- 非翻訳領域（UTRを）とともに完全長遺伝子配列を取得します。
- シーケンスの三つの異なる領域が300から400 bpの断片を選択し、TRV2ベクターにそれらのクローンを作成。独立して3つのすべてのVIGSコンストラクトを使用してVIGSを実行し、すべての3つの遺伝子の沈黙植物の非宿主抵抗性の妥協点を確認してください。
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Representative Results
本研究の主要な目的は、Nを沈黙遺伝子を容易かつ正確に同定するための方法を実証することである非宿主抵抗性のために妥協しているベンサミ工場 。この方法論の4つの主要なステップがあります。最初のステップは、個別にTRV-VIGSを使用して多数の遺伝子を沈黙させることである。我々は、 図1に示されているプロトコルを使用して、約1.5年間にわたり約5,000遺伝子6,18を沈黙していた。遺伝子サイレンシング植物のいくつかは、表現型（ 図2）黄変し、光退色、発育不全を含む様々な表現型の変化を示した。
第二段階は、非宿主病原体に対する感受性を示す遺伝子サイレンシング植物の同定である。私たちは、GFPuvの表現バクテリアを使用し、 植物体 （ 図3A-3C） で彼らの成長を追跡した。遺伝子の同定の方法を実証するために、非宿主pに影響を受けやすい植物を沈黙さathogen（s）は、我々は3つの非宿主病原体、Pを使用シリン PV。 トマトT1、P. syringaeのPV。glycineaとX.白葉。vesicatoria。予想通り、非沈黙（ベクトル制御）N.彼らは、植物の免疫力を克服することができなかったとして、これらの病原体を接種benthamianaの植物は成長しなかった。しかし、P.シリン PV。 トマト T1はNbSGT1遺伝子（非宿主抵抗25に関与する遺伝子）沈黙植物（ 図3D）上の緑色蛍光コロニーを形成した。これらのデータは、非宿主抵抗を損なわ遺伝子サイレンシング植物を識別するプロセスを示す。このプロトコルは、直接遺伝スクリーニングを転送するために適用することができる。例えば、我々の以前の前方の遺伝画面（ 図4）のいずれかから取られ、代表の結果はPの変化度を持つ2つの独立した遺伝子沈黙の植物を示していますシリン PV。 トマト T1の成長（ 図5
第三段階では、細菌の増殖を定量化することにより、画面から同定された遺伝子沈黙植物の細菌の増殖の確認です。 NbSGT1遺伝子サイレンシング植物における植物体における細菌増殖を推定するための一例を図3Eに示されている。その結果、Pのプランタ成長のシリン PV。 トマト T1は（TRV :: 00）非沈黙対照植物（ 図3E）に比べNbSGT1沈黙植物ではるかに高かった。特定の遺伝子サイレンシングのために非宿主抵抗性の損失は、部分的または完全な可能性があります。これに応じて、遺伝子沈黙植物に非宿主病原体の成長の程度が異なることがあります。
第四のステップはTRV2ベクトルの挿入を配列されています。 BLASTは、遺伝子およびその詳細を識別するために、このシーケンスを用いて行われる。
図1。 TRVベースVIGSを使用して多数の遺伝子サイレンシングに必要な手順を示した漫画。三週齢N. benthamianaの植物は、個々のポットに移植し、数日間増殖させた。TRV1構築物を担持するアグロバクテリウムは言うまでもないシリンジを用いて三時五十七葉に浸潤されている。その後、LB寒天プレート上で増殖させ96 cDNAクローンは、個別に爪楊枝を使用して撮影し、それぞれの植物のTRV1接種スポットへと刺している。約3週間の接種後、標的遺伝子サイレンシングは、トップ非接種新たに成長した葉に発生する。これらの葉は、（ 第 5〜8 回目 ） の非宿主病原体の増殖を試験するために使用される。
図2。 VIGS媒介フォワード遺伝スクリーニングN. benthamianaのは、植物の表現型の様々な変化を示している。三週齢N.独立してそれぞれのTRVを接種benthamianaの工場は、図示のようにされている前方の遺伝画面の一部として、 図1にdescriedコンストラクト。写真はTRV接種21日後に採取した。
図3。 GFPuvのから緑色蛍光が病原菌と非宿主抵抗性に関与する遺伝子を同定するためのその使用を表明。GFPuv の構築物を運ぶ、シュードモナスシリン PV。 コナジラミ 、ホスト病原体が、KB-培地プレートにストリークと、暗闇の中長波のUV光下で緑色蛍光を示しています（ A）。これらの細菌は、KB培地上で増殖させ、水（B）に再懸濁し、N.するに接種するベンサミ 4 CFU / ml）を。 3日後に接種（dpi）で細菌のコロニーでは葉の表皮細胞（C、左）の背軸側から肉眼で緑色蛍光スポットとして見ている。通常の光（可視領域）の下で描か同じリーフも（C、右）が表示されます。P.を表現GFPuvのsyringaeの PV。 コナジラミ（PSTAB、1×10 4 CFU / ml）と3非宿主病原体、P.シリン PV。 トマトT1（PstT1、1×10 4 CFU / ml）を、P. 。。; syringaeの PV glycinea（PSG、3×10 5 CFU / ml）および白葉vesicatoria（XCV、3×10 4 CFU / ml）をベクトル制御（TRV :: 00から葉の背軸側への接種D、左）とNbSGT1遺伝子沈黙植物（D、右）。 PSTABの細菌コロニーは、両方の葉に見られるとPstT1のもののみNで見られるbSGT1遺伝子沈黙葉は。沈黙NbSGT1遺伝子PstT1成長は24で定量残し、24および72時間後に接種（HPI、E）をグラフに示されている。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。プロトコルの概要は、非宿主抵抗性に関与する遺伝子の同定のためのVIGS媒介フォワード遺伝スクリーニングに続く。TRV2ベクターにおけるcDNAライブラリーは、Nを接種した非宿主病原体（S）からのRNAを用いて構築benthamianaの葉をスクリーニングするために使用することができる。 cDNAライブラリーからの個々のクローンをN.に沈黙しているTRV-VIGSによってbenthamianaの 。非宿主細菌性病原体（単数または複数）を発現する各GFPuvの遺伝子サイレンシングは 、植物の葉に接種する。 2〜4センチ接種スポットは、暗闇の中で、UVランプを用いて観察され、非宿主病原体の成長を示す植物を同定する。この予備審査の後、選択されたクローンは再び沈黙し、非宿主病原体成長が再確認されています。この第二のレベル画面は偽陽性を取り除くために行われます。その後、確認されたクローンを、三度目のサイレンシングされており、それぞれの細菌増殖が推定される。 TRV2ベクトルにおける各クローンのインサートを配列決定されており、遺伝子情報が識別される。同時にHRアッセイはまた、タイプIIの非宿主の病原体に対して誘導されるHRに寄与する遺伝子を同定するために遺伝子サイレンシング植物に行うことができる。
図5。前方の遺伝画面の一部として同定された遺伝子沈黙植物の非宿主細菌の病原体の成長。forwarをからの写真同定された遺伝子は、Nの非宿主抵抗性に関与しているD遺伝スクリーニングPstT1、PSGとXCVに対してbenthamianaの工場 。接種後3 dpiで2つの代表的な遺伝子沈黙植物のため撮影した写真はここに示されています。接種に使用される細菌の濃度を図3に記載されている。 43D4や94C1はよく番号が続き、96ウェルプレートの番号を示します。
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Discussion
植物免疫はほとんどまたは全く緑色蛍光がベクトル制御プラントから放出されていない、したがって、非宿主病原体の成長を制限し、長波長のUV光（ 図3D）の下で非宿主病原体を接種した葉。しかし、非宿主抵抗性に関与する遺伝子が沈黙したとき、遺伝子沈黙植物は非宿主病原体と緑色蛍光の成長（ 図3E）見られているを好む。これは、この原稿に記載された方法に関わる基本的な原則である。この方法論はHRベースアッセイ上の2つの主要な利点があります。 GFPuvのベースアッセイによる非宿主病原体に感受性沈黙植物の一つ、識別が閲覧することができプランタ成長のように 、精度を向上させます。第二に、この方法では、I型非宿主抵抗2,26（可視細胞死にはなりません）、およびタイプII非宿主抵抗2,26（過敏応答細胞死における結果）の両方に関与する遺伝子の同定を可能にします。例えば、私たちは以前に6C8と呼ばれ、沈黙植物はタイプ1とタイプ2の病原体18の両方に感受性であったクローンを同定した。
また、VIGSに使用される2つ以上の独立したクローンは、彼らが特定の遺伝子を沈黙させるために起こるのと同様の表現型を有する遺伝子サイレンシングの植物をもたらすことが可能である。それはサイレンの表現型を確認し、この冗長性は、便利です。このような繰り返しの発生はスクリーニングと遺伝子のタイプ（いくつかの遺伝子が高発現し、それゆえ図書館で繰り返し発生しているように）のために使用するライブラリに依存します。さらに、クローニングほぼすべての遺伝子は、NでエンコードされたbenthamianaのゲノムのcDNA VIGSライブラリに、独立して、それらを黙らせることが可能です。
効果的にGFPuvの蛍光アッセイに続いVIGSを使用非宿主抵抗性に関与する遺伝子を同定するための前方の遺伝学のスクリーニングを実施するために、次のヒントが役立ちます。
順番に（2）最適TRV1とTRV2価が重要であり、TRV接種のための4葉期の植物 - 成功VIGSのため、（1）3を使用しています。 TRV2価がVIGSの開始を制限する要因になることができるので、 アグロバクテリウムが TRV2を保有する少なくとも4完全に成長した細菌コロニーを接種し、（3）12最適な環境条件を維持する。周囲温度が最適VIGSの誘導において重要な役割を果たしている。
病原体からの緑色蛍光を効率よく検出するための重要なステップは、（1）常に指数増殖期に収穫新鮮な病原体培養液を使用し、接種する前にそれらを保存しない、彼らは自動UVの下で蛍光を発することができるように、（2）HR細胞死は避けるべきである光と負の観測に影響を与える。タイプII非宿主病原体（例えば、P. syringaeの PV。 トマト T1）の研究のために使用されるとき、これは特に重要である。下微視的HRが疑われる場合非宿主病原体の濃度やEVを使ってidenced。
トラブルシューティング：
複製の間で可変サイレン表現型の遺伝子サイレンシングと発生（1）矛盾：
TRV接種時にすべてのクローンのために手袋を変更します。また、TRV2 アグロバクテリウムコロニーコロニーPCRにより複数のクローンが含まれていないことを確認してください。コロニーPCRは、複数のバンドが明らかになった場合、それは、複数のクローンがコロニーに存在することが可能である。コロニーPCRによるクローンをLB寒天プレートとスクリーン上にストリークしてクローンを分離するためである。個々のクローンを同定した後、それらの各々に独立してVIGSを実行し、非宿主抵抗性を損なう遺伝子サイレンシング植物を同定する。
沈黙の植物（2）重度の成長の欠陥：
標的遺伝子サイレンシング（s）は、植物の基礎代謝に関与している場合は、成長欠陥が期待されている。しかし、遺伝子のいくつかは、計画を沈黙さTSは、ベクトル制御プラントに比べTRVの高い乗算が表示される場合があり、これは表現型の重症度に相加効果を引き起こす可能性があります。 アカザamaranticolor工場のローカル病変アッセイ12は沈黙植物がベクトル制御プラントに比べて高いTRV価を持っているかどうかを調べるために行われてもよい。このような状況の下、約4週齢の植物は、表現型の重症度を軽減するためにVIGSに使用することができる。
（2）オフ標的遺伝子サイレンシング：
頻繁にオフターゲットサイレンシングと呼ば非特異的遺伝子サイレンシングは、VIGS中に発生することができます。部分配列の相同性は、siRNAは27意図サイレン目標ではありません遺伝子のmRNAを分解する意図標的遺伝子のために生成可能にする場合に発生します。 TRV2ベクトルの挿入としてUTRシーケンスを使用します。すべて予想オフターゲット遺伝子の内在性遺伝子の下方制御を研究し、興味のある単一の遺伝子コンストラクト沈黙を確認してください。 T最小又は全くオフターゲットとする遺伝子断片の同定を容易にO、バイオインフォマティクスツール（例えば、使用することができるhttp://plantgrn.noble.org/pssRNAit/ ）。
プランタの細菌コロニーから（3）いいえ緑色蛍光ん：
これは成長文化上の使用によって最も可能性が高いが発生します。もう一つの原因は、小さい細菌の接種である可能性があります。細菌の濃度を間接的光学密度OD 600を測定することにより測定することができますが、死んだ細菌細胞は、より高いODを構成することができます。それはKB寒天培地プレート上に生細胞を計数することによりコロニー形成単位（CFU）に基づいて最適な細菌濃度を計算することをお勧めします。 OD値はcfuのに基づいて調整することができる。また、ストリークグリセロールストックからできるだけ頻繁に病原体は、KB寒天プレート上で、それを成長し、接種のために文化を調製するために、単一の新鮮なコロニーを接種する。
TRV2ベクトル（コロニーPCRによる）で、インサートを配列に伴う困難の一つ一般的に発生する原因は、複数のコロニーの存在である。 （＃1）上述したように、これを克服するために、個々のTRV2構築体を保有するクローンを単離しれるべきである。
GFPuvの方法と克服する方法の制限：
病原体が増殖中に、したがって、プラスミドを運ぶGFPuvのを失う可能性があり、悪影響の観測に影響を与える。また、遺伝子沈黙の植物の一部が黄変と光退色葉とこれらの葉は、異なる蛍光を（赤より）放出を示しています。これは見て緑色蛍光を困難にする。黄色又は白色葉から自己蛍光の影響を低減する方法の一つは、バックグラウンドEFFEを削除するか、または減少させることができるフィルタを備えたカメラを用いて緑色蛍光細菌の画像をキャプチャすることであるカラットピクチャは、細菌が成長したか否たかどうかを推測するために使用することができる。特定のソフトウェア（例えば、Adobe Photoshopの）は、そのようなピクチャの分析中にバックグラウンドの影響を低減するために使用することができる。
トランスジェニック細菌性病原体の適切な処分のようなバイオセーフティに関する注意事項は、実験の際に従う必要がある。 UVランプを取り扱う場合にも、適切な皮膚や眼の保護シールドが使用されるべきである。
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Disclosures
我々は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
このプロジェクトは、サミュエル·ロバーツノーブル財団によって資金を供給された。著者はれたMSSを感謝します。アートワークのためのさんとケイティ·ブラウン;ジェイニーGallawayとコリーンElles優れた植物のケアのため。またれたMSSを感謝したいと思います。このプロトコルの確立時の技術的なサポートがトリーナコットレル、プージャUppalapati、Moumitaサハ、Swethaビヌコンダ氏アイザックGreenhut。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well U-bottom plates | Becton Dickinson Labware (Franklin Lakes, NJ, USA) | 35-3077 | |
| 96-pin replicator stainless steel | Nalge Nunc International (Naperville, IL, USA) | 250520 | |
| High Intensity UV Inspection Lamps, Model B-100ap | Thomas scientific (Swedesboro, NJ, USA) | 6283K50 | Manufacturer ID 95-0127-01 |
| Stuart SC6 colony counter | Bibby Scientific Limited, Staffordshire, UK | SC6PLUS | |
| Soil-less potting mixture, Metro-Mix 350 | SUNGRO Horticulture Distribution, Inc., (Bellevue, WA, USA) | ||
| Primers: attB1 (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT) attB2 (GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT) |
Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville, IA, USA) | Custom synthesized | |
| MES, Monohydrate | VWR international (Radnor, PA, USA) | CAS No. 145224-94-8 | |
| Acetosyringone (Dimethoxy-4’-hydroxyacetophenone) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D134406 | |
| Vac-In-Stuff (Silwet L-77) | Lehle Seeds (Round Rock, TX, USA) | VIS-30 |
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