Summary
L'esperimento di Miller-Urey è stato uno studio pionieristico per quanto riguarda la sintesi abiotica di composti organici con possibile rilevanza alle origini della vita. Gas semplici sono stati introdotti in un apparecchio di vetro e sottoposti ad una scarica elettrica, simulando gli effetti del fulmine nel sistema atmosfera-oceano primordiale della Terra. L'esperimento è stato condotto per una settimana, dopo di che, i campioni raccolti da esso sono stati analizzati per i mattoni chimica della vita.
Abstract
Nel 1953, Stanley Miller ha riferito la produzione di biomolecole da semplici materiali di partenza gassosi, utilizzando un apparato costruito per simulare il sistema atmosfera-oceano primordiale della Terra. Miller introdotto 200 ml di acqua, 100 mmHg di H 2, 200 mmHg di CH 4 e 200 mmHg di NH 3 nell'apparecchio, poi sottoposto questa miscela, a riflusso, ad una scarica elettrica per una settimana, mentre l'acqua era simultaneamente riscaldata. Lo scopo di questo manoscritto è di fornire al lettore un protocollo sperimentale generale che può essere utilizzato per condurre un esperimento scintilla di scarico tipo Miller-Urey, utilizzando un pallone di reazione 3 L semplificata. Poiché l'esperimento consiste nell'esporre gas infiammabili ad una scarica elettrica ad alta tensione, vale la pena evidenziare passi importanti che riducono il rischio di esplosione. Le procedure generali descritte in questo lavoro possono essere estrapolati per progettare e condurre una grande varietà di esperimento scarica elettricas simulando ambienti planetari primitivi.
Introduction
La natura delle origini della vita sulla Terra rimane una delle questioni scientifiche più imperscrutabili. Nel 1920 il biologo russo Alexander Oparin e britannici evolutiva biologo e genetista John Haldane ha proposto il concetto di "brodo primordiale" 1,2, descrivendo gli oceani terrestri primitive contenenti composti organici che possono aver facilitato l'evoluzione chimica. Tuttavia, non è stato fino al 1950 quando i chimici cominciarono a condurre studi di laboratorio deliberatamente volti a comprendere come le molecole organiche avrebbero potuto essere sintetizzato da semplici materiali di partenza sulla Terra primitiva. Uno dei primi rapporti a tal fine è stata la sintesi di acido formico dalla irradiazione di soluzioni acquose di CO 2 nel 1951 3.
Nel 1952, Stanley Miller, allora studente laureato presso l'Università di Chicago, si avvicinò Harold Urey di fare un esperimento per valutare la possibilità che i composti organiciimportante per l'origine della vita potrebbero essere stati formati abiologicamente sulla Terra primitiva. L'esperimento è stato condotto utilizzando un apparato di vetro su misura (Figura 1A) progettato per simulare Terra primitiva. L'esperimento di Miller imitato fulmine dall'azione di una scarica elettrica su una miscela di gas che rappresentano l'atmosfera primordiale, in presenza di un serbatoio di acqua liquida, che rappresenta i primi oceani. L'apparecchio anche simulato evaporazione e precipitazione mediante l'utilizzo di un mantello riscaldante e di un condensatore, rispettivamente. I dettagli specifici circa l'apparato Miller utilizzato può essere trovato altrove 4. Dopo una settimana di scintille, il contenuto del pallone erano visibilmente trasformati. L'acqua trasformato una torbida, colore rossastro 5 e il materiale giallo-marrone accumulata sugli elettrodi 4. Questo lavoro pionieristico è considerato il primo intenzionale, efficace sintesi di biomolecole in condizioni simulate primitive della Terra. 
Figura 1. Confronto tra i due tipi di apparecchi descritti in questo documento. Apparecchiatura classico utilizzato per l'esperimento originale Miller-Urey (A) e l'apparato semplificato utilizzato nel protocollo qui descritto (B). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Dopo la pubblicazione di 1953 risultati classico esperimento di Miller, numerose varianti dell'esperimento scintilla di scarico, ad esempio utilizzando altre miscele di gas, sono stati eseguiti per esplorare la plausibilità di produrre composti organici importanti per la vita sotto una varietà di possibili condizioni iniziali Terra. Ad esempio, un CH 4 2 O / NH 3 / H 2 S miscela di gas è stato testato per la sua capacità di produrre gli acidi α-ammino contenenti zolfo codificati, anche se questi non sono stati rilevati 6. Cromatografia-spettrometria di massa di gas (GC-MS) analisi di un CH 4 / NH 3 miscela sottoposta ad una scarica elettrica ha mostrato la sintesi di α-aminonitriles, che sono precursori di acido ammino 7. Nel 1972, utilizzando un apparecchio semplice, introdotto da Oró 8 (Figura 1B), Miller e colleghi hanno dimostrato la sintesi di tutti gli acidi α-amminoacidi codificati 9 e amminoacidi non proteici 10 che erano stati identificati nel meteorite Murchison ad oggi, sottoponendo CH 4, N 2, e piccole quantità di NH 3 ad una scarica elettrica. In seguito, utilizzando lo stesso disegno sperimentale semplificato, miscele di gas contenenti H 2 O, N 2 e CH 4, CO 2, CO o sono stati scatenato per studentidy la resa di acido cianidrico, formaldeide, e amminoacidi in funzione dello stato di ossidazione di specie carbonio atmosferico 11.
Oltre all'esplorazione di disegni sperimentali alternativi nel corso degli anni, si sono verificati significativi progressi analitici dal classico esperimento di Miller, che ha recentemente aiutato indagini più di sondaggio di scarica elettrica campioni sperimentali archiviati da Miller, che sarebbe stato facilitato dalle tecniche Miller ha avuto accesso ad nel 1950. L'esperimento di Miller vulcanica 12, prima riportato nel 1955 4, e del 1958 H 2 S-contenenti esperimento 13 hanno mostrato di avere formato una varietà più ampia e maggiori abbondanze, di numerosi amminoacidi e ammine rispetto al classico esperimento, compresi molti dei quali che non erano stati precedentemente identificato in esperimenti di scarico scintilla.
L'esperimento descritto in questo documento può essere condotta utilizzandouna varietà di miscele di gas. Tipicamente, per lo meno, tali esperimenti contenere un gas C-cuscinetto, un gas N-cuscinetto, e acqua. Con una pianificazione, quasi qualsiasi miscela di gas può essere esplorato, tuttavia, è importante considerare alcuni aspetti chimici del sistema. Ad esempio, il pH della fase acquosa può avere un impatto significativo sulla chimica che avviene lì 14.
Il metodo qui descritto è stato adattato per istruire i ricercatori come condurre esperimenti di scarico scintilla che ricordano l'esperimento di Miller-Urey usando un recipiente di reazione 3 L semplificata, come descritto di Miller 1972 pubblicazioni 9,10. Da questo esperimento comporta un arco elettrico ad alta tensione che agisce sul gas infiammabili, è fondamentale per rimuovere O 2 dal pallone di reazione per eliminare il rischio di esplosione, che può verificarsi nella combustione di ridotte gas contenente carbonio quali metano o monossido di carbonio, o la reazione of H 2 con ossigeno.
Ci sono ulteriori dettagli che dovrebbero essere tenuti a mente quando si prepara a condurre l'esperimento discusso qui. In primo luogo, quando si lavora con le linee di vuoto di vetro e gas sotto pressione, esiste il pericolo insito sia di implosione e sovra-pressioni. Pertanto, occhiali di sicurezza devono essere indossati in ogni momento. Secondo luogo, l'esperimento è tipicamente effettuato a meno di pressione atmosferica. Ciò minimizza il rischio di sovra-pressione del collettore e pallone di reazione. Cristalleria può essere valutato pari o superiore alla pressione atmosferica, tuttavia, pressioni superiori a 1 atm non sono raccomandati. Pressioni possono aumentare in questi esperimenti come insolubile in acqua H 2 è liberato dai gas ridotte (come CH 4 e NH 3). Over-pressione può portare a perdite di tenuta, che può permettere O 2 atmosferico per entrare nel recipiente di reazione, rendendo possibile indurre combustione, con conseguente esplosione. In terzo luogo,occorre ricordare che la modifica di questo protocollo per condurre variazioni del esperimento richiede un'attenta pianificazione per garantire condizioni sicure non vengono creati. In quarto luogo, si raccomanda vivamente che il futuro sperimentatore leggere attraverso l'intero protocollo di cura più volte prima di tentare questo esperimento per essere sicuro che lui o lei ha familiarità con potenziali insidie e che tutto l'hardware necessario è disponibile e in atto. Infine, gli esperimenti che effettuano coinvolgono gas combustibili prevedono il rispetto di salute ambientale e sicurezza le linee guida dipartimentali dell'istituzione ospitante dello sperimentatore. Osservare queste raccomandazioni prima di procedere con eventuali esperimenti. Tutti i passi descritti nel protocollo qui sono in conformità con le linee guida di accoglienza Salute ambientali e di sicurezza istituzionali degli autori.
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Protocol
1. Impostazione di un sistema collettore / vuoto
- Utilizzare un collettore di vetro per introdurre gas nel pallone di reazione. Questo collettore può essere acquistato o costruito da un impianto di soffiatura del vetro, ma deve includere porte a tenuta di vuoto che possono essere collegati ad un sistema di aspirazione, bombole di gas, un vacuometro, e il recipiente di reazione.
- Utilizzare giunti a smeriglio e spine di vetro con valvole sul collettore. Assicurarsi che tutti gli O-ring sui tappi sono in grado di fare le guarnizioni necessarie. Se si utilizza giunti in vetro, una quantità sufficiente di grasso per vuoto può essere applicato per rendere una guarnizione, se necessario. Grasso per vuoto silicio può essere utilizzato per evitare la potenziale contaminazione organica.
- Utilizzare rubinetti di vetro sul collettore. Applicare la quantità minima di grasso per vuoto necessario fare un sigillo.
- Misurare il volume del collettore. Questo volume viene utilizzato per i calcoli relativi a pressioni del gas finali nel pallone di reazione 3 L e dovrebbe essere noto il più precisamente possibile. A meno che il collettore ha abbastanza connessioni per ospitare le bombole del gas contemporaneamente, collegare un cilindro alla volta al collettore. Includere in tale contesto, un rubinetto che consente il collettore sia isolato dall'atmosfera ambiente.
- Utilizzare adeguati, puliti, inerte, e chimica e perdite tubi resistenti e raccordi per vuoto ultratorr per collegare le bombole di gas al collettore. Raccordi Ultratorr, dove è utilizzato, devono essere finger-serrati.
- Collegare al collettore, una pompa a vuoto in grado di stabilire un vuoto di <1 mmHg. Lo scarico pompa a vuoto deve essere situata all'interno della cappa, o adeguatamente ventilato con altri mezzi.
- Per garantire un rapido raggiungimento del vuoto e per proteggere la pompa, inserire una trappola tra il collettore e la pompa del vuoto. Un azoto antischiacciamento liquido è raccomandato poiché impedisce volatili quali NH 3, CO 2 e H 2 O di entrare nella pompa. Si deve prestare attenzione, come volatili intrappolati, su warming, può sovrapressioni il collettore e provocare la rottura del vetro.
- Collegare al collettore, di un manometro o di altro calibro vuoto in grado di risoluzione di 1 mmHg o superiore. Mentre i vari dispositivi possono essere utilizzati, un manometro a mercurio, o calibro MacLeod, è preferibile in quanto il mercurio è abbastanza reattivo.
- Misurare e registrare la temperatura ambiente con un termometro adatto.
2. Preparazione del pallone di reazione
- Riscaldare la vetreria a 500 ° C per almeno 3 ore in aria prima dell'uso, per rimuovere contaminanti organici.
- Pulire gli elettrodi di tungsteno lavando delicatamente con salviette di laboratorio pulite e metanolo, ed essiccazione in aria.
- Versare 200 ml di acqua ultrapura (18,2 mW cm, <5 ppb TOC) nel pallone di reazione 3 L.
- Introdurre un ancoretta magnetica predepurata e sterilizzati, che garantirà un rapido scioglimento dei gas solubili e la miscelazione dei reagenti durante la experiment.
- Attaccare gli elettrodi di tungsteno al pallone di reazione 3 L utilizzando una quantità minima di grasso per vuoto, con punte separate da circa 1 cm all'interno della muffola. Fissare con clips.
- Inserire un adattatore di rubinetto incorporato nel collo del pallone di reazione 3 L e fissare con una clip.
- Collegare il pallone di reazione 3 L al collettore gas tramite l'adattatore. Utilizzare una clip o morsetto per proteggere il pallone.
- Ungere leggermente tutte le connessioni per garantire una buona tenuta di vuoto.
- Aprire tutte le valvole e rubinetti sul collettore, ad eccezione di Valve 6 e Stopcock 1 (figura 4), e accendere la pompa del vuoto per evacuare il collettore. Una volta che una misura del vuoto stabile di <1 mmHg è stata raggiunta, chiudere la valvola 1 e lasciare il collettore a sedere per ~ 15 minuti per controllare eventuali perdite di vuoto. Se non vengono rilevati, passare al punto 2.8. In caso contrario, risolvere i vari collegamenti fino a quando le perdite possono essere identificati e risolti.
- Lapply agitazione magnetica al recipiente di reazione. Aprire la valvola 1 e Stopcock 1 (figura 4) per evacuare spazio di testa del pallone di reazione 3 L finché la pressione ha raggiunto <1 mmHg.
- Chiudere la valvola 1 (figura 4) e monitorare la pressione all'interno del pallone di reazione 3 L. La pressione misurata dovrebbe aumentare la pressione di vapore d'acqua. Per garantire che non vi siano perdite, attendere ~ 5 min in questa fase. Se la pressione (come letto sul manometro) aumenta mentre la valvola 1 è chiusa durante questa fase, controllare eventuali perdite in Stopcock 1 e le varie connessioni pallone di reazione. Se non viene trovata alcuna perdita, procedere al passaggio successivo.
3. Introduzione di gassoso NH 3
- Calcolare la pressione necessaria di NH 3 gassosa introdurre nel collettore tale che 200 mmHg di NH 3 saranno introdotti nel pallone di reazione. I dettagli su come eseguire questa operazione sono fornite nella sezione di discussione.
- Chiudere le valvole1 e 6, e Stopcock 1 (figura 4) prima di introdurre del gas nel collettore. Lasciare le altre valvole e rubinetto aperto.
- Introdurre NH 3 nel collettore fino al raggiungimento di una pressione (circa 10 mmHg) e poi evacuare il collettore ad una pressione di <1 mmHg aprendo la valvola 1 (figura 4). Ripetere 3x.
- Introdurre NH 3 nel collettore raggiunge la pressione determinata nella fase 3.1.
- Aprire il rubinetto 1 (figura 4) introdurre 200 mmHg di NH 3 nel pallone di reazione 3 L. Il NH 3 si dissolve in acqua nel pallone di reazione e la pressione cadrà lentamente.
- Una volta che la pressione si ferma cadere, vicino Stopcock 1 (figura 4) e registrare la pressione letta dal manometro. Questo valore rappresenta la pressione all'interno del pallone e verrà utilizzata per calcolare le pressioni di altri gas che saranno introdotte nel collettore tardi.
- Chiudere la valvola 2 (Figura 4) e scollegare il cilindro NH 3 gas dal collettore.
4. Introduzione di CH 4
- Calcolare la pressione necessaria di CH 4 siano introdotti nel collettore tale che 200 mmHg di CH 4 saranno introdotti nel pallone di reazione 3 L. Calcoli di esempio sono riportati nella sezione discussione.
- Collegare il cilindro CH 4 gas al collettore.
- Aprire tutte le valvole ei rubinetti, tranne valvola 6 e Stopcock 1 (figura 4), e svuotare il raccordo ad una pressione di <1 mmHg.
- Chiusura Valvola 1 una volta che il collettore è stato evacuato (Figura 4).
- Introdurre CH 4 nel collettore fino ad ottenere una piccola pressione (circa 10 mmHg). Questo elimina la linea di eventuali gas contaminanti from precedenti passaggi. Aprire la valvola 1 (figura 4) per svuotare il raccordo a <1 mmHg. Ripetere più 2x.
- Introdurre CH 4 nel collettore finché la pressione calcolata al punto 4.1, è raggiunto.
- Aprire il rubinetto 1 (figura 4) introdurre 200 mmHg di CH 4 nel pallone di reazione 3 L.
- Chiudere il rubinetto 1 volta la pressione prevista di CH 4 è stato introdotto nel pallone di reazione 3 L (Figura 4) e registrare la pressione misurata dal manometro.
- Aprire la valvola 1 (figura 4) per svuotare il raccordo a <1 mmHg.
- Chiudere la valvola 2 (figura 4) e scollegare il CH 4 cilindri dal collettore.
5. Introduzione di altri gas (ad esempio N 2)
- A questo punto, non è necessario introdurre gas in questione. Tuttavia, se desiderato, si consiglia di aggiungere 100 mmHg di N 2. In questo caso, calcolare la pressione necessaria di N 2 ad essere introdotti nel collettore tale che 100 mmHg di N 2 saranno introdotti nel pallone di reazione 3 L. Calcoli di esempio sono riportati nella sezione discussione.
- Collegare il cilindro N 2 gas al collettore.
- Aprire tutte le valvole ei rubinetti, tranne valvola 6 e Stopcock 1 (figura 4), e svuotare il raccordo ad una pressione di <1 mmHg.
- Chiusura Valvola 1 una volta che il collettore è stato evacuato (Figura 4).
- Introdurre N 2 nel collettore fino ad ottenere una piccola pressione (circa 10 mmHg). Aprire la valvola 1 (figura 4) per svuotare il raccordo a <1 mmHg. Ripetere più 2x.
- Introdurre N 2 nel collettore fino a raggiungere la pressione calcolata nel passo 5.1.
- Aprire il rubinetto 1 (figura 4) introdurre 100 mmHg di N 2 nel pallone di reazione.
- Chiudere il rubinetto 1 volta la pressione prevista di N 2 è stato introdotto nel pallone di reazione, (figura 4) e registrare la pressione con manometro.
- Aprire la valvola 1 (figura 4) per svuotare il raccordo a <1 mmHg.
- Chiudere la valvola 2 (Figura 4) e scollegare il cilindro N 2 dal collettore.
6. Inizio dell'esperimento
- Staccare il pallone di reazione dal collettore chiudendo Stopcock 1 e valvola 1 (figura 4) una volta tutti i gas sono stati introdotti nel pallone di reazione, in modo che l'aria ambiente può entrare nel collettore e portare il collettore fino alla pressione ambiente.
- Dopo aver scollegato attentamente il pallone di reazione dal collettore, impostare il matraccio qualche non sarà disturbato (ad esempio all'interno di una cappa vuoto).
- Scollegare la pompa del vuoto e rimuovere con cautela la trappola fredda e permettere ventilazione all'interno di un pienocappa operativa.
- Fissare la bobina Tesla collegato al generatore di alta frequenza scintilla.
- Collegare l'elettrodo di tungsteno opposto a terra elettrica per consentire il passaggio efficiente della corrente elettrica attraverso lo spazio tra i due elettrodi.
- Impostare la tensione di uscita del generatore di scintille a circa 30.000 V, come indicato dai documenti disponibili presso il produttore.
- Prima di iniziare la scintilla, chiudere il battente cappa, per servire come uno schermo di sicurezza tra l'apparecchiatura e il sperimentatore. Girare la bobina di Tesla su per avviare l'esperimento, e consentire scintille proseguire per 2 settimane (o altro periodo desiderato) in 1 ora cicli on / off.
7. End of Experiment
- Interrompere l'esperimento spegnendo la bobina di Tesla.
- Aprire il rubinetto 1 (figura 4) introdurre lentamente aria ambiente nel pallone di reazione e facilitare la rimozione dell'adattatore e gli elettrodi di tungsteno così samples possono essere raccolti. Se lo si desidera, il vuoto può essere utilizzato per evacuare il pallone di reazione dei gas di reazione nocivi.
8. Raccolta campione di liquido
- Usando una pipetta di vetro pirolizzati, rimuovere campioni di liquido dal pallone di reazione, facendo attenzione a minimizzare l'esposizione ai contaminanti, come quelli che potrebbero essere introdotte toccando la pipetta al grasso vuoto o altre superfici non sterili.
- Trasferire il campione ad una plastica sterile o recipiente di vetro. Recipienti di plastica sono meno inclini alla rottura o di rottura sopra lo zero, rispetto ai recipienti di vetro.
- Contenitori dei campioni Seal e conservare in un congelatore in grado di raggiungere temperature di -20 ° C o inferiore, come prodotti insolubili possono impedire la soluzione del campione da congelamento a 0 ° C.
9. Pulizia della Apparato
- Utilizzare laboratorio pulito salviette per rimuovere con attenzione grasso per vuoto dal collo degli apparecchi, la adeguareer e rubinetto, e il vetro che circonda gli elettrodi di tungsteno.
- Pulire accuratamente le superfici stesse descritte nel punto 9.1 con toluene per rimuovere completamente grasso per vuoto organico dalla cristalleria. Se si usa grasso al silicone, il grasso alto vuoto può rimanere sul cristalleria dopo pirolisi, creando problemi futuri, come dettagliato nella sezione di discussione.
- Pulire accuratamente il pallone di reazione con un pennello e le seguenti solventi in ordine: acqua ultrapura (18,2 mW cm, <5 ppb TOC), acqua ultrapura (18,2 mW cm, <5 ppb TOC) con il 5% di detergente pulizia, metanolo, toluene, metanolo, acqua ultrapura (18,2 mW cm, <5 ppb TOC) con il 5% di detergente pulizia, e infine acqua ultrapura (18,2 mW cm, <5 ppb TOC).
- Coprire tutti gli orifizi aperti del pallone di reazione con un foglio di alluminio e avvolgere l'adattatore e dei suoi componenti in alluminio.
- Una volta che tutta la vetreria è stato avvolto in un foglio di alluminio, pyrolyze per almeno 3 ore inaria a 500 ° C.
- Elettrodi delicatamente pulite con metanolo e lasciate asciugare all'aria.
10. Analisi dei campioni
Nota: Nel preparare campioni per analisi, l'uso di un protocollo idrolisi acida come è stato descritto in dettaglio altrove 15, è utile per ottenere più aminoacidi. Idrolisi di una porzione del campione recuperato offre l'opportunità di analizzare sia aminoacidi liberi così come i loro precursori di acido-labile che vengono sintetizzati in condizioni abiotici.
- Per l'analisi degli aminoacidi, utilizzare una tecnica adatta (ad esempio cromatografia liquida e metodi basati spettrometria di massa, o con altri metodi appropriati). Tali tecniche analitiche includono cromatografia liquida ad alta prestazione con rivelazione a fluorescenza (HPLC-FD) 14, e ultra cromatografia liquida ad un rivelatore a fluorescenza in parallelo con la spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray tempo di volo positivo (UHPLC-FD/ToF-MS) 12,13. Questo manoscritto descrive le analisi con spettrometria di massa analisi tramite uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo (QQQ-MS), in combinato disposto con l'HPLC-FD.
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Representative Results
I prodotti sintetizzati in esperimenti scarica elettrica possono essere complessi, e ci sono numerosi approcci analitici che possono essere utilizzati per studiare loro. Alcune delle tecniche più comunemente utilizzate in letteratura per l'analisi di aminoacidi sono discussi qui. Metodi cromatografici e di spettrometria di massa sono tecniche altamente informativi per analizzare le miscele chimiche complesse prodotte dal tipo di Miller-Urey esperimenti di scarico scintilla. Amminoacido analisi può essere condotta utilizzando o -phthaldialdehyde/N-acetyl-L-cysteine (OPA / NAC) 16, una coppia reagente chirale che tag gruppi amminici primari, ottenendo derivati diastereoisomero fluorescenti che possono essere separati in una fase stazionaria achirale. Figura 2 mostra un cromatogramma di uno standard OPA / amminoacido NAC derivatizzato ottenuto mediante HPLC accoppiata alla fluorescenza rilevamento e qqq-MS. Gli aminoacidi contenuti nello standard comprendono quelli tipicamente prodotti in Miller-Urey dis tipo di accensionecaricare esperimenti. Le identità di questi amminoacidi sono elencati nella Tabella 1. Rappresentativi tracce di fluorescenza di un campione tipico e bianco analitica sono mostrati in Figura 3, dimostrando la complessità molecolare di tipo Miller-Urey campioni a scarica elettrica. Il cromatogramma di esempio in figura 3 è stato prodotto da un esperimento scintilla di scarico in base alle seguenti condizioni iniziali: 300 mmHg di CH 4, 250 mmHg di NH 3, e 250 ml di acqua.
Figura 2. Il min regione dei cromatogrammi HPLC-FD/QqQ-MS prodotte dall'analisi di uno standard amminoacido OPA / NAC-derivatizzato 3-21. Identità picco aminoacidi sono elencati nella Tabella 1. La traccia fluorescenza è mostrato in basso e le corrispondenti mas estrattis cromatogrammi sono indicati sopra. La ionizzazione elettrospray (ESI) qqq-MS è stato operato in modo positivo e monitorato una serie di massa di 50-500 m / z. Le impostazioni ESI sono: gas desolvatazione (N 2) Temperatura: 350 ° C, 650 L / h, la tensione capillare: 3,8 kV, tensione di cono: 30 V. I picchi senza etichetta nel 367 estratto cromatogramma ionico sono i 13 C 2 picchi da 365 estratto cromatogramma ionico, come risultato della naturale abbondanza circa l'1% dei 13 C. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
| Picco | Amino Acid |
| 1 | L'acido D-aspartico |
| 2 | Acido L-aspartico |
| 3 | Acido L-glutammico |
| 4 | L'acido D-glutammico |
| 5 | D-serina |
| 6 | L-serina |
| 7 | Glycine |
| 8 | b-alanina |
| 9 | D-alanina |
| 10 | g-ammino-n-butirrico (g-ABA) |
| 11 | L-alanina |
| Db-ammino-n-butirrico (Db-ABA) | |
| 13 | un aminoisobutyric acido (a-AIB) |
| 14 | Lb-ammino-n-butirrico (Lb-ABA) |
| 15 | D / La-ammino-n-butirrico (D / La-ABA) |
| 16 | D-isovaline |
| 17 | L-isovaline |
| 18 | L-valina |
| 19 | e-ammino-n-caproico acido (EACA) |
| 20 | D-valina |
| D-isoleucina | |
| 22 | L-isoleucina |
| 23 | D / L-leucina |
Tabella 1. Identità di picco per gli amminoacidi identificati nella norma e che sono tipicamente prodotte in Tipo di Miller-Urey esperimenti di scarico scintilla.
Figura 3. Il min regione del rappresentante cromatogrammi HPLC-FD di tipo Miller-Urey esperimenti scarica scintilla 3-21. Peaks sono stati identificati e quantificata con tempo di ritenzione e l'analisi di massa di composti target rispetto ad un bianco standard ed analitica. Tutti obiettivo ana Lytes con tempi di ritenzione che coeluiscono fluorescenza può essere separato e quantificato utilizzando la spettrometria di massa, tranne α-AIB e L-β-ABA (picchi 13 e 14), e D / L-norleucina, che coelutes con D / L-leucina (picco 23), nelle condizioni cromatografiche utilizzate. D / L-norleucina stato aggiunto come standard interno per campioni e spazi analitici durante la loro preparazione. Separazione amminoacido è stato realizzato utilizzando 4,6 mm x 250 mm, 5 granulometria micron colonna fenil-esile HPLC. La fase mobile era costituita da: A) acqua ultrapura (18,2 mW cm, <5 ppb TOC), B) metanolo, e C) 50 mM di formiato di ammonio con 8% di metanolo, a pH 8. Il gradiente utilizzato è stato: 0-5 min, 100% C, 5-15 min, 0-83% A, B 0-12%, 100-5% C, 15-22 min, 83-75% A, 12 - 20% di B, 5% C, 22-35 min, 75-35% A, B 20-60%, 5% C, 35-37 min, 35-0% A, B 60-100%, 5-0% C; 37-45 min, 100% B; 45-46 min, 100-0% B, 0-100% C 46-55 min, 100% C. La portata era di 1 ml / min.hres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
Numerosi passi nel protocollo qui descritto sono fondamentali per lo svolgimento di Miller-Urey tipo di esperimenti in modo sicuro e corretto. In primo luogo, tutti gli strumenti di vetro e di manipolazione dei campioni che entrano a contatto con il pallone di reazione o campione devono essere sterilizzati. La sterilizzazione si ottiene sciacquarle accuratamente i prodotti in questione con acqua ultrapura (18,2 mW cm, <5 ppb TOC) e poi avvolgendoli in carta stagnola, prima di pirolisi a 500 ° C in aria per almeno 3 ore. Una volta che l'apparecchio è stato pirolizzati e durante la preparazione dei campioni per l'analisi, la cura deve essere presa per evitare la contaminazione organica. Il rischio di contaminazione può essere ridotta indossando guanti di nitrile, un camice da laboratorio e occhiali protettivi. Essere sicuri di lavorare con campioni lontano dal proprio corpo come fonti comuni di contaminazione sono impronte digitali, pelle, capelli e respiro esalato. Evitare il contatto con i guanti bagnati e non utilizzare in lattice o materiale Nylon. In secondo luogo, degasaggio approfondita di tegli pallone di reazione prima dell'aggiunta gas nel pallone di reazione è critica. La presenza di quantità anche minime di ossigeno molecolare nel pallone di reazione costituisce un rischio di esplosione quando la scintilla si scarica in gas infiammabili come CH 4. Mentre degasaggio il pallone, l'acqua all'interno del matraccio bollirà, che impedirà una lettura stabile. A questo punto ci sono due opzioni: 1) degassarla il pallone con cicli di gelo-disgelo (in genere 3 sono utilizzati), o 2) degassarla semplicemente la soluzione liquida. In quest'ultimo caso, acqua sarà persa, tuttavia, la quantità sarà relativamente minore rispetto al volume rimanente. In terzo luogo, una configurazione ben attrezzato ed efficiente deve essere attentamente costruita per stabilire una scintilla coerente tra gli elettrodi in tutta l'interezza dell'esperimento. Bobine BD-50E Tesla non sono progettati per il funzionamento prolungato, in quanto sono destinati per il rilevamento di perdite di vuoto. Raffreddamento intermittente della bobina di Tesla è quindi consigliato per esteso vita operativa. Cie sono diversi modi di raggiungere questo obiettivo. Un modo semplice è quello di collegare un timer in linea tra il tester scintilla e la sua alimentazione e programmare il timer in modo che si alterna in 1 ora cicli on / off. Raffreddamento della bobina di Tesla con un ventilatore commerciale può anche essere necessario prolungare la vita della bobina Tesla. La punta bobina di Tesla dovrebbe essere in contatto o quasi a toccare uno degli elettrodi di tungsteno; una distanza tra i due di circa 1 mm o meno. Inoltre, una scarica intensa può essere ottenuto utilizzando una lunghezza di filo metallico conduttore con un anello in un'estremità drappeggiato leggermente sopra l'elettrodo opposto a quello di toccare la bobina di Tesla per evitare la rottura del sigillo al contenuto. Si raccomanda inoltre di avere un secondo generatore disponibili scintilla nel caso dello scintillatore primario fallisce a causa di un uso prolungato.
Ci sono molte note aggiuntive vale la pena tenere a mente quando svolgimento delle varie fasi del protocollo descritto qui. Nel preparare il sistema collettore per unn esperimento e utilizzando un manometro a mercurio, è generalmente riconosciuto che una precisione di 1 mmHg è la migliore ottenibile, a causa della risoluzione dell'occhio umano. Alcuni gas possono presentare problemi di conducibilità con calibri a base di resistenza. Manometri a mercurio presenti potenziali pericoli di fuoriuscita, che dovrebbero essere preparate in anticipo.
Durante il montaggio del pallone di reazione 3 L, l'uso di grasso per vuoto silicio può mitigare il potenziale contaminazione organica, ma la cura deve essere presa per rimuovere questo fondo tra le piste. In caso contrario si comporterà l'accumulo di depositi di silice durante la pirolisi ad alta temperatura, che può interferire con guarnizioni vuoto. Inoltre, gli elettrodi di tungsteno sono disponibili in commercio, come il 2% di tungsteno torio e devono essere temperati nella metà di tutto l'raccordi di vetro smerigliato. Non pyrolyze elettrodi di tungsteno vetro-montato in un forno. I coefficienti di espansione termica di tungsteno e vetro sono diversi e heating superiore a 100 ° C può indebolire la guarnizione attorno agli elettrodi ricotti vetro e introdurre perdite nel sistema. Inoltre, l'acqua ultrapura può essere introdotto nel pallone di reazione 3 L versando, facendo attenzione ad evitare il contatto con il grasso sulla porta utilizzata, o pipettando, utilizzando una pipetta di vetro prepyrolyzed. La fase acquosa nel pallone di reazione può essere tamponata, se desiderato. Ad esempio, Miller e colleghi 9 tamponata la soluzione a pH ~ 8,7 con un tampone 4 Cl NH 3 / NH. Per fare questo la fase acquosa è costituita 0,05 M in NH 4 Cl prima di introdurlo nel pallone di reazione. NH 4 Cl del 99,5% di purezza, o maggiore, dovrebbe essere usato. Il resto del NH 3 viene quindi aggiunta al recipiente di reazione come gas.
In preparazione per l'introduzione del gas nel pallone di reazione 3 L, il pallone può essere fissato sul collettore mettendo il pallone su un anello di sughero, in cima a un jack laboratorio e sollevando delicatamente il gruppo pallone fino aè realizzato il collegamento comodo. Durante il controllo di perdite, vale la pena notare che probabili fonti di perdite sono tenute poveri presso le giunzioni dei giunti a metà turno di vetro smerigliato, che fissano gli elettrodi di tungsteno al pallone di reazione, e il rubinetto dell'adattatore attaccato al collo di pallone di reazione 3 L. Se vengono rilevate perdite da queste fonti, rimuovere con cautela il pallone di reazione 3 L dal collettore, pulire queste aree con il tessuto laboratorio pulito, riapplicare un nuovo strato di grasso per vuoto e riattaccare il pallone al collettore per la ricerca di perdite. Se non vengono trovati perdite, procedere ad introdurre gas nel pallone di reazione.
Mentre l'introduzione di gas nell'apparecchiatura, bombole di gas devono essere fissati saldamente ad un supporto. Si deve prestare attenzione a introdurre gas lentamente. Le valvole delle bombole di gas devono essere aperte lentamente e con attenzione, monitorando il manometro per evitare un eccesso di pressioni di vetro e di accessori. E 'importante notare that mentre l'aggiunta di NH 3 nel pallone di reazione, perché NH 3 è sensibilmente solubile in acqua inferiore al pK a di NH 4 + (~ 9.2), essenzialmente tutta l'NH 3 gas introdotto nel collettore dissolverà nella fase acquosa, rendendo la pressione finale nel pallone e collettore come la tensione di vapore dell'acqua alla temperatura ambiente. Una volta che questa pressione viene raggiunto, si può assumere il trasferimento è stato completato. I seguenti sono esempi dei calcoli che devono essere eseguite al fine di introdurre proprio gas nel pallone di reazione alle loro pressioni desiderate:
Introduzione di gassoso NH 3
A causa della solubilità di NH 3, essenzialmente tutta trasferirà dal collettore al pallone di reazione e sciogliere nella fase acquosa finché il NH 3 nel collettore è ad una pressione superiore alla pressione di vapore dell'acqua nella reazionepallone. Pertanto, la temperatura dovrebbe essere notato e la tensione di vapore di acqua a quella temperatura deve essere fatto riferimento prima di introdurre NH 3 nel collettore. La pressione target di NH 3 siano introdotti nel pallone di reazione deve essere uguale alla pressione bersaglio di NH 3 nel pallone di reazione 3 L, più la pressione di vapore dell'acqua nel pallone di reazione, alla temperatura ambiente registrata. Ad esempio, a 25 ° C, la pressione di vapore di acqua è di circa 24 mmHg. Pertanto, al fine di introdurre 200 mmHg di NH 3 nel pallone di reazione, carico circa 225 mmHg di NH 3 nel collettore prima di trasferire NH 3 dal collettore e nel pallone di reazione. Questo si tradurrà in circa 200 mmHg di NH 3 introdotti nel pallone di reazione.
Introduzione di CH 4
Dopo NH 3 addizione e la sua dissoluzione in the fase acquosa, la pressione nello spazio di testa del pallone di reazione sarà uguale alla tensione di vapore dell'acqua a 25 ° C, circa 24 mmHg. Verrà utilizzato il valore, in combinazione con il collettore esempio mostrato in figura 4, per effettuare un calcolo per quanto CH 4 per introdurre nel collettore tale che 200 mmHg di CH 4 saranno introdotti nel pallone di reazione:
P 1 = pressione totale richiesta nell'intera sistema, compreso il pallone di reazione
V 1 = volume totale di tutto il sistema, compreso il pallone di reazione
P 2 = pressione di CH 4 necessario per riempire il collettore volume prima della introduzione nel recipiente di reazione
2 V = volume di collettore utilizzato per l'introduzione del gas
P 3 = pressione già nello spazio di testa del pallone di reazione
3 V = volume del pallone di reazione
V 1 = 3.000 ml + 100 ml + 300 ml + 40 ml + 20 ml + 3.000 ml + 40 ml + 500 ml = 7.000 ml
P 2 = pressione di CH 4 viene calcolata
V 2 = 100 ml + 300 ml + 40 + 20 + 3000 ml + 40 ml + 500 ml = 4.000 ml
P 3 = 24 mmHg di H 2 O
V 3 = 3.000 ml
Introduzione di N 2
Dopo introduzione di CH 4, lo spazio di testa del pallone di reazione è occupato da 200 mmHg di CH 4 e 24 mmHg di H 2 O per un totale di 224 mmHg. Verrà utilizzato questo valore, insieme alle dimensioni del collettore esempio mostrato in Figura 4, per calcolare tegli N 2 pressione che deve essere introdotto nel collettore tale che 100 mmHg di N 2 saranno introdotti nel pallone di reazione:
P 1 = pressione totale richiesta nell'intera sistema, compreso il pallone di reazione
V 1 = volume totale di tutto il sistema, compreso il pallone di reazione
P 2 = pressione di N 2 necessaria per riempire collettore volume prima della introduzione nel recipiente di reazione
2 V = volume di collettore utilizzato per l'introduzione del gas
P 3 = pressione già nello spazio di testa del pallone di reazione
3 V = volume del pallone di reazione
P 1 = 24 mmHg di H 2 O + 200 mmHg di CH 4 + 100 mmHg di N 2 = 324 mmHg
V 1 = 3.000 ml + 100 ml> + 300 ml + 40 ml + 20 ml + 3.000 ml + 40 ml + 500 ml = 7.000 ml
2 = pressione di N 2 viene calcolata
V 2 = 100 ml + 300 ml + 40 ml + 20 ml + 3.000 ml + 40 ml + 500 ml = 4.000 ml
P 3 = 200 mmHg di CH 4 + 24 mmHg di H 2 O = 224 mmHg
V 3 = 3.000 ml
Figura 4. . Sistema collettore / vuoto utilizzato per introdurre gas nel pallone di reazione 3 L Valvole di controllo del flusso di gas sono etichettati come V 1 - V 8, mentre i rubinetti che controllano il flusso di gas sono etichettati come S 1 e S 2. Vale la pena notare che mentre Valvole 1, 2 e 6, e Stopcock 1 sono indicati explicitly nel protocollo, le altre valvole e rubinetto nel collettore mostrato qui sono utili per l'aggiunta o la rimozione di volume (cioè in possesso di palloni) o dal collettore. Ad esempio, quando si introduce gas nel collettore a pressioni relativamente elevate (circa 500 mmHg o superiore), è consigliabile che lo sperimentatore fa uso di tutte le beute spurgo collegati al collettore per aumentare il volume accessibile del collettore e ridurre al minimo il rischio di sovra-pressione del collettore.
Dopo aver iniziato l'esperimento, il sistema deve essere controllato regolarmente per assicurare l'esperimento sta funzionando correttamente. Cose da controllare sono: 1) il generatore di scintilla sta producendo una scintilla, e 2) la scintilla viene generato attraverso gli elettrodi di tungsteno in modo continuo. Se non sono soddisfatte le condizioni di cui sopra, scollegare la bobina di Tesla dalla sua alimentazione e sostituirla con la bobina di Tesla di backup. Nel frattempo, le riparazioni alla bobina di Tesla malfunzionamento possono essere fatte.Spesso, le piastre di contatto all'interno della carcassa del generatore di scintilla possono diventare corrosi da un uso prolungato e devono essere lucidato, o sostituiti.
Al termine dell'esperimento, i gas nella testa-space possono essere irritanti per il sistema respiratorio. Gas nocivi, come acido cianidrico 4 possono essere prodotte dall'esperimento. Se lo sperimentatore non sta raccogliendo campioni di gas per analisi, può essere utile per collegare l'apparecchio ad un aspiratore acqua per evacuare volatili per circa un'ora dopo il completamento della sperimentazione, mentre l'apparecchio rimane nella cappa, prima di raccogliere campioni liquidi . Per motivi di sicurezza, è consigliabile che l'apparecchio si sfiata in una cappa aspirante piena operatività. Raccolta dei campioni deve essere eseguita in una cappa operativo e manipolazione del campione in una HEPA pressione positiva panchina flusso filtrato è raccomandato.
Tra i numerosi tipi di prodotti formati da scarica di scintille exrimentazioni, gli amminoacidi sono di importanza. Gli aminoacidi sono sintetizzati facilmente attraverso la sintesi Strecker 17. La sintesi Strecker di amminoacidi comporta la reazione di aldeidi o chetoni e HCN generate dall'azione di scarica elettrica sui gas introdotto nel recipiente di reazione e che alla dissoluzione nella fase acquosa, può reagire con ammoniaca per formare α-aminonitriles che subiscono idrolisi per produrre amminoacidi. Questo è, naturalmente, ma un meccanismo di sintesi, e altri possono anche operativo, come amminazione diretta dei precursori compreso acrilonitrile invia precursori β-alanina, o idrolisi diretta di peso materiale Tholin simile molecolare più elevato che invia direttamente amminoacidi , by-passando il meccanismo Strecker.
Contaminazione aminoacido dei campioni prodotti da esperimenti Miller-Urey può verificare se le precauzioni di cui in precedenza non sono seguiti esplicitamente. Durante l'analisi del campione, è importante search per segni di contaminazione terrestre, che potrebbe aver avuto origine dalla manipolazione dei campioni o la conservazione del campione. L'uso di OPA / NAC 16 in combinazione con tecniche LC-FD consente la separazione cromatografica di D-e L-enantiomeri di amminoacidi con centri chirali e loro rispettiva, quantificazione individuale. Amminoacidi chirali sintetizzati dall'esperimento dovrebbero essere racemica. Accettabile errore sperimentale durante la sintesi di amminoacidi con centri chirali è generalmente considerata essere circa il 10%. Pertanto chirali rapporti amminoacido D / L suggestivi di arricchimento in un enantiomero di oltre il 10% è una buona metrica per cui per determinare se il campione è stato contaminato.
I metodi qui presentati hanno lo scopo di istruire come condurre un esperimento scintilla di scarico di tipo Miller-Urey, tuttavia, ci sono delle limitazioni alla tecnica qui descritta che dovrebbe essere notato. Primo, il riscaldamento del pallone di reazione 3 L singola (Figura 1B), Si tradurrà in condensazione del vapore acqueo sulle punte degli elettrodi, smorzando la scintilla, e ridurre la generazione di specie radicaliche che guidano gran parte della chimica che ha luogo durante l'esperimento. Inoltre, l'utilizzo di un mantello riscaldante per riscaldare l'apparato non è necessaria per sintetizzare composti organici, come gli amminoacidi. Ciò differisce da esperimento originale di Miller dove ha usato un più complesso, su misura, apparecchi dual pallone (Figura 1A) 5 e riscaldata la fiaschetta nella parte inferiore dell'apparecchio, che aveva acqua in esso (Figura 1A). Riscaldamento l'apparecchio ha aiutato con la circolazione dei materiali di partenza e lo scopo di imitare l'evaporazione in un sistema Terra primordiale. In secondo luogo, il protocollo qui descritto raccomanda un 1 hr a ciclo / off quando si utilizza la bobina Tesla, che raddoppia la quantità di tempo di un esperimento necessario per completare, rispetto agli esperimenti condotti da Miller, mentre scaricata in continuo eleCTricity nel sistema 4. Terzo, come generatori di accensione non sono destinati ad un uso a lungo termine, essi sono soggetti a malfunzionamenti durante l'uso prolungato e devono essere regolarmente mantenuti e talvolta sostituiti da una unità di back-up, se il generatore di scintille primario non riesce nel corso di un esperimento. Infine, il protocollo qui descritto prevede l'utilizzo di rubinetti di vetro, che richiedono grasso alto vuoto per rendere opportune guarnizioni. Se lo si desidera, politetrafluoroetilene (PTFE) rubinetti di arresto possono essere usati per evitare grasso per vuoto. Tuttavia, se l'esame di questi rubinetti per potenziali perdite con un rilevatore di perdite scintilla, essere prudenti per non sovraesporre il PTFE alla scintilla come questo può compromettere l'integrità del PTFE e portare a guarnizioni povero essere fatte da questi rubinetti.
Il significato del metodo qui riportato rispetto alle tecniche esistenti, risiede nella sua semplicità. Si utilizza un pallone a 3 L disponibile in commercio, che è notevolmente meno fragile e più facile da CLEuna tra esperimenti rispetto al disegno originale usato da Miller 5. Poiché l'apparato è meno ingombrante, è abbastanza piccolo per eseguire esperimenti all'interno di una cappa aspirante.
Una volta che la tecnica descritta qui è stato masterizzato, può essere modificato in una varietà di modi per simulare numerosi tipi di ambienti terrestri primitive. Per esempio, miscele di gas più ossidate possono essere usate 14,18,19. Inoltre, utilizzando modifica dell'apparecchio, la fonte di energia può essere modificata, ad esempio, utilizzando uno scarico silenzioso 4, luce ultravioletta 20, simulando sistemi vulcanici 4,12,21, imitando radioattività dalla crosta terrestre 22, e mimando energia prodotta da onde d'urto da impatti meteoritici 23, e anche radiazioni cosmiche 18,19.
Il classico esperimento di Miller-Urey ha dimostrato che gli aminoacidi, importanti mattoni delle proteine biologiche, possono essere sincronizzatethesized utilizzando semplici materiali di partenza in condizioni prebiotiche terrestri simulate. L'eccitazione di molecole gassose da scariche elettriche porta alla produzione di composti organici, tra cui aminoacidi, in tali condizioni. Mentre aminoacidi sono importanti per la biologia contemporanea, l'esperimento di Miller-Urey fornisce solo un possibile meccanismo per la loro sintesi abiotici, e non spiega l'origine della vita, come i processi che danno origine a organismi viventi erano probabilmente più complesso della formazione di semplici molecole organiche.
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Disclosures
Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto congiuntamente dalla NSF e NASA Astrobiology Programma, nell'ambito del Centro NSF per Chimica Evolution, CHE-1004570, e il Centro Goddard di Astrobiologia. ETP desidera ringraziare finanziamento supplementare fornito dal Programma di Biologia Tirocinio NASA Planetary. Gli autori desiderano inoltre ringraziare il dottor Asiri Galhena per il prezioso aiuto nella creazione delle strutture di laboratorio iniziali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Plugs for Manifold | Chemglass | CG-983-01 | |
| High Vacuum Grease | Apiezon | N/A | Type M/N |
| Silicon High Vacuum Grease | Dow Corning | 1597418 | |
| Teflon PFA Tubing | McMaster-Carr | 51805K54 | |
| Ultra-Torr Vacuum Fittings | Swagelok | SS-4-UT-6 | |
| Dry Scroll Vacuum Pump | Edwards | A72401905 | |
| U-Tube Manometer | Alta-Robbins | 100SS | |
| Tungsten Electrodes | Diamond Ground Products | TH2-1/16 | 2% thoriated |
| Methanol | Alfa Aesar | N/A | Ultrapure HPLC Grade |
| Teflon-Coated Magnetic Stir Bar | McMaster-Carr | 5678K127 | |
| Gaseous NH3 | Airgas | AMAHLB | 99.99% purity |
| Gaseous CH4 | Airgas | ME UHP300 | 99.99% purity |
| Gaseous N2 | Airgas | NI UHP300 | 99.999% purity |
| Tesla Coil | Electro-Technic Products | 15001 | Model BD-50E |
| 24 hr Plug-in Basic Timer | General Electric Company | 15119 | |
| Cleaning Detergent | Alconox | 1104 | |
| Toluene | Thermo Fisher Scientific | N/A | Optima Grade |
| Luna Phenyl-Hexyl HPLC Column | Phenomenex | 00G-4257-E0 | Brand: Luna |
| Formic Acid | Sigma-Alrich | F0507 | Used to make 50 mM ammonium formate |
References
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