Abstract
许多组织中，如成人心，都无法破坏后，以充分再生。2,3策略在组织工程中提出的创新，以协助身体恢复和修复。例如，TE方法可能能够减轻心肌梗死（MI）后心脏重塑和可能增加总的心脏功能，以接近正常的预MI水平。4与任何功能性组织，心脏组织的再生成功涉及适当的递送多种细胞类型与环境因素有利于整合植入的细胞/组织移植和生存。工程化组织应处理的多个参数包括：评价为运载工具，其对细胞存活的影响，材料强度和细胞 - 组织机构的便利可溶信号，细胞 - 细胞相互作用，并且基质材料。研究采用直接注射移植的细胞不仅无视这些基本要素。2,5,6一种组织设计结合这些成分还有待开发。这里，我们提出的使用图案化的细胞片层的分层与两种不同类型的含有靶器官的细胞类型和内皮细胞用于增强新血管形成中的“组织”生物衍生材料集成设计的例子。虽然这些研究集中在心脏样组织的产生，此组织设计可以应用于许多器官比心脏以最小的设计和材料的变化等，并意指是断开的，现成的产品用于再生疗法。该协议包含五个详细步骤。一种温度敏感聚（N -isopropylacrylamide）（PNIPAAM）用于涂层的组织培养皿。然后，特定组织细胞的涂装板/微图案的表面的表面上培养，以形成细胞片层具有很强的横向粘连。第三，基础矩阵的组织由多孔基体结合新生血管permissi创建已经凝胶和内皮细胞。最后，将细胞片从PNIPAAm的涂覆菜肴解除，并转移到基座元件，使得整个结构。
Protocol
1，创建PNIPAAM涂层板的
- 解散2.6克PNIPAAM的2毫升60％甲苯/ 40％正己烷溶液。
- 加热到60℃，将混合物搅拌10分钟，直到PNIPAAM溶解。
- 切滤纸为60毫米直径的圆和地点纸张布氏漏斗。
- 过滤该溶液，通过用布氏漏斗放入预先称重的玻璃烧杯（不使用塑料，如己烷将熔化的塑料）。
- 将烧杯中，内容为钟真空（24磅）的O / N（16小时）。注：直到残留物用异丙醇反应，它会氧化所以一定要确保它不与氧气接触。
- 称量烧杯建立PNIPAAM的重量。
- 添加异丙醇的PNIPAAM，创造一个各占50％w / w的解决方案。
- 放置2毫升在UV光下的溶液中的组织培养板的表面上，并且涂层为5分钟的。
- 用2毫升温的PBS洗板两次使用的细胞培养之前。
2，创建细胞片的
注：，或通过如这里描述的涂覆的组织培养表面与热响应性聚合物可以使用许多不同的方法来创建的初级细胞对靶器官的细胞片层。预涂温敏板是由一些厂商也提供。
注：该协议是使用35毫米的菜文化。简言之，将细胞首先在37℃下进行至少24小时，在合流建立相邻单元之间的横向连接。释放细胞片材，板材受到温度低于32℃。细胞片，然后转移到含有新生血管容许水凝胶与血管内皮细胞的强碱纤维状基质。
- 分离的细胞群。注意：此方法是依赖于个体的推导过程和细胞类型。大鼠主动脉平滑肌万亩SCLE细胞（RASMC）被用于本实例。这些是主要的平滑肌细胞从大鼠的腹主动脉分离。
- 用2毫升温的PBS洗细胞。
- 加入3 ml胰蛋白酶（或其他切割/解离溶液）向细胞5分钟。
- 通过加入3毫升含10％胎牛血清（FBS）的培养基中，或磷酸盐缓冲液（PBS）的抑制的胰蛋白酶。
- 收集细胞在锥形管和计数等分。
- 旋转细胞以1000rpm（228 XG）5分钟。
- 吸出上清液并将细胞重新悬浮在生长培养基（SmGM2加子弹试剂盒培养基用于RASMC）。
- 将含有细胞的培养基上35毫米热敏制版 - PNIPAAm的涂层板，其浓度将达到100％汇合。注意：对于RASMCs该号码被确定为100000细胞/ cm 2。然而，由于细胞的传递过程中的损失，120是VA的％略被使用。
- 放入培养箱中，在37℃CO / N。注意：维持细胞在37℃下维持细胞粘附到板是重要的。
3，准备基础性矩阵
注意：各种三维纤维基质可用于层中的微妙细胞片层之间强的纤维基体。一些例子包括：明胶海绵，生物玻璃，天然脱细胞物质26或nanospun材料27,28在这些研究中所用的猪膀胱基质层（UBM）的慷慨从我们的合作者，Badylak医生提供29。
- 在使用之前，确定矩阵特征包括缺乏细胞含量如果脱细胞基质的情况下，27,28细胞特异性存活率，和空隙空间22中
- 切断已预先灭菌的基质成所需的尺寸和形状。注：在这里，打孔用于切割4毫米直径的圆。
注意：内皮细胞可从各种来源，包括从干细胞或祖细胞分化而得到。这里，的HuVECs被使用。
- 使用任何允许的水凝胶（血纤蛋白，胶原蛋白凝胶），只要交联时间短得足以使细胞保持活力。注意：在此，透明质酸（HA）的基于凝胶的交联与二硫键被使用。
- 准备医管局水凝胶按照公司的协议。
- 收集内皮细胞和成分散使用1X胰蛋白酶单细胞溶液。注意：的Accutase或细胞解离缓冲液也可用于单细胞分散。
- 用大豆胰蛋白酶抑制剂等量或在PBS中的10％FBS，收集该溶液/细胞入15ml锥形管中（如果该细胞不接触到血清接触是很重要的）去激活胰蛋白酶的酶。
- ç指望。2-15的细胞，并计算出所需要的补丁尺寸的体积（先前量化）。注意：对于4毫米的补丁，这里200万内皮细胞使用。
- 提取200万细胞，并放入一个新的15 mL锥形管。
- 转速为（228 XG）5分钟。
- 吸出上清液，留下细胞在锥形管的颗粒。
- 混合HA和明胶液体物料在1:1比值。然后加入80％总体积的成锥形管含有沉淀。
- 重悬内皮细胞在1:1的HA /明胶混合
- 将悬浮的细胞在HA /明胶混合物制成从步骤2中的碱纤维基体。
- 加入所需的交联剂的总体积的五分之一（20％）的
- 孵育1小时，在37℃。
5，隔离单元表的
- 除去含有从培养箱和地方的细胞35毫米PNIPAAM处理板中的细胞培养罩在RT。
- 从细胞中迅速吸出介质，并加入2毫升6％正常明胶已被加热到37℃。
- 而明胶仍然温暖时，将金属晶格入明胶，淹没它的正常明胶（电影1）的表面之下。
- 放置5-7分钟，整个板在冰上，使明胶硬化。
- 7分钟后，用刮勺从板的侧面仔细分离明胶边缘，然后用钳子抬起金属晶格从板注：6％的明胶，和细胞片应该解除与晶格。
- 将电池板的菜，并放置在基体的纤维基质的水凝胶组合的顶部，仔细设置在构建体的上方的格子。注：电池板的顶面仍然会在榜首的位置。
- 加入2毫升温介质（37℃）。
- 孵育O 2 / N使细胞的薄片粘附到水凝胶的表面上。
- 除去叔后的溶液升温（约1小时），或在第二天，他的金属晶格。
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Representative Results
的流程图（ 图1）示出了制作的多层片的整体方法。细胞片从PNIPAAM处理板通过降低温度低于32℃的分离。然后将细胞板置于含有接种到底层的纤维基体（ 图1）在内皮细胞中的交联水凝胶的顶部。经预处理的温敏板，也可用于创建细胞片。特殊的拓扑表面使用专门的模式（ 即对齐）单元30。
基底的纤维基质可以由脱细胞天然的组织基质或静电产生。这里，纤维材料的片材切成直径4毫米的片基（ 图2A）。这种材料的特性是，用于确定水凝胶可以用于填充空隙空间的量很重要。这里所使用的基质已经上10狡猾的特点和出版。22
含有内皮细胞的水凝胶是交联的应用程序的HA水凝胶的液体组分在纤维基质后。荧光/透射显微镜显示活细胞染色，用钙黄绿素AM（ 图2B）已经捕获在交联的水凝胶。
创建电池板的过程中被成像（ 图3），其中包括我们自己的PNIPAAm的涂层钢板及从供应商处购买了预涂覆的板之间的比较。 RASMC都在37℃下电镀在PNIPAAM处理过的表面为至少16小时。这个最短时间允许细胞以确定其横向房客粘连与邻近细胞（ 图3A）。注：电池必须在汇合建立这些横向房客。为至少16小时的培养后，将细胞的板必须被移动到室温以下32℃时的下降，并且使用冰F或5-8分钟加速冷却过程中（ 图3B）。温度的下降改变了材料的涂层使细胞片抬离板的构象的接触角。 图3C示出了从板的电池板升降。
板包覆在实验室效果很好，经过一番优化，用于创建和移动细胞片。 图4d显示RASMC的转移之前融合单层。当细胞被允许解除，纸张趋向于折叠并粘到其自身（ 图3E）。实际上，操纵细胞片层上的内部创建的PNIPAAM或那些购买的是困难的，往往导致在片材的撕裂（ 图3F）。因此，用于传送的片材中的溶液被开发。一旦细胞从培养箱中取出，并开始凉爽，6％明胶被用于覆盖细胞的附加金属升attice嵌入式凝胶（ 图3G）之内。作为该板冷却，将细胞抬起，明胶硬化。使用镊子，将明胶晶格和电池板可一起从培养板去除;所有在同一时间（ 图3H）。然后这三个部件被放置在基础结构（ 图3I）的顶部。在这里，电池板（粉红色）小于基础基部矩阵（粉色电池板下粘稠的白色基质）大得多。细胞片可容易地修整尺寸。
最终的细胞膜片（ 图4）是通过层叠的细胞片上的贴片基和宽容的水凝胶的预形成复合物产生。从底部到顶部，贴片由一纤维基体接种的透明质酸水凝胶含有内皮细胞，然后将细胞片层叠在该基体的顶部的。早期的尝试来操纵细胞片在不使用明胶/晶格服装出口的ATU都导致经常折叠和被撕破非常小的细胞片（ 图4A-D从上方观察）。 图4A表示一个早期补丁设计复合图象组合mitotracker红染色RASMC（ 图4B），钙黄绿素AM绿色荧光的HuVECs（ 图图4C），并且透射光图像（ 图4D）。接近10倍的图像被提供在电池板和HA /水凝胶而不矩阵（ 图4E-H）。图4E是mitotraker红（ 图4F）的复合物中，钙黄绿素AM绿色的HuVECs（ 图4G）和透射光（ 图4H）。从下面（基矩阵，HA / HUVEC），并且每个组件的电池片图像的观点是展示在图4I-L。该合成图像是图4I，在图4J-L表示的各个部分， 如图4J的sh流入的细胞片（红色），内皮细胞（绿色）是在图4K，和透射图像（ 图4L）的合成图像（ 图4M）示出了具有均匀的细胞片覆盖所述基体的整个区域中的补丁没有任何折叠或撕裂。 图4M-P也从底部仰视到基质。 图4N是电池板，含有中性红。再次，厚的红色条带的基质周围出现，因为片折叠在这些区域直接邻接于矩阵的边缘。透射光成像（ 图40）显示了细胞的形态，并在基质的结构。最后（ 图4P），基体具有荧光的波长相同大埤作为一种特殊的素质。因此，基体的紫外激发是用来清楚地查看它从细胞片（鲜红色）分开。贴片的边缘可被修整，以取出片材的被挂在矩阵的边缘的任何边缘。
组织大会。细胞表的图1流程图是由细胞接种到温敏PNIPAAM涂层钢板，并允许有足够的时间让细胞达到汇合并建立相邻小区横向连接建立。细胞片被释放通过降低温度（黄色磁盘）。同时，内皮细胞被嵌入到一个新血管宽容HA水凝胶，注射到更强的碱纤维基质的空隙空间，并且化学交联（白盘）。电池片（黄盘）然后分层与内皮细胞矩阵组合（白），根据需要， 请点击这里查看本图的放大版本。
图基矩阵和内皮封装的2图像。 （A）中的更强的碱纤维基体冲压成圆形。在这里，4毫米直径基础上， 在体内动物模型被使用。（二）沾上mitotracker绿色（钙黄绿素AM）悬浮在医管局水凝胶的基础矩阵（10X）的表面上的HuVECs。 请点击这里查看大图这个版本的人物。
图3，创建细胞片的。 （一）RASMCç细胞片从商业上购买的释放边缘的ultured上PNIPAAM处理35毫米-菜16小时（10X）（B）将所述板在冰上5-7分钟后RASMC解除（C）的图像温敏细胞培养皿（10×）（DF）的图像描绘了类似的结果为细胞片层的生成从内部创建的PNIPAAM被覆菜（D）汇合RASMC生长在35 mm的标准组织培养板（4X）（五）冷却后，将细胞片层收缩并折叠成它们分离的（4X）（F）由于单电池片的脆性，细胞片常常举或其它操纵的（4X）中受损。（G）在为了减轻在电池板的穿孔，金属屏被用作物理支撑，以帮助细胞片层的转移。 RASMC沾满中性红，覆盖着6％的明胶和多孔金属网支持，第二使其硬化。（H）随着屏幕支持，细胞片层被转移以最小的损伤（4X）（Ⅰ）的 那么大的RASMC细胞片层（粉红色）被放置在强基纤维贴片凝胶组合（箭头）的顶部。 请点击这里查看该图的放大版本。
分层蜂窝修补。细胞的图4的图像分别在一个pNIPPAM涂覆表面培养，然后移至作为片材的纤维基体的表面上。那些没有用的明胶/金属晶格转移早期试验导致小破烂补丁（AD）。的（BD）（甲）综合形象，（B）在两片沾上Mitotracker红色，和（C）染色的绿色的HuVECs，和（D）中的透射光（E）的细胞表合并含有强碱的纤维基质的水凝胶组合的复合图像RASMCs Calceing AM染色的HuVECs（绿），和（F）Mitotracker红RASMCs（G）的绿色荧光的HuVECs悬浮于水凝胶。（H）传输更强的碱纤维基质的水凝胶组合的图像（I）的复合图像寻找从补丁向上通过强碱纤维基质（未染色的），HA含有的HuVECs（绿），和RASMCs的细胞片（红色），分别为（J）的红色荧光RASMCs片，通过基底的纤维基质-看去的底水凝胶组合（K）绿色荧光的HuVECs（L）的贴剂构建体的透射图像。（M）的细胞片（红色）在基底的纤维基质的水凝胶组合（自体荧光，蓝色）的复合图像。在纸张盖子（N）的单元格中的基础纤维基质的水凝胶组合显示增加在边缘处的荧光是由于聚束细胞。（O）传输的结构图像。（P）的天然纤维的基础矩阵自身荧光的DAPI（蓝色波长）， 请点击这里查看该图的放大版本。
影片1 。转印单元的片材的方法，在与文档提交补充电影被高亮显示。电影节目，在逐步的过程中，除去从孵化器中的细胞;更换介质，用6％明胶，次的插入ë金属屏，在冰上冷的细胞，从PNIPAAM涂布培养皿转移细胞到另一培养皿中，细胞的转移过程中的图像，并最终从片材中除去的画面。
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Discussion
在该协议中的关键步骤包括：涂布板面与温敏聚合物和冷却板后操纵的细胞片层。因为不同的细胞表现出不同的物理性质，如粘合性，升降时间应为每个不同的细胞类型进行了优化。本协议的第二个，也是最显著挑战性成分，集中在电池板，为组织组装方法的一个重要方面的操作。在电池板的单细胞层是相当脆弱的，并且可以很容易地撕开，如果操作用钳子。此外，当细胞片层中的地方不被保持时，往往会收缩，并可以很容易地折叠。使用支持屏幕所提出的电池板传输艾滋病脆弱电池板的操作。
该设计方法在这个手稿展示提供了一个相当低的成本的方法来创建一个单元格板适用于各种组织工程APPLI阳离子。此外，在一个大学实验室创建PNIPAAM涂层板可以标准化以这种方法和修改可以做出适应多种细胞类型，并且表面上的协议。利用细胞片层，而不是无组织的单细胞，有助于组织组件，并且还可以增加存活和整合植入组织中的可能性。但是，这些构建体的体内递送的方法（在该协议没有提及）将需要为每种组织类型进行优化。未来的应用包括探索和产生组织特定器官系统的优化方法。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Calcein-AM | Invitrogen | C3099 | Cell tracker / live dye |
| Lysotracker Red | Invitrogen | L7528 | Cell tracker |
| Neutral Red | Sigma | N7005 | Visible Cell dye |
| pNIPAAM | Sigma Aldrich | 412780250 | Poly(N-isopropylacrylamide) |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511-1L | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090-1L | |
| RAOSMC | Lonza | R-ASM-580 | Rat Aortic Smooth Muscle Cells |
| SmGM2 | Lonza | CC-4149 | Smooth Muscle Media |
| HUVEC | Invitrogen | C-003-5C | Human Venous Endothelial Cells |
| HyStem | Glycosan/Biotime | ||
| Isopropyl alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| Trypsin | Corning Cellgro | 25-053-C1 | |
| PBS | Gibco | 14287-072 | |
| FBS | Gibco | 16140-071 | |
| Specific Equipment | |||
| Filter paper | Ahlstrom | 6310-0900 | |
| Buchner Funnel | Sigma Aldrich | Z247308 | |
| UpCell Plates | Nunc | 2014-11 | |
| UV light | Jelight Company | UVO Cleaner Model No.42 | |
References
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