Abstract
Molti tessuti, come i cuori umani adulti, non sono in grado di rigenerarsi in modo adeguato dopo un danno. 2,3 Strategie di ingegneria dei tessuti propongono innovazioni per aiutare il corpo nel recupero e riparazione. Ad esempio, gli approcci TE possono essere in grado di attenuare il rimodellamento cardiaco dopo infarto miocardico (MI) e possibilmente aumentare la funzione cardiaca totale a un livello normale di MI-pre vicino. 4 Come con qualsiasi tessuto funzionale, la rigenerazione del tessuto cardiaco di successo comporta la corretta consegna dei più tipi di cellule con stimoli ambientali che favoriscono l'integrazione e la sopravvivenza del trapianto di cellule / tessuti impiantati. Tessuti ingegnerizzati dovrebbero affrontare più parametri tra cui: segnali solubili, cell-to-cell interazioni e materiali a matrice, calcolati come veicoli per le consegne, i loro effetti sulla sopravvivenza delle cellule, la forza materiale, e la facilitazione di organizzazione cellula-tessuto. Gli studi che utilizzano l'iniezione diretta di cellule madri per marze ignorare solo questi elementi essenziali. 2,5,6Un design di tessuto che unisce questi ingredienti deve ancora essere sviluppato. Qui, presentiamo un esempio di design integrate con stratificazione di fogli di cellule fantasia con due tipi distinti di materiali biologici di derivazione contenenti il tipo di cellule dell'organo bersaglio e le cellule endoteliali per migliorare la formazione di nuovi vasi nel "tessuto". Sebbene questi studi si concentrano sulla generazione di tessuto cardiaco-like, questo disegno tessuto può essere applicato a molti altri organi oltre cuore con minimi cambiamenti di design e materiali, ed è pensato per essere un prodotto off-the-shelf per terapie rigenerative. Il protocollo contiene cinque passaggi dettagliati. Una temperatura sensibile Poli (N -isopropylacrylamide) (pNIPAAM) viene utilizzato per tessuti cappotto coltura piatti. Poi, le cellule del tessuto specifico sono coltivate sulla superficie delle piastre rivestite / superfici micropattern per formare fogli di cellule con forti aderenze laterali. In terzo luogo, una matrice di supporto è per il tessuto combinando matrice porosa con Permissi neovascolareve idrogel e cellule endoteliali. Infine, i fogli di cellule vengono sollevati dai piatti pNIPAAM rivestiti e trasferiti all'elemento di base, rendendo il costrutto completo.
Protocol
1 Creazione di piatti pNIPAAM rivestite
- Sciogliere 2.6 g di pNIPAAM in 2 ml di una soluzione di esano al 60% di toluene / 40%.
- Riscaldare la miscela a 60 ° C per 10 min agitati, finché il pNIPAAM è disciolto.
- Tagliare carta da filtro in un cerchio di diametro di 60 mm e carta posto in imbuto Buchner.
- Filtrare la soluzione attraverso imbuto Buchner nel bicchiere di vetro pre-pesato (non usare la plastica, come esano si scioglierà la plastica).
- Porre il bicchiere e contenuto in un vuoto campana (24 psi) O / N (16 ore). Nota: Fino a quando il residuo viene fatto reagire con isopropilico esso si ossida in modo da assicurarsi che non venga a contatto con l'ossigeno.
- Pesare il becher per stabilire il peso del pNIPAAM.
- Aggiungere alcool isopropilico al pNIPAAM, creando un 50/50 w / w soluzione.
- Inserire 2 ml della soluzione sulla superficie della piastra di coltura tissutale, e cappotto per 5 min sotto luce UV.
- Lavare la piastra con 2 ml di PBS caldo due volteprima di utilizzare per la coltura cellulare.
2 Creazione di fogli Cellulari
Nota: fogli di cellule primarie per l'organo bersaglio possono essere creati utilizzando una serie di metodi diversi, o da rivestimento di superfici di coltura di tessuti con polimero termo-sensibile come descritto qui. Lastre termo-sensibile pre-rivestiti sono offerti anche da un certo numero di fornitori.
Nota: Questo protocollo è per la cultura con un piatto da 35 mm. Brevemente, le cellule vengono incubate a 37 ° C per un minimo di 24 ore a confluenza per stabilire connessioni laterali tra celle adiacenti. Per rilasciare fogli cellulari, piastre vengono sottoposti a temperature inferiori a 32 ° C. Il foglio cella viene poi trasferito al forte matrice fibrosa base contenente un idrogel permissiva neovascolare con cellule endoteliali vascolari.
- Isolare la popolazione cellulare. Nota: questo metodo dipende dai singoli procedimenti di derivazione e del tipo di cellule. Rat aortica mu lisciacellule SCLE (RASMC) sono utilizzati in questo esempio. Queste sono cellule muscolari lisce primarie isolate dall'aorta addominale di un topo.
- Lavare le cellule con 2 ml di PBS caldo.
- Aggiungere 3 ml di tripsina (o altro / soluzione dissociare scissione) alle cellule per 5 min.
- Inibire la tripsina con l'aggiunta di 3 ml di terreno di coltura, o soluzione tampone fosfato (PBS) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS).
- Raccogliere le cellule in un tubo conico e contare una aliquota.
- Spin le cellule a 1000 rpm (228 xg) per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in loro mezzi di crescita (SmGM2 più kit proiettile terreno di coltura viene utilizzato per RASMC).
- Posizionare i supporti contenenti le cellule su un piatto di 35 millimetri termo-sensibili - piastra rivestita pNIPAAM ad una concentrazione che permetterà di conseguire il 100% di confluenza. Nota: Per RASMCs quel numero è stato determinato in 100.000 cellule / cm 2. Tuttavia, a causa della perdita di cellule durante il passaggio, 120% di detto va viene utilizzato lue.
- Mettere in un incubatore a 37 ° CO / N. Nota: È importante mantenere le cellule a 37 ° C per mantenere l'adesione delle cellule alla piastra.
3 Preparazione di Matrix Foundational
Nota: Vari matrici fibrosi 3D possono essere usati per sovrapporre forte matrice fibrosa tra i fogli di cellule delicate. Alcuni esempi includono: Gelfoam, Bioglass, materiali naturali acellularized 26 o nanospun materiali 27,28 Il suina matrice vescica urinaria (UBM) utilizzati in questi studi è stato generosamente fornito dal nostro collaboratore, il dott Badylak 29.
- Prima dell'uso, determinare le caratteristiche della matrice, tra cui la mancanza di contenuto cellulare se si utilizza matrice decellularized, 27,28 cellulare vitalità specifico, e lo spazio vuoto. 22
- Tagliare la matrice pre-sterilizzato in una dimensione e forma desiderata. Nota: Qui, un foro-perforazione è utilizzata per tagliare un cerchio del diametro di 4 mm.
Nota: Le cellule endoteliali possono essere ottenuti da una varietà di fonti, tra cui la differenziazione da cellule staminali o progenitrici. Qui, vengono utilizzati HUVECs.
- Utilizzare qualsiasi idrogel permissiva (fibrina, gel di collagene) fintanto che il tempo di reticolazione è abbastanza breve da consentire alle cellule rimangono vitali. Nota: Qui, un gel Hyaluronan (HA) basato reticolato con viene utilizzato un ponte disolfuro.
- Preparare l'idrogel HA in conformità con il protocollo aziendale.
- Raccogliere le cellule endoteliali e disperdersi in una soluzione singola cella utilizzando tripsina 1x. Nota: Accutase o cellulare Dissociazione Buffer potrebbero essere utilizzati anche per la dispersione singola cellula.
- Disattivare l'enzima tripsina utilizzando una pari quantità di inibitore della tripsina di soia (se è importante che le cellule non vengano a contatto con il siero) o 10% FBS in PBS, raccogliendo la soluzione / cellule in un tubo da 15 ml.
- Count le cellule, e calcolare il volume necessario per le dimensioni delle patch (precedentemente quantificato). Nota: Per una patch a 4 mm, sono usati qui 2 milioni di cellule endoteliali.
- Estrarre 2 milioni di cellule, e inserire in un nuovo tubo da 15 ml.
- Spin a (228 xg) per 5 min.
- Aspirare il supernatante, lasciando le cellule come pellet in un tubo conico.
- Mescolare i materiali liquidi HA e la gelatina in un 1: 1 razione. Aggiungere quindi 80% del volume totale nel tubo conico contenente il pellet.
- Risospendere le cellule endoteliali nella miscela 1: 1 HA / gelatina
- Posizionare le cellule in sospensione nella miscela HA / gelatina nella base matrice fibrosa dal punto 2.
- Aggiungere 1/5 (20 percento) del volume totale desiderata del cross-linker
- Incubare per 1 ora a 37 ° C.
5 Isolamento di fogli Cellulari
- Rimuovere le piastre 35 millimetri pNIPAAM trattati contenenti le cellule dal incubatore e posto in una cappa di coltura cellulare aRT.
- Aspirare rapidamente il supporto dalle cellule, e aggiungere 2 ml di 6% di gelatina normale che è stato riscaldato a 37 ° C.
- Mentre la gelatina è ancora caldo, posizionare il reticolo di metallo nella gelatina, immergendo sotto la superficie della gelatina normale (Film 1).
- Inserire l'intera piastra su ghiaccio per 5 a 7 minuti, consentendo la gelatina per indurire.
- Dopo 7 minuti, utilizzare una spatola per separare accuratamente i bordi gelatina dal lato della piastra, e quindi utilizzare pinze per sollevare la grata metallica dalla piastra Nota: La gelatina 6%, e il foglio di cella deve sollevare con il reticolo.
- Spostare il foglio cella al piatto e posto sulla sommità della combinazione matrice idrogel di base fibrosa, impostando attentamente il reticolo sopra il costrutto. Nota: La parte apicale dello strato di cellule sarà ancora in prima posizione.
- Aggiungere 2 ml di supporti caldo (37 ° C).
- Incubare O / N consentendo il foglio di cellule di aderire alla superficie idrogel.
- Rimuovere tegli reticolo di metallo dopo la soluzione si riscalda (circa 1 ora), o il giorno successivo.
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Representative Results
Il diagramma di flusso (figura 1) illustra il metodo generale di rendere la patch multistrato. Fogli cellulari sono staccati dalla piastra trattata pNIPAAM facendo cadere la temperatura sotto i 32 ° C. Poi il foglio cella è posto in cima al idrogel reticolato contenente le cellule endoteliali seminate nella matrice fibrosa sottostante (Figura 1). Le piastre termosensibili pretrattati possono essere utilizzati anche per creare i fogli di cellule. Superfici speciali topologiche sono usati in modo specifico modello (ad esempio, allineare) le cellule 30.
La matrice fibrosa base può essere generato da decellularizing matrice di tessuto nativo o elettrofilate. Qui, il foglio di materiale fibroso è stato tagliato ad un diametro di 4 mm per la base di patch (Figura 2A). La caratterizzazione di questo materiale è importante per determinare la quantità di idrogel che può essere utilizzato per riempire gli spazi vuoti. La matrice usata qui è stato Precesly caratterizzato e pubblicato. 22
Gli idrogeli contenenti cellule endoteliali sono reticolati dopo l'applicazione dei componenti idrogel liquidi HA alla matrice fibrosa. Microscopia a fluorescenza / trasmissione mostra cellule colorate con calceina AM (Figura 2B), che sono stati catturati in idrogel reticolato vivente.
Il processo di creazione dello strato di cellule viene esposta (Figura 3), tra cui il confronto tra i nostri piatti pNIPAAM rivestite propri e piastre pre-rivestite acquistati da un fornitore. RASMC sono plated sulla superficie pNIPAAM trattata per almeno 16 ore a 37 ° C. Questo tempo minimo permette alle cellule di stabilire le loro adesioni boarder laterali con le cellule vicine (Figura 3a). Nota: Le cellule devono essere a confluenza di stabilire questi confini laterali. Dopo la coltura per almeno 16 ore, la piastra di celle deve essere spostato RT per il calo sotto 32 ° C, e l'utilizzo di ghiaccio fo 5-8 min accelera il processo di raffreddamento (Figura 3B). La caduta di temperatura cambia l'angolo di contatto conformazionale del rivestimento materiale permettendo strato di cellule di sollevare dalla piastra. Figura 3C mostra il sollevamento strato di cellule dalla piastra.
Piastre rivestite in laboratorio hanno lavorato bene, dopo qualche ottimizzazione, per creare e spostare i fogli di cella. Figura 4D mostra un monostrato confluente di RASMC prima del trasferimento. Quando le cellule sono stati autorizzati a sollevare, i fogli tendevano a piegare e bastone a se stesso (Figura 3E). Infatti, manipolando le lenzuola cellulari su creato in-house pNIPAAM o quelli acquistati era difficile e spesso portato a strappo dei fogli (Figura 3F). Pertanto, è stata sviluppata una soluzione per il trasferimento dei fogli. Una volta che le cellule vengono rimosse dal termostato e iniziano a fresco, il 6% di gelatina è stato utilizzato per coprire le cellule con un ulteriore metallo ltraliccio inserita all'interno del gel (Figura 3G). Come raffreddato la piastra, le cellule sollevato, e la gelatina indurisce. Utilizzando pinze, il foglio di lattice e cellule gelatin- può essere rimosso insieme dalla piastra di coltura; tutti allo stesso tempo (Figura 3H). Poi questi tre componenti sono posizionati sulla parte superiore del costrutto base (Figura 3I). Qui, il foglio di cella (colore rosa) è molto più grande della matrice di base sottostante (matrice bianca spessa sotto dello strato di cellule rosa). Il foglio di cella può essere facilmente tagliato a misura.
La patch cellulare finale (Figura 4) è stato creato da stratificazione strato di cellule sul complesso preformato della base di patch e idrogel permissivo. Dal basso verso l'alto, il cerotto è costituito da una matrice fibrosa seminato con acido ialuronico idrogel contenente le cellule endoteliali, e poi il foglio cella viene stratificata in cima a questa matrice. I primi tentativi di manipolare i fogli di cellule senza l'uso della gelatina / reticolo apparappa- portato in fogli di cellule molto piccole che spesso piegati e sono stati strappati (Figura 4A-D visto da sopra). Figura 4A rappresenta una patch di design composito primo quadro che combina la Mitotracker rosso tinto RASMC (Figura 4B), calceina AM HUVECs fluorescente verde (Figura 4C), e l'immagine di luce trasmessa (Figura 4D). Closer 10x immagini vengono fornite per il foglio cellulare e HA / Hydrogel senza matrice (Figura 4E-H). Figura 4E è la composita del mitotraker rosso (Figura 4F), la calceina AM verde HUVECs (Figura 4G) e la luce trasmessa ( Figura 4H). La vista da sotto (matrice di base, HA / HUVEC), e le immagini di ciascuna componente foglio cella è spettacolo nelle figure 4I-L. Le immagini composite è figura 4I, con le singole parti rappresentate in Figura 4J-L, figura 4J shflussi strato di cellule (rosso), le cellule endoteliali (verdi) sono in Figura 4K, e l'immagine di trasmissione (Figura 4L) L'immagine composita (Figura 4M) mostra la patch con una cella fogli uniforme che copre l'intera area della matrice senza nessuna piegatura o strappo. Figure 4M-P sono anche dal basso verso l'alto nella matrice. figura 4N è strato di cellule, contenente rosso neutro. Ancora una volta, strisce rosse spesse appaiono attorno alla matrice perché il foglio ripiega in queste aree direttamente adiacenti al bordo della matrice. Immagini poco Trasmissione (figura 4O) mostra la morfologia delle cellule, e la struttura della matrice. Infine (Figura 4P), la matrice ha una qualità speciale di fluorescenti alla stessa lunghezza d'onda Dapi. Pertanto, l'eccitazione ultravioletta della matrice è utilizzato per chiarezza visualizza separato dal foglio di cella (rosso brillante). I bordi del cerotto può essere tagliata perrimuovere eventuali bordi del telone che sono appesi sopra i bordi della matrice.
Figura 1 Diagramma di flusso del tessuto dell'Assemblea. Cellulare schede sono creati da semina cellule su piastre pNIPAAM rivestite thermoresponsive, e dando il tempo sufficiente per le cellule per raggiungere confluenza e stabilire connessioni laterali a cellule vicine. Lo strato di cellule viene rilasciato riducendo la temperatura (disco giallo). Allo stesso tempo, le cellule endoteliali sono incorporate in una neovascolare permissivo HA idrogel, iniettato in vuoti spazio della matrice fibrosa base più forte, e chimicamente reticolato (disco bianco). Lo strato di cellule (disco giallo) è quindi a strati con la combinazione di matrice endoteliale (bianco), se necessario. Cliccare qui pervisualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 Immagini di Matrix Base e endoteliale incapsulamento. (A) La base della matrice fibrosa forte è perforato in una forma rotonda. Ecco un diametro di 4 mm viene utilizzata in base al modello animale in vivo. (B) HUVECs colorati con Mitotracker verde (calceina AM) sospesi in idrogel HA sulla superficie della matrice di base (10X). Cliccate qui per vedere una più grande versione di questa figura.
Figura 3 Creazione di fogli di cella. (A) RASMC cultured on pNIPAAM trattati 35 millimetri-piatti per 16 ore (10X). (B) RASMC sollevato dopo aver posizionato la piastra in ghiaccio per 5-7 min. (C) Immagine del bordo di un foglio di cellule liberando dal commercio acquistati piatto di coltura cellulare thermoresponsive (10X). (DF) Le immagini raffigurano risultati simili per la generazione di fogli di cellule da piatti in-house creato pNIPAAM-rivestite. (D) Confluent RASMC coltivato su 35 millimetri piastre di coltura dei tessuti normali (4X). (E ) Dopo il raffreddamento, i fogli di cellule contratte e piegate come si staccano (4X). (F) A causa della fragilità della lastra singola cellula, i fogli di cellule sono spesso danneggiati durante il sollevamento o altre manipolazioni (4X). (G) In Per mitigare perforazioni dello strato di cellule, uno schermo metallico è stato utilizzato come supporto fisico per favorire il trasferimento dei fogli di cellule. RASMC sono state colorate con rosso neutro, coperto con il 6% di gelatina e un supporto schermata metallo poroso, unnd permesso di indurire. (H) Con il supporto dello schermo, fogli di cellule vengono trasferiti con il minimo danno (4X). (I) grande strato di strato di cellule RASMC (colore rosa) è stato poi posto sulla parte superiore della combinazione patch-idrogel fibroso base più forte (freccia). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Immagini di Layered Cellular Patch. Cellule sono state coltivate su una superficie rivestita pNIPPAM e poi spostati come un foglio alla superficie della matrice fibrosa. I primi esperimenti che non sono stati trasferiti con il reticolo di gelatina / metallo portato a piccole macchie stracciati (AD). (A) Immagine composita di (BD),(B) RASMCs in due fogli macchiati di Mitotracker rosso, e (C) HUVECs macchiati di verde, e (D), in luce trasmessa. (E) Immagine composita di una cella di fogli in combinazione con la combinazione matrice idrogel fibroso base più forte contenente Calceing AM macchiato HUVECs (verde), e (F) Mitotracker Red RASMCs. (G) HUVECs fluorescenti verdi sospesi in un idrogel. (H) Trasmissione immagine della combinazione matrice idrogel fibroso base più forte. (I) immagine composita guardando dalla inferiore della patch verso l'alto attraverso la matrice fibrosa base più forte (non tinto), HA contenente HUVECs (verde), e strato di cellule di RASMCs (rosso), rispettivamente. (J) Red foglio RASMCs fluorescenti, come si è visto attraverso la base da matrice fibrosa combinazione idrogel. (K) HUVECs verde fluorescente. (L) immagine Trasmissione del costrutto patch.(M) immagine composita di cell-fogli (rosso) sulla base di combinazione matrice idrogel fibroso (autofluorescenti-blu). (N) Le cellule del coperchio lamiera della base fibrosa matrice idrogel combinazione mostrano un aumento della fluorescenza ai bordi è dovuto alla raggruppamento delle cellule. (O) Trasmissione immagine del costrutto. (P) matrice di base fibrosa naturale è autofluorescenti nel DAPI (blu lunghezza d'onda). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Movie 1 . Il processo di trasferimento dei fogli di cellule è evidenziato nel film supplementare presentata con il documento. Gli spettacoli del cinema, in un processo graduale, la rimozione delle cellule dal termostato; sostituzione del supporto con il 6% di gelatina, l'inserimento di thschermo e metallo, refrigerazione delle celle su ghiaccio, il trasferimento delle cellule dal piatto pNIPAAM rivestita di un altro piatto, un'immagine delle cellule durante il trasferimento e la rimozione dello schermo dal foglio.
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Discussion
I passaggi critici nel protocollo comprendono: rivestimento delle superfici delle piastre con il polimero thermoresponsive e manipolare i fogli di cellule dopo il raffreddamento delle piastre. Poiché le cellule differenti presentano differenti proprietà fisiche, come adesività, il tempo di sollevamento deve essere ottimizzata per ogni tipo di cellula diversa. Il secondo, e più significativamente impegnativo componente di questo protocollo, incentrata sulla manipolazione dello strato di cellule, un aspetto critico di metodi per l'assemblaggio dei tessuti. Il livello di singola cellula nel foglio cella è abbastanza fragile e può strappare facilmente se manipolato con una pinza. Inoltre, quando i fogli cellulari non sono tenuti in posizione, tendono a contrarsi e possono piegare facilmente. Il trasferimento strato di cellule proposto di utilizzare uno schermo di supporto aiuta la manipolazione dello strato di cellule fragile.
La metodologia di progettazione presentate in questo manoscritto fornisce un approccio abbastanza basso costo per la creazione di un foglio di cella per una vasta gamma di appli ingegneria tissutalecationi. Inoltre, la creazione di piatti pNIPAAM rivestite all'interno di un laboratorio universitario può essere standardizzata con questo metodo e le modifiche al protocollo può essere fatto per ospitare più tipi di cellule, e superfici. L'uso dei fogli di cellule, piuttosto che singole cellule non organizzati, aiuta l'assemblaggio dei tessuti, e può anche aumentare la probabilità di sopravvivenza e di integrazione dei tessuti impiantati. Tuttavia, il metodo di consegna in vivo (non menzionato in questo protocollo) di questi costrutti dovrà essere ottimizzata per ogni tipo di tessuto. Le applicazioni future includono esplorazioni e metodologie ottimizzate per la generazione di tessuti per i sistemi di organi specifici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Calcein-AM | Invitrogen | C3099 | Cell tracker / live dye |
| Lysotracker Red | Invitrogen | L7528 | Cell tracker |
| Neutral Red | Sigma | N7005 | Visible Cell dye |
| pNIPAAM | Sigma Aldrich | 412780250 | Poly(N-isopropylacrylamide) |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511-1L | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090-1L | |
| RAOSMC | Lonza | R-ASM-580 | Rat Aortic Smooth Muscle Cells |
| SmGM2 | Lonza | CC-4149 | Smooth Muscle Media |
| HUVEC | Invitrogen | C-003-5C | Human Venous Endothelial Cells |
| HyStem | Glycosan/Biotime | ||
| Isopropyl alcohol | VWR International | BDH1133-4LP | |
| Trypsin | Corning Cellgro | 25-053-C1 | |
| PBS | Gibco | 14287-072 | |
| FBS | Gibco | 16140-071 | |
| Specific Equipment | |||
| Filter paper | Ahlstrom | 6310-0900 | |
| Buchner Funnel | Sigma Aldrich | Z247308 | |
| UpCell Plates | Nunc | 2014-11 | |
| UV light | Jelight Company | UVO Cleaner Model No.42 | |
References
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