Summary
El experimento de Miller-Urey fue un estudio pionero en cuanto a la síntesis abiótica de compuestos orgánicos con posible relevancia para los orígenes de la vida. Gases simples se introdujeron en un aparato de vidrio y se sometieron a una descarga eléctrica, simulando los efectos de un rayo en el sistema atmósfera-océano primordial de la Tierra. El experimento se llevó a cabo durante una semana, después de lo cual, se analizaron las muestras tomadas de la misma para los componentes químicos de la vida.
Abstract
En 1953, Stanley Miller reportó la producción de biomoléculas a partir de materiales de partida gaseosos simples, utilizando un aparato construido para simular el sistema atmósfera-océano primordial de la Tierra. Miller introdujo 200 ml de agua, 100 mm Hg de H 2, 200 mm Hg de CH 4, y 200 mmHg de NH 3 en el aparato, después se sometió esta mezcla, bajo reflujo, a una descarga eléctrica durante una semana, mientras que el agua era simultáneamente climatizada. El propósito de este manuscrito es proporcionar al lector un protocolo experimental general que puede ser utilizado para llevar a cabo un tipo de Miller-Urey experimento descarga de chispa, usando un matraz de reacción de 3 L simplificada. Dado que el experimento consiste en exponer los gases inflamables a una descarga eléctrica de alto voltaje, hay que destacar importantes medidas que reducen el riesgo de explosión. Los procedimientos generales descritos en este trabajo se pueden extrapolar a diseñar y llevar a cabo una amplia variedad de experimentos de descarga eléctricas simulando ambientes planetarios primitivos.
Introduction
La naturaleza de los orígenes de la vida en la Tierra sigue siendo una de las cuestiones científicas más inescrutables. En la década de 1920 el biólogo ruso Alexander Oparin y British evolutiva biólogo y genetista John Haldane propusieron el concepto de una "sopa primordial" 1,2, describiendo los océanos terrestres primitivas que contienen compuestos orgánicos que puedan haber facilitado la evolución química. Sin embargo, no fue hasta la década de 1950 cuando los químicos comenzaron a realizar estudios de laboratorio deliberadas dirigidas a la comprensión de cómo las moléculas orgánicas podrían haberse sintetizado a partir de materiales de partida simples en la Tierra primitiva. Uno de los primeros informes con este fin fue la síntesis del ácido fórmico a partir de la irradiación de soluciones acuosas de CO 2 en 1951 3.
En 1952, Stanley Miller, entonces un estudiante graduado en la Universidad de Chicago, Harold Urey acercó haciendo un experimento para evaluar la posibilidad de que los compuestos orgánicosimportante para el origen de la vida pudo haber sido formado abiologically en la Tierra primitiva. El experimento se llevó a cabo utilizando un aparato de vidrio hecha a la medida (Figura 1A) diseñado para simular la Tierra primitiva. El experimento de Miller imitaba un rayo por la acción de una descarga eléctrica en una mezcla de gases que representan a la atmósfera primitiva, en presencia de un depósito de agua en estado líquido, en representación de los océanos primitivos. El aparato también simula la evaporación y la precipitación a través del uso de una manta de calefacción y un condensador, respectivamente. Detalles específicos sobre el aparato de Miller utiliza se pueden encontrar en otros lugares 4. Después de una semana de la formación de chispas, el contenido en el matraz se transforman visiblemente. El agua se volvió un color rojizo turbio 5 y el material de color amarillo-marrón acumulada en los electrodos 4. Este innovador trabajo es considerado como la primera síntesis deliberada y eficiente de biomoléculas en condiciones de la Tierra primitiva simulados. 
Figura 1. La comparación entre los dos tipos de aparatos discutidos en este documento. El aparato clásico usado para el experimento de Miller-Urey original (A) y el aparato simplificado utilizado en el protocolo descrito aquí (B). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Después de la publicación 1953 de los resultados de experimento clásico de Miller, numerosas variaciones del experimento descarga de chispa, por ejemplo el uso de otras mezclas de gases, se llevaron a cabo para explorar la plausibilidad de la producción de compuestos orgánicos importantes para la vida bajo una variedad de condiciones posibles principios de la Tierra. Por ejemplo, un CH 4 2 O / NH 3 / H 2 S mezcla de gas fue probado por su capacidad para producir los ácidos α-amino que contienen azufre codificados, aunque estos no se detectaron 6. Cromatografía de gas-espectrometría de masa (GC-MS) análisis de un CH 4 / NH mezcla 3 se somete a una descarga eléctrica mostró la síntesis de α-aminonitrilos, que se precursores de ácido 7 amino. En 1972, el uso de un aparato sencillo, primero introducido por Oró 8 (Figura 1B), Miller y sus colegas demostraron la síntesis de todos los ácidos α-amino codificados 9 y aminoácidos no proteicos 10 que habían sido identificados en el meteorito Murchison hasta la fecha, sometiendo CH 4, N 2, y pequeñas cantidades de NH 3 a una descarga eléctrica. Más tarde, con este mismo diseño experimental simplificado, mezclas de gases que contienen H 2 O, N 2 y CH 4, CO 2 o CO fueron provocados para estudiantesdy el rendimiento de cianuro de hidrógeno, formaldehído, y aminoácidos como una función del estado de oxidación de las especies de carbono en la atmósfera 11.
Además de la exploración de diseños experimentales alternativos en los últimos años, los avances analíticos significativos han ocurrido desde experimento clásico de Miller, que recientemente ayudó a investigaciones más de sondeo de muestras experimentales de descarga eléctrica archivados por Miller, que se hubiera facilitado por las técnicas Miller tenía acceso a en la década de 1950. El experimento de Miller volcánica 12, por primera vez en 1955 4, y un 1958 de H 2 S que contienen experimento 13 se demostró que han formado una variedad más amplia y mayor abundancia, de numerosos aminoácidos y aminas que el experimento clásico, incluyendo muchos de los cuales que no habían sido identificados previamente en experimentos de descarga de chispa.
El experimento descrito en este documento puede llevarse a cabo utilizandouna variedad de mezclas de gases. Típicamente, por lo menos, tales experimentos contendrán un gas de soporte de C, un gas N-cojinete, y agua. Con un poco de planificación, casi cualquier mezcla de gases puede ser explorado, sin embargo, es importante tener en cuenta algunos aspectos químicos del sistema. Por ejemplo, el pH de la fase acuosa puede tener un impacto significativo en la química que se produce allí 14.
El método descrito aquí se ha adaptado para instruir a los investigadores cómo llevar a cabo experimentos de descarga de chispa que se asemejan al experimento de Miller-Urey usando un recipiente de reacción 3 L simplificada, como se describe en las publicaciones de 1972 Miller 9,10. Desde este experimento consiste en un arco eléctrico de alta tensión que actúa sobre los gases inflamables, es crucial para eliminar O 2 del matraz de reacción para eliminar el riesgo de explosión, que puede ocurrir tras la combustión de los gases que contienen carbono reducidas tales como metano o monóxido de carbono, o o reacciónf H 2 con oxígeno.
Hay detalles adicionales que deben tenerse en cuenta cuando se prepara para realizar el experimento discutido aquí. En primer lugar, cuando el trabajo con líneas de vacío de vidrio y gases a presión, existe el peligro inherente tanto de implosión y el exceso de presionar. Por lo tanto, las gafas de seguridad deben ser usados en todo momento. En segundo lugar, el experimento se realiza típicamente a una presión inferior a la atmosférica. Esto minimiza el riesgo de sobre-presión sobre el colector y matraz de reacción. Cristalería puede estar clasificado en o por encima de la presión atmosférica, sin embargo, no se recomiendan presiones superiores a 1 atm. Las presiones pueden aumentar en estos experimentos como insoluble en agua H 2 se libera de gases reducidos (como el CH 4 y NH 3). El exceso de presionar puede conducir a la fuga por el sello, que puede permitir que la atmósfera de O 2 para entrar en el matraz de reacción, por lo que es posible para inducir la combustión, dando como resultado una explosión. En tercer lugar,hay que tener en cuenta que la modificación de este protocolo para llevar a cabo las variaciones del experimento requiere una planificación cuidadosa para garantizar condiciones de inseguridad no se crean. En cuarto lugar, es muy recomendable que el experimentador prospectivo leer a través de todo el protocolo cuidadosamente varias veces antes de intentar este experimento para asegurarse de que él o ella está familiarizado con los peligros potenciales y que todo el hardware necesario está disponible y en su lugar. Por último, la realización de experimentos que involucran gases combustibles requieren el cumplimiento de Salud y Seguridad Ambiental directrices departamentales de la institución anfitriona del experimentador. Tenga en cuenta estas recomendaciones antes de proceder con cualquier experimento. Todos los pasos que se detallan en el protocolo que aquí están en conformidad con las directrices del centro de acogida de Salud y Seguridad Ambiental de los autores.
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Protocol
1. Configuración de un sistema colector de vacío /
- Utilice un colector de vidrio para introducir los gases en el matraz de reacción. Este colector puede ser comprado o construido por una instalación de soplado de vidrio, pero debe incluir puertos estanca al vacío que se pueden conectar a un sistema de vacío, los cilindros de gas, un manómetro de vacío, y el recipiente de reacción.
- Utilice juntas de vidrio esmerilado y tapones de vidrio con válvulas en el colector. Asegúrese de que todas las juntas tóricas de los tapones son capaces de hacer los sellos necesarios. Si el uso de juntas de vidrio, una cantidad suficiente de grasa de vacío se puede aplicar para ayudar a hacer un sello, si es necesario. Grasa de vacío de silicona se puede utilizar para evitar la contaminación orgánica potencial.
- Utilice las llaves de paso de vidrio en el colector. Aplique la cantidad mínima de grasa de vacío necesario para hacer un sello.
- Mida el volumen del colector. Este volumen será utilizado para cálculos relacionados con presiones de gas finales en el matraz de reacción de 3 L y debe ser conocido con la mayor precisión posible. A menos que el colector tiene suficientes conexiones para dar cabida a todos los cilindros de gas al mismo tiempo, conectar un cilindro a la vez en el bloque. Incluir en esta conexión, un grifo que permite el colector a ser aislado de la atmósfera ambiente.
- Utilice adecuado, limpio e inerte, y química y de fugas de tubos resistentes y accesorios de vacío ultratorr para conectar los cilindros de gas en el bloque. Accesorios Ultratorr, cuando se usen, deben ser apretado con los dedos.
- Conecte al colector, una bomba de vacío capaz de establecer un vacío de <1 mm Hg. El escape de la bomba de vacío debe estar situado dentro de la campana de humos o ventilados adecuadamente por otros medios.
- Para garantizar la rápida consecución de vacío y para proteger la bomba, inserte una trampa entre el colector y la bomba de vacío. Se recomienda un nitrógeno para los dedos de líquido ya que evitará que las sustancias volátiles tales como NH 3, CO 2 y H 2 O en la bomba. Se debe tener cuidado, ya que los volátiles atrapados, al warmando, puede sobrepresión del colector y provocar la rotura del vidrio.
- Conecte al colector, un manómetro u otro indicador de vacío capaz de resolución 1 mmHg o superior. Mientras que varios dispositivos pueden ser utilizados, un manómetro de mercurio, o medidor de MacLeod, es preferible como el mercurio es bastante no reactivo.
- Mida y registre la temperatura ambiente usando un termómetro adecuado.
2. Preparación de matraz de reacción
- Calentar el material de vidrio a 500 ° C durante al menos 3 horas en el aire antes de su uso, para eliminar los contaminantes orgánicos.
- Limpiar los electrodos de tungsteno lavando suavemente con toallitas de laboratorio limpias y metanol, y el secado en el aire.
- Verter 200 ml de agua ultrapura (18,2 MΩ cm, <5 ppb TOC) en el matraz de reacción de 3 l.
- Introducir una barra de agitación magnética prefiltrado y esterilizado, lo que garantizará la rápida disolución de los gases solubles y mezcla de reactivos durante la exexperimento.
- Fije los electrodos de tungsteno a la 3 L matraz de reacción utilizando una cantidad mínima de grasa de vacío, con puntas separadas por aproximadamente 1 cm dentro del matraz. Fijar con clips.
- Inserte un adaptador con una llave de paso integrada en el cuello del matraz de reacción de 3 L y seguro con un clip.
- Una el matraz de reacción de 3 L al colector de gas a través del adaptador. Utilice un clip o una pinza para ayudar a asegurar el matraz.
- Engrase ligeramente todas las conexiones para asegurar un buen sellado al vacío.
- Abra todas las válvulas y llaves de paso del colector, a excepción de la válvula 6 y 1 llave de paso (Figura 4), y encienda la bomba de vacío para evacuar el colector. Una vez que una lectura de vacío estable de <1 mm Hg se ha alcanzado, cerca de la válvula 1 y permitir que el colector se siente durante ~ 15 min para comprobar si hay fugas de vacío. Si no se detecta, vaya al paso 2.8. De lo contrario, solucionar las diferentes conexiones hasta las fugas pueden ser identificados y corregidos.
- Lapply agitación magnética al recipiente de reacción. Abrir la válvula 1 y la llave de paso 1 (Figura 4) para evacuar el espacio superior del frasco de reacción de 3 l hasta que ha alcanzado la presión <1 mmHg.
- Cerrar la válvula 1 (Figura 4) y controlar la presión dentro del matraz de reacción de 3 l. La presión medida debe aumentar a la presión de vapor de agua. Para asegurarse de que no existen fugas, espere ~ 5 min en esta etapa. Si la presión (como se lee en el manómetro) aumenta, mientras que la válvula 1 se cierra durante este paso, compruebe si hay fugas en la llave de paso 1 y las diferentes conexiones del matraz de reacción. Si no se encuentra ninguna fuga, continúe con el siguiente paso.
3. La introducción de NH3 gaseoso
- Calcular la presión necesaria de NH3 gaseoso a introducir en el colector de tal manera que 200 mm Hg de NH 3 se introducen en el matraz de reacción. Los detalles sobre cómo hacer esto se proporcionan en la sección de debate.
- Cierre las válvulas1 y 6, y la llave de paso 1 (Figura 4) antes de introducir cualquier gas en el colector. Deje las otras válvulas y abierta la llave de paso.
- Introducir NH 3 en el colector hasta que se alcanza una pequeña presión (aproximadamente 10 mmHg) y luego evacuar el colector a una presión de <1 mm de Hg mediante la apertura de la válvula 1 (Figura 4). Repita 3 veces.
- Introducir NH 3 en el colector para alcanzar la presión determinada en el paso 3.1.
- Abrir la llave de paso 1 (Figura 4) para introducir 200 mmHg de NH 3 en el matraz de reacción de 3 l. El NH 3 se disolverá en el agua en el matraz de reacción y la presión caerá lentamente.
- Una vez que la presión deja de caer, cerca Llave de paso 1 (Figura 4) y registrar la presión leída por el manómetro. Este valor representa la presión dentro del matraz y se utilizará para calcular las presiones para otros gases que se introducirán en el colector más tarde.
- Cierre la válvula 2 (Figura 4) y desconecte el cilindro de gas NH3 del colector.
4. Introducción de CH 4
- Calcular la presión necesaria de CH 4 a ser introducidos en el colector de tal manera que 200 mm Hg de CH 4 se introducen en el matraz de reacción de 3 l. Ejemplo de cálculos se muestran en la sección de Discusión.
- Conecte el cilindro de CH4 gas al colector.
- Abrir todas las válvulas y llaves de paso, a excepción de la válvula 6 y la llave de paso 1 (Figura 4), y evacuar el colector a una presión de <1 mm de Hg.
- Cerrar la válvula de 1 una vez que el colector ha sido evacuada (Figura 4).
- Introducir CH 4 en el colector hasta que se obtiene una pequeña presión (aproximadamente 10 mmHg). Esto purga la línea de ningún fr gases contaminantesOM pasos anteriores. Abra la válvula 1 (Figura 4) para evacuar el colector de <1 mm Hg. Repita 2x más.
- Introducir CH 4 en el colector hasta que, se alcanza la presión calculada en el paso 4.1.
- Abrir la llave de paso 1 (Figura 4) para introducir 200 mmHg de CH 4 en el matraz de reacción de 3 l.
- Cerrar la llave de paso 1 una vez que la presión prevista de CH 4 se ha introducido en el matraz de reacción de 3 L (Figura 4) y registrar la presión medida por el manómetro.
- Abra la válvula 1 (Figura 4) para evacuar el colector de <1 mm Hg.
- Cierre la válvula 2 (Figura 4) y desconecte el CH 4 cilindros del colector.
5. La introducción de otros gases (por ejemplo, N 2)
- En este punto, no es necesario introducir gases adicionales. Sin embargo, si se desea, se recomienda añadir 100 mm de Hg de N 2. En este caso, el cálculo de la presión necesaria de N 2 a ser introducidos en el colector de tal manera que 100 mm Hg de N 2 se introducen en el matraz de reacción de 3 l. Ejemplo de cálculos se muestran en la sección de Discusión.
- Conecte el cilindro de gas N2 al colector.
- Abrir todas las válvulas y llaves de paso, a excepción de la válvula 6 y la llave de paso 1 (Figura 4), y evacuar el colector a una presión de <1 mm de Hg.
- Cerrar la válvula de 1 una vez que el colector ha sido evacuada (Figura 4).
- Introducir N 2 en el colector hasta que se obtiene una pequeña presión (aproximadamente 10 mmHg). Abra la válvula 1 (Figura 4) para evacuar el colector de <1 mm Hg. Repita 2x más.
- Introducir N 2 en el colector hasta que se alcanza la presión calculada en el paso 5.1.
- Abrir la llave de paso 1 (Figura 4) para introducir 100 mmHg de N 2 en el matraz de reacción.
- Cerrar la llave de paso 1 una vez que la presión prevista de N 2 se ha introducido en el matraz de reacción, (Figura 4) y registrar la presión mediante el manómetro.
- Abra la válvula 1 (Figura 4) para evacuar el colector de <1 mm Hg.
- Cierre la válvula 2 (Figura 4) y desconecte el cilindro N 2 del colector.
6. A partir del experimento
- Separar el matraz de reacción desde el colector mediante el cierre de llave de paso 1 y de la válvula 1 (Figura 4) una vez que todos los gases se han introducido en el matraz de reacción, de manera que el aire ambiente puede entrar en el colector y llevar el colector hasta la presión ambiente.
- Después de desconectar con cuidado el matraz de reacción desde el colector, ajuste el frasco en algún lugar que no se verá afectado (por ejemplo, dentro de una campana de extracción vacío).
- Desconecte la bomba de vacío y retirar con cuidado la trampa fría y dejar ventilar el interior de una completacampana de humos en funcionamiento.
- Fije la bobina de Tesla conectado al generador de chispa de alta frecuencia.
- Conectar el electrodo de tungsteno opuesta a una tierra eléctrica para permitir el paso eficiente de la corriente eléctrica a través de la brecha entre los dos electrodos.
- Ajuste la tensión de salida del generador de chispas de aproximadamente 30.000 V, como se detalla en los documentos disponibles por el fabricante.
- Antes de iniciar la chispa, cerrar la hoja campana de humos, para servir como un escudo de seguridad entre el aparato y el experimentador. Gire la bobina de Tesla en para iniciar el experimento, y permitir la formación de chispas para continuar durante 2 semanas (o cualquier otro período deseado) en 1 hr ciclos de encendido / apagado.
7. Fin del Experimento
- Detenga el experimento desactivando la bobina de Tesla.
- Abrir la llave de paso 1 (Figura 4) para introducir aire ambiente lentamente en el matraz de reacción y facilitar la extracción del adaptador y los electrodos de tungsteno de manera samples se pueden recoger. Si se desea, el vacío se puede utilizar para evacuar el matraz de reacción de los gases de reacción nocivos.
8. Recolección de la muestra líquida
- Usando una pipeta de vidrio pirolizado, extraer muestras de líquido del matraz de reacción, teniendo cuidado de minimizar la exposición a los contaminantes, como las que podrían ser introducidos al tocar la pipeta a la grasa de vacío u otras superficies no estériles.
- Transferir la muestra a un plástico estéril o recipiente de vidrio. Recipientes de plástico son menos propensos a la formación de grietas o romper al congelarse, en comparación con los recipientes de vidrio.
- Contenedores de muestras Seal y almacenar en un congelador capaz de alcanzar temperaturas de -20 ° C o menos, como los productos insolubles pueden evitar que la solución de la muestra de la congelación a 0 ° C.
9. Limpieza de la instalación
- Utilice laboratorio limpio toallitas para quitar cuidadosamente la grasa de vacío desde el cuello del aparato, la adaptaciónER y llave de paso, y el cristal que rodea los electrodos de tungsteno.
- Limpiar a fondo las mismas superficies descritas en el paso 9.1 con tolueno para eliminar completamente la grasa de vacío orgánica de la cristalería. Si se utiliza grasa de silicona, la grasa de alto vacío puede permanecer en el material de vidrio después de la pirólisis, creando problemas en el futuro, como se detalla en la sección de Discusión.
- Limpiar a fondo el matraz de reacción con un cepillo y los disolventes siguientes en orden: agua ultrapura (18,2 MΩ cm, <5 ppb TOC), agua ultrapura (18,2 MΩ cm, <5 ppb TOC) con 5% de detergente de limpieza, metanol, tolueno, metanol, agua ultrapura (18.2 MΩ cm, <5 ppb TOC) con 5% de detergente de limpieza, y por último con agua ultrapura (18.2 MΩ cm, <5 ppb TOC).
- Cubra todos los orificios abiertos del matraz de reacción con papel de aluminio y envolver el adaptador y sus componentes en papel de aluminio.
- Una vez que todo el material de vidrio ha sido envuelto en papel de aluminio, pirolizar durante al menos 3 horas enaire a 500 ° C.
- Electrodos suavemente limpias con metanol y deje que se seque al aire.
10. Análisis de las muestras
Nota: En la preparación de muestras para el análisis, el uso de un protocolo de hidrólisis de ácido tal como se ha descrito en detalle en otra parte 15, es útil para la obtención de más aminoácidos. La hidrólisis de una porción de la muestra recuperada ofrece la oportunidad de analizar tanto los aminoácidos libres, así como sus precursores lábiles en medio ácido que se sintetizan bajo condiciones abióticas.
- Para el análisis de aminoácidos, utilizar una técnica adecuada (tal como cromatografía líquida y métodos basados en espectrometría de masas, u otros métodos apropiados). Tales técnicas de análisis incluyen cromatografía líquida de alto rendimiento con detección de fluorescencia (HPLC-FD) 14, y la cromatografía de líquidos de ultra alta con detección de fluorescencia en paralelo con la espectrometría de masas de ionización por electrospray positivo tiempo-de-vuelo (UHPLC-FD/ToF-MS) 12,13. Este manuscrito describe el análisis de espectrometría de masas usando análisis a través de un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo (QqQ-MS) en conjunción con HPLC-FD.
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Representative Results
Los productos sintetizados en los experimentos de descarga eléctrica puede ser bastante complejo, y hay numerosos enfoques analíticos que se pueden utilizar para estudiar ellos. Algunas de las técnicas más comúnmente utilizadas en la literatura para el análisis de aminoácidos se discuten aquí. Los métodos de espectrometría de masas y cromatográficos son técnicas altamente informativos para analizar las mezclas químicas complejas producidas por tipo de Miller-Urey experimentos de descarga de chispa. Los análisis de aminoácidos puede ser llevado a cabo usando o -phthaldialdehyde/N-acetyl-L-cysteine (OPA / NAC) 16, un par reactivo quiral que etiquetas de grupos amino primarios, produciendo derivados de diastereoisómeros fluorescentes que pueden ser separados en una fase estacionaria aquiral. Figura La figura 2 muestra un cromatograma de un estándar de aminoácido de OPA / derivatizado-NAC obtenida por HPLC acoplado a la detección de fluorescencia y QqQ-MS. Los aminoácidos contenidos en la norma incluyen los que normalmente se produce en Miller-Urey dis tipo de chispacargar experimentos. Las identidades de estos aminoácidos se enumeran en la Tabla 1. Rastros de fluorescencia representativos de una muestra típica en blanco y analíticos se muestran en la Figura 3, lo que demuestra la complejidad molecular de muestras de descarga eléctrica de tipo de Miller-Urey. El cromatograma muestra en la Figura 3 se produce a partir de un experimento de descarga de chispa utilizando las siguientes condiciones de partida: 300 mmHg de CH 4, 250 mmHg de NH 3, y 250 ml de agua.
Figura 2. La región min 3-21 de los cromatogramas HPLC-FD/QqQ-MS producidos a partir del análisis de un estándar de aminoácido derivatizado-NAC de OPA /. Identidades de pico de aminoácidos se enumeran en la Tabla 1. La traza de la fluorescencia se muestra en la parte inferior y los correspondientes mas extraídoss cromatogramas aparecen arriba. La ionización por electrospray (ESI) QqQ-MS se hizo funcionar en modo positivo y se controló un intervalo de masa de 50-500 m / z. La configuración de ESI fueron: gas de desolvatación (N 2) Temperatura: 350 ° C, 650 L / hr; tensión capilar: 3,8 kV; voltaje del cono: 30 V. Los picos marcados en el 367 se extrae cromatograma de iones son los 13 C 2 picos de el 365 se extrae cromatograma de iones, como resultado de la abundancia natural de aproximadamente el 1% del 13 C Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
| Pico | Aminoácido |
| 1 | Ácido D-aspártico |
| 2 | Ácido L-aspártico |
| 3 | Ácido L-glutámico |
| 4 | Ácido D-glutámico |
| 5 | D-serina |
| 6 | L-serina |
| 7 | Glicina |
| 8 | b-alanina |
| 9 | D-alanina |
| 10 | g-amino-n-butírico (g-ABA) |
| 11 | L-alanina |
| Db-amino-n-butírico (DB-ABA) | |
| 13 | un-aminoisobutírico (un-AIB) |
| 14 | Lb-amino-n-butírico (Lb-ABA) |
| 15 | D / La-amino-n-butírico (D / La-ABA) |
| 16 | D-isovalina |
| 17 | L-isovalina |
| 18 | L-valina |
| 19 | e-amino-n-caproico (EACA) |
| 20 | D-valina |
| D-isoleucina | |
| 22 | L-isoleucina |
| 23 | D / L-leucina |
Tabla 1. Identidades de pico para los aminoácidos detectados en la norma y que se suelen producir en tipo Miller-Urey experimentos de descarga de chispa.
Figura 3. La región min 3-21 del HPLC-FD cromatogramas representativos de tipo Miller-Urey experimentos de descarga de chispa. Peaks se identificaron y cuantificaron por el tiempo de retención y análisis de masas de los compuestos de interés en comparación con un estándar en blanco y analítico. Todo objetivo ana electrolitos con tiempos de retención de fluorescencia coeluyentes se puede separar y se cuantificó mediante espectrometría de masas, a excepción de α-AIB y L-β-ABA (picos 13 y 14), y D / L-norleucina, que coeluye con D / L-leucina (pico 23), en las condiciones cromatográficas usadas. D / L-norleucina se añadió como un estándar interno para muestras y blancos analíticos durante la preparación de la muestra. Separación de aminoácidos se consiguió utilizando un 4,6 mm x 250 mm, tamaño de partícula 5 m columna de fenil-hexilo HPLC. La fase móvil se compone de: a) agua ultrapura (18,2 MΩ cm, <5 ppb TOC), formiato de amonio B) metanol, y C) 50 mM con metanol al 8%, a pH 8. El gradiente utilizado fue: 0-5 min, 100% C; 5-15 min, 0-83% A, 0-12% de B, 100-5% C; 15-22 min, 83-75% A, 12 - 20% de B, 5% de C; 22-35 min, 75-35% de A, 20-60% de B, 5% de C; 35-37 min, 35-0% de A, 60-100% de B, 5-0% C; 37-45 min, 100% de B; 45-46 min, 100-0% de B, 0-100% de C 46-55 min, 100% C. La velocidad de flujo fue de 1 ml / min.hres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.
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Discussion
Numerosos pasos en el protocolo descrito aquí son fundamentales para la realización de experimentos de tipo Miller-Urey forma segura y correcta. En primer lugar, todas las herramientas de cristalería y de manipulación de muestras que entrarán en contacto con el matraz de reacción o de la muestra deben ser esterilizados. La esterilización se consigue de aclarar a fondo los artículos en cuestión con agua ultrapura (18,2 MΩ cm, <5 ppb TOC) y luego envolver en papel de aluminio, antes de la pirólisis de a 500 ° C en aire durante al menos 3 h. Una vez que el equipo ha sido pirolizado y mientras se preparan las muestras para el análisis, se debe tener cuidado para evitar la contaminación orgánica. El riesgo de contaminación puede ser minimizado mediante el uso de guantes de nitrilo, una bata de laboratorio y gafas de protección. Asegúrese de trabajar con muestras de distancia de su cuerpo como fuentes comunes de contaminación incluyen las huellas dactilares, la piel, el pelo y el aliento exhalado. Evite el contacto con guantes mojados y no utilice ninguna de látex o materiales de nylon. En segundo lugar la desgasificación, a fondo de tque matraz de reacción antes de la adición de gas en el matraz de reacción es crítico. La presencia de pequeñas cantidades de oxígeno molecular en el matraz de reacción plantea un riesgo de explosión cuando la chispa se descarga en gases inflamables como CH 4. Mientras desgasificar el matraz, el agua en el interior del matraz se hervir, lo que impedirá una lectura estable. En esta etapa hay dos opciones: 1) Degas del matraz a través de los ciclos de congelación-descongelación (por lo general 3 se utilizan), o 2) simplemente desgasificar la solución líquida. En este último caso, se pierde un poco de agua, sin embargo, la cantidad será relativamente menor en comparación con el volumen restante. En tercer lugar, una instalación bien equipada y eficiente debe ser construido cuidadosamente para establecer una chispa consistente a través de los electrodos a lo largo de la totalidad del experimento. Bobinas BD-50E Tesla no están diseñados para el funcionamiento prolongado, ya que están diseñados para la detección de fugas de vacío. Refrigeración intermitente de la bobina de Tesla se recomienda así para toda la vida operativa prolongada. There son múltiples maneras de lograr esto. Una forma sencilla es conectar un temporizador en la línea entre el probador de chispa y su fuente de alimentación y programar el temporizador de manera que se alterna en 1 hora ciclos de encendido / apagado. El enfriamiento de la bobina de Tesla con un ventilador comercial también puede ser necesario prolongar la vida de la bobina de Tesla. La punta de la bobina de Tesla debe estar tocando o casi tocando uno de los electrodos de tungsteno, una distancia entre ambos de aproximadamente 1 mm o menos. Además, una descarga intensa se puede lograr usando una longitud de alambre de metal conductor con un lazo en un extremo cubierto ligeramente sobre el electrodo opuesto al tocar la bobina de Tesla para evitar romper el sello a los contenidos. También se recomienda contar con un segundo generador disponible chispa en caso de que el generador de chispas principal falla debido a un uso prolongado.
Hay muchas notas adicionales por valor teniendo en cuenta al llevar a cabo diversos pasos en el protocolo descrito aquí. Cuando se prepara el sistema colector para unaN experimentar y utilizando un manómetro de mercurio, generalmente se admite que una precisión de 1 mm de Hg es la mejor alcanzable, debido a la resolución del ojo humano. Algunos gases pueden presentar problemas de conductividad con medidores de resistencia en forma. Manómetros de mercurio presentes los posibles riesgos de derrames, que deben prepararse por adelantado.
Mientras que el montaje del matraz de reacción de 3 l, el uso de grasa de vacío de silicio puede mitigar la contaminación orgánica potencial, pero se debe tener cuidado para quitar este fondo entre carreras. De no hacerlo, dará lugar a la acumulación de depósitos de sílice durante la pirólisis de alta temperatura, que puede interferir con los sellos de vacío. Además, los electrodos de tungsteno están disponibles comercialmente como 2% de tungsteno toriado y deben ser recocidas en accesorios de vidrio esmerilado de media caña. No pirolizar los electrodos de tungsteno equipado de vidrio en un horno. Los coeficientes de expansión térmica de tungsteno y el vidrio son diferentes y caleng por encima de 100 ° C puede debilitar el sello alrededor de los electrodos de vidrio recocido e introducir fugas en el sistema. Además, el agua ultrapura se puede introducir en el matraz de reacción 3 L mediante el vertido, teniendo cuidado de evitar el contacto con cualquier grasa en el puerto usado, o por pipeteo, usando una pipeta de vidrio prepyrolyzed. La fase acuosa en el matraz de reacción puede ser tamponada, si se desea. Por ejemplo, Miller y colegas 9 tamponar la solución a pH ~ 8,7 con un tampón de NH 4 3 / NH Cl. Para ello la fase acuosa se hizo 0,05 M en NH4Cl antes de introducir en el matraz de reacción. NH 4 Cl de 99,5% de pureza, o más, se debe utilizar. El resto de la NH 3 se añade a continuación al matraz de reacción como un gas.
En la preparación para la introducción de gas en el matraz de reacción de 3 L, el matraz se puede fijar en el colector, colocando el matraz en un anillo de corcho, ubicado sobre un gato de laboratorio y levantando suavemente el conjunto de frasco hasta que unse logra la conexión ajustada. Al comprobar que no haya fugas, vale la pena señalar que las fuentes probables de fugas incluyen sellos de pobres en las uniones de las juntas de vidrio esmerilado media ronda, que se unen los electrodos de tungsteno al matraz de reacción, y la llave de paso del adaptador conectado al cuello de el matraz de reacción de 3 l. Si se detectan fugas de estas fuentes, retirar con cuidado el matraz de reacción de 3 L del colector, limpie estas áreas con el tejido de laboratorio limpia, vuelva a aplicar una capa fresca de grasa de vacío y vuelva a conectar el matraz al colector para buscar fugas. Si no se encuentran fugas, proceda a introducir los gases en el matraz de reacción.
Si bien la introducción de los gases en el aparato, las botellas de gas deben estar bien sujetos a un soporte. Se debe tener cuidado para introducir los gases lentamente. Las válvulas de los cilindros de gas deben abrirse lentamente y con cuidado mientras se monitorea el manómetro para evitar el exceso de presión sobre el material de vidrio y accesorios incorporados. Es importante tener en cuenta THAt, mientras que la adición de NH 3 en el matraz de reacción, porque NH 3 es apreciablemente soluble en agua inferior al pKa de NH 4 + (~ 9,2), esencialmente todo el gas de NH 3 introducido en el colector se disolverá en la fase acuosa, lo que hace la presión final en el matraz y el colector como la presión de vapor del agua a la temperatura ambiente. Una vez que se alcanza esta presión, se puede suponer la transferencia. Los siguientes son ejemplos de los cálculos que se deben ejecutar con el fin de introducir con precisión los gases en el matraz de reacción a sus presiones deseadas:
La introducción de NH3 gaseoso
Debido a la solubilidad de NH 3, esencialmente todo se transferirá desde el colector al matraz de reacción y se disuelven en la fase acuosa, siempre y cuando el NH 3 en el colector está a una presión mayor que la presión de vapor de agua en la reacciónmatraz. Por lo tanto, la temperatura ambiente debe tenerse en cuenta y la presión de vapor de agua a esa temperatura debe ser referenciado antes de la introducción de NH 3 en el colector. La presión objetivo de NH 3 para ser introducido en el matraz de reacción debe ser igual a la presión objetivo de NH 3 en el matraz de reacción de 3 L, además de la presión de vapor de agua en el matraz de reacción, a la temperatura ambiente registrada. Por ejemplo, a 25 ° C, la presión de vapor de agua es de aproximadamente 24 mm de Hg. Por lo tanto, con el fin de introducir 200 mmHg de NH 3 en el matraz de reacción, la carga de aproximadamente 225 mm de Hg de NH 3 en el colector antes de la transferencia de NH 3 desde el colector y en el matraz de reacción. Esto dará lugar a aproximadamente 200 mm Hg de NH 3 que se introducen en el matraz de reacción.
Introducción de CH 4
Después de NH 3 adición y su disolución en the fase acuosa, la presión en el espacio de cabeza del matraz de reacción será igual a la presión de vapor de agua a 25 ° C, aproximadamente 24 mm de Hg. Se utilizará Este valor, en conjunción con el ejemplo colector mostrado en la Figura 4, para llevar a cabo un cálculo de la cantidad de CH 4 para introducir en el colector de tal manera que 200 mm Hg de CH 4 se introducen en el matraz de reacción:
P 1 = presión total deseada a través de todo el sistema, incluyendo el matraz de reacción
V 1 = volumen total de todo el sistema, incluyendo el matraz de reacción
P = presión de 2 CH 4 necesaria para llenar el volumen de colector antes de la introducción en matraz de reacción
V 2 = volumen de colector utilizado para la introducción de gas
P = presión de 3 ya en el espacio de cabeza del matraz de reacción
V 3 = volumen del matraz de reacción
V 1 = 3000 ml + 100 ml + 300 ml + 40 ml + 20 ml + 3000 ml + 40 ml + 500 ml = 7000 ml
Calculándose P2 = presión de CH 4
V 2 = 100 ml + 300 ml + 40 + 20 + 3000 ml + 40 ml + 500 ml = 4000 ml
P 3 = 24 mmHg de H 2 O
V 3 = 3000 ml
Introducción de N2
Después de la introducción de CH 4, el espacio de cabeza del matraz de reacción está ocupado por 200 mm Hg de CH 4 y 24 mmHg de H2O para un total de 224 mmHg. Se utilizará Este valor, junto con las dimensiones del colector de ejemplo se muestra en la Figura 4, para calcular TN 2 que la presión que necesita ser introducido en el colector de tal manera que 100 mm Hg de N 2 se introducen en el matraz de reacción:
P 1 = presión total deseada a través de todo el sistema, incluyendo el matraz de reacción
V 1 = volumen total de todo el sistema, incluyendo el matraz de reacción
P 2 = presión de N 2 necesario para llenar el volumen de colector antes de la introducción en matraz de reacción
V 2 = volumen de colector utilizado para la introducción de gas
P = presión de 3 ya en el espacio de cabeza del matraz de reacción
V 3 = volumen del matraz de reacción
P 1 = 24 mmHg de H 2 O + 200 mmHg de CH 4 + 100 mmHg de N 2 = 324 mmHg
V 1 = 3000 ml + 100 ml> + 300 ml + 40 ml + 20 ml + 3000 ml + 40 ml + 500 ml = 7000 ml
2 = presión de N 2
V 2 = 100 ml + 300 ml + 40 ml + 20 ml + 3000 ml + 40 ml + 500 ml = 4000 ml
P 3 = 200 mmHg de CH 4 + 24 mmHg de H 2 O = 224 mmHg
V 3 = 3000 ml
Figura 4. . Sistema colector / vacío utilizado para introducir gases en la 3 L matraz de reacción válvulas que controlan el flujo de gas se etiquetan como V 1 - V 8, mientras que las llaves de paso que controlan el flujo de gas se etiquetan como S 1 y S 2. Vale la pena señalar que mientras que las válvulas 1, 2, y 6, y la llave de paso 1 se hace referencia a explicitly en el protocolo, las otras válvulas y llave de paso en el colector que se muestra aquí son útiles para agregar o quitar volumen (es decir, la celebración de frascos) hacia o desde el colector. Por ejemplo, cuando la introducción de los gases en el colector a presiones relativamente altas (aproximadamente 500 mm Hg o mayor), se aconseja que el experimentador hace uso de todos los matraces de purga conectados al colector para aumentar el volumen accesible del colector y ayudar a minimizar el riesgo de un exceso de presión sobre el colector.
Después de iniciar el experimento, el sistema debe ser revisado con regularidad para garantizar el experimento está funcionando correctamente. Se debe comprobar que: 1) el generador de la chispa se produce una chispa, y 2) la chispa que se genera a través de los electrodos de tungsteno de una manera continua. Si no se cumplen las condiciones anteriores, desconecte la bobina de Tesla de su fuente de alimentación y sustituirla por la bobina de Tesla de copia de seguridad. Mientras tanto, se pueden realizar las reparaciones de la bobina de Tesla funcionando mal.Muchas veces, las placas de contacto dentro de la carcasa del generador de chispas pueden corroerse por el uso prolongado y deben ser pulidos, o reemplazado.
Al finalizar el experimento, los gases en el espacio de cabeza pueden ser irritantes para el sistema respiratorio. Gases nocivos, tales como cianuro de hidrógeno 4 pueden ser producidos por el experimento. Si el experimentador no está recogiendo muestras de gas para el análisis, puede ser útil para conectar el aparato a un aspirador de agua para evacuar sustancias volátiles durante aproximadamente una hora después de la finalización del experimento, mientras que el aparato permanece en la campana de humos, antes de la recogida de muestras líquidas . Por razones de seguridad, se recomienda que el aparato se ventila en una campana de humos totalmente operativa. Se recomienda la recolección de la muestra se debe realizar en una campana de humos operativa y manejo de las muestras en un banco de flujo filtrado HEPA de presión positiva.
Entre los numerosos tipos de productos formados por descarga de chispa exexperimentos, los aminoácidos son de importancia. Los aminoácidos se sintetizan fácilmente a través de la síntesis de Strecker 17. La síntesis de Strecker de aminoácidos implica la reacción de aldehídos o cetonas y HCN generados por la acción de la descarga eléctrica en los gases introducidos en el aparato de reacción, que después de disolver en la fase acuosa, puede reaccionar con amoníaco para formar α-aminonitrilos que se someten hidrólisis para producir aminoácidos. Esto es, por supuesto, pero uno de los mecanismos de síntesis, y otros también puede ser operativo, tales como la aminación directa de los precursores incluyendo acrilonitrilo para dar precursores de β-alanina, o la hidrólisis directa de material-Tholin como el peso molecular más alto para dar directamente los aminoácidos , sin pasar por el mecanismo de Strecker.
Contaminación de aminoácidos de las muestras producidas por los experimentos de Miller-Urey puede ocurrir si las precauciones antes mencionadas no se siguen de forma explícita. Durante el análisis de la muestra, es importante search para detectar signos de contaminación terrestre que pueden tener su origen en la manipulación de muestras o el almacenamiento de la muestra. El uso de OPA / NAC 16 en conjunción con técnicas de LC-FD permite la separación cromatográfica de D-y L-enantiómeros de aminoácidos con centros quirales y su respectiva, la cuantificación individual. Aminoácidos quirales sintetizados por el experimento deben ser racémica. Error experimental aceptable durante la síntesis de los aminoácidos con centros quirales se considera generalmente que es aproximadamente 10%. Por lo tanto proporciones de aminoácidos D / L quirales sugestivos de enriquecimiento en un enantiómero en más de un 10% es una buena métrica por el cual para determinar si la muestra ha sido contaminado.
Los métodos presentados aquí están destinados a instruir a cómo llevar a cabo un tipo de experimento de Miller-Urey descarga de chispas, sin embargo, existen limitaciones a la técnica descrita aquí que hay que destacar. En primer lugar, calentar el matraz de reacción 3 L sola (Figura 1B), Dará lugar a la condensación de vapor de agua sobre las puntas de los electrodos, amortiguación de la chispa, y reducir la generación de especies de radicales que impulsan gran parte de la química que tiene lugar dentro del experimento. Además, el uso de una manta de calefacción para calentar el aparato no es necesario sintetizar compuestos orgánicos, tales como aminoácidos. Esto difiere de experimento original de Miller donde utilizó un más complejo, construido a medida, aparatos matraz doble (Figura 1A) 5 y se calienta el matraz pequeño en la parte inferior del aparato, que tenía agua en el mismo (Figura 1A). Calefacción el aparato ayudó con la circulación de los materiales de partida y objetivo para imitar la evaporación en un sistema de la Tierra temprana. En segundo lugar, el protocolo detallado aquí recomienda una hora en el ciclo 1 / apagado cuando se utiliza la bobina de Tesla, que duplica efectivamente la cantidad de tiempo que un experimento se necesita para completar, en comparación con los experimentos llevados a cabo por Miller, como se descarga de forma continua elementoCTricity en el sistema 4. En tercer lugar, como generadores de chispa no están destinados para su uso a largo plazo, que son propensos a un mal funcionamiento durante el uso prolongado, y deben mantenerse con regularidad y a veces sustituidos por una unidad de copia de seguridad, si el generador de chispa principal falla durante el curso de un experimento. Última, el protocolo descrito aquí implica el uso de llaves de paso de vidrio, que requieren grasa de alto vacío para hacer sellos apropiados. Si se desea, politetrafluoroetileno (PTFE) llaves de paso se pueden utilizar para evitar que la grasa de vacío. Sin embargo, si el examen de estas llaves de paso para posibles fugas con un detector de fugas de chispa, ser cautelosos de no sobreexponer el PTFE a la chispa ya que esto puede poner en peligro la integridad del PTFE y dañar las juntas pobres que están realizando estas llaves de paso.
La importancia del método reportado aquí con respecto a las técnicas existentes, se encuentra dentro de su simplicidad. Se utiliza un comercialmente disponible matraz de 3 L, que también es considerablemente menos frágil y más fácil de CLEuna entre los experimentos que el diseño original utilizado por Miller 5. Debido a que el aparato es menos engorroso, que es lo suficientemente pequeño para llevar a cabo un experimento en el interior de una campana de humos.
Una vez que la técnica descrita aquí ha sido dominado, se puede modificar en una variedad de maneras para simular numerosos tipos de ambientes terrestres primitivas. Por ejemplo, las mezclas de gases más oxidados se pueden utilizar 14,18,19. Además, el uso de modificaciones del aparato, la fuente de energía se puede cambiar, por ejemplo, mediante el uso de una descarga silenciosa 4, la luz ultravioleta 20, la simulación de sistemas volcánicas 4,12,21, imitando la radiactividad de la corteza de la Tierra 22, y imitando energía producida por ondas de choque de los impactos de meteoritos 23, así como la radiación cósmica 18,19.
El clásico experimento de Miller-Urey demostró que los aminoácidos, los bloques importantes de proteínas biológicas de construcción, se pueden SYNthesized usando materiales de partida simples bajo condiciones terrestres prebióticas simuladas. La excitación de las moléculas gaseosas por descarga eléctrica conduce a la producción de compuestos orgánicos, incluyendo aminoácidos, bajo tales condiciones. Mientras que los aminoácidos son importantes para la biología contemporánea, el experimento de Miller-Urey sólo proporciona un posible mecanismo para su síntesis abióticas, y no explica el origen de la vida, como los procesos que dan lugar a organismos vivos eran probablemente más complejo que la formación de moléculas orgánicas simples.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta obra fue financiada en forma conjunta por el Programa de Astrobiología de la NASA NSF y, bajo el Centro NSF para la evolución química, CHE-1004570, y el Centro Goddard de Astrobiología. ETP desea agradecer la financiación adicional proporcionada por el Programa de Prácticas de Biología Planetaria de la NASA. Los autores también desean agradecer al Dr. Asiri Galhena de inestimable ayuda en el establecimiento de las instalaciones iniciales de laboratorio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Plugs for Manifold | Chemglass | CG-983-01 | |
| High Vacuum Grease | Apiezon | N/A | Type M/N |
| Silicon High Vacuum Grease | Dow Corning | 1597418 | |
| Teflon PFA Tubing | McMaster-Carr | 51805K54 | |
| Ultra-Torr Vacuum Fittings | Swagelok | SS-4-UT-6 | |
| Dry Scroll Vacuum Pump | Edwards | A72401905 | |
| U-Tube Manometer | Alta-Robbins | 100SS | |
| Tungsten Electrodes | Diamond Ground Products | TH2-1/16 | 2% thoriated |
| Methanol | Alfa Aesar | N/A | Ultrapure HPLC Grade |
| Teflon-Coated Magnetic Stir Bar | McMaster-Carr | 5678K127 | |
| Gaseous NH3 | Airgas | AMAHLB | 99.99% purity |
| Gaseous CH4 | Airgas | ME UHP300 | 99.99% purity |
| Gaseous N2 | Airgas | NI UHP300 | 99.999% purity |
| Tesla Coil | Electro-Technic Products | 15001 | Model BD-50E |
| 24 hr Plug-in Basic Timer | General Electric Company | 15119 | |
| Cleaning Detergent | Alconox | 1104 | |
| Toluene | Thermo Fisher Scientific | N/A | Optima Grade |
| Luna Phenyl-Hexyl HPLC Column | Phenomenex | 00G-4257-E0 | Brand: Luna |
| Formic Acid | Sigma-Alrich | F0507 | Used to make 50 mM ammonium formate |
References
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