Summary
ניסוי מילר יורי היה מחקר החלוצים לגבי סינתזת אביוטי של תרכובות אורגניות עם שייכות אפשרית למקורותיה של חיים. גזים פשוט הוכנסו לתוך מנגנון זכוכית ונתונים לפריקה חשמלית, לדמות את ההשפעה של ברק במערכת אווירת האוקיינוס של כדור הארץ הקדומה. הניסוי נערך במשך שבוע אחד, שלאחריו, הדגימות שנאספו מאותו נותחו לאובניים הבניין הכימי של חיים.
Abstract
ב1953, סטנלי מילר דיווח הייצור של ביומולקולות מחומרי המוצא גזים פשוטים, תוך שימוש במנגנון שנבנה כדי לדמות מערכת אווירת האוקיינוס של כדור הארץ הקדומה. מילר הציג 200 מיליליטר של מים, של H 2 100 מ"מ כספית, 200 מ"מ כספית של CH 4, ו200 מ"מ כספית של NH 3 לתוך המכשיר, ולאחר מכן נתון תערובת זו, תחת רפלוקס, לפריקה חשמלית במשך שבוע, ואילו המים היו בו זמנית מחומם. מטרתו של כתב יד זה היא לספק לקורא פרוטוקול ניסוי כללי שיכול לשמש לעריכת ניסוי ניצוץ פריקה סוג מילר יורי, באמצעות בקבוק תגובת 3 L פשוט. מאז הניסוי כרוך בחשיפה לגזים דליקים פריקה חשמלית במתח גבוה, זה שווה הדגשת צעדים חשובים המפחיתים את הסיכון לפיצוץ. הנהלים הכלליים המתוארים בעבודה זו ניתן להסיק לעצב ולנהל מגוון רחב של ניסוי פריקה חשמליזה לדמות סביבות פלנטרית פרימיטיביות.
Introduction
טבעו של מקור חיים על פני כדור הארץ נשאר אחת השאלות המדעיות הסתומות ביותר. ב1920s הביולוג הרוסי אלכסנדר Oparin ובריטי ביולוג האבולוציוני והגנטיקאי ג'ון Haldane הציעו את הרעיון של "מרק הבראשיתי" 1,2, המתארים את האוקיינוסים היבשתיים הפרימיטיביים המכילים תרכובות אורגניות שעלולות הקלו אבולוציה כימית. עם זאת, זה לא היה עד 1950s, כאשר כימאים החלו לבצע מחקרי מעבדה מכוונים שמטרתה להבין כיצד מולקולות אורגניות יכול היו מסונתז מחומרי המוצא פשוטים בכדור ארץ הצעיר. אחד הדו"חות הראשונים לשם כך היה הסינתזה של חומצה פורמית מההקרנה של 2 פתרונות CO מימיים ב1951 3.
ב1952, סטנלי מילר, אז סטודנט לתואר שני באוניברסיטה של שיקגו, ניגש הרולד יורי על עושה את ניסוי כדי להעריך את האפשרות כי תרכובות אורגניותחשוב למקור של חיים אולי נוצר abiologically בכדור ארץ הצעיר. הניסוי נערך באמצעות מנגנון שהותקן זכוכית (איור 1 א) שנועד לדמות את כדור הארץ הפרימיטיבית. הניסוי של מילר חיקה את הברקים על ידי הפעולה של פריקה חשמלית בתערובת של גזים המייצגים את האווירה מוקדם, בנוכחותו של מאגר מים נוזלי, המייצג את האוקיינוסים מוקדם. המנגנון גם מדומה אידוי ומשקעים באמצעות מעטפת חימום וקבל, בהתאמה. ניתן למצוא את הפרטים ספציפיים לגבי המנגנון מילר השתמש במקום אחר 4. אחרי שבוע של ניצוצות, את התוכן בבקבוק נהפך בעליל. המים הפכו צבע עכור, אדמדם 5 וחומר צהוב חום שהצטבר על האלקטרודות 4. עבודתו פורץ דרך זה נחשבת לסינתזה הראשונה מכוונת, היעילה של ביומולקולות בתנאי כדור הארץ פרימיטיביות מדומים. 
איור 1. השוואה בין שני הסוגים של מנגנונים שנדונו במאמר זה. המנגנון הקלאסי המשמש לניסוי המקורי של מילר יורי () ואת המנגנון הפשוט בשימוש בפרוטוקול שתואר כאן (ב '). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
לאחר פרסום 1953 תוצאות מהניסוי של מילר הקלאסי, וריאציות רבות של ניסוי ניצוץ הפריקה, למשל באמצעות תערובות גז אחרות, בוצעו כדי לחקור את הסבירות של ייצור תרכובות אורגניות חשובות לחיים תחת מגוון רחב של תנאי כדור הארץ מוקדמים אפשריים. לדוגמא, CH 4 2 O / NH 3 / H 2 תערובת גז S נבדקה על יכולתה לייצר חומצות אמינו-α המכיל גופרית המקודדת, אם כי אלה לא התגלו 6. ניתוח ספקטרומטריית המון גז כרומטוגרפיה (GC-MS) של 4 / NH תערובת CH 3 נתון לפריקה חשמלית הראה את הסינתזה של α-aminonitriles, אשר אמין מבשרי חומצה 7. ב1972, באמצעות מנגנון פשוט יותר, הוצג לראשונה על ידי oro 8 (איור 1 ב '), מילר ועמיתיו הוכיחו את הסינתזה של כל החומצות מקודדות α-אמינו 9 וחומצות אמינו nonprotein 10 שזוהו במטאוריט מורצ'יסון עד כה, על ידי חשיפת CH 4, N 2, וכמויות קטנות של NH 3 לפריקה חשמלית. מאוחר יותר, תוך שימוש באותו מערך ניסוי הפשוט הזה, תערובות גז המכילות H 2 O, N 2, ו4 CH, CO 2, או CO היו הציתו לסוטיםdy התשואה של המימן ציאניד, פורמלין, וחומצות אמינו כפונקציה של מצב החמצון של מיני הפחמן באטמוספרה 11.
בנוסף לבדיקה של עיצובים ניסיוניים חלופיים במהלך השנים, התקדמות אנליטיים משמעותית התרחשה מאז הניסוי הקלאסי של מילר, שלאחרונה נעזר חקירות מעמיקות יותר של דגימות ניסוי פריקה חשמלית בארכיון על ידי מילר, מזה שהיה בהנחייתם של הטכניקות היה מילר גישה ל ב1950s. הניסוי של מילר הוולקני 12, שפורסם לראשונה בשנת 1955 4, ו1958 H 2 ניסוי 13 המכיל S הוצגו יצר מגוון רחב יותר, ושכיחותם גבוהה יותר, של חומצות אמינו רבות ואמינים יותר מניסוי הקלאסי, ובם רבים מהם כי לא זוהה בעבר בניסויי ניצוץ שחרור.
הניסוי המתואר במאמר זה ניתן לבצע באמצעותמגוון רחב של תערובות גז. בדרך כלל, לכל הפחות, ניסויים כאלה יכילו גז C נושאות, גז N-ועליו, ומים. עם קצת תכנון, כמעט בכל תערובת של גזים יכולה להיות חוקרת, לעומת זאת, חשוב לשקול כמה היבטים כימיים של המערכת. לדוגמא, ה-pH של השלב המימית יכולה להיות השפעה משמעותית על הכימיה שמתרחשת שם 14.
השיטה המתוארת כאן כבר מותאמת להורות לחוקרים כיצד לבצע ניסויי ניצוץ פריקה דומים לניסוי מילר יורי באמצעות כלי תגובת 3 L פשוט, כפי שתואר בשנת 1972 הפרסומים של מילר 9,10. מאז ניסוי זה כרוך קשת חשמלית במתח גבוה הפועלת על גזים דליקים, זה הוא חיוני כדי להסיר O 2 מהבקבוק התגובה לחסל את הסיכון של פיצוץ, אשר יכול להתרחש בשריפה של גזי נושאות פחמן מופחתים כגון מתאן או פחמן חד חמצני, או O תגובהו H 2 עם חמצן.
ישנם פרטים נוספים שיש לזכור בעת נערך לביצוע הניסוי שנדון כאן. ראשית, בכל פעם שעובד עם קווי ואקום זכוכית וגזים בלחץ, קיימת סכנת קריסה של שני ולוחץ על יתר. לכן, משקפיים בטיחות חייבים להיות משוחק בכל העת. שנית, הניסוי שנערך בדרך כלל בפחות מלחץ אטמוספרי. זה ממזער את הסיכון ללחץ יתר על הסעפת ובקבוק תגובה. זכוכית עשויה להיות מדורגת בבית או מעל לחץ אטמוספרי, לעומת זאת, לחצים מעל 1 כספומט אינם מומלצים. לחצים עשויים להגדיל בניסויים אלה כH לא מסיסים במים 2 הוא משוחרר מהגזים מופחתים (כגון CH 4 ו NH 3). לוחץ יתר יכול להוביל לזליגת חותם, אשר יכולים לאפשר O אטמוספרי 2 להיכנס לבקבוק התגובה, כך שניתן לגרום לבעירה, וכתוצאה מכך לפיצוץ. שלישית,יש לזכור כי שינוי של פרוטוקול זה לנהל וריאציות של הניסוי מחייב תכנון קפדני כדי להבטיח תנאים בטוחים הם לא נוצרו. הרביעית, זה מאוד מומלץ כי הנסיין הפוטנציאלי לקרוא את הפרוטוקול כולו כמה פעמים בעיון לפני שתנסה את הניסוי הזה כדי להיות בטוח שהוא או היא מכירה את בעיות פוטנציאליות וכי כל החומרה הנדרשת יהיה זמינה ובמקומו. לבסוף, ניסויי ניצוח מעורבים גזים דליקים מחייבים עמידה בהנחיות המחלקתיות הסביבה הבריאות ובטיחות של המוסד המארח של הנסיין. שים לב, ההמלצות האלה לפני שתמשיך עם כל ניסויים. כל הצעדים שפורטו בפרוטוקול כאן עומד בהנחיות איכות הסביבה בריאות ובטיחות של המחברים מארח מוסדיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הקמת מערכת סעפת / אבק
- השתמש בסעפת זכוכית כדי להציג את הגזים לתוך בקבוק התגובה. סעפת זה ניתן לרכוש או נבנתה על ידי מתקן ניפוח זכוכית, אבל חייב לכלול יציאות ואקום חזק הניתנות לחיבור למערכת ואקום, מיכלי גז, מד ואקום, וכלי התגובה.
- השתמש במפרקי זכוכית גרוסים ותקעי זכוכית עם שסתומים בסעפת. ודא שכל O-הטבעות על האטמים הן מסוגלת לעשות את החותמות הדרושות. אם אתם משתמשים במפרקי זכוכית, כמות מספקת של שומן ואקום ניתן ליישם כדי לסייע להפוך את חותם, במידת צורך. גריז ואקום סיליקון ניתן להשתמש כדי למנוע זיהום אורגני פוטנציאלי.
- השתמש בברזים למיני זכוכית על הסעפת. להחיל את הכמות המינימלית של שומן הוואקום דרוש כדי להפוך את חותם.
- מדוד את נפח הסעפת. נפח זה ישמש לחישובים הקשורים ללחצי גז סופיים בבקבוק תגובת 3 L וצריך להיות ידוע באופן מדויק ככל האפשר. אלא אם כן יש לו את הסעפת מספיק קשרים כדי להכיל את כל בלוני הגז בו זמנית, להתחבר צילינדר אחד בכל פעם לסעפת. כולל בהקשר זה, ברז המאפשר את הסעפת להיות מבודדת מאווירת הסביבה.
- השתמש מתאים, נקי, אינרטי, וכימי ולדלוף צינורות עמידים ואביזרי ואקום ultratorr לחבר את בלוני גז לסעפת. אבזרי Ultratorr, שבו השתמש, הם להיות-הידק את אצבע.
- להתחבר לסעפת, משאבת ואקום מסוגלת הקמת ואקום של <מ"מ כספית 1. פליטת משאבת הוואקום צריכה להיות ממוקמת בתוך מנדף, או כראוי פרקה באמצעים אחרים.
- כדי להבטיח השגה מהירה של ואקום וכדי להגן על המשאבה, להכניס מלכודת בין הסעפת ומשאבת הוואקום. אצבע מלכודת חנקן נוזלית מומלצת כפי שהוא ימנע נדיפים כגון 3 NH, CO 2, ו-H 2 O מלהיכנס למשאבה. יש להקפיד, כפי נדיפים לכודים, על warming, עשוי overpressure הסעפת ולגרום לקרע זכוכית.
- להתחבר לסעפת, מד לחץ או מד ואקום אחר לרזולוציה של mmHg 1 או טובה יותר. בעוד שניתן להשתמש התקנים שונים, מד לחץ כספית, או מד מקלאוד, עדיף כמו כספית היא די nonreactive.
- מדוד ורשום את טמפרטורת הסביבה באמצעות מדחום מתאים.
2. הכנת בקבוק תגובה
- מחממים את כל כלי הזכוכית ב500 מעלות צלזיוס במשך לפחות 3 שעות באוויר לפני השימוש, להסרת מזהמים אורגניים.
- לנקות את אלקטרודות טונגסטן בעדינות על ידי שטיפה עם מגבוני מעבדה נקיים ומתנול, וייבוש באוויר.
- יוצקים 200 מיליליטר של המים ultrapure (18.2 MΩ סנטימטר, <5 TOC ppb) לתוך בקבוק תגובת 3 L.
- להציג את בר ומערבב מגנטיים precleaned והמעוקר, שיבטיח פירוק מהיר של גזים מסיסים וערבוב של מגיבים במהלך לשעברperiment.
- צרף את אלקטרודות טונגסטן לבקבוק תגובת 3 L באמצעות כמות מינימאלית של שומן ואקום, עם טיפים מופרדים על ידי כ 1 סנטימטר בתוך הבקבוק. להדק עם קליפים.
- הכנס מתאם עם ברזלים מובנים לתוך הצוואר של בקבוק תגובת 3 L ובטוח עם קליפ.
- צרף את בקבוק תגובת 3 L לסעפת הגז באמצעות המתאם. שימוש בקליפ או לצבוט כדי לעזור לאבטח את הבקבוק.
- משמנים קל כל החיבורים כדי להבטיח חותם ואקום טוב.
- פתח את כל השסתומים וברזים למיניהם על הסעפת, למעט Valve 6 וברזלים 1 (איור 4), ולהפעיל את משאבת הוואקום כדי לפנות את הסעפת. ברגע קריאת ואקום יציבה של <מ"מ כספית 1 הושגה, Valve הקרוב 1 ולאפשר לסעפת לשבת ~ 15 דקות כדי לבדוק אם קיים דליפת ואקום. אם אף מזוהים, המשך לשלב 2.8. אחרת לפתור את החיבורים השונים עד שניתן לזהות דליפות וקבועות.
- pply ערבוב מגנטי לכלי התגובה. Valve הפתוח 1 וברזלים 1 (איור 4) לפנות את האמיץ של בקבוק תגובת 3 L עד הגיע הלחץ <1 מ"מ כספית.
- סגור Valve 1 (איור 4) ולנטר את הלחץ בתוך בקבוק תגובת 3 L. הלחץ הנמדד צריך להגדיל ללחץ האדים של מים. כדי לוודא שאין דליפות קיימות, חכה ~ 5 דקות בשלב זה. אם הלחץ (כפי שקורא במד הלחץ) מגדיל בעוד Valve 1 סגור במהלך שלב זה, לבדוק אם קיים דליפה ב1 ברזלים וקשרים בקבוק תגובה השונים. אם אין דליפה נמצאת, המשך לשלב הבא.
3. מבוא של גז NH 3
- לחשב את הלחץ הדרוש של NH גזי 3 להכניס לסעפת כזו ש200 מ"מ כספית של NH 3 יושקו לתוך בקבוק התגובה. פרטים על איך לעשות את זה ניתן בסעיף הדיון.
- שסתומים קרוב1 ו -6, וברזלי 1 (איור 4), לפני החדרת כל גז לסעפת. השאר את השסתומים אחרים ופתוח ברזלים.
- להציג NH 3 לתוך הסעפת עד לחץ קטן (כ 10 מ"מ כספית) הוא הגיע ולאחר מכן לפנות את הסעפת ללחץ של <1 מ"מ כספית על ידי פתיחת שסתום 1 (איור 4). חזור 3x.
- להציג NH 3 לתוך הסעפת כדי להגיע ללחץ שנקבע בשלב 3.1.
- ברזלים פתוחים 1 (איור 4) להציג 200 מ"מ כספית של NH 3 לתוך בקבוק תגובת 3 L. NH 3 יתמוסס במים בבקבוק התגובה והלחץ ייפול לאט.
- ברגע שהלחץ עוצר נשירה, קרובים ברזלים 1 (איור 4) ורשום את הלחץ לקריאה על ידי מד הלחץ. ערך זה מייצג את הלחץ בתוך הבקבוק וישמש כדי לחשב את הלחצים לגזים אחרים שיושקו לתוך הסעפת מאוחר יותר.
- סגור Valve 2 (איור 4) ונתק את בלון הגז NH 3 מהסעפת.
4. מבוא של CH 4
- לחשב את הלחץ הדרוש של 4 CH להיות הציג לתוך הסעפת כזו ש200 מ"מ כספית של CH 4 יהיה הציג לתוך בקבוק תגובת 3 L. חישובי דוגמא מוצגים בסעיף הדיון.
- חבר את בלון הגז CH 4 לסעפת.
- פתח את כל השסתומים וברזים למיניהם, למעט Valve 6 וברזלים 1 (איור 4), ולפנות את הסעפת ללחץ של <1 מ"מ כספית.
- Valve לסגור 1 פעם הסעפת כבר פונתה (איור 4).
- להציג CH 4 לתוך הסעפת עד לחץ קטן (כ 10 מ"מ כספית) מתקבל. זה מוחק את הקו של כל fr גזים מזהמיםאום שקדמו לצעדים. פתח Valve 1 (איור 4) לפנות את הסעפת ל< מ"מ כספית 1. חזור 2x יותר.
- להציג CH 4 לתוך הסעפת עד, הוא הגיע הלחץ מחושב בשלב 4.1.
- ברזלים פתוחים 1 (איור 4) להציג 200 מ"מ כספית של 4 CH לתוך בקבוק תגובת 3 L.
- ברזלים לסגור 1 פעם אחת את הלחץ המיועד של CH 4 כבר הציג לתוך בקבוק תגובת 3 L (איור 4) ורשום את הלחץ שנמדד על ידי מד הלחץ.
- פתח Valve 1 (איור 4) לפנות את הסעפת ל< מ"מ כספית 1.
- סגור Valve 2 (איור 4) ונתק את הצילינדרים CH 4 מהסעפת.
5. מבוא של גזים נוספים (כגון N 2)
- בשלב זה, אין צורך להציג את גזים נוספים. עם זאת, אם תרצה בכך, מומלץ להוסיף של N 2 100 mmHg. במקרה זה, לחשב את הלחץ הדרוש של N 2 להיות הציג לתוך הסעפת כגון זה של N 2 100 מ"מ כספית יהיה הציג לתוך בקבוק תגובת 3 L. חישובי דוגמא מוצגים בסעיף הדיון.
- חברו את צילינדר N 2 גז לסעפת.
- פתח את כל השסתומים וברזים למיניהם, למעט Valve 6 וברזלים 1 (איור 4), ולפנות את הסעפת ללחץ של <1 מ"מ כספית.
- Valve לסגור 1 פעם הסעפת כבר פונתה (איור 4).
- להציג N 2 לתוך הסעפת עד לחץ קטן (כ 10 מ"מ כספית) מתקבל. פתח Valve 1 (איור 4) לפנות את הסעפת ל< מ"מ כספית 1. חזור 2x יותר.
- להציג N 2 לתוך הסעפת עד שיגיע ללחץ המחושב בשלב 5.1.
- ברזלים פתוחים 1 (איור 4) להציג את של N 2 100 mmHg לתוך בקבוק התגובה.
- ברזלים 1 לסגור פעם אחת את הלחץ המיועד של N 2 כבר הציג לתוך בקבוק התגובה, (איור 4) ורשום את הלחץ באמצעות מד הלחץ.
- פתח Valve 1 (איור 4) לפנות את הסעפת ל< מ"מ כספית 1.
- סגור Valve 2 (איור 4) ונתק את צילינדר N 2 מהסעפת.
6. החל הניסוי
- לנתק את בקבוק התגובה מהסעפת ידי סגירת ברזלים 1 ו Valve 1 (איור 4) פעם אחת בכל הגזים הוכנסו לתוך בקבוק התגובה, כך שאוויר הסביבה יכול להיכנס לסעפת ולהביא עד לחץ הסביבה הסעפת.
- לאחר ניתוק בזהירות את בקבוק התגובה מהסעפת, הגדר את הבקבוק איפשהו זה לא יפריע (למשל בתוך מנדף ריק).
- נתק את משאבת הוואקום ולהסיר בזהירות את המלכודת הקרה ולאפשר אוורור פנימי באופן מלאמנדף המבצעי.
- אבטח את סליל טסלה מחובר לגנרטור הניצוץ בתדירות הגבוה.
- חבר את האלקטרודה טונגסטן ההפוכה לקרקע חשמלית כדי לאפשר מעבר היעילה של זרם חשמלי על פני הפער בין שתי אלקטרודות.
- הגדר את מתח היציאה של מחולל הניצוץ לכ 30,000 V, כמפורט במסמכים זמינים מהיצרן.
- לפני שאזם את הניצוץ, סגור את אבנט מנדף, כדי שישמש כמגן בטיחות בין המנגנון והנסיין. סובב את סליל טסלה על להתחיל את הניסוי, ולאפשר ניצוצות להמשיך 2 שבועות (או תקופה רצויה אחרת) בשעה 1 / כיבוי מחזורים.
7. סוף הניסוי
- הפסק את הניסוי על ידי כיבוי סליל טסלה.
- ברזלים פתוחים 1 (איור 4) להציג לאט אוויר הסביבה לתוך בקבוק התגובה ולהקל על ההסרה של המתאם ואלקטרודות טונגסטן כך saניתן לאסוף mples. אם תרצה, ואקום יכול לשמש כדי לפנות את בקבוק התגובה של גזים רעילים תגובה.
8. איסוף דגימות נוזלים
- בעזרת פיפטה זכוכית pyrolyzed, להסיר דגימות נוזל מהבקבוק התגובה, להיות זהיר, כדי לצמצם את החשיפה למזהמים, כגון אלה שעשויים להיות מוצגים על ידי הנגיעה בפיפטה גריז הוואקום או משטחים לא סטרילי אחרים.
- להעביר את הדגימה לפלסטיק סטרילית או כלי קיבול מזכוכית. קיבול מפלסטיק נוטה פחות לפיצוח או שבירה על הקפאה, בהשוואה לקיבול מזכוכית.
- מכולות מדגם חותם ולאחסן במקפיא מסוגל טמפרטורות לכת של -20 מעלות צלזיוס או נמוכה יותר, כמו מוצרים מסיסים עלולות למנוע פתרון המדגם מההקפאה ב 0 ° C.
9. ניקוי המכשיר
- השתמשו במעבדה נקייה מגבונים כדי להסיר בזהירות גריז ואקום מצווארו של המנגנון, להתאיםאה וברזלים, והזכוכית המקיפה את אלקטרודות טונגסטן.
- לנקות ביסודיות את אותו המשטחים מתוארים בשלב 9.1 עם טולואן להסיר גריז ואקום אורגני מלאה מכלי הזכוכית. אם אתם משתמשים בגריז סיליקון, גריז הוואקום הגבוה עשוי להישאר על הזכוכית לאחר פירוליזה, יצירת בעיות בעתיד, כמפורט בסעיף הדיון.
- לנקות ביסודיות את בקבוק התגובה עם מברשת והממסים הבאים לפי סדר: מים ultrapure (18.2 MΩ סנטימטר, <5 TOC ppb), מים ultrapure (18.2 MΩ סנטימטר, <5 TOC ppb) עם 5% חומר ניקוי ניקוי, מתנול, טולואן, מתנול, מים ultrapure (18.2 MΩ סנטימטר, <5 TOC ppb) עם 5% חומר ניקוי ניקוי, ומים סוף סוף ultrapure (18.2 MΩ סנטימטר, <5 TOC ppb).
- לכסות את כל הפתחים הפתוחים של בקבוק התגובה עם רדיד אלומיניום ולעטוף את המתאם ומרכיביו בנייר אלומיניום.
- ברגע שכל הזכוכית כבר עטופה ברדיד אלומיניום, pyrolyze לפחות 3 שעות באוויר ב500 ° C.
- אלקטרודות לנקות בעדינות עם מתנול ולתת אוויר יבש.
10. ניתוח מדגם
שימו לב: בעת הכנת דגימות לבדיקה, השימוש בפרוטוקול הידרוליזה חומצה כגון תואר בפירוט במקומות אחרים 15, הוא שימושי לקבלת חומצות אמינו נוסף. הידרוליזה של חלק מהמדגם התאושש מספקת ההזדמנות לנתח את שני חומצות אמינו חופשיות, כמו גם מבשרי חומצה יציבה שלהם, כי הם מסונתזים בתנאי אביוטי.
- לניתוח חומצת אמינו, להשתמש בטכניקה מתאימה (כגון כרומטוגרפיה נוזלית ושיטות מבוססות ספקטרומטריית מסה, או גישות מתאימות אחרות). טכניקות אנליטיות אלה כוללות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים עם גילוי הקרינה (HPLC-FD) 14, וכרומטוגרפיה נוזלית ביצועי ultrahigh עם גילוי הקרינה במקביל עם ספקטרומטריית מסת יינון electrospray החיובית בזמן של הטיסה (UHPLC-FD/ToF-MS) 12,13. כתב יד זה מתאר ניתוח באמצעות ספקטרומטריה מנתח באמצעות ספקטרומטר משולש quadrupole ההמוני (QQQ-MS) בשיתוף עם HPLC-FD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המוצרים מסונתזים בניסויי פריקה חשמליים יכולים להיות די מורכבים, וישנן גישות אנליטיות רבות שניתן להשתמש בם כדי ללמוד אותם. כמה מן הטכניקות הנפוצות יותר בספרות לניתוח חומצות אמינו הם דנו כאן. שיטות spectrometric כרומטוגרפי ומסת טכניקות אינפורמטיבי מאוד לניתוח התערובות כימיות מורכבות המיוצרים על ידי ניסויי ניצוץ פריקה סוג מילר יורי. חומצת אמינו מנתח יכול להתבצע באמצעות -phthaldialdehyde/N-acetyl-L-cysteine o (OPA / NAC) 16, זוג מגיב כיראליות שמתייג קבוצות אמינו עיקריות, מניב נגזרי diastereomer ניאון שניתן להפריד בשלב נייח achiral. איור 2 מראה הכרומתוגרמה של תקן מתקבל על ידי HPLC OPA / חומצת אמינו derivatized-NAC בשילוב פלואורסצנטי איתור וQQQ-MS. חומצות אמינו הכלולות בתקן כוללות אלה המיוצרים בדרך כלל בדיס ניצוץ סוג מילר יורילחייב את הניסויים. זהותם של חומצות אמינו אלה מוצגות בטבלה 1. עקבות הקרינה נציג של מדגם טיפוסי וריק אנליטיים מוצגות באיור 3, הממחישות את המורכבות מולקולריות של דגימות פריקה חשמלית סוג מילר יורי. Chromatogram המדגם באיור 3 הופק מניסוי ניצוץ פריקה באמצעות תנאי ההתחלה הבאים: 300 מ"מ כספית של CH 4, 250 מ"מ כספית של NH 3, ו250 מיליליטר של מים.
איור 2. אזור דקות 3-21 של chromatograms HPLC-FD/QqQ-MS הופק מניתוח סטנדרטי חומצת אמין derivatized-NAC OPA /. זהויות שיא חומצת אמינם מופיעות בטבלה 1. עקבות הקרינה מוצגת בתחתית וmas חילוץ המתאיםchromatograms של מוצג לעיל. יינון electrospray (ESI) QQQ-MS הופעל במצב חיובי ופיקוח טווח מסה של 50-500 מ '/ z. הגדרות ESI היו: גז desolvation (N 2) טמפרטורה: 350 ° C, 650 ליטר / שעה; מתח נימים: 3.8 ק; מתח חרוט: 30 V. הפסגות ללא תווית בהכרומתוגרמה יון שחולצה 367 הן 2 פסגות 13 C מ הכרומתוגרמה יון שחולצה 365, כתוצאה מהשפע הטבעי כ -1% מ13 ג לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
| שיא | חומצת אמינו |
| 1 | D-חומצה אספרטית |
| 2 | L-חומצה אספרטית |
| 3 | L-חומצה גלוטמית |
| 4 | D-חומצה גלוטמית |
| 5 | D-סרין |
| 6 | L-סרין |
| 7 | גליצין |
| 8 | ב-אלאנין |
| 9 | D-אלנין |
| 10 | g-אמינו-N-בוטירית חומצה (G-ABA) |
| 11 | L-אלאנין |
| DB-אמינו-N-בוטירית חומצה (DB-ABA) | |
| 13 | -aminoisobutyric חומצה (-AIB) |
| 14 | LB-אמינו-N-בוטירית חומצה (LB-ABA) |
| 15 | D / La-אמינו-N-בוטירית חומצה (D / La-ABA) |
| 16 | D-isovaline |
| 17 | L-isovaline |
| 18 | L-לין |
| 19 | דואר אמינו-n-קפרואית חומצה (EACA) |
| 20 | D-לין |
| D-isoleucine | |
| 22 | L-isoleucine |
| 23 | D / L-לאוצין |
טבלת 1. זהויות שיא של חומצות אמינו זוהו בתקן ושמיוצרות בדרך כלל בניסויי ניצוץ פריקה סוג מילר יורי.
איור 3. אזור דקות 3-21 של נציג chromatograms HPLC-FD של ניסויי ניצוץ פריקה סוג מילר יורי. פיקס זוהו ונרשמת ידי זמן שמירה וניתוח מסה של תרכובות מטרה בהשוואה לריקה סטנדרטי ואנליטית. כל היעד ana lytes עם פעמים שמירת הקרינה coeluting ניתן להפריד ונרשמת באמצעות ספקטרומטריית מסה, למעט α-AIB ו-L-β-ABA (פסגות 13 ו14), ו-D / L-norleucine, שcoelutes עם D / L-לאוצין (שיא 23), בתנאי chromatographic בשימוש. D / L-norleucine נוספה כסטנדרט פנימי לדגימות ואת החסר אנליטיים במהלך הכנת מדגם. הפרדת חומצות אמינו הושגה באמצעות 4.6 מ"מ x 250 מ"מ, עמודת פניל-Hexyl HPLC 5 חלקיקים בגודל מיקרומטר. השלב הנייד היה מורכב: א) מים ultrapure (18.2 MΩ סנטימטר, <5 TOC ppb), ב ') מתנול, ו-C) formate 50 מ"מ אמוניום עם מתנול 8%, ב-pH 8. השיפוע השתמש היה: 0-5 דק ', C 100%; 5-15 דקות, 0-83%, 0-12% B, 100-5% C; 15-22 דקות, 83-75%, 12 - 20% B, C 5%; 22-35 דקות, 75-35%, 20-60% B, 5% C; 35-37 דקות, 35-0%, 60-100% ב ', 5-0% C; 37-45 דקות, 100% B; 45-46 דקות, 100-0% B, C 0-100% 46-55 דקות, 100% ג קצב הזרימה הייתה 1 מיליליטר / דקה.hres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים רבים בפרוטוקול המתואר כאן הם קריטיים לביצוע ניסויים מסוג מילר יורי צורה בטוחה ונכון. ראשית, כל הכלים וכלי זכוכית מדגם הטיפול שיבואו במגע עם בקבוק התגובה או מדגם צריכים להיות מעוקרים. עיקור מושגת על ידי שטיפה באופן יסודי את הפריטים בשאלה עם המים ultrapure (18.2 MΩ סנטימטר, <5 TOC ppb) ולאחר מכן עוטף אותם בנייר אלומיניום, לפני pyrolyzing ב500 מעלות צלזיוס באוויר לפחות 3 שעות. ברגע שהציוד כבר pyrolyzed ובעת הכנת דגימות לבדיקה, יש להקפיד כדי למנוע זיהום אורגני. הסיכון של זיהום יכול להיות ממוזער על ידי לבישת כפפות nitrile, מעיל מעבדה, ומשקפי מגן. הקפד לעבוד עם דגימות מגופו של אדם כמקורות נפוצים של זיהום כוללים טביעות אצבע, עור, שיער, ונשפה נשימה. יש להימנע ממגע עם כפפות רטובות ולא להשתמש בכל טכס או חומרי ניילון. degassing השני, יסודי של tהוא בקבוק תגובה לפני תוספת גז לתוך בקבוק התגובה הוא קריטי. הנוכחות של אפילו כמויות קטנות של חמצן מולקולרי בבקבוק התגובה מהווה סיכון פיצוץ כאשר הניצוץ ריקה לגזים דליקים כגון 4 CH. בעוד degassing הבקבוק, המים בתוך הבקבוק יהיו לרתוח, אשר תמנע קריאה יציבה. בשלב זה קיימות שתי אפשרויות: 1) דגה הבקבוק באמצעות להקפיא להפשיר מחזורים (בדרך כלל 3 נמצאים בשימוש), או 2) פשוט דגה הפתרון הנוזלי. במקרה האחרון, כמה מים ילכו לאיבוד, לעומת זאת, הסכום יהיה קטן יחסית בהשוואה לנפח שנותר. שלישית, התקנה מצויידות היטב ויעילה חייבת להיות בנויה בקפידה להקים ניצוץ עקבי על פני האלקטרודות ברחבי המכלול של הניסוי. סלילי BD-50E טסלה אינם מיועדים לפעולה ממושכת, כפי שהם נועדו לגילוי דליפת ואקום. קירור לסירוגין של סליל טסלה כך מומלץ לחיים מבצעיים ממושכים. Therדואר מספר דרכים להשגת מטרה זו. דרך פשוטה אחת היא לצרף טיימר בקו בין בוחן הניצוץ ואת אספקת החשמל שלה ולתכנת את הטיימר כך שהוא מתחלף בשעה 1 / כיבוי מחזורים. קירור סליל טסלה עם מאוורר מסחרי יכול להיות גם צורך להאריך את חייו של סליל טסלה. קצה סליל טסלה צריך להיות נוגע ללב או כמעט נוגע אחד אלקטרודות טונגסטן; מרחק בין שני של כ 1 מ"מ או פחות. בנוסף, הזרמה אינטנסיבית יכולה להיות מושגת באמצעות אורך של חוט מתכת מוליך עם לולאה בקצה אחד עטופה בקלילות על פני האלקטרודה נגדית אחת נוגע בסליל טסלה כדי למנוע שבירת החותם לתוכן. כמו כן הוא מומלץ יש גנרטור שני ניצוץ זמין במקרה מחולל הניצוץ הראשוני נכשל בשל שימוש ממושך.
יש הרבה הערות נוספות כדאי לזכור בעת ביצוע פעולות שונות בפרוטוקול שתואר כאן. בעת הכנת מערכת הסעפת עבורn ניסוי ושימוש במד לחץ כספית, זה בדרך כלל הודה כי דיוק של 1 מ"מ כספית הוא בר השגה הטובה ביותר, בשל הרזולוציה של העין האנושית. גזים מסוימים עשויים להציג בעיות מוליכות עם מדדים המבוסס על התנגדות. מודד לחץ מרקורי סכנות דליפה פוטנציאליות הנוכחיות, שאמור להיות מוכן לה מראש.
בעוד הרכבת בקבוק תגובת 3 L, השימוש בגריז ואקום סיליקון יכול להקטין זיהום אורגני פוטנציאל, אבל צריך להקפיד להסיר ביסודיות את זה בין ריצות. הימנעות מלעשות זאת תגרום להצטברות של משקעי סיליקה במהלך פירוליזה בטמפרטורה גבוהה, מה שיכול להפריע לחותמות ואקום. בנוסף, אלקטרודות טונגסטן הם זמינות מסחריים כמו 2% טונגסטן thoriated וצריכה להיות מרותקת לאבזרי זכוכית קרקע חצי עגולים. אל pyrolyze אלקטרודות טונגסטן מצויד הזכוכית בתנור. מקדמי התפשטות תרמית של טונגסטן וזכוכית שונים ולחימוםng מעל 100 ° C עלול להחליש את החותם סביב אלקטרודות annealed הזכוכית ולהציג את ההדלפות למערכת. כמו כן, מים ultrapure יכולים להיות הציגו לתוך בקבוק תגובת 3 L על ידי שפיכה, באמצעות טיפול, כדי למנוע מגע עם גריז כלשהו ביציאה המשמשת, או על ידי pipetting, באמצעות פיפטה זכוכית prepyrolyzed. השלב המימית בבקבוק התגובה יכול להיות שנאגרו, אם תרצה בכך. לדוגמא, מילר ועמיתים 9 נאגרו הפתרון לpH ~ 8.7 עם 4 חיץ Cl NH 3 / NH. לשם כך את השלב המימית נעשה 0.05 M בNH 4 Cl לפני החדרת אותו לתוך בקבוק התגובה. Cl NH 4 של טוהר 99.5%, או יותר, צריך להיות בשימוש. שארית NH 3 לאחר מכן הוסיפה לבקבוק התגובה כגז.
כהכנה לכניסת גז לתוך בקבוק תגובת 3 L, הבקבוק יכול להיות מאובטח על הסעפת על ידי הנחת הבקבוק על טבעת פקק, העומד על שקע מעבדה ובעדינות להעלות את ההרכבה הבקבוק עדחיבור נוח מושגת. בעת בדיקת דליפות, ראוי לציין שסביר להניח שמקורות של דליפות כוללים חותמות עניות בצמתים של מפרקי זכוכית הגרוסים חצי עגולים, אשר לצרף אלקטרודות טונגסטן לבקבוק התגובה, וברזלים של המתאם המחובר לצוואר של בקבוק תגובת 3 L. אם הדלפות ממקורות אלה מזוהים, להסיר בזהירות את בקבוק תגובת 3 L מהסעפת, לנגב אזורים אלה עם רקמות במעבדה נקיות, להחיל מחדש ציפוי טרי של שומן ואקום ולצרף בקבוק לסעפת כדי לחפש את הדלפות. אם אין דליפות נמצאות, המשך להציג את הגזים לתוך בקבוק התגובה.
תוך הצגת גזים לתוך המכשיר, בלוני גז צריכים להיות מהודקים היטב לתמיכה. יש להקפיד להציג את הגזים באיטיות. שסתומים על בלוני גז אמור להיפתח לאט ובזהירות תוך ניטור מד הלחץ כדי למנוע את הזכוכית ואביזרים מצורפים לוחץ יתר על המידה. חשוב לציין thaלא תוך הוספת NH 3 לתוך בקבוק התגובה, כי NH 3 הוא במידה ניכרת מסיס במים מתחת לpK של NH 4 + (~ 9.2), למעשה כל הגז שהוכנס לסעפת NH 3 יתמוססו בשלב המימית, טיוח הלחץ הסופי בבקבוק והסעפת כמו לחץ האד של מים בטמפרטורת הסביבה. ברגע שהלחץ הזה יושג, אפשר להניח שההעברה הושלמה. להלן דוגמאות של החישובים שיש לבצע על מנת להציג דווקא גזים לתוך בקבוק התגובה בלחצים הרצויים שלהם:
מבוא של גז NH 3
בשל המסיסות של NH 3, בעצם כל זה יעביר מהסעפת לבקבוק התגובה ולהתמוסס בשלב המימית, כל עוד 3 NH בסעפת הוא בלחץ גבוה יותר מלחץ האד של מים בתגובהבקבוק. לכן, טמפרטורת הסביבה יש לציין ולחץ האד של מים בטמפרטורה שצריך להיות מופנה קודם להחדרת NH 3 לתוך הסעפת. לחץ היעד של NH 3 להיות הציג לתוך בקבוק התגובה צריך להיות שווה ללחץ היעד של NH 3 בבקבוק תגובת 3 L, בתוספת לחץ האדים של מים בבקבוק התגובה, בטמפרטורת הסביבה שנרשמה. לדוגמא, ב ° C25, לחץ האד של מים הוא כ 24 מ"מ כספית. לפיכך, על מנת להציג את 200 מ"מ כספית של NH 3 לתוך בקבוק התגובה, עומס בערך 225 מ"מ כספית של NH 3 לתוך הסעפת לפני העברת NH 3 מהסעפת ולתוך בקבוק התגובה. זה יגרום כ 200 מ"מ כספית של NH 3 שהוצגו לתוך בקבוק התגובה.
מבוא של CH 4
לאחר NH בנוסף 3 ופירוקה בשנת הדואר שלב מימיים, בלחץ באמיץ של בקבוק התגובה יהיה שווה ללחץ אדי מים ב ° C25, כ 24 מ"מ כספית. ערך זה ישמש, בשיתוף עם סעפת הדוגמא מוצגת באיור 4, לבצע את חישוב לכמה CH 4 להכניס לתוך הסעפת כזו ש200 מ"מ כספית של CH 4 יהיה הציג לתוך בקבוק התגובה:
1 = לחץ כולל P הרצוי בכל המערכת כולה, כולל את בקבוק התגובה
V 1 = נפח כולל של המערכת כולה, כוללים את בקבוק התגובה
P 2 = לחץ של CH 4 הנדרשים למילוי נפח סעפת לפני כניסתה לבקבוק תגובה
V 2 = נפח של סעפת משמשת לכניסת גז
P = 3 לחץ כבר באמיץ של בקבוק התגובה
V 3 = נפח של בקבוק התגובה
V 1 = 3,000 מיליליטר + 100 מיליליטר + 300 מיליליטר + 40 מיליליטר + 20 מיליליטר 3,000 + מיליליטר + 40 מיליליטר + 500 מיליליטר = 7,000 מיליליטר
P 2 = לחץ של CH 4 מחושב
V 2 = 100 מיליליטר + 300 מיליליטר + 40 + 20 + 3,000 מיליליטר + 40 מיליליטר + 500 מיליליטר = 4,000 מיליליטר
P = 3 24 מ"מ כספית של H 2 O
V 3 = 3,000 מיליליטר
מבוא של N 2
לאחר כניסתה של CH 4, האמיץ של בקבוק התגובה היא נכבשה על ידי 200 מ"מ כספית של CH 4 ו24 מ"מ כספית של H 2 O עבור סכום כולל של 224 מ"מ כספית. ערך זה ישמש, יחד עם המידות של סעפת הדוגמא מוצגת באיור 4, כדי לחשב t הוא N 2 בלחץ שצריך להיות מוחדרים לסעפת כגון זה של N 2 100 מ"מ כספית יהיה הציג לתוך בקבוק התגובה:
1 = לחץ כולל P הרצוי בכל המערכת כולה, כולל את בקבוק התגובה
V 1 = נפח כולל של המערכת כולה, כוללים את בקבוק התגובה
P 2 = לחץ של N 2 דרוש כדי למלא נפח סעפת לפני כניסתה לבקבוק תגובה
V 2 = נפח של סעפת משמשת לכניסת גז
P = 3 לחץ כבר באמיץ של בקבוק התגובה
V 3 = נפח של בקבוק התגובה
P = 1 24 מ"מ כספית של H 2 O 200 + מ"מ כספית של CH 4 100 + מ"מ כספית של N 2 = 324 mmHg
V 1 = 3,000 מיליליטר + מיליליטר> + 100 300 מיליליטר + 40 מיליליטר + 20 מיליליטר + 3,000 מיליליטר + 40 מיליליטר + 500 מיליליטר = 7,000 מיליליטר
> P 2 = לחץ של N 2 מחושב
V 2 = 100 מיליליטר + 300 מיליליטר + 40 מיליליטר + 20 מיליליטר + 3,000 מיליליטר + 40 מיליליטר + 500 מיליליטר = 4,000 מיליליטר
P = 3 200 מ"מ כספית של CH 4 24 + מ"מ כספית של H 2 O = 224 mmHg
V 3 = 3,000 מיליליטר
איור 4. . מערכת ואקום סעפת / משמשת להציג גזים לתוך בקבוק תגובת 3 L שסתומים שליטה זרימת גז מתויגות כV 1 - V 8, בעוד שברזים למיניהם שליטה זרימת גז מתויגים כS 1 ו-S 2. ראוי לציין כי בעוד שסתומים 1, 2, ו -6, ו1 ברזלים מכונים explicitly בפרוטוקול, שסתומים וברזלים בסעפת מוצגת כאן האחרים הם שימושיים להוספה או הסרה של נפח (כלומר מחזיק צלוחיות) או מהסעפת. לדוגמא, כאשר החדרת גזים לתוך הסעפת בלחצים גבוהים יחסית (כ 500 mmHg או יותר), מומלץ שהנסיין עושה שימוש בכל טיהור צלוחיות מחוברת הסעפת להגדיל את הנפח הנגיש של הסעפת ולמזער את הסיכון של למעלה מ-לוחץ על הסעפת.
לאחר שיזם את הניסוי, המערכת חייבת להיבדק באופן קבוע על מנת להבטיח את הניסוי פועל כראוי. מה עליך לבדוק כולל: 1) מחולל הניצוץ הוא לייצר ניצוץ, ו2) הניצוץ הוא להיות שנוצר על פני אלקטרודות טונגסטן בצורה רציפה. אם התנאים הנ"ל אינם התקיים, נתק את סליל טסלה מאספקת החשמל שלה ולהחליף אותו עם סליל טסלה הגיבוי. בינתיים, תיקונים לסליל טסלה תקלה יכולים להתבצע.פעמים רבות, קשר הצלחות בתוך הניצוץ גנרטור הדיור יכולות להיות חלודות משימוש ממושך וצריכה להיות מלוטשת, או להחלפה.
עם השלמת הניסוי, הגזים בראש המרחב יכולים להיות מעצבן למערכת הנשימה. גזים מזיקים, כגון מימן ציאניד 4 יכולים להיות מיוצרים על ידי הניסוי. אם הנסיין לא איסוף דגימות גז לניתוח, זה עשוי להיות מועיל כדי לחבר את המכשיר לaspirator מים לפנות נדיפים כשעה לאחר סיום הניסוי, ואילו המנגנון נשאר במנדף, לפני איסוף דגימות נוזלים . מטעמי בטיחות, מומלץ כי המנגנון הוא פרקו במנדף מלוא מבצעי. איסוף דגימה יש לבצע במנדף תפעולי וטיפול מדגם בזרימת ספסל מסונן HEPA חיובי בלחץ מומלץ.
בין הסוגים הרבים של מוצרים שנוצרו על ידי לשעבר ניצוץ פריקהperiments, חומצות אמינו הן בעלי חשיבות. חומצות אמינו מסונתזים בקלות באמצעות סינתזת Strecker 17. הסינתזה של חומצות אמינו Strecker כרוכה התגובה של אלדהידים או קטונים וHCN שנוצרו על ידי הפעולה של פריקה חשמלית בגזים שהוכנסו למנגנון התגובה, שעל ההמסה בשלב המימית, עשוי להגיב עם אמוניה ליצירת α-aminonitriles שעוברים הידרוליזה להניב חומצות אמינו. זהו, כמובן, אבל מנגנון אחד של סינתזה, ואחרים יכולים להיות גם אופרטיביים, כגון amination הישיר של מבשרים כוללים אקרילוניטריל לתת מבשרי β-אלאנין, או הידרוליזה ישירה של חומר דמוי tholin-גבוה מולקולרי משקל לתת חומצות אמינו באופן ישיר , מנגנון Strecker עובר על ידי.
זיהום חומצת אמינו של דגימות המיוצרים על ידי ניסויי מילר יורי יכול להתרחש אם אמצעי הזהירות שהוזכר קודם לכן אינה אחריו באופן מפורש. במהלך ניתוח מדגם, חשוב לsearcשעות לסימנים של זיהום יבשתי, שייתכן שמקורו מטיפול מדגם או אחסון מדגם. השימוש בOPA / 16 NAC בשילוב עם טכניקות LC-FD מאפשר הפרדת chromatographic של D-ו-L-האננטיומרים של חומצות אמינו עם מרכזי כיראליות וquantitation בהתאמה, האישי שלהם. חומצות אמינו כיראליות המסונתזת על ידי הניסוי צריכה להיות רצמית. שגיאה ניסיונית מקובלת בסינתזה של חומצות אמינו עם מרכזי כיראליות נחשבת בדרך כלל להיות כ 10%. לכן יחס L / D חומצת אמין כיראליות רמיזות של העשרה בenantiomer אחד על ידי יותר מ 10% הוא מדד טוב שבו, כדי לקבוע אם המדגם כבר מזוהם.
השיטות שהוצגו כאן נועדו להורות איך לנהל את ניסוי ניצוץ פריקה סוג מילר יורי, עם זאת, יש מגבלות על הטכניקה שתוארה כאן שיש לציין. ראשית, חימום בקבוק תגובת 3 L אחד (איור 1 ב), יגרום לעיבוי של אדי מים על הטיפים של אלקטרודות, ריסון הניצוץ, ולהקטין את הדור של מינים רדיקליים המניעים הרבה מהכימיה שמתרחשת בניסוי. יתר על כן, השימוש במעטפת חימום כדי לחמם את המנגנון אין צורך לסנתז תרכובות אורגניות, כגון חומצות אמינו. זה שונה מהניסוי המקורי של מילר שבו הוא השתמש,, (איור 1 א) מורכב יותר שהותקן מנגנון בקבוק כפול 5 וחמם את הבקבוק הקטן בחלק התחתון של המכשיר, שהיה לה מים (איור 1 א). חימום המנגנון עזר עם מחזור של חומרי המוצא ומטרתה לחקות את האידוי במערכת כדור הארץ מוקדמת. שנית, הפרוטוקול המפורט כאן ממליץ 1 שעות / כיבוי מחזור בעת שימוש בסליל טסלה, אשר למעשה מכפיל את כמות הזמן שנדרש כדי להשלים את הניסוי, בהשוואה לניסויים שנערכו על ידי מילר, כפי שהוא משוחרר ברציפות electricity למערכת 4. שלישית, כמחוללי ניצוץ אינם מיועדים לשימוש לטווח ארוך, הם נוטים לתקלה בזמן שימוש ממושך ויש לשמור באופן קבוע והוחלפו לעתים על ידי יחידת גיבוי, אם מחולל הניצוץ הראשוני נכשל במהלך ניסוי. אחרון, הפרוטוקול המתואר כאן כרוך בשימוש בברזים למיני זכוכית, אשר דורשים גריז ואקום גבוה כדי להפוך את החותמות מתאימות. אם תרצה, ניתן להשתמש בברזים למיני polytetrafluoroethylene (PTFE), כדי למנוע גריז ואקום. עם זאת, אם בוחנים את הברזים למינים אלה דליפות פוטנציאליות עם גלאי ניצוץ דליפה, להיות זהיר שלא לחשוף יותר מדי PTFE לניצוץ כמו זה יכול לפגוע ביושרה של PTFE ולהוביל לחותמות עניים נעשות על ידי ברזים למינים אלה.
המשמעות של השיטה שדווחה כאן ביחס לטכניקות קיימות, נמצאת בתוך הפשטות שלו. היא משתמשת בבקבוק 3 ליטר זמין באופן מסחרי, שהוא גם הרבה פחות שביר וקל יותר לCLEבין ניסויים מהעיצוב המקורי בשימוש על ידי מילר 5. מכיוון שהמנגנון הוא מסורבל פחות, הוא קטן מספיק כדי לבצע את הניסוי בתוך מנדף.
ברגע שהטכניקה המתוארת כאן כבר שולטת, זה יכול להיות שונה במגוון רחב של דרכים כדי לדמות סוגים רבים של סביבות יבשתיים פרימיטיביות. לדוגמא, ניתן להשתמש בתערובות גז יותר מחומץ 14,18,19. יתר על כן, באמצעות שינויים של המנגנון, ניתן לשנות את מקור האנרגיה, למשל, על ידי שימוש בפריקה שקטה 4, אור אולטרה סגול 20, לדמות מערכות וולקניות 4,12,21, מחקה רדיואקטיביות מקרום כדור הארץ 22, ומחק אנרגיה המופקת על ידי גלי הלם מהשפעות meteoritic 23, וגם קרינה קוסמית 18,19.
ניסוי מילר יורי קלאסי הראה כי חומצות אמינו, אבני בניין חשוב של חלבונים ביולוגיים, ניתן synthesized שימוש בחומרי מוצא פשוטים בתנאים יבשתיים prebiotic מדומים. העירור של מולקולות גז על ידי פריקה חשמלית מוביל לייצור של תרכובות אורגניות, הכוללים חומצות אמינו, בתנאים כאלה. בעוד חומצות אמינו חשובות לביולוגיה עכשווית, ניסוי מילר יורי רק מספק מנגנון אפשרי אחד לסינתזת אביוטי שלהם, ואינו מסביר את מקור חיים, כתהליכים שיוצרים אורגניזמים חיים היו בסבירות גבוהה יותר מורכבים מההיווצרות מולקולות אורגניות פשוטות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה במשותף על ידי NSF ונאס"א תכנית אסטרוביולוגיה, תחת מרכז NSF לכימית אבולוציה, מל"ג-1004570, ומרכז גודארד לאסטרוביולוגיה. ETP רוצה להכיר מימון נוסף הניתן על ידי תכנית התמחות הביולוגיה נאס"א פלנטריים. המחברים גם רוצים להודות לד"ר Asiri Galhena לעזרה לא יסולא בפז בהקמת מתקני מעבדה הראשוניים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Plugs for Manifold | Chemglass | CG-983-01 | |
| High Vacuum Grease | Apiezon | N/A | Type M/N |
| Silicon High Vacuum Grease | Dow Corning | 1597418 | |
| Teflon PFA Tubing | McMaster-Carr | 51805K54 | |
| Ultra-Torr Vacuum Fittings | Swagelok | SS-4-UT-6 | |
| Dry Scroll Vacuum Pump | Edwards | A72401905 | |
| U-Tube Manometer | Alta-Robbins | 100SS | |
| Tungsten Electrodes | Diamond Ground Products | TH2-1/16 | 2% thoriated |
| Methanol | Alfa Aesar | N/A | Ultrapure HPLC Grade |
| Teflon-Coated Magnetic Stir Bar | McMaster-Carr | 5678K127 | |
| Gaseous NH3 | Airgas | AMAHLB | 99.99% purity |
| Gaseous CH4 | Airgas | ME UHP300 | 99.99% purity |
| Gaseous N2 | Airgas | NI UHP300 | 99.999% purity |
| Tesla Coil | Electro-Technic Products | 15001 | Model BD-50E |
| 24 hr Plug-in Basic Timer | General Electric Company | 15119 | |
| Cleaning Detergent | Alconox | 1104 | |
| Toluene | Thermo Fisher Scientific | N/A | Optima Grade |
| Luna Phenyl-Hexyl HPLC Column | Phenomenex | 00G-4257-E0 | Brand: Luna |
| Formic Acid | Sigma-Alrich | F0507 | Used to make 50 mM ammonium formate |
References
- Oparin, A. I. The Origin of Life. , Izd. Moskovshii Rabochii. (1924).
- Haldane, J. B. The origin of life. Rationalist Annu. 148, 3-10 (1929).
- Garrison, W. M., Morrison, D. C., Hamilton, J. G., Benson, A. A., Calvin, M. Reduction of Carbon Dioxide in Aqueous Solutions by Ionizing Radiation. Science. 114, 416-418 (1951).
- Miller, S. L. Production of Some Organic Compounds under Possible Primitive Earth Conditions. J. Am. Chem. Soc. 77, 2351-2361 (1955).
- Miller, S. L. A Production of Amino Acids Under Possible Primitive Earth Conditions. Science. 117, 528-529 (1953).
- Heyns, H. K., Walter, W., Meyer, E. Model experiments on the formation of organic compounds in the atmosphere of simple gases by electrical discharges (Translated from German). Die Naturwissenschaften. 44, 385-389 (1957).
- Ponnamperuma, C., Woeller, F. α-Aminonitriles formed by an electric discharge through a mixture of anhydrous methane and ammonia. Biosystems. 1, 156-158 (1967).
- Oró, J. Synthesis of Organic Compounds by Electric Discharges. Nature. 197, 862-867 (1963).
- Ring, D., Wolman, Y., Friedmann, N., Miller, S. L. Prebiotic Synthesis of Hydrophobic and Protein Amino Acids. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 765-768 (1972).
- Wolman, Y., Haverland, W. J., Miller, S. L. Nonprotein Amino Acids from Spark Discharges and Their Comparison with the Murchison Meteorite Amino Acids. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 809-811 (1972).
- Roscoe, S., Miller, S. L. Energy Yields for Hydrogen Cyanide and Formaldehyde Syntheses: The HCN and Amino Acid Concentrations in the Primitive Ocean. Orig. Life. 17, 261-273 (1987).
- Johnson, A. P., et al. The Miller Volcanic Spark Discharge Experiment. Science. 322, 404 (2008).
- Parker, E. T., et al. Primordial synthesis of amines and amino acids in a 1958 Miller H2S-rich spark discharge experiment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5526-5531 (2011).
- Cleaves, H. J., Chalmers, J. H., Lazcano, A., Miller, S. L., Bada, J. L. A reassessment of prebiotic organic synthesis in neutral planetary atmospheres. Orig. Life Evol. Biosph. 38, 105-115 (2008).
- Glavin, D. P., et al. Amino acid analyses of Antarctic CM2 meteorites using liquid chromatography-time of flight-mass spectrometry. Meteorit. Planet. Sci. 41, 889-902 (2006).
- Zhao, M., Bada, J. L. Determination of α-dialkylamino acids and their enantiomers in geologic samples by high-performance liquid chromatography after a derivatization with a chiral adduct of o-phthaldialdehyde. J. Chromatogr. A. 690, 55-63 (1995).
- Strecker, A. About the artificial formation of lactic acid and a new Glycocoll the homologous body Justus Liebigs Annalen der Chemie. 75, 27-45 (1850).
- Miyakawa, S., Yamanashi, H., Kobayashi, K., Cleaves, H. J., Miller, S. L. Prebiotic synthesis from CO atmospheres: implications for the origins of life. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14628-14631 (2002).
- Kobayashi, K., Kaneko, T., Saito, T., Oshima, T. Amino Acid Formation in Gas Mixtures by Particle Irradiation. Orig. Life Evol. Biosph. 28, 155-165 (1998).
- Sagan, C., Khare, B. N. Long-Wavelength Ultraviolet Photoproduction of Amino Acids on the Primitive Earth. Science. 173, 417-420 (1971).
- Harada, K., Fox, S. W. Thermal Synthesis of Natural Amino-Acids from a Postulated Primitive Terrestrial Atmosphere. Nature. 201, 335-336 (1964).
- Ponnamperuma, C., Lemmon, R. M., Mariner, R., Calvin, M. Formation of Adenine by Electron Irradiation of Methane Ammonia, and Water. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 49, 737-740 (1963).
- Bar-Nun, A., Bar-Nun, N., Bauer, S. H., Sagan, C. Shock Synthesis of Amino Acids in Simulated Primitive Environments. Science. 168, 470-473 (1970).
