Summary
Snittet-öppna vaselin gapet metod används för att erhålla låga ljudinspelningar av joniska och grind strömmar från spänningsberoende jonkanaler som uttrycks i Xenopus oocyter med hög upplösning på snabba kanal kinetik. Med mindre modifiering, kan spänningen klämma fluorometri kopplas till cut-öppna äggcell protokoll.
Abstract
Snittet-öppna äggcell Vaselin gap (COVG) spänningsklämtekniken möjliggör analys av elektrofysiologiska och kinetiska egenskaper heterologa jonkanaler i oocyter. Inspelningar från cut-öppen inställning är särskilt användbara för att lösa låg magnitud gating strömmar, snabb jonström aktivering och avaktivering. De främsta fördelarna över två-elektrodspänningen klämman (TEVC) teknik är ökad klämhastighet, förbättrat signal-till-brus-förhållande, och förmågan att modulera intracellulära och extracellulära miljön.
Här använder vi den mänskliga hjärtnatriumkanal (HNA V 1.5), uttryckt i Xenopus oocyter, att demonstrera cut-öppen inställning och protokoll samt ändringar som krävs för att lägga spänning klämma fluorometri förmåga.
Egenskaperna för snabba aktiverande jonkanaler, såsom HNA V 1.5, inte helt kan lösas nära rumstemperatur med hjälp TEVC, i which helheten av oocyten membranet är fastklämd, vilket gör spänningsreglering svår. Emellertid i cut-öppen teknik, isolering av endast en liten del av cellmembranet möjliggör snabb fastspänning krävs för att korrekt registrera snabb kinetik och samtidigt förhindra kanal neddragning associerad med patch clamp-tekniker.
I samband med COVG teknik jonkanal kinetik och elektrofysiologiska egenskaper kan ytterligare analyseras genom att använda spänningsklämma fluorometri, där proteinet rörelsen spåras via cystein konjugeringen av extracellulärt tillämpade fluoroforer, infogning av genetiskt kodade fluorescerande proteiner, eller inkorporering av onaturliga aminosyror in i området av intresse 1. Denna ytterligare uppgifter ger kinetisk information om spänningsberoende konforma omdisponeringar av proteinet via förändringar i mikromiljö som omger den fluorescerande molekylen.
Introduction
Specialiserade spänningsklämtekniker tillåter inspelning av joniska strömmar vid styrda membranpotentialer. Ofta används två elektroder spänning klämma (TEVC) och patch clamp teknik ger tillförlitlig elektro uppgifter om egenskaperna hos många jonkanaler. Men båda dessa metoder har nackdelar som hindrar förvärv av tillförlitliga uppgifter för snabba spänningskänsliga natriumkanaler och andra snabba aktiverande kanaler i membran som de i Xenopus oocyter. De Bezanilla och Stefani laboratorier utvecklades därför cut-öppna vaselin gapet spänningsklämteknik (COVG) för ägg 2. Tekniken har använts i stor utsträckning för att spela in, Na +, K + och Ca 2 +-kanaler 3-8.
Under COVG inspelning, är ett heterologt protein-uttryck äggcell membran uppdelad i tre regioner. Jonströmmen data registreras från den övre regionen av äggcellen sombad som omger övre regionen är fastklämd på ett kommando potential, som kan lätt och snabbt ändras. Mittområdet skyddar mot läckströmmar genom att vara fastspänd vid samma potential som den översta regionen 9. Den nedre regionen är där oocyten öppning (cut-öppen) sker genom användning av en saponin lösning eller en kanyl. Kemisk eller manuell öppning av membranet i bottenområdet möjliggör kontroll av den inre potential, som är fastklämd till jord, samt en cellens inre angränsande till den undre kammaren lösning. Perfusion av lösningar in i den nedre kammaren kan justera egenskaperna för den inre miljön, medan lösning utbyte i den övre kammaren förändrar de yttre omgivningarna. 
Figur 1. Äggcellen Cut-Open Voltage-Clamp Bath Setup Diagram. (A) Topned med de tre baden separerade från varandra. Dimensionerna hos kamrama för COVG visas på figuren. (B) från sidan av bad setup i testläge. Klicka här för att visa en större bild .
Fördelarna med COVG tekniken inkluderar låg ström brus (1 nA vid 3 kHz), kontroll av den joniska sammansättningen av de externa media, förmågan att modulera den interna medier, snabba tidsupplösning (20-100 isek tidskonstant av sönderfallet av kapacitet övergående), och stabila inspelningar i flera timmar 9. Nackdelarna är att det kräver specialutrustning och det är svårare att utföra jämfört med två elektrodspänningskläm (TEVC) 10.
Medan COVG metod kräver mycket specialiserad utrustning och intrikata processuella inslag, kan det göra det möjligt att förvärva värdeable elektrofysiologiska data. Dessa uppgifter, som t.ex. slussströmmar med snabba kinetik och stjärtströmmar 4, kan spelas in utan några av de frågor som är förknippade med andra spänningskläm protokoll inklusive kanal nedgångna. Smärre ändringar i COVG inställning kan göra det möjligt att använda temperaturregulatorer och spänningsklämma fluorometri (VCF). Införandet av spänningskläm fluorometri element inom COVG monteringen kan öka datautgång genom att ge möjlighet att övervaka proteinkonformationsförändringar och samtidigt spelar in Ström 11-13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Initial Installation av utrustning
- Placera scenen och mikroelektrod manipulator på en vibrationsisolering systemet (t.ex. en luft tabell) med en omgivande Faradays bur för att förhindra elektriska och mekaniska ljud.
- Löd sex Ag / AgCl pellets till sex-tums längder av 24 AWG-kabel. För en av dessa längder (som skall anslutas till P1), skarv i en andra tråd för att bilda en "Y". På ändarna av varje tråd löda ett guld BNC stift, som ingår med förstärkaren.
- Anslut fem Ag / AgCl pellets lödda till 24 AWG-kabel till bad / Guard huvudsteg (P1, P2, CC, GS1 och GS2). Anslut den "jag" Ag / AgCl pellet till "jag" huvudsteg och den andra tråden kommer ut av P1 till V2 huvudsteg.
- Anslut förstärkaren till datainsamlingsenheten enligt anvisningarna i handböckerna utrustningen.
- Placera och epoxi temperaturreglaget termistorer. Trä blocket termistor genom ett hål i metall scaffold direkt ovanför centrum av värme / kyl-elementet. Placera och epoxi badet termistor i ett hål borrat i kroppen av den temperatur-ledande bottenkammaren mycket nära men inte i kontakt med lösningen.
2. Äggcellen och förberedelsevis
- För att spela in ett heterologt uttryckt kanal såsom HNA V 1.5, syntetisera mRNA (härlett från hSCN5a) och injicera det i en Xenopus äggcell omkring 4-5 dagar innan du utför protokoll 4. För hSCN5a är topp uttryck som erhölls efter inkubation under 4-5 dagar vid 19 ° C. Se Richards och Dempski 14 och Cohen et al. 15 för detaljerade instruktioner om äggcellen, mRNA förberedelse och äggcellen injektion.
- Klorid i AgCl tråd och AgCl pellets innan protokoll 4. För att göra detta, placera ena änden av tråden och pellets i blekmedel i minst 20 minuter och så länge O / N. När pelletsen har klorided, anbringa dem till fördelaren med hjälp av lim.
Anm: Körning ström genom trådarna kan också användas till klorid viran och pellets. Denna teknik kommer att öka hastigheten på chloridation men kräver också mer utrustning. Se Tekniker för Chloriding Silvertrådar för vidare instruktioner 16.
3. Agar Bridge Framställning
- Göra minst sex agar broar genom att värma upp en ände av en borosilikat kapillärrör i ett medium flamma. Se till att änden av kapillärröret befinner sig i den övre delen av den blå flamma. Gör extra broar i händelse av skada på originalen.
- När kapillärröret har värmts upp, använder pincett för att göra en 90 ° vinkel böj i röret. Sikta på en böj med en jämn krökning snarare än ett abrupt hörn eller den kan avsevärt minska den inre diametern på glas, vilket gör att fylla svårare och ökar motståndet av bron.
- Gör en andra 90 ° böji samma riktning 25 mm ner i kapillärröret från den första kurvan med användning av samma steg.
OBS: Den exakta längden på bron spelar ingen roll så länge som bron storlek är konsekvent, men i slutändan längderna ska vara lämpliga för riggen de kommer att användas på. Tänk på att bryggmotståndet är proportionell mot dess längd och bör minimeras. - När kapillärrören har svalnat, använd en diamantbestyckad glas fräs att trimma "ben" bron till cirka 5 mm.
- Sätt i längder av platinatråd i kapillärrören av de tre "ström-som levererar" broar för att förbättra prestandan genom att minska motståndet i agar 17. Klipp bort överflödigt platinatråd, så att det inte finns någon tråd exponerad utanför röret.
OBS: På grund av de höga kostnaderna för platina, hämta och återanvända någon tråd från trasiga broar. - Skjut platinatråd längre in i kapillärröret med ett spetsigt verktyg såsom en mikropipett tip så att tråden är 1 mm kortare än glas på båda ändarna av kapillärröret.
- Gör 100 ml av 1 M NMDG buffrade med 1,2 g HEPES. Använd en pH-mätare och lägga MES hydrat pulver tills ett pH av 7,4 uppnås (~ 10 g). Så snart ett pH på 7,4 har nåtts, ta bort pH-elektrod. Avsätt 40 ml av lösningen för att hålla som en förvaringslösning.
- Lägg granulerad agar för att producera en 2-3% agar blandning. Rör om och värm tills ägarn lösning upplöses och tydlig. Inte överhettas eller koka lösningen eftersom det kommer att bli alltför trögflytande och fylla broarna kommer att bli svårt.
- Flytta agar lösningen på en ny bägare och tillsätt en liten omrörare. Fortsätt att värma och omrörning med måttlig hastighet.
- Lägg kapillär broar en i taget med benen vända uppåt. Med tiden broarna fylls med agar. Alternativt fylla bryggorna genom att trycka agarlösning genom en spruta fäst till en liten pipettspetsen.
- När det inte finns några bubblor i briDG Elect, hämta bryggorna från agarlösning och placera bryggorna på en pappershandduk för att torka. Alla broar med rest bubblor kan skakas med pincett för att underlätta bubbla avsluta.
Anmärkning: Fast agar med bubblor kan avlägsnas helt genom nedsänkning bryggorna i kokande vatten. När agar tas bort, använd en vakuumledning för att avlägsna kvarvarande vatten. Broar kan sedan återanvändas för agar behandling. - Ta bort överflödigt agar från broarna vid torra. Tillsätt 60 ml vatten till 40 ml reservlösning och placera broarna i lagringslösningen.
4. Cut-öppen Rig Förberedelser
- Sätt på vattenkällan för temperaturregulator och sedan strömbrytaren till temperaturreglaget. Vänta tills badtemperaturen når den angivna temperaturen (19 ° C).
- Dra microelectrodes från borosilikatglas kapillärrör med en mikroelektrod avdragare till en resistans på 0,2-0,5 Mohm.
OBS: Sänkning pipette motstånd förbättrar klämhastigheten. Men lägre motstånd pipetter är mer benägna att skada äggcellen. Experiment krävs för att bestämma den bästa pipett motståndsvärde för varje applikation. - Förbered saponin lösning genom att blanda 0,125 g torr saponin med 50 ml av en inre lösning. Detta kommer att leda till en 0,25% lösning. Vänd försiktigt för att blanda.
- Gälla under ett dissektionsmikroskop en liten mängd vaselin runt kanten av hålet på den övre sidan av den mellersta kammaren och den nedre sidan av den övre kammaren med en mycket spetsigt föremål.
Anmärkning: "donut" vaselin kommer att hjälpa till att hålla oocyten på plats över hålet och kommer att hjälpa till vid bildandet av tätningen. Men för mycket vaselin kommer fälla bubblor och förhindra lösningarna från att nå ägget ytan. - Lägg 3 M KCl lösning in i förgreningsröret platserna som håller Ag / AgCl-pellets, så att det inte finns något överflöde från slitsarna men pellets och bro ben ändarna är vikrött. Städa upp extra KCl-droppar för att förhindra oönskade elektriska anslutningar mellan spåren.
- Lägg till extern lösning på de lägre och mellersta bad kammare.
- Placera agar broarna i spåren i AgCl pelletsfördelaren så att ett ben per bro är i varje kortplats. Det andra benet av broarna kommer senare att placeras in i respektive kammare (P1, P2, CC topp, GS1, GS2 mitten (guard), I botten). Se till att platina tråd broar är i GS2, P2, och I-slots.
OBS: Se till broar tvättas med destillerat vatten och helt torr innan du sätter in i kammare bad. - Slå på datainsamlingssystem och PC. Starta inspelningsprogram.
5. Cut-öppet förfarande
- Montera de övre och mellersta äggcell kammare utan en äggcell. Skjut toppkammaren excentriskt så att hålen i de två kamrarna inte överlappar varandra. Fylla alla kammare med extern lösning och placera alla elektroderna i deras respektive kammare.
Obs: Tryck inte den övre kammaren hela vägen ner när du installerar kamrarna. Se till att ett mycket litet gap förblir mellan de två kamrarna. Den excentriskt arrangemang ökar resistansen hos kammarsystem för att bättre simulera närvaron av en cell. Denna process, som kallas "balansera broarna", kompenserar för de förskjutna potentialer som kan uppstå från homogen bland agar broar.- Stäng av externt kommando och båda klämmorna. Kontrollera den aktuella behandlingen av förstärkaren. Justera med en liten skruvmejsel P offset på baksidan av badet / guard head-stadiet till noll ström.
- Växla bad / guard switch på förstärkaren till aktiva och justera GS offset för att få noll ström.
- Upprepa mellan "aktiv" och "passiv" tills båda är någorlunda nära noll (<100 nA).
- Avlägsna den övre kammaren och överföra en oocyt i mitten badkammaren användning av en pipett pump. Se till oocyte är placerat över hålet i mitten av badet.
OBS: När man förbereder en äggcell för VCF, placera den märkta cellen in i kammaren med djuret polen (mörkare sida) vänd uppåt. Cell läggning spelar ingen roll om RKF inte utförs. - Avlägsna överskott extern lösning från botten bad med användning av en sugapparat för att skapa en tätning mellan oocyten och badytan.
- Placera topp badkammaren över oocyten så att hålet i kammaren är centrerad ovanpå oocyten. Med hjälp av en tumme och långfinger, sakta applicera tryck nedåt på kammaren tills det pressas tätt mot oocyten för att exponera endast en liten del av membranet till den övre badet genom hålet.
Obs! Äggcellen kan bukta ut under trycket från den övre kammaren. Använd inte överdriven kraft på den övre kammaren, eftersom detta kommer att orsaka äggcellen att brista. Pincett spetsar placerade på diagonala hörn av den övre kammaren kan användas som ett alternativ till fingrarna för att APPLy tryck nedåt. - Lägg extern lösning på de övre och nedre bad tills de är nästan full.
- Placera de fria benen hos agar broar in i den yttre lösningen av varje bad såsom framgår av fig. 2 (brygga placering). Se till att varje bron vilar i sitt rätta bad plats. (Jag brygga i botten bad, GS1 och GS2 broar i mitt badkar, och P1, P2, och CC broar i övre bad). Växla bad / guard switch på förstärkaren till aktiv.
OBS: Se till att det inte finns några 3 M KCl anslutningar mellan broarna, deras brunnar och inspelningskamrarna. Dessutom, se till att broar är formade så att de är upp över inspelningen kammaren lösningar.
Figur 2. Agar Bridge Setup Läge Diagram. Placerings placeringarna av de fria ändarna av agar broari de olika baden. Klicka här för att visa en större bild . - Starta ett testprotokoll i inspelningsprogrammet. Om pulsen visar vertikal förskjutning av den horisontella delen mellan de två topparna vid tillämpning av en 100 mV puls som är större än 100 nA (motsvarande 0,3 Mohm med bad / guard i passiv) sedan öka tätheten av badet locket. Se figur 3 för ett exempel på en perfekt testpuls.
Obs: Testprotokollet avger en spänningspuls för att se om badet locket är tätt nog och alla komponenter har monterats korrekt. Alternativt kan användas för testfunktionen hos förstärkaren.
Figur 3. Idealisk Test Puls från Recording Software. Testpulsbör likna den ovan pulsen beroende på protokollet tillämpas. Hållström (mitten baslinjen) bör vara nära noll. Klicka här för att visa en större bild . - Ta bort extern lösning i den nedre badet och ersätta med saponin lösning. Var noga med att inte skapa bubblor samtidigt lägga saponin. För att säkerställa maximal ersättning, applicera sug på den motsatta änden av det nedre badet under tillsats av lösningen.
- Efter saponin lösning har tillsatts, observera den upprepande testpuls. Om toppen av testprotokollet minskar eller försvinner så är det ett tecken på att det finns en bubbla som ligger nedanför äggcellen. I detta fall helt ta bort saponin lösning och sedan ersätta den.
OBS: Permeabilization är normalt klar inom 30 sekunder med färsk saponin lösning. Lösningarna kan ha svårt att nå cellen om det finns fångade bubbloreller om den follikulära skiktet förblir på en dåligt smält äggcellen. Den oocyt har permeabiliserades (öppnad) när lutningen på spänningsspiken minskar (ökning av tidskonstanten för sönderfall).
Figur 4. Testpuls Traces Under Oocyte Permeabilization. Valda rester från testpulsprotokoll efter en 0,25% saponin lösning infördes i botten oocyt kammaren. Ökningen av tidskonstant förfall ses i spåren visar på en ökning med äggcellen permeabilization. Klicka här för att visa en större bild . - När cellen permeabiliserad, ta bort saponin lösningen och fyll badkaret med intern lösning. Stoppa testprotokollet.
OBS: Även om saponin ger tillgång tillinre av cellen genom permeabilisering membranet, är utjämning av jonkoncentrationer mellan det nedre badet och cytoplasman hos oocyten genom diffusion en mycket långsam process. Denna process kan kräva tiotals minuter, beroende på förhållandena (Figur 5). - Kontrollera om det finns höga halter av lösning i badet och kristallis KCl mellan brunnarna i fördelaren eftersom dessa kan orsaka kortslutning och nyckfulla beteende.
- Använd den modifierade spruta för att injicera 3 M KCl i en mikroelektrod. Snärta mikroelektroden flera gånger med ett finger medan stagning med de andra fingrarna.
OBS: Detta steg krävs för att avlägsna eventuella luftbubblor i mikroelektrod. - Montera KCl fyllda elektrod på mikromanipulator armen genom att sätta in trådfilament i den öppna mikroelektroden slut. Skjut in änden av mikroelektrod in i glödhållaren och se till att elektroden inte är löst. Dra elektrodfästanordningen.
Notera: Make till att tråden har en jämn AgCl beläggning för elektroden för att fungera normalt. - Swing armen i läge över äggcellen bad och dra åt klämmorna för att förhindra ytterligare armrörelse.
- Med hjälp av manipulator rattar, gå elektroden ner i badet. Se till att ingen testpuls tillämpas och att membranprov funktionen är inte aktiverad på denna punkt.
Observera: Innan elektrodspetsen införes i vätskan, V1-V2 på spänningsklämman kommer att läsa en positiv spänning. När elektrodspetsen införes i vätskan, bör spänningsmätaren på spänningsklämma ändras till ett värde nära noll. För VCF inspelningar behöver elektroden att närma cellen vid en relativt liten vinkel för att lämna utrymme för det syftet. Spetsa cellen med elektrod ocentrerad, närmare kanten av det isolerade membranplåster hjälper också till att undvika kollisionen av målet med elektroden. - Sluta gå elektroden ner. Ställ in elektrod offsetpotential till noll genom att trycka på V1-knappen och sedan minska V1 spänningen till noll genom att justera V1 offset. Dessutom utför samma justering för V2. Potentialskillnaden V1-V2 bör läsa 000 mV.
- Byt tillbaka till V1 och vrid Z-test på att mäta elektrodmotstånd. Värdet kommer gradvis att sjunka och närma sig den faktiska motståndet. Sikta på ett motståndsvärde på 0,2-0,5 Mohm.
- Fortsätt gå elektroden ner mot synliga fläck av äggcellen i toppen bad. När mikroelektrod är mycket nära till äggcellen, titta på V1-V2 läsning att se när elektroden går in i äggcellen, V1-V2 spänningen blir negativ när mikroelektrod in i cellen.
Obs: Värdet som visas vid denna punkt är membranpotentialen i cellen och kommer att påverkas av de kanaler som uttrycks och de lösningar som använts. Insättning av mikroelektrod för långt kommer att skada cellmembranet. - Öppna datainsamlingsprotokoll iinspelningsprogram.
- Vänd på klämman brytare på spänningsklämman och justera potential att matcha kommandot (t.ex. -100 mV) genom att justera ratten sitter på "jag" huvudsteg.
- Vänd på kapacitans och motstånd kompensation switch.
- Vänd på "Test" tända på "Kommandon" region i spänningsklämman. Använd oscilloskopet att visualisera signalen. Justera Cm ersättnings rattarna i signalkonditionerings-segmentet för att minska de kapacitiva transienter på oscilloskopet. Dra inte kompensera topparna till den punkt där ytterligare omvända toppar inträffar eller topparna börja utveckla en sigmoidal krökning, som kan införa artefakter i inspelningen.
- När kapacitansen har manuellt reducerats till en tillfredsställande nivå, stäng av provdon.
- Påbörja dataregistreringsprotokollet i inspelningsprogrammet.
6. Rensning
- När inspelningarna har been klar, stäng av alla de olika omkopplarna på spänningsklämman inklusive klämma och bad / vaktbrytare.
- Använd pincett för att avlägsna agar broar från de olika baden.
- Ta bort den översta bad och aspirera alla lösningar och äggcellen från alla bad.
- Använd en flaska med avjoniserat vatten för att skölja alla bad och sedan aspirera badet med ett vakuum. Upprepa steg 3-5x.
- Torka kristalliserad KCl bort broarna och placera broarna i förvaringslösningen. Broar kan återanvändas i flera veckor så länge de förvaras på rätt sätt.
- Aspirera KCl-lösning från de många brunnar och skölj grenröret med avjoniserat vatten flera gånger.
- Stäng av alla de olika utrustning, inklusive temperaturkontroll och inspelningsprogram.
7. Tillägg av Voltage Clamp fluorometri
- Följ anvisningarna i avsnitt 1 till 6 i en tidigare publicerad JUPITER-protokoll 16 Examining konforma Dynamics av membranproteiner in situ med Site-riktad Fluorescens märkning: Klicka här för att se sidan.
- Utför stegen i avsnitt 4 till 5,22 i den tidigare nämnda COVG protokollet använder en VCF mikroskop inställd på 4X fokus.
OBS: RKF inspelningar kräver större äggcellen bad kammare än vad som krävs i COVG mätningar. (Måtten på anpassade VCF kammare finns i listan material.) Denna större VCF kammare måste samtidigt kunna tillmötesgående objektiv, mikroelektrod, och agar broar. Dessutom djuret pol (mörka sidan av oocyten) måste vara vänd uppåt i kammaren för låg bakgrunds VCF inspelningar. - Ta den övre delen av oocyten i fokus med hjälp av en vatten-immersion 40X objektiv.
Obs: Övergång från 4X till 40X mål kräver en särskild GEometry av cut-öppna komponenter och noggrann uppmärksamhet för att inte träffa elektrod, broar eller kammare vid sänkning av 40X objektiv. Vidare, beroende på den ökade volymen i toppskydd, så att badet volym från toppskydd är inte ansluten med den mellersta skyddet när 40X objektiv är satt på plats. - Fokusera på en ring i ytterkanten av den exponerade äggcellen ytan, så att högst upp i äggcellen är något över plan fokus.
Anm: Justering i xy-planet kan vara nödvändigt, så att synfältet är oftast fylld med membran och inte i kammaren. XY översättning enklast uppnås genom placering av mikroskopet på en översättning skede. - Flytta filterkuben i den optiska vägen och slå ljusets väg från okularet till detektorn (diod).
- Slå på RKF ljuskälla.
- Släck belysning, fiberljusbelysningen och andra ljuskällor.
OBS: Helst VCFinspelningar bör utföras i ett helt mörkt rum. - Kör en fluorescens-protokoll i inspelningsprogrammet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 visar förändringen i permeabilitet hos oocyten som en saponin lösning anbringas på den nedre delen av oocyten. Figur 5 visar hastigheten för intracellulär lösning utbyte genom diffusion följande saponin permeabilisering. 20-40 minuter krävs för att komma till en steady-state 2,18.
Figur 6A visar spår som genereras från inspelningsprotokollet. Figuren visar jonströmmar (efter P/-8 läcka subtraktion) som svar på den spänning-protokollet (infälld). Varje kurva i figuren representerar en annan pålagd spänning. Spåren med långsammaste kinetik representerar de lägsta potentialerna där natriumkanalen kan öppnas. Vanligtvis med traditionella metoder, är det svårt att upprätthålla spänningskontroll för dessa lägre potentialer eftersom inåt ström depolariserar membranet. Denna depolarisering i sin tur aktiverar fler kanaler skapar en positiv feedback loop . Den förbättrade klämhastighet cut-öppen teknik gör det möjligt för spänningskontroll krävs för registrering av kanalen även vid dessa svåra potentialer.
Figur 6B visar ström / spänningskurvan, som alstrades från spåren i figur 6A. Utan spänningskontroll noterats ovan, toppströmmen tidigast potentialer (~ -60 mV) skulle överskattas. Detta skulle förhindra korrekt beskrivning av det nuvarande spänningsförhållande.
Figur 7 visar ett exempel på spänningsklämma fluorometri resultat för en oocyt. De fluorescenssignaler registrerades från en oocyt märkt med MTS-TAMRA vid en cystein införts vid position 805 i DII domänen av humant kardiellt natriumkanalen Na V 1,5.
_upload/51040/51040fig5.jpg "width =" 500px "/>
Figur 5. Kinetik Cytoplasmatisk Na + Koncentration Förändring av Diffusion. Graden av intern lösning jämvikt bedömdes genom att tillämpa 90 mM Na + till både de yttre och inre sidor av cellen och sedan mäta Na + återföring potential genom att spela in IV relationer varje 2 min. Om den interna miljön var perfekt ut, skulle E rev vara 0 mV. Tids Mätningarna började när saponin permeabilized äggcellen membranet. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 6. Wild Type Na v 1.5Natriumkanal Resultat från Cut-Open Voltage Kläm. (A) Spår av inspelad ström från olika stimuli spänningar från en anläggning potential -80 mV ner till -120 mV till 100 ms, testpulsen (-120 mV till +40 mV i 10 mV steg) för 200 ms, och slutligen repolarizing till -120 mV. (B) Den IV-kurvan, som representerar spänningsberoendet av toppström i panel A. Här, toppströmmen för pulser upp till +60 mV visas. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 7. Na v 1.5 Natrium Channel Voltage Clamp fluorometri Recordings. (A) Ionic strömmar som spelats in från en äggcellmärkta med MTS-TAMRA vid en cystein införd vid position 805 i DII-S4 domänen av den humana hjärtnatriumkanal Na V 1.5. Spänningspulser som sträcker sig från -170 mV till +70 mV tillämpades i 20 steg mV för en löptid på 20 ms efter en prepulse till -120 mV. (B) De associerade fluorescens signaler. Varannan fluorescens spår utelämnas för tydlighet. AF / F representerar den relativa förändringen av fluorescensintensiteten inducerad av spänningspuls. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Snittet-öppna äggcell vaselin gapet spänningsklämteknik möjliggör snabb upplösning av data, låg ljudnivå, ökad kontroll över intern lösning och extern lösning sammansättning, och stabila inspelningar under relativt långa protokoll 19. Dessa fördelar ställa denna teknik bortsett från den standard två-elektrodspänningsklämma och patch clamp-tekniker. Även om specialutrustning som krävs och protokollet är relativt svårt, mycket få problem uppstår när systemet har optimerats. Detta möjliggör reproducerbara inspelningar av natrium (HNA V 1.5) och andra snabbaktiverande kanaler.
De mest kritiska stegen i protokollet är placeringen av den övre kammaren i äggcellen och impalement med V1 elektroden. Tätheten av tätningen mellan cellen och kanterna av kammarhålen har en stor inverkan på inspelningskvalitet. Den övre kammaren måste tryckas ned på cellen för att åstadkomma högsta möjliga resistance utan att skada äggcellen. Detta kommer att kräva att äggcellen bula och platta, men det krävs erfarenhet och övervägande av cellernas kvalitet för att bestämma den optimala trycket för att förhindra brott. Snabb inspelning kräver användning av det största möjliga pipetten öppning som konsekvent kan användas utan att skada cellen. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt avsmalning av pipetten, som bör vara grunt nog inte att avsevärt utöka såret som pipettspetsen infogas. Impalement bör ske långsamt och försiktigt, omedelbart stoppa elektrod avancemang på utseendet på membranpotentialen behandlingen.
Skador på äggcellen membranet och mindre än perfekt äggcellen / kammartätningar kan leda till höga läckströmmar. Höga läckströmmar försämras alltid kvaliteten på inspelningarna. Därför bör inspelningar alltid har låga läckströmmar (helst <150-200 nA). Förstärkarens ersättning krets, användning av P / N på nätet läcka-correction, eller off-line förfaranden kan kompensera för läckström.
Felsökning bör börja med dubbelkontroll att alla komponenter är korrekt ansluten eller justeras, som i allmänhet kommer att lösa de flesta problem. Under förberedelserna och experimentet i sig, måste särskild hänsyn tas till eventuella spillts eller överfyllda vätskenivåer och kristallis KCl eftersom dessa kan elektriskt förbinda fack som är tänkta att vara isolerad. Om systemet beter sig oväntat, kontrollera om saknade eller oönskade anslutningar mellan broar och kammare. Luftbubblor i agar broar, vid ändarna av agar broar, eller att fastna nedanför cellen kan också orsaka anslutningsproblem som är svåra att detektera.
Ändringar, som beskrivits ovan, är skyldiga att utföra spännings klämma fluorometri (VCF) tillsammans med COVG. Den huvudsakliga modifieringen innebär att man använder en förändrad bad design. För att inrymma användningen av en vatten-immersion 40X objektivpå mikroskop, måste den övre kammaren badet vara större än den skulle behöva vara för en standard cut-öppen konfiguration. Andra aspekter och utrustningsbehov RKF inspelning i COVG läge liknar RKF inspelning i två-elektrodspänningsklämläge 14. Såsom understrukits tidigare är den främsta fördelen med den COVG teknik den mycket snabbare och noggrann spänningsstyrning jämfört med TEVC i en membranplåster som uttrycker betydligt mer jonkanaler än vad som kan uppnås i däggdjurscellexpressionssystem. Sålunda är tekniken idealisk för RKF och gating aktuella studier där både hög tidsupplösning och hög kanalnummer krävs för detekterbara signaler.
Även om både extra-och intracellulära lösning utbyte i princip är möjliga, deras fullständighet och hastighet utbyte ange några begränsningar på vissa typer av experiment. Såsom visas i figur 5, jämviktshastigheten av jonkoncentrationer mellan cytoplasman och den nedre chamBER är ganska långsamt efter saponin permeabilization. Ändra joniska koncentrationer bör därför övervägas under långa experiment innan cellen anländer till ett stabilt tillstånd. Valutakurser kan variera i hög grad beroende på förhållandena. Hög kanaluttryck, stor drivkraft, och högre temperatur leder till snabbare priser. I vårt experiment cellen kyldes till 19 ° C, kanaluttryck var måttlig, och nettoavgift drivs av IV-protokoll var minimal på grund av den förändrade strömriktningen. I dessa lägen normal COVG teknik är underlägsen olika patch-clamp konfigurationer. För COVG tillämpningar som kräver snabb ersättning av den cytoplasmatiska mediet en perfusion kanyl kan användas. I framtiden kan COVG kammare utformade med inbyggda perfusion hamnar möjliggöra bättre kontroll över valuta egenskaper extracellulära lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Samtliga medlemmar i Washington University i St Louis Cardiac molekylär Engineering Lab. En Burroughs Welcome Fund Karriär Award på den vetenskapliga Interface - 1010299 (till JS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| External Solution | Brand | Catalog Number | [Final], weight, or volume |
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 25mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 90mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Internal Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 105mM |
| MES Sodium Salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 10mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | 2mM |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Depolarizing Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 110mM |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | 1.5mM |
| Calcium Chloride | Caisson | C021 | 0.8mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 10mM |
| Pipet Solution | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | 221473 | 3M |
| Saponin Solution | |||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | 0.125g |
| Internal Solution | See above | 50mL | |
| Agar Bridge Solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | 100ml of 1M |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 1.2g |
| MES Hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | variable (pH to 7.4) |
| Granulated Agar | Research Products International | A20250 | 3% |
| NMDG Storage Solution | |||
| NMDG, HEPES, MES Hydrate solution | see above | 40ml | |
| Water | 60ml | ||
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan | CA-1B | |
| Data Acquisition System | Axon CNS | Digidata 1440A | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS 210 | |
| Rack Power Filter | APC | G5 | |
| Heating/Cooling Bath Temperature Controller | Dagan | HCC-100A | |
| PC | Dell | Optiplex 990 | |
| pCLAMP 10.3 Voltage Clamp Software | Molecular Devices, LLC | pCLAMP10.3 | |
| TMC Vibration Control TableTop Platform | TMC | 64 SERIES | |
| TMC Vibration Control Air Table | TMC | 20 Series | |
| V1/I Electrode Data Collector | Dagan | part of CA-1B | |
| MX10L Micromanipulator | Siskiyou | MX10L | |
| Bath/Guard (I/V) Headstage (with appropriate connectors) | Dagan | part of CA-1B | |
| Microscope | Omano | OM2300S-JW11 | |
| Temperature Control Bath | Custom or Dagan | Custom or HE-204C | Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). Dagan also provides a prefeabricated stage (HE-204C). |
| Custom AgCl Pellet Container | Custom | Custom | Custom machined |
| Ag/AgCl electrode, pellet, 2.0 mm | Warner | E-206 | |
| External Oocyte Bath | Custom or Dagan | Custom or CC-1-T-LB | Custom machined or purchased from Dagan |
| Internal Oocyte Bath | Custom or Dagan | Custom or CC-TG-ND | Custom machined or purchased from Dagan |
| Capillaries for Agar Bridges and Pulled Electrodes | Warner | G150T-4 | |
| Rotatable Mounts for the Microscope, Micromanipulator, and Bath | Siskiyou | SD-1280P | |
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner | LMI-600 | |
| Regular Bleach | Clorox | 470174-764 | |
| Xenopus laevis Oocytes | Nasco | LM535M (sexually mature females) | |
| 90 Na+ External Solution | See Solutions sheet | ||
| 10 Na+ Internal Solution | See Solutions sheet | ||
| 3 M KCL | See Solutions sheet | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| NMDG Storage Solution | See Solutions sheet | ||
| 5mL transfer pipets | SciMart | GS-52 | |
| Modified KCl electrode injector | BD | 309659 | Plastic syringe tip melted to allow for injection of solution into electrodes. Alternatively, a Microfil by WPI can be purchased. |
| Microvaccum | Custom | Custom | |
| Forceps | VWR | 63040-458 | |
| Oocyte Handling Tools (Pipette Pump) | VWR | 53502-222 | |
| Deionized Water Squirt Bottle | VWR | 16649-911 | |
| Vaseline Petroleum Jelly | Fisher Scientific | 19-086-291 | |
| Additional Materials Required for VCF Recordings: | |||
| VCF Microscope | Nikon | Eclipse FN1 | |
| Nikon CFI APO 40XW NIR Objective | Nikon | N40X-NIR | |
| X-Y Translator System for Fixed-Stage Upright Microscopes | Sutter Instruments | MT500-586 | |
| External VCF Oocyte Bath | Custom | Custom machined. The chamber dimensions are 2.7 x 1.9 x 0.4 cm. | |
| Internal VCF Oocyte Bath | Custom | Custom machined. The chamber dimensions are 1.6 x 1.6 x 0.4 cm. | |
| Modified Temperature Control Bath | Custom | Custom chamber made from materials from Cool Polymers (D-series). The chamber dimensions of the modified temperature controller bath are 2.7 x 1.9 x 0.3 cm for the horizontal chamber, and 1 x 2.5 x 0.5 cm for the vertical chamber. |
References
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).
- Stefani, E., Bezanilla, F. Cut-open oocyte voltage-clamp technique. Methods Enzymol. 293, 300-318 (1998).
- Muroi, Y., Chanda, B. Local anesthetics disrupt energetic coupling between the voltage-sensing segments of a sodium channel. J. Gen. Physiol. 133, 1-15 (2009).
- Stefani, E., Toro, L., Perozo, E., Bezanilla, F. Gating of Shaker K+ channels: I. Ionic and gating currents. Biophys. J. 66, 996-1010 (1994).
- Wang, S., Liu, S., Morales, M. J., Strauss, H. C., Rasmusson, R. L. A quantitative analysis of the activation and inactivation kinetics of HERG expressed in Xenopus oocytes. J. Physiolt. 502 (Pt 1), 45-60 (1997).
- Neely, A., Garcia-Olivares, J., Voswinkel, S., Horstkott, H., Hidalgo, P. Folding of active calcium channel beta(1b) -subunit by size-exclusion chromatography and its role on channel function. J. Biol. Chem. 279, 21689-21694 (2004).
- Silva, J. R., Goldstein, S. A. Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels I: wild-type skeletal muscle. Na(V)1.4. J. Gen. Physiol. 141, 309-321 (2013).
- Silva, J. R., Goldstein, S. A. Voltage-sensor movements describe slow inactivation of voltage-gated sodium channels II: a periodic paralysis mutation in Na(V)1.4 (L689I). J. Gen. Physiol. 141, 323-334 (2013).
- Taglialatela, M., Toro, L., Stefani, E. Novel voltage clamp to record small, fast currents from ion channels expressed in Xenopus oocytes. Biophys. J. 61, 78-82 (1992).
- Clare, J. J., Trezise, D. J. Expression and analysis of recombinant ion channels : from structural studies to pharmacological screening. , Wiley-VCH. (2006).
- Susan, G. A. Methods in enzymology. 296, Academic Press. 566-578 (1998).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
- Cha, A., Bezanilla, F. Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence. Neuron. 19, 1127-1140 (1997).
- Richards, R., Dempski, R. E. Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling. J. Vis. Exp. , (2011).
- Cohen, S., Au, S., Pante, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J. Vis. Exp. , (2009).
- Techniques for Chloriding Silver Wires. , Available from: http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/chloriding_wire.pdf (1999).
- Raynauld, J. P., Laviolette, J. R. The silver-silver chloride electrode: a possible generator of offset voltages and currents. J. Neurosci. Methods. 19, 249-255 (1987).
- Gagnon, D. G., Bissonnette, P., Lapointe, J. Y. Identification of a disulfide bridge linking the fourth and the seventh extracellular loops of the Na+/glucose cotransporter. J. Gen. Physiol. 127, 145-158 (2006).
- Pantazis, A., Olcese, R. Cut-Open Oocyte Voltage-Clamp Technique. In: Roberts G. (Ed.) Encyclopedia of Biophysics: SpringerReference. Roberts, G. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. New York. (2013).
