Summary
Anvendes cut-open Vaseline hul tilgang til at opnå lav støj optagelser af ioniske og gating strømme fra spændingsafhængige ionkanaler udtrykt i Xenopus oocyter med høj opløsning på hurtige kanal kinetik. Med mindre ændringer kan spændingsklemme fluorometri kobles til cut-åben oocyt protokol.
Abstract
Cut-open oocyt Vaseline hul (COVG) spænding clamp teknik giver mulighed for analyse af elektrofysiologiske og kinetiske egenskaber af heterologe ionkanaler i oocyter. Optagelser fra cut-åbne setup er især nyttige til at løse lav størrelsesorden gating strømme, hurtig ionstrømmen aktivering og deaktivering. De vigtigste fordele end de to-elektrode spænding klemme (TEVC) teknik omfatter øget klemme hastighed, forbedret signal-til-støj-forhold, og evnen til at modulere den intracellulære og ekstracellulære miljø.
Her beskæftiger vi det menneskelige hjerte-natrium-kanal (HNA V 1.5), udtrykt i Xenopus oocytter, at demonstrere cut-åben opsætning og protokol samt ændringer, der er nødvendige til at tilføje spænding klemme fluorometri kapacitet.
Egenskaberne for hurtige aktiverende ionkanaler, såsom HNA V 1.5, kan ikke fuldt afklaret nær stuetemperatur hjælp TEVC i which helhed af oocyt membran er fastspændt, så spænding kontrol vanskelig. Men i cut-åben teknik, isolering af kun en lille del af cellemembranen tillader hurtig fastspænding kræves præcist at registrere hurtige kinetik samtidig forhindre kanal nedslidning forbundet med patch-clamp-teknikker.
I forbindelse med COVG teknik ionkanal-kinetik og elektrofysiologiske egenskaber kan yderligere analyseres ved anvendelse af spændingsklemme fluorometri hvor protein bevægelse spores via cystein konjugering af ekstracellulært anvendte fluorophorer, insertion af genetisk indkodede fluorescerende proteiner, eller inkorporering af unaturlige aminosyrer ind i området af interesse 1. Denne ekstra data giver kinetisk information om spændingsafhængige konformationelle rearrangements af protein via ændringer i mikromiljø omkring fluorescerende molekyle.
Introduction
Specialized spændingsfikseringsenheden teknikker tillader registrering af ionstrømme på kontrollerede membranpotentialer. Udbredte to-elektrode spænding klemme (TEVC) og patch clamp teknikker giver pålidelig elektrofysiologiske oplysninger om egenskaberne af mange ionkanaler. Men begge disse metoder har ulemper, der forhindrer erhvervelse af pålidelige data til hurtige spændingsafhængige natrium-kanaler og andre hurtigt aktiverende kanaler i membraner såsom dem af Xenopus oocytter. De Bezanilla og Stefani laboratorier derfor udviklet cut-open Vaseline kløften spænding clamp teknik (COVG) for oocyter 2. Teknikken har været anvendt bredt til at optage, Na +, K + og Ca2 + kanaler 3-8.
Under COVG optagelse indspilles en heterologt protein-udtrykkende oocyt membran opdelt i tre regioner. Ionstrømmen data registreres fra den øverste region af oocyt sombad omkring topområde er fastspændt på en kommando potentiale, som let og hurtigt kan ændres. Den midterste region beskytter mod lækstrømme ved at være fastspændt på samme potentiale som den øverste region 9. Bundområdet er hvor oocyt åbning (cut-åben) sker gennem brug af en saponin-opløsning eller en kanyle. Kemisk eller manuel åbning af membranen i bundområdet muliggør styring af det indre potentiale, som er fastspændt til jorden, og gør cellens indre sammenhængende med det nedre kammer løsning. Perfusion af opløsninger i det nedre kammer kan justere egenskaberne af det indre miljø, mens opløsning udveksling i øverste kammer ændrer de ydre omgivelser. 
Figur 1. Oocyte Cut-Open Spænding-Clamp Bath Indstillingsdiagram. (A) Topned betragtning af de tre bade adskilt fra hinanden. Dimensionerne af kamrene for COVG vises på figuren. (B) Side udsigt over bade setup i testposition. Klik her for at se større billede .
Fordelene ved COVG teknik omfatter lav nuværende støj (1 nA ved 3 kHz), kontrol af den ioniske sammensætning af de eksterne medier, evnen til at modulere den interne medier, hurtig tidsopløsning (20-100 mikrosekunder tidskonstant henfald af kapacitet forbigående), og stabile optagelser i flere timer 9. Ulemperne er, at det kræver specialiseret udstyr, og det er mere vanskeligt at udføre i forhold til to elektrode spændingsfikseringsenheden (TEVC) 10.
Mens COVG tilgang kræver højt specialiseret udstyr og indviklede proceduremæssige elementer, kan det give mulighed for erhvervelse af værdifuldestand elektrofysiologiske data. Disse data, som f.eks gating strømme med hurtige kinetik og halestrømme 4, kan registreres, uden nogle af de spørgsmål, der er forbundet med andre spændingsfikseringsenheden protokoller, herunder kanal nedslidte. Mindre ændringer til den COVG setup kan tillade brugen af temperaturregulatorer og spænding klemme fluorometri (VCF). Inddragelsen af spændingsklemme fluorometri elementer i COVG samling kan forøge data output ved at give mulighed for at overvåge protein konformationsændringer samtidig optager strøm 11-13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Initial Setup Udstyr
- Placer scenen og mikroelektrode manipulator på en vibrationsfri isolation (f.eks en luft tabel) med en omgivende Faradays bur for at undgå elektrisk og mekanisk støj.
- Lod seks Ag / AgCl pellets til seks-tommer længder af 24 AWG. For en af disse længder (tilsluttes til P1), splejsning i en anden tråd til dannelse af en "Y". På enderne af hver tråd lodde en guld BNC pin, som er inkluderet med forstærkeren.
- Forbind de fem Ag / AgCl pellets loddet til 24 AWG ledning til Bad / Guard hovedtrin (P1, P2, CC, GS1, og GS2). Tilslut "I" Ag / AgCl pille til "I" hovedtrin og den anden ledning der kommer ud af P1 til V2 hovedtrin.
- Tilslut forstærkeren til datafangst enhed i henhold til anvisningerne i det udstyr, manualer.
- Placer og epoxy temperaturstyringen termistorer. Tråd blokken termistor gennem et hul i metallet stilladsetd direkte over midten af den varme / køling element. Placer og epoxy bad termistor i et hul boret i kroppen af temperatur-ledende bundkammeret meget tæt, men ikke i kontakt med opløsningen.
2. Oocyt og indledende forberedelse
- Hvis du vil optage et heterologt udtrykt kanal som HNA V 1.5, syntetisere mRNA (afledt af hSCN5a), og indsprøjte det i en Xenopus oocyt omkring 4-5 dage, før du udfører protokol 4. For hSCN5a er topekspression opnås efter inkubation i 4-5 dage ved 19 ° C. Der henvises til Richards og Dempski 14 og Cohen et al. 15 for detaljerede instruktioner om ægcelle, mRNA forberedelse og oocyt injektion.
- Klorid AgCI ledninger og AgCI piller, før du begynder protokol 4. For at gøre dette, skal du placere den ene ende af wiren og pellets i blegemiddel i mindst 20 minutter, og så længe O / N. Når pellets er blevet chloridudgave, anbringe dem til manifolden ved hjælp af klæbemiddel.
Bemærk: Kørsel strøm gennem ledningerne kan også anvendes til chlorid tråd og pellets. Denne teknik vil øge hastigheden af chloridation men også kræver mere udstyr. Se Teknikker til Chloriding sølvtråde for yderligere vejledning 16.
3. Agar Bridge Forberedelse
- Lav mindst seks agar broer ved at opvarme den ene ende af et borsilicat kapillarrør i et medium flamme. Sørg for, at enden af kapillarrør er i den øverste del af den blå flamme. Gøre ekstra broer i tilfælde af beskadigelse af originalerne.
- Når kapillarrøret er varmet op, pincet til at gøre en 90 ° bøjning i røret. Sigt efter en bøjning med en jævn krumning snarere end en brat hjørne eller det kan reducere den indre diameter af glas, som gør påfyldning vanskeligere og øger modstanden af broen.
- Lav en anden 90 ° bøjningi samme retning 25 mm ned kapillarrøret fra den første bøjning ved hjælp af de samme trin.
Bemærk: Den nøjagtige længde af broen er ligegyldigt, så længe broen størrelse er konsistent, men i sidste ende de længder, skal være egnet til riggen, de vil blive brugt på. Husk på, at broen modstand er proportional med dens længde og bør minimeres. - Når kapillarrørene er afkølet, skal du bruge en diamant spids glas cutter at trimme "ben" af broen til ca 5 mm.
- Indsæt længder af platintråd ind i kapillarrørene af de tre "strømforsyningsorganet" broer for at forbedre ydeevnen ved at reducere modstand i agar 17. Skær overskydende platintråd, så der ikke er nogen ledning udsættes uden for røret.
Bemærk: På grund af den høje pris på platin, hente og genbruge nogen ledning fra ødelagte broer. - Skub platintråden længere ind i kapillarrøret med en spids redskab, såsom en mikropipette tip således at tråden 1 mm kortere end glasset på begge ender af kapillarrøret.
- Lav 100 ml 1 M NMDG bufret med 1,2 g HEPES. Brug et pH-meter og tilføj MES hydrat pulver, indtil en pH på 7,4 er nået (~ 10 g). Når en pH-værdi på 7,4 er nået, fjernes pH-elektroden. Braklægning 40 ml af opløsningen for at holde som en storage-løsning.
- Læg granuleret agar for at fremstille en agarblanding 2-3%. Rør rundt og varme, indtil agaropløsningen opløses og klar. Må ikke overophedes eller koge den løsning, da det vil blive alt for tyktflydende og fylde broerne vil være vanskeligt.
- Flyt agaropløsning i et nyt bæger og tilføje en lille omrører. Fortsæt opvarmning og omrøring ved moderat hastighed.
- Tilsæt kapillære broer én ad gangen med benene opad. Over tid broerne vil fylde med agar. Alternativt fylde broerne ved at skubbe agar løsning gennem en sprøjte knyttet til en lille pipette spids.
- Når der ikke er bobler i bridges, hente broerne fra agaropløsningen og placere broerne på et stykke køkkenrulle til at tørre. Eventuelle broer med resterende bobler kan ophidset med en pincet for at lette boble exit.
Bemærk: Fast agar med bobler kan fjernes fuldstændigt ved at nedsænke broer i kogende vand. Når agaren er fjernet, anvendes en vakuumledning for at fjerne resterende vand. Broer kan derefter genanvendes til agar behandling. - Fjern overskydende agar fra broerne, når tørre. 60 ml vand til reserven løsning 40 ml og placere broerne i lagerløsning.
4.. Cut-open Rig Forberedelse
- Tænd for vandet kilde til temperatur controller og derefter afbryderen til temperatur regulatoren. Vent badet temperaturen når den specificerede temperatur (19 ° C).
- Træk mikroelektroder fra borosilicate kapillarrør med en mikroelektrode aftrækker til en modstand på 0,2-0,5 MOhm.
Bemærk: Sænkning pipette modstand forbedrer fastspænding hastighed. Men er mere tilbøjelige til at skade ægget, lavere modstand pipetter. Eksperimenter er nødvendig for at bestemme den bedste pipette modstand værdi for hvert program. - Forbered saponin løsning ved at blande 0,125 g tørt saponin med 50 ml intern løsning. Dette vil føre til en 0,25% opløsning. Vend forsigtigt for at blande.
- Under et dissektionsmikroskop anvende en lille mængde vaseline omkring kanten af hullet på oversiden af den midterste kammer og bunden af det øvre kammer med en meget spids genstand.
Bemærk: "doughnut" Vaseline vil hjælpe med at holde ægget på plads over hullet og vil støtte i dannelsen af forseglingen. Men for meget Vaseline vil fælde bobler og forhindre de løsninger at nå oocyt overflade. - Tilsæt 3 M KCl-opløsning ind i de mangfoldige slots Holding AG / AgCl piller, så at der ikke er overløb fra slots, men pillerne og bro ben ender er vigrød. Ryd op ekstra KCI dråber for at forhindre uønskede elektriske forbindelser mellem slots.
- Tilføj ekstern løsning til de lavere og mellemste bad kamre.
- Placer agar broer ind i åbningerne i AgCl pille manifold, så det ene ben pr broen er i hvert hul. Det andet ben af broerne vil senere blive placeret i de respektive kamre (P1, P2, CC toppen, GS1, GS2 midten (vagt) I bund). Sørg for, at platin wire broer er i GS2, P2, og I slots.
Bemærk: Sørg broer vaskes med destilleret vand og helt tørre, før du sætter ind i kammeret bad. - Tænd for datafangst og PC. Start optagelse software.
5.. Cut-offentligt udbud
- Monter de øverste og mellemste oocyt kamre uden en oocyt. Skub den øverste kammer off-center, således at hullerne i de to kamre ikke overlapper hinanden. Udfyld alle kamre med ekstern løsning og placere alle elektroderne i deres respektive kamre.
Bemærk: Du må ikke skubbe den øverste kammer hele vejen ned, når du installerer kamrene. Sørg for, at et meget lille hul forbliver mellem de to kamre. Excentermålet arrangement øger modstanden af kammeret for at bedre at simulere tilstedeværelsen af en celle. Denne proces, der kaldes "afvejning af de broer", kompenserer for de forskudte potentialer, der kan opstå fra inhomogenitet blandt agar broer.- Sluk for eksterne kommando og begge klemmer. Kontrollér den aktuelle læsning på forstærkeren. Juster med en lille skruetrækker P offset på bagsiden af bad / vagt head-etape til nul strøm.
- Skift bad / vagtskifte på forstærkeren til aktiv og justere GS offset for at opnå nul strøm.
- Gentag mellem "aktiv" og "passiv", indtil begge er rimeligt tæt på nul (<100 nA).
- Fjern det øverste kammer og overføre en oocyt i midten badkammeret anvendelse af en pipette pumpe. Sørg for, at oocyte er placeret over hullet i midten af badet.
Bemærk: Når du forbereder en oocyt til VCF placere mærkede celle ind i kammeret med dyret pol (mørkere side) opad. Cell orientering betyder ikke noget, hvis VCF ikke udføres. - Fjern overskydende ekstern opløsning fra bunden badet ved hjælp af et sug til at skabe en tætning mellem oocytten og badoverfladen.
- Anbring det øverste badkammeret over oocyt, således at hullet i kammeret er centreret på toppen af oocyt. Ved hjælp af en tommel-og langfinger, langsomt pres ned på kammeret, indtil den presses tæt mod oocytten, således at udsætte kun en lille del af membranen til den øvre bad gennem hullet.
Bemærk: oocyt kan bule under pres fra den øverste kammer. Brug ikke overdreven kraft, til den øverste kammer, da dette vil medføre ægget til at briste. Pincet tips placeret på diagonale hjørner af øverste kammer kan anvendes som et alternativ til fingre til apply nedadgående pres. - Tilføj ekstern løsning på de øverste og nederste bade, indtil de er næsten fuld.
- Placer de frie ben af agar broer i den eksterne opløsning af hvert bad, som det ses i figur 2 (bro placering). Sørg for, at hver bro hviler i sin korrekte bad placering. (Jeg bro i bunden bad, GS1 og GS2 broer i midten bad og P1, P2, og CC broer i øverste bad). Skift bad / vagtskifte på forstærkeren til aktiv.
Bemærk: Sørg for der er ingen 3 M KCl forbindelser mellem broerne, deres brønde og optagelsen kamre. Desuden skal du sørge broer er formet således, at de er hævet over optagelse kammer løsninger.
Figur 2. Agar Bridge Setup Placering diagram. Placement placeringen af de frie ender af de agar broeri de forskellige bade. Klik her for at se større billede . - Start en test protokol i optagelse software. Hvis pulsen viser lodret forskydning af det horisontale afsnit mellem de to toppe ved at anvende en 100 mV puls, der er større end 100 nA (svarende til 0,3 MOhm med bad / vagt i passiv) derefter øge tætheden af badet dækning. Se figur 3 for et eksempel på en ideel test puls.
Bemærk: Den forsøgsprotokol udsender en spænding puls at se, om badet dækning er stram nok, og alle komponenter er samlet korrekt. Alternativt kan prøven funktion af forstærkeren anvendes.
Figur 3. Ideel Testimpuls fra Recording Software. Testen pulsskal ligne ovenstående puls afhængig af protokol anvendt. Beholdningen strøm (center baseline) bør være tæt på nul. Klik her for at se større billede . - Fjern det eksterne løsning i bunden bad og erstatte med saponin løsning. Vær omhyggelig med at undgå at skabe bobler, mens tilføje saponin. For at sikre maksimal udskiftning sugning på den modsatte ende af bunden bad, mens tilsætning af opløsningen.
- Efter at der er tilsat saponin løsning, observere den gentagne test puls. Hvis toppen af forsøgsprotokollen reducerer eller forsvinder, så er dette et tegn på, at der er en boble placeret under oocyt. I dette tilfælde helt fjerne saponin-opløsning og derefter erstatte den.
Bemærk: Permeabilisering er typisk fuldstændig inden for 30 sek med frisk saponin løsning. Opløsningerne kan have svært ved at nå den celle, hvis der er indespærrede boblereller hvis den follikulære lag forbliver på et dårligt fordøjet oocyt. Oocytten er blevet permeabiliseret (åbnes), når hældningen af spændingsstigning aftager (stigning i tidskonstant henfald).
Figur 4.. Testimpuls Traces Under oocyt Permeabilisering. Valgte spor fra testimpulsen protokollen efter en 0,25% saponin opløsning blev indført i bunden oocyt kammeret. Forøgelsen af tidskonstant forfald set i sporene viser en stigning på oocyt permeabilization. Klik her for at se større billede . - Når cellen permeabiliseres fjerne saponin opløsning og fylde bad med indre opløsning. Stop forsøgsprotokollen.
Bemærk: Selv om saponin giver adgang tilcellens indre ved permeabilisering membranen, ligevægt af ionkoncentrationer mellem den nedre bad og cytoplasma oocytten ved diffusion er en meget langsom proces. Denne proces kan kræve ti minutter afhængigt af betingelser (figur 5). - Kontrollér for eventuelle høje niveauer af opløsning i bade og krystalliseret KCl mellem brøndene af manifolden, da disse kan forårsage kortslutninger og uberegnelig adfærd.
- Brug modificerede sprøjte til at injicere 3 M KCI i en mikroelektrode. Flick mikroelektroden flere gange med én finger, mens afstivning med de andre fingre.
Bemærk: Dette trin er nødvendigt for at fjerne eventuelle luftbobler inden mikroelektroden. - Monter KCl-fyldte elektrode på mikromanipulator armen ved indsætning af tråden glødetråd i den åbne mikroelektrode ende. Skub enden af mikroelektroden i endeløse holderen og sørg elektroden ikke er løst. Spænd elektroden beslag.
Bemærk: MaKE sikker på, at tråden har en endnu AgCI belægning for elektroden at fungere normalt. - Sving armen i position over oocyt bade og spænd klemmerne for at forhindre yderligere arm bevægelse.
- Ved hjælp af manipulatoren drejeknapper, gå elektroden ned i badet. Sørg for, at ingen test puls påføres og at membranen test funktionen aktiveres ikke på dette punkt.
Bemærk: Før elektrodespidsen er indsat i væsken, V1-V2 på spændingsklemme vil læse en positiv spænding. Når elektroden spids er indsat i væsken, bør spændingen måler på spændingsklemme skifte til en værdi tæt på nul. For VCF optagelser, elektroden skal nærme cellen på et forholdsvis lavvandet vinkel at give plads til målsætningen. Spidde cellen med elektroden off-center, tættere på kanten af den isolerede membran patch hjælper også til at undgå sammenstød af målet med elektroden. - Stop gå elektroden ned. Sæt elektroden offsetpotentiale til nul ved at trykke på V1 knappen og derefter reducere V1 spænding til nul ved at justere V1 offset. Desuden udføre den samme justering for V2. Den potentielle forskel V1-V2 læses 000 mV.
- Skift tilbage til V1 og drej Z-test på at måle elektrode modstand. Værdien vil gradvist falde og nærme sig den faktiske modstand. Sigt efter en modstand værdi på 0,2-0,5 MOhm.
- Fortsæt gå elektroden ned mod synlige plaster på ægget i den øverste bad. Når mikroelektrode er meget tæt på oocyt, se V1-V2 læsning at se, når elektroden ind i ægget, V1-V2 spænding bliver negativ, når mikroelektrode trænger ind i cellen.
Bemærk: Den viste på dette punkt værdi er membranpotentialet af cellen og vil blive berørt af de kanaler udtryk for, og de løsninger, der anvendes. Indsættelse mikroelektrode for langt vil skade cellemembranen. - Åbn dataindsamlingen protokol ioptagelse software.
- Vend på den klemme kontakten på den spænding klemme og justere potentiale til at matche kommandoen (f.eks -100 mV) ved at justere knappen placeret på "I" hovedtrin.
- Vend på kapacitans og modstand kompensation switch.
- Flip "Test" tænde på "kommandoer" region af spændingen klemme. Brug oscilloskopet at visualisere signalet. Juster kompensation drejeknapper cm i signal-condition segment at reducere kapacitive transienter på oscilloskopet. Må ikke over-kompensere toppene til det punkt, hvor yderligere omvendte toppe forekomme eller toppene begynder at udvikle en sigmoidal krumning, der kan introducere artefakt i optagelsen.
- Når kapacitans er blevet manuelt reduceret til et tilfredsstillende niveau, slukkes test switch.
- Påbegynde dataregistrering protokol i optagelse software.
6.. Oprydning
- Når optagelserne har bin færdig, slukke for alle de forskellige kontakter på den spænding klemme, herunder klemme og bad / vagt switche.
- Pincet til at fjerne agar broer fra de forskellige bade.
- Fjern det øverste bad og aspirér alle de løsninger og oocyt fra alle bade.
- Brug en flaske demineraliseret vand til at skylle alle de bade og derefter aspireres bade med et vakuum. Gentag dette trin 3-5x.
- Tør krystalliseret KCl fra broerne og placere broerne i lagerløsning. Broer kan genbruges i mange uger, så længe de er korrekt opbevaret.
- Aspirer KCI-opløsning fra de mangfoldige brøndene og skylles manifolden med deioniseret vand flere gange.
- Sluk alt diverse udstyr, herunder temperaturstyring og optagelse software.
7.. Tilsætning af Voltage Clamp fluorometri
- Følg trinene i afsnit 1 til 6 i en tidligere offentliggjort JOVE protokol 16 Examining den Konformationel Dynamics membranproteiner in situ med Steddirigeret fluorescensmærkning: Klik her for at se siden.
- Udfør trinene i afsnit 4 til 5.22 i ovennævnte COVG protokollen ved hjælp af en venturekapitalfond mikroskop sat til 4X fokus.
Bemærk: VCF optagelser kræver større oocyt bad kamre end krævet i COVG målinger. (Dimensioner brugerdefinerede VCF kamre er placeret i listen materialer.) Denne større VCF kammer skal være i stand til samtidigt imødekommende objektivlinsen, mikroelektrode, og agar broer. Derudover dyret pol (mørke side af oocyt) skal vende opad i kammeret til lav baggrund VCF optagelser. - Bring den øverste del af oocytten i fokus ved hjælp af en vand-nedsænkning 40X mål.
Bemærk: Skift fra 4X til 40X målsætning kræver en bestemt geometry af afskårne åbne komponenter og omhyggelig opmærksomhed, så for ikke at ramme elektrode, broer eller kamre ved sænkning af 40X mål. På grund af den øgede volumen i top vagt, sikre, at bad volumen fra toppen vagt ikke er forbundet med den midterste afskærmningen, når 40X målsætning er sat på plads. - Fokus på en ring omkring omkredsen af den udsatte oocyt overflade, så selve toppen af ægget er lidt over planet af fokus.
Bemærk: Justering i xy-planet kan være nødvendigt, så synsfeltet er for det meste fyldt med membran og ikke i kammeret. XY oversættelse opnås lettest ved placering af mikroskopet på en oversættelse fase. - Flyt filteret terning i det optiske sti og tænder lyset sti fra okularet til detektoren (diode).
- Tænd VCF lyskilden.
- Sluk loftslys, fiber lys illuminator, og andre lyskilder.
Bemærk: Ideelt set VCFoptagelser skal udføres i et helt mørkt rum. - Kør en fluorescens protokol i optagelse software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 viser ændringen i permeabilitet oocytten som en saponin-opløsning påføres den nederste del af oocyt. Figur 5 viser hastigheden af intracellulær opløsning udveksling ved diffusion efter saponin permeabilisering. 20-40 min er forpligtet til at komme til en steady state 2,18.
6A viser spor genereret fra optagelsen protokollen. Figuren viser ionstrømme (efter P/-8 læk subtraktion) som svar på den spænding protokollen (indsat). Hvert spor i figuren repræsenterer en anden anvendt spænding. Sporene med langsomste kinetik repræsenterer de laveste potentialer, hvor natrium-kanalen kan åbnes. Typisk hjælp af traditionelle metoder, er det vanskeligt at opretholde spænding kontrol for disse lavere potentialer fordi aktiv strøm depolariserer membranen. Denne depolarisering igen aktiverer flere kanaler at skabe et positivt feedback loop . Den forbedrede klemme hastighed cut-åben teknik muliggør spænding kontrol der kræves for at optage den kanal selv på disse vanskelige potentialer.
6B viser den aktuelle / spænding kurve, der blev genereret fra spor i figur 6A. Uden spænding kontrol nævnt ovenfor spidsstrømmen tidligst potentialer (~ -60 mV) ville være overvurderet. Dette ville forhindre nøjagtig beskrivelse af den aktuelle spænding forhold.
Figur 7 viser et eksempel på spændingsklemme fluorometri resultater for en oocyt. De fluorescerende signaler blev registreret fra en oocyt mærket med MTS-TAMRA ved en cystein indsat ved position 805 i DII domæne af den humane hjerte-natriumkanalen Na V 1.5.
_upload/51040/51040fig5.jpg "width =" 500px "/>
Figur 5. Kinetik af Cytoplasmatisk Na + Koncentration Change ved diffusion. Satsen for intern løsning ligevægtsindstilling blev vurderet ved anvendelse af 90 mM Na + til både eksterne og interne sider af cellen og derefter måle Na + tilbageførsel potentiale ved at optage IV relationer hver 2 min. Hvis den interne miljø perfekt blev udskiftet, ville E rev være 0 mV. Tidsmålinger blev startet, da saponin permeabiliseres oocyt membran. Klik her for at se større billede .
Figur 6. Wild Type Na v 1.5Natrium Channel Resultater fra Cut-Open spændingsfikseringsenheden. (A) spor af optaget strøm fra forskellige stimuli spændinger fra en bedrift potentiale -80 mV ned til -120 mV til 100 millisekunder, testimpulsen (-120 mV til +40 mV i 10 mV trin) til 200 msek, og endelig repolarizing til -120 mV. (B) Den IV kurve, som repræsenterer den spænding afhængighed spidsstrøm i panel A. Her spidsstrømmen for impulser op til +60 mV vises. Klik her for at se større billede .
Figur 7. Na v 1.5 Natrium Channel spændingsklemme fluorometriassay Recordings. (A) ionstrømmene optaget fra en oocytmærket med MTS-TAMRA ved en cystein indsat ved position 805 i DII-S4 domæne af den humane hjerte-natriumkanalen Na V 1.5. Spændingspulser spænder fra -170 mV til +70 mV blev anvendt i 20 mV intervaller i en periode på 20 msek efter en præimpuls til -120 mV. (B) de associerede fluorescens signaler. Hver anden fluorescens spor er udeladt for klarhed. Bf / F repræsenterer den relative ændring af fluorescens intensitet fremkaldt af spænding puls. Klik her for at se større billede .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cut-open oocyt Vaseline hul spænding clamp teknik giver mulighed for hurtig løsning af data, lav støj, øget kontrol over intern løsning og ekstern løsning sammensætning, og stabile optagelser med relativt lange protokoller 19. Disse fordele indstille denne teknik bortset fra standard to-elektrode spænding klemme og patch clamp teknikker. Selvom specialudstyr er påkrævet, og protokollen er relativt svært, optræder meget få spørgsmål, når systemet er blevet optimeret. Dette giver mulighed for reproducerbare optagelser af natrium (HNA V 1.5) og andre hurtige-aktiverende kanaler.
De mest kritiske trin i protokollen er placeringen af den øverste kammer på oocytten og impalement med V1 elektrode. Tæthed af forseglingen mellem cellen og kanter af kammeret huller har en stor indvirkning på optagekvalitet. Det øverste kammer skal skubbes ned på cellen for at opnå den højest mulige rebistand uden at beskadige oocyt. Dette vil kræve, at gøre oocyt bule og flade, men erfaring og overvejelse af cellernes kvalitet er nødvendig for at bestemme den optimale pres for at forhindre brud. Hurtig optagelse kræver brug af den størst mulige pipette åbning, der konsekvent kan anvendes uden at beskadige cellen. Særlig opmærksomhed skal rettes til tilspidsning af pipetten, som bør være overfladisk nok til ikke at markant udvide såret som pipettespidsen er indsat. Impalement bør ske langsomt og forsigtigt, øjeblikkeligt at standse elektrode fremskridt på udseendet af membranpotentialet læsning.
Skader på oocyt membran og mindre end perfekt oocyt / kammer sæler kan føre til høje læk strømme. Høje læk strømme altid forringe kvaliteten af optagelserne. Således bør optagelser altid har lave læk strømme (helst <150-200 NA). Forstærkerens kompensationskredsløb, anvendelse af P / N online lækage-correction, eller off-line procedurer kan kompensere for lækage strøm.
Fejlfinding bør begynde med dobbeltkontrol, at alle komponenter er fastgjort eller justeret korrekt, hvilket generelt vil løse de fleste problemer. Under klargøring og eksperimentet selv, skal man være særlig opmærksom på eventuelle spildt eller overfyldte væskestande og krystalliseret KCl da disse elektrisk kan forbinde rum, der er beregnet til at være isoleret. Hvis systemet opfører sig uventet, så tjek for manglende eller uønskede forbindelser mellem broer og kamre. Luftbobler inden agar broer, ved enderne af agar broer eller fanget under celle kan også forårsage forbindelsesproblemer, der er vanskelig at opdage.
Ændringer, som beskrevet ovenfor, er forpligtet til at udføre spændingsklemme fluorometri (VCF) sammen med COVG. Den vigtigste ændring indebærer anvendelse af en ændret bad design. For at tilgodese anvendelsen af en vand-nedsænkning 40X objektivpå mikroskopet, skal det øverste kammer badet være større end det skulle være for en standard cut-åbne setup. Andre aspekter og udstyr behov for VCF optagelse i COVG tilstand ligner VCF optagelse i to-elektrode spænding-clamp-tilstand 14. Som fremhævet tidligere, er den største fordel af COVG teknik er meget hurtigere og præcis spænding kontrol i forhold til TEVC i en membran patch, der udtrykker langt flere ionkanaler, end der kan opnås i mammale ekspressionssystemer. Således teknik er ideel til VCF og gating igangværende undersøgelser, hvor der kræves både høj tidslig opløsning og høje kanalnumre for påviselige signaler.
Selv i princippet er mulige både ekstra-og intracellulære løsning udvekslinger, deres fuldstændighed og hastigheden af udvekslingen sat nogle begrænsninger for bestemte typer af eksperimenter. Som vist i figur 5, er antallet af ligevægt af ionkoncentrationer mellem cytoplasmaet og den nedre chamber er temmelig langsomme efter saponin permeabilization. Ændring ionkoncentrationer bør derfor overvejes under lange forsøg forud for den celle, der ankommer til en stabil tilstand. Valutakurser kan variere i vid udstrækning afhængigt af betingelserne. Høj kanal udtryk, stor drivkraft, og højere temperatur resulterer i hurtigere satser. I vores eksperiment cellen blev afkølet til 19 ° C, kanal udtryk var moderat, og nettoladningen drevet af IV-protokoller var minimal på grund af skiftende aktuelle retning. I disse indstillinger normal COVG teknik er ringere end diverse patch-clamp konfigurationer. For COVG applikationer, der kræver hurtig udskiftning af det cytoplasmatiske medium en perfusion kanyle kan anvendes. I fremtiden kan COVG kamre designet med indbygget perfusion porte giver mulighed for bedre kontrol over de valutakurser karakteristika ekstracellulære løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Alle medlemmer af Washington University i St. Louis Cardiac Molecular Engineering Lab. En Burroughs Velkommen Fund Career Award ved den videnskabelige Interface - 1010299 (til JS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Solution | Brand | Catalog Number | [Final], weight, or volume |
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 25mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 90mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Internal Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 105mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 10mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Depolarizing Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 110mM |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | 1.5mM |
| Calcium Chloride | Caisson | C021 | 0.8mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 10mM |
| Pipet Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 3M |
| Saponin Solution | |||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | 0.125g |
| Internal Solution | See above | 50mL | |
| Agar Bridge Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 100ml of 1M |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 1.2g |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Granulated Agar | Research Products International | A20250 | 3% |
| NMDG Storage Solution | |||
| NMDG, HEPES, MES Hydrate solution | see above | 40ml | |
| Water | 60ml | ||
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan | CA-1B | |
| Data Acquisition System | Axon CNS | Digidata 1440A | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 210 | |
| Rack Power Filter | APC | G5 | |
| Heating/Cooling Bath Temperature Controller | Dagan | HCC-100A | |
| PC | Dell | Optiplex 990 | |
| pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software | Molecular Devices, LLC | pCLAMP10.3 | |
| TMC Vibration Control TableTop Platform | TMC | 64 SERIES | |
| TMC Vibration Control Air Table | TMC | 20 Series | |
| V1/I Electrode Data Collector | Dagan | part of CA-1B | |
| MX10L Micromanipulator | Siskiyou | MX10L | |
| Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors) | Dagan | part of CA-1B | |
| Microscope | Omano | OM2300S-JW11 | |
| Temperature Control Bath | Custom or Dagan | Custom or HE-204C | Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C). |
| Custom AgCl Pellet Container | Custom | Custom | Custom machined |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm | Warner | E-206 | |
| External Oocyte Bath | Custom or Dagan | Custom or CC-1-T-LB | Custom machined or purchased from Dagan |
| Internal Oocyte Bath | Custom or Dagan | Custom or CC-TG-ND | Custom machined or purchased from Dagan |
| Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes | Warner | G150T-4 | |
| Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath | Siskiyou | SD-1280P | |
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner | LMI-600 | |
| Regular Bleach | Clorox | 470174-764 | |
| Xenopus laevis Oocytes | Nasco | LM535M (sexually mature females) | |
| 90 Na+ External Solution | See Solutions sheet | ||
| 10 Na+ Internal Solution | See Solutions sheet | ||
| 3 M KCL | See Solutions sheet | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| NMDG Storage Solution | See Solutions sheet | ||
| 5mL transfer pipets | SciMart | GS-52 | |
| Modified KCl electrode injector | BD | 309659 | Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased. |
| Microvaccum | Custom | Custom | |
| Forceps | VWR | 63040-458 | |
| Oocyte Handling Tools (Pipette Pump) | VWR | 53502-222 | |
| Deionized Water Squirt Bottle | VWR | 16649-911 | |
| Vaseline Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086-291 | |
| Additional Materials Required for VCF Recordings: | |||
| VCF Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Nikon CFI APO 40XW NIR Objective | Nikon | N40X-NIR | |
| X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes | Sutter Instruments | MT500-586 | |
| External VCF Oocyte Bath | Custom | Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm. | |
| Internal VCF Oocyte Bath | Custom | Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm. | |
| Modified Temperature Control Bath | Custom | Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber. |
References
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).
- Stefani, E., Bezanilla, F. Cut-open oocyte voltage-clamp technique. Methods Enzymol. 293, 300-318 (1998).
- Muroi, Y., Chanda, B. Local anesthetics disrupt energetic coupling between the voltage-sensing segments of a sodium channel. J. Gen. Physiol. 133, 1-15 (2009).
- Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents. Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).
- Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes. J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).
- Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function. J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).
- Silva, J. R., Goldstein, S. A. Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle. Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).
- Silva, J. R., Goldstein, S. A. Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I). J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).
- Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes. Biophys. J. 61, 78-82 (1992).
- Clare, J. J., Trezise, D. J. Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening. , Wiley-VCH. (2006).
- Susan, G. A. Methods in enzymology. 296, Academic Press. 566-578 (1998).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19, 1127-1140 (1997).
- Richards, R., Dempski, R. E. Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling. J. Vis. Exp. , (2011).
- Cohen, S., Au, S., Pante, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J. Vis. Exp. , (2009).
- Techniques for Chloriding Silver Wires. , Available from: http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf (1999).
- Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: a possible generator of offset voltages and currents. J. Neurosci. Methods. 19, 249-255 (1987).
- Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter. J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).
- Pantazis, A., Olcese, R. Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference. Roberts, G. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. (2013).
