Summary
आमतौर पर इस्तेमाल किया, इन विट्रो में सेल प्रवास और आक्रमण की जांच के लिए अत्यधिक सुलभ तरीके से वर्णित हैं. पहली विधि सेल गतिशीलता उपाय है कि सेल घाव बंद परख है. दूसरी विधि chemotactic और कोशिकाओं के आक्रामक क्षमता का आकलन है कि transwell प्रवास और आक्रमण परख है.
Introduction
गतिशीलता जीवित कोशिकाओं का एक अनिवार्य विशेषता है. सेल प्रवास जीवन, भ्रूण विकास, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है, और इस तरह के कैंसर मेटास्टेसिस और सूजन 1-9 के रूप में कई रोग प्रक्रियाओं की अवधारणा में शामिल है. इसलिए, सेल प्रवासी व्यवहार का अध्ययन करने के तरीकों जैव चिकित्सा विज्ञान, जीव विज्ञान, जैव अभियांत्रिकी, और संबंधित क्षेत्रों में विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए बहुत उपयोगी अनुसंधान उपकरण हैं.
कैंसर रोगियों में मृत्यु का मुख्य कारण metastatic प्रगति से संबंधित है के रूप में कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में सेल प्रवास के अध्ययन विशेष रुचि का है. पूरे शरीर में फैल गया और प्रसार करने के लिए कैंसर के लिए आदेश में, कैंसर कोशिकाओं को विस्थापित करना होगा और intravasate रक्त परिसंचरण में, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के माध्यम से आक्रमण, दूर के एक साइट के लिए देते हैं, और अंत में दूर foci 1,10-12 के लिए फार्म का बहना. विभिन्न जैविक विधियों विस्तार में इन घटनाओं का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है. सेल संस्कृति घाव बंद एकडी transwell प्रवास और आक्रमण assays व्यापक रूप से वैज्ञानिक समुदाय 1,10 में उपयोग किया जाता है. इन परीक्षणों के लिए एक विशेष सेल प्रकार अनायास विस्थापित या एक chemo-attractant का जवाब और directionally यह की ओर पलायन कर सकते हैं कितनी अच्छी तरह का एक समझने के लिए अनुमति दे सकता है कि आवश्यक डेटा प्रदान कर सकते हैं. कई प्रवासी phenotypes वर्णित किया गया है. कोशिकाओं mesenchymal या अमीबाभ तरह आंदोलन में या 13 स्ट्रीमिंग सामूहिक प्रवास या सेल लेबल बहुकोशिकीय आंदोलन से देखा जैसे किसी एकल कक्ष के रूप में विस्थापित हो सकते हैं. चलता - फिरता कोशिकाओं में इस्तेमाल आंदोलन की विधि आसानी से सेल संस्कृति घाव बंद परख का उपयोग कर देखा जा सकता है.
सेल प्रवास अध्ययन करने के लिए कई तरीके के अलावा, सेल घाव बंद परख सरलतम में से एक है. इस विधि पूरे सेल जनता के प्रवास क्षमता निर्धारित करने के लिए उपयोगी है. एक कदम आगे ले लिया जब यह माइग्रेशन 14 के दौरान व्यक्तिगत सेल के लक्षण निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. घाव बंद के विश्लेषण के बाद कई phenotypes से पता चला जा सकता है. एक नियंत्रण करने के लिए जब तुलना में समय के साथ बंद दूरी को मापने के विशिष्ट प्रवास परिवर्तन या पहले से अनजान था कि एक भ्रष्ट प्रवासी फेनोटाइप प्रकट हो सकता है. इसके अलावा, एकल कक्ष lamellipodium गठन, पूंछ त्याग, और दिशात्मक आंदोलन ब्याज 14 की कोशिकाओं में बिगड़ा या बढ़ाया जा सकता है के लिए सुराग दे सकता है.
transwell प्रवास और आक्रमण assays directionally वे chemokines, वृद्धि कारक है, लिपिड, या nucleotides 4,5,8,15,16 हैं कि क्या विभिन्न chemo-attractants का जवाब करने के लिए एकल कक्षों की क्षमता का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी कारण एक रिसेप्टर 1,14 से अधिक अभिव्यक्ति के लिए अंतर प्रवासी क्षमता का आकलन हो सकता है. ये assays भी इस तरह के छोटे GTPases 2 का रो परिवार के रूप में सेल प्रवास के प्रमुख नियामकों की पहचान और विशेषताएँ इस्तेमाल किया जा सकता है. Acces आसानी से इन छोटी और निम्नलिखितsible परीक्षण, सेल प्रवास के मोड और एक 3 डी मैट्रिक्स में आक्रमण करने के लिए एक सेल की क्षमता भी निर्धारित किया जा सकता है.
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Protocol
1. सेल संस्कृति घाव बंद परख
- ट्रिप्सिन-EDTA समाधान 0.25% का उपयोग टिशू कल्चर प्लेट से कोशिकाओं को अलग. Centrifugation द्वारा एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में गोली कोशिकाओं, सतह पर तैरनेवाला aspirate, और संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं फिर से निलंबित. 24 घंटे में 100% संगम के लिए 6 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं की उचित नंबर प्लेट.
नोट: टेस्ट (उदाहरण के लिए, 1 x 10 6 B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं को एक से एक अच्छी तरह से में वरीयता प्राप्त कर रहे हैं की वजह से सेल प्रकार और अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा रहा है के आकार को 100% संगम को प्राप्त करने के लिए समय और कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है 6 अच्छी तरह से थाली पूर्व घाव पीढ़ी के लिए 24 घंटे). वैकल्पिक रूप से, 12 अच्छी तरह से या 24 अच्छी तरह प्लेटें इस्तेमाल किया जा सकता है.
नोट: यदि उपलब्ध है, कोशिकाओं घाव पूर्व casted बना एक इलाज टिशू कल्चर प्लेट पर एक संस्कृति सम्मिलित (Ibidi LLC से) में वरीयता प्राप्त किया जा सकता है. एक संस्कृति सम्मिलित पिपेट टिप द्वारा क्षति से टिशू कल्चर प्लेट की सतह की रक्षा कर सकते हैं. एक संस्कृति सम्मिलित न आना कदम प्रयोग किया जाता है1.2. - एक बाँझ वातावरण में (आमतौर पर एक जैव सुरक्षा हुड) टिशू कल्चर प्लेट के ऊपर के खिलाफ मजबूती से प्रेस करने के लिए एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग और तेजी से सेल monolayer के माध्यम से नीचे एक खड़ी घाव बनाते हैं. एक अलग आकार पिपेट टिप वांछित है कि घाव आकार बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह सतह को नुकसान हो सकता पिपेट टिप के साथ टिशू कल्चर प्लेट के खिलाफ अत्यधिक बल का प्रयोग न करें. घाव पूर्व casted है, तो इस चरण को छोड़ा जा सकता है.
- ध्यान से मीडिया और सेल मलबे aspirate. धीरे धीरे अच्छी तरह से नीचे को कवर और अतिरिक्त कक्षों detaching से बचने के लिए अच्छी तरह से दीवार के खिलाफ पर्याप्त संस्कृति मीडिया जोड़ें. घाव की पीढ़ी और निरीक्षण के बाद एक प्रारंभिक तस्वीर लिया जाना चाहिए. उचित तापमान और सीओ 2 एकाग्रता पर एक मशीन सेट में टिशू कल्चर थाली प्लेस (आमतौर पर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2).
- कई बार अंक में, हर 3 घंटे जैसे, incubat से थाली हटाया और एक स्नैपशॉट तस्वीर लेने के लिए और घाव बंद करने के लिए जाँच करने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत यह जगह. समय चूक माइक्रोस्कोपी उपलब्ध है, तो किसी भी समय एक के तापमान में अवधि और सीओ 2 नियंत्रित कक्ष के लिए एक तस्वीर (आमतौर पर हर 5 मिनट के साथ शुरू) मिनट के हर एक्स संख्या ले. सेल के प्रकार पर निर्भर करता है, घाव बंद समय भिन्न हो सकते हैं.
- स्नैपशॉट चित्रों के परिणामों का विश्लेषण करने के लिए, एक पैमाने पर पट्टी का उपयोग कर दूसरे के घाव के एक तरफ की दूरी को मापने. एक तितर बितर साजिश या बार ग्राफ, जैसे चित्रा 1 का उपयोग का विश्लेषण करने और समय के साथ स्पष्ट रूप से उपस्थित घाव बंद.
- समय चूक चित्रों का विश्लेषण करने के लिए, एक वीडियो बनाने के लिए (http://rsb.info.nih.gov/ij/ पर आसानी से उपलब्ध) ImageJ सॉफ्टवेयर में चित्रों को आयात करते हैं. इस खुले ImageJ करने के लिए, आयात फ़ाइल क्लिक करें, और छवि अनुक्रम. चित्रों के साथ फाइल का पता; फ़ाइल में पहली तस्वीर पर क्लिक करें. , फ़ाइल का चयन करके वीडियो को बचाने के रूप में सहेजें, और AVI. सिंगल पलायन कोशिकाओं chara को देखा जा सकता हैदिशात्मक आंदोलन cterize. इसके अलावा, इस तरह के lamellipodia गठन और अनुगामी किनारे त्याग के रूप में लक्षण (चित्रा 2 और अनुपूरक वीडियो) के रूप में अच्छी तरह से अध्ययन किया जा सकता है.
2. Transwell सेल प्रवास और आक्रमण परख
- एक बाँझ वातावरण (आमतौर पर एक जैव सुरक्षा हुड) में एक गैर enzymatic सेल विसंघटन बफर या 0.25% trypsin EDTA समाधान, गोली कोशिकाओं centrifugation द्वारा उपयोग कर टिशू कल्चर प्लेट से कोशिकाओं को अलग, और मौजूदा मीडिया pelleted कोशिकाओं को छोड़ने aspirate. 0.1% BSA (गोजातीय सीरम albumin) युक्त सीरम मुक्त सेल संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं फिर से निलंबित.
नोट: ट्रिप्सिन-EDTA कारण कोशिका की सतह पर 17 विभिन्न रिसेप्टर्स की दरार को सेल प्रवास और आक्रमण को प्रभावित कर सकता 0.25% जांच की जा रही सेल लाइन पर निर्भर करता है.
नोट: मिलीलीटर प्रति कोशिकाओं की संख्या कोशिकाओं के आकार पर निर्भर करता है. इसके अलावा परीक्षण समर्थक कि एक बोने घनत्व को खोजने के लिए आवश्यक हो सकता हैसबसे अच्छा परिणाम vides. 24 अच्छी तरह से सम्मिलित transwell का उपयोग करते समय आम तौर पर 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल सबसे प्रकार की कोशिकाओं के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है. एक transwell सम्मिलित आकार की सीमा है और कहा कि कोशिकाओं की संख्या के हिसाब से लिए समायोजित किया जाना चाहिए है. - प्लेट 100 एक transwell डालने में फिल्टर झिल्ली के शीर्ष पर सेल के समाधान के μl और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए सेते हैं और 5% सीओ 2 कोशिकाओं बसने की अनुमति देने के लिए.
नोट: प्रयुक्त transwell झिल्ली की विशेष छेद के आकार के नमूने में कोशिकाओं के व्यक्तिगत आकार पर निर्भर है. कोशिकाओं बहुत छोटे हैं तो उदाहरण के लिए, वे माइग्रेशन की सुविधा के लिए आवश्यकता के बिना छिद्रों के माध्यम से पारित हो सकता है या वे बहुत बड़े हैं वे छिद्रों के माध्यम से फिट नहीं हो सकता है. कई transwell 3 से माइक्रोन कि सीमा ताकना आकार के साथ सम्मिलित करता है, 5 माइक्रोन, और सेल प्रवास assays के लिए 8 माइक्रोन कर रहे हैं. transwell सम्मिलित करता है इस तरह के Corning के रूप में कंपनियों से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं.
नोट: transwell एमigration परख आसानी से सेल आक्रमण परख प्रदर्शन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. ऐसा transwell झिल्ली के शीर्ष पर बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) सामग्री जोड़ने और फिर ईसीएम के शीर्ष पर कोशिकाओं को जोड़ने के लिए. उदाहरण के लिए, Matrigel thawed है और बर्फ पर तरलीकृत, और फिर Matrigel की 30-50 μl डालने transwell 24 अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा गया है और एक पतली जेल परत के रूप में 15-30 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में जम. सेल समाधान बाह्य मैट्रिक्स के माध्यम से आक्रमण अनुकरण करने Matrigel कोटिंग के शीर्ष पर जोड़ा जाता है.
नोट: transwell सेल प्रवास और transwell सेल आक्रमण assays के बीच स्पष्ट मतभेद हैं. transwell सेल प्रवास परख एक chemo-attractant की ओर कक्षों की chemotactic क्षमता के उपाय. transwell सेल आक्रमण परख, हालांकि, बाह्य मैट्रिक्स के माध्यम से आमतौर पर कैंसर मेटास्टेसिस या भ्रूण के विकास में पाया जाता है एक प्रक्रिया है कि सेल chemotaxis और कोशिकाओं के आक्रमण दोनों के उपाय. - एक विंदुक का प्रयोग, बहुत carefully 24 अच्छी तरह से थाली में निचले सदन के तल में वांछित chemo-attractant के 600 μl जोड़ें. Transwell डालने चलते बिना chemo-attractant जोड़ें और बुलबुले पैदा करने से बचें. नीचे कुएं में chemo-attractant तरल एक chemotactic ढाल के लिए फार्म का ऊपरी कुएं में झिल्ली के साथ संपर्क में आता है सुनिश्चित करें. ऊष्मायन समय सेल प्रकार और इस्तेमाल किया जा रहा chemo-attractant पर निर्भर है.
नोट: इसके अलावा परीक्षण ऊष्मायन अवधि निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है.
नोट: पक्षपाती कोशिकाओं के लिए, माइग्रेट कोशिकाओं झिल्ली 1,8 के दूसरी ओर करने के लिए देते हैं जाएगा. माइग्रेट कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव कदम 2.4 (2.4-2.8 एक बाँझ वातावरण में प्रदर्शन करने की आवश्यकता नहीं है कदम) के 2.8 के बाद किया जा सकता है. गैर पक्षपाती कोशिकाओं के लिए, माइग्रेट कोशिकाओं निचले सदन में मीडिया में छोड़ देंगे. माइग्रेट कोशिकाओं की संख्या hemocytometer का उपयोग करके गिना या 5 प्रवाह cytometer किया जा सकता है. - थाली से transwell डालने निकालें. जरूरत के रूप में ध्यान से यह नुकसान पहुँचाए बिना झिल्ली के ऊपर से माइग्रेट नहीं है कि मीडिया और शेष कोशिकाओं को हटाने के लिए कई बार के रूप में एक कपास इत्तला दे दी applicator का प्रयोग करें.
- 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में 70% इथेनॉल के 600-1,000 μl जोड़ें. सेल निर्धारण अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में transwell डालने जगह. 24 अच्छी तरह से थाली से transwell डालने निकालें और झिल्ली के ऊपर से शेष इथेनॉल दूर करने के लिए एक कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग करें. Transwell झिल्ली (आमतौर पर 10-15 मिनट) सूखे की अनुमति दें.
- 24 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में 0.2% क्रिस्टल वायलेट के 600-1,000 μl जोड़ें और धुंधला के लिए इसे में झिल्ली की स्थिति. 5-10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- धीरे से एक विंदुक टिप या कपास इत्तला दे दी applicator के साथ झिल्ली के ऊपर से क्रिस्टल बैंगनी हटा दें. जरूरत के रूप में बहुत सावधानी से तय की कोशिकाओं को धोने से बचने के लिए, अतिरिक्त क्रिस्टल viole दूर करने के लिए कई बार के रूप में आसुत जल में झिल्ली डुबकीटी. Transwell झिल्ली सूखे की अनुमति दें.
- देखें एक औंधा माइक्रोस्कोप के नीचे और chemo-attractant की ओर झिल्ली के माध्यम से चले गए और झिल्ली के नीचे (चित्रा 3) पर संलग्न है कि कोशिकाओं के एक औसत राशि प्राप्त करने के लिए देखने के विभिन्न क्षेत्रों में कोशिकाओं की संख्या गिनती.
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Representative Results
यहाँ प्रस्तुत घाव बंद परख और transwell सेल प्रवास परख एक मॉडल प्रणाली के रूप में माउस B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. घाव बंद परख में, B16F10 कोशिकाओं 6 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट में वरीयता प्राप्त थे और 24 घंटे में 100% संगम हो गई. लगभग 700 मीटर चौड़ा का एक घाव समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर दर्ज की गई थी एक विंदुक टिप और घाव बंद (सेल प्रवास) का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था. वैकल्पिक रूप से, घाव बंद भी समय चूक माइक्रोस्कोपी 1 उपलब्ध नहीं है तो अलग अलग समय बिंदुओं पर स्नैपशॉट तस्वीर लेने के द्वारा अध्ययन किया जा सकता है. चार 0 पर समय व्यतीत श्रृंखला से चित्र, 4, 8, और 12 घंटे का समय अंक चित्र 1 में दिखाया गया है. घाव की चौड़ाई के आधार पर हमने 40.42 मीटर पर सेल प्रवास के प्रवास दूरी और गति की गणना / घंटा (चित्रा 1 बी). समय चूक तस्वीर भी ImageJ कार्यक्रम (अनुपूरक वीडियो देखें) का उपयोग करते हुए एक वीडियो में इकट्ठे हुए थे. गुई गतिशील सेल माइग्रेशन प्रक्रिया का अध्ययन किया जा सकता है. चित्रा 2 में दिखाया गया है, lamellipodia (अग्रणी धार) और पूंछ (धार अनुगामी) के साथ पलायन कोशिकाओं की आकृति विज्ञान स्पष्ट रूप से मनाया गया.
Transwell सेल प्रवास परख, Corning से 24 अच्छी तरह आवेषण इस्तेमाल किया गया. B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं सीरम के बिना DMEM मध्यम और 0.1% बीएसए से मिलकर माइग्रेशन बफर में 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में फिर से निलंबित कर दिया गया. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त DMEM मध्यम में उगाई NIH3T3 fibroblast कोशिकाओं से वातानुकूलित मीडिया chemo-attractant के रूप में इस्तेमाल किया गया था. B16F10 कोशिकाओं के 100 μl निचले सदन या प्रवास बफर के समान मात्रा में जोड़ा गया था ऊपरी सदन और chemo-attractant के 600 μl में transwell झिल्ली के शीर्ष पर जोड़ा एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में जोड़ा गया है. प्रक्रिया में वर्णित के रूप में सेल प्रवास प्रदर्शन किया गया था. माइग्रेट कोशिकाओं की संख्या एक खुर्दबीन के नीचे या में गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता हैचित्र (3B चित्रा) ले लिया. 3 चित्र में दिखाया गया है, नियंत्रण प्रवास बफर (चित्रा -3 सी) की तुलना में chemo-attractant की ओर पलायन कोशिकाओं में एक 15 गुना वृद्धि हुई थी. transwell परख सेल chemotaxis, chemo-attractant की ओर दिशात्मक सेल प्रवास परख होती है.
चित्रा 1. B16F10 मेलेनोमा सेल घाव बंद परख. (ए) एक 16 घंटे का घाव बंद परख चित्रों के दौरान एक समय चूक माइक्रोस्कोप का उपयोग हर 5 मिनट में ले जाया गया. प्रतिनिधि 0 पर चित्र, 4, 8, और 12 घंटा दिखाए जाते हैं और बड़े पैमाने सलाखों (400 माइक्रोन) घाव चौड़ाई माप के लिए जोड़ रहे हैं. (बी) के घाव की दूरी माइक्रोन में मापा गया था. एक तितर बितर साजिश समय के साथ घाव की चौड़ाई और घाव बंद की दर की गणना की गई प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. जीनआर 2 मूल्य दर, एक रेखीय प्रतिगमन GraphPad चश्मे सॉफ्टवेयर (संस्करण 5.0, GraphPad सॉफ्टवेयर, Inc) का उपयोग घाव चौड़ाई डेटा पर चलाया गया था. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. एक 16 घंटे का घाव बंद परख चित्रों के दौरान घाव बंद परख का समय व्यतीत हो माइक्रोस्कोपी. से B16F10 पलायन कोशिकाओं की आकृति विज्ञान हर 5 मिनट में ले जाया गया. सभी तस्वीरें ImageJ कार्यक्रम (5 फ्रेम / सेकंड) का उपयोग करते हुए एक वीडियो में इकट्ठे हुए थे. सेल ध्रुवीकरण, lamellipodia विस्तार, और अनुगामी किनारे त्याग से जुड़े सेल प्रवास मनाया गया. वीडियो का 34.6, 36.6, और 38.6 सेकंड का समय अंक से चित्र (वीडियो समय वास्तविक समय चूक माइग्रेशन समय के लिए इसी (प्रस्तुत किए गएघंटा: मिनट: सेकंड) 34.6 सेकंड, 14:20:00; 36.6 सेकंड, 15:10:00; और क्रमशः 38.6 सेकंड, 16:00:00,). स्केल बार 50 माइक्रोन. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
B16F10 मेलेनोमा कोशिकाओं के चित्रा 3. Transwell प्रवास परख. (ए) सेल प्रवास और आक्रमण को मापने के लिए इस्तेमाल किया transwell डालने तंत्र के एक आरेख. (बी) B16F10 सेल transwell प्रवास के प्रतिनिधि तस्वीरें. सेल प्रवास बफर और NIH3T3 सेल वातानुकूलित माध्यम क्रमशः, नकारात्मक नियंत्रण और chemo-attractant के रूप में निचले सदन के लिए जोड़ा गया था. प्रक्रिया में वर्णित के रूप में क्रिस्टल वायलेट के साथ सेल प्रवास और धुंधला करने के बाद चले गए कोशिकाओं (बैंगनी दाग) की तस्वीरें एक माइकर का उपयोग कर लिया गयाएक 10x उद्देश्य (कुल बढ़ाई 100x) के साथ oscope. झिल्ली का pores भी तस्वीर में कई छोटे, गोल और काले रंग का डॉट्स के रूप में देखा जा सकता है.. प्रवास बफर या chemo-attractant (100x कुल बढ़ाई 5 चित्र क्षेत्रों का औसत) की ओर पलायन कोशिकाओं (सी) मात्रा करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
एक B16F10 मेलेनोमा सेल घाव बंद परख के पूरक वीडियो. समय चूक वीडियो. तस्वीर 193 चित्रों को उत्पन्न करने के लिए 16 घंटे के लिए हर 5 मिनट में ले जाया गया. सभी तस्वीरें ImageJ कार्यक्रम (5 फ्रेम / सेकंड) का उपयोग करते हुए एक वीडियो में इकट्ठे हुए थे. डाउनलोड तहत "Supplementary_Video_JOVE.avi" अनुपूरक फ़ाइल देखें.
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Discussion
सेल प्रवास कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलू है और यह भी, विकास प्रतिरक्षाविज्ञानी और घाव भरने के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है. सेल संस्कृति बंद करने परख घाव और transwell सेल प्रवास और आक्रमण assays सेल प्रवासी व्यवहार की विस्तृत जानकारी से पता चलता है और सेल प्रवास 1,2,10,14 के आणविक तंत्र की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारे अध्ययन से एक B16F10 मेलेनोमा सेल लाइन के प्रवास वेग और आक्रमण क्षमताओं का निर्धारण करने के लिए इन सेल गतिशीलता assays के लिए इस्तेमाल किया.
सेल घाव बंद परख कोशिकाओं का एक मिला हुआ थाली में किए गए एक घाव की ओर पलायन और बाद में बंद करने के लिए एक विशेष सेल लाइन की क्षमता की परख होती है. यह परख बुनियादी उपकरणों के साथ और मौजूदा तरीकों की तुलना में समूहों के लिए अत्यधिक सुलभ है सेल प्रवास को मापने के लिए एक सरल तरीका है. घाव बंद परख में कुछ बदलाव व्यक्तिगत उपचार समूहों में पाया जा सकता है लेकिन कई कदम उठाए हैं कि माY यह कम मदद करने के लिए ले जाया जा. भिन्नता को कम करने के लिए एक संभावित विधि तुल्यकालिक संगम को प्राप्त करने और एक प्रयोग की दीक्षा में स्वस्थ कोशिका की स्थिति बनाए रखने के लिए कोशिकाओं का एक ही नंबर के साथ प्रत्येक नमूना थाली करने के लिए है. सेल संस्कृति प्रयोगों के कई परीक्षणों स्वतंत्र नमूनों के बीच अचल संगम और स्वस्थ कोशिका का दर्जा हासिल करने के लिए जरूरी है कि सटीक चढ़ाना संख्या निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इसके अलावा, नमूना आकार में वृद्धि भी भिन्नता को कम करेगा. महत्वपूर्ण माइग्रेशन निरीक्षण करने के लिए 24 घंटे से अधिक समय ऊष्मायन समय की आवश्यकता है कि धीमी गति से पलायन सेल लाइनों के लिए, यह संभावित परख के परिणाम को प्रभावित कर सकता है कि सेल नंबर परिवर्तन को रोकने में aphidicolin या अन्य प्रसार अवरोध करनेवाला का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक है.
सेल घाव बंद परख, एकल कोशिका प्रवासी व्यवहार का एक विस्तृत मूल्यांकन का उपयोग सेल प्रवास वेग अध्ययन करने की क्षमता माहिर के बाद भी 14 से पूरा किया जा सकता है. इसके अलावा, के बाद एक wouएन डी बंद करने परख कोशिकाओं से तय किया जा सकता है और cytoskeletal संरचना और गतिशीलता के साथ शामिल विभिन्न प्रोटीन देखा जा सकता है और immunocytochemistry 2 का उपयोग कर मूल्यांकन किया. इस विश्लेषण पहले अज्ञात आगे विस्तृत जैव रासायनिक परिवर्तन हो सकता है. सेल घाव बंद परख भी समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके प्रवास गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए वास्तविक समय रहते सेल इमेजिंग के लिए अत्यधिक उत्तरदायी है. उदाहरण के लिए, actin GFP, ट्यूबिलिन GFP, और paxillin-GFP संलयन प्रोटीन सेल प्रवास या आसंजन 18,19 में अलग अलग समय बिंदुओं पर प्रोटीन का स्थानीयकरण देखने के लिए जीवित कोशिकाओं में व्यक्त किया जा सकता है. घाव बंद परख की कुछ सीमाएं उदाहरण के लिए, यह गैर पक्षपाती कोशिकाओं के लिए उपयुक्त नहीं है और सेल chemotaxis उपाय नहीं है, कि शामिल हैं. इसके अलावा, कुछ सेल लाइनों घाव (जैसे HEK293T कोशिकाओं) किया जाता है तुरंत बाद थाली से अलग करने की प्रवृत्ति है. उन सेल लाइनों के लिए, यह पूर्व casted घाव प्लेटों या transw उपयोग करने के लिए बेहतर हैपक्ष प्रवास परख नीचे चर्चा की.
transwell सेल प्रवास और आक्रमण परख एक विशेष chemo-attractant भावना और यह की ओर एक शारीरिक बाधा के माध्यम से विस्थापित करने की कोशिकाओं की क्षमता का पूरी तरह से विश्लेषण प्रदान करता है. इस परीक्षा में आगे ईसीएम आक्रमण और परिस्त्राव 1,10 की प्रक्रिया की नकल करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स की एक परत या transwell झिल्ली के शीर्ष पर endothelial कोशिकाओं की एक परत जोड़कर सेल आक्रमण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, Matrigel के माध्यम से आक्रमण के बाद, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संयोजन में cytoskeletal प्रोटीन की प्रतिरक्षा धुंधला 3 डी आक्रमण के दौरान रूपात्मक अध्ययन के लिए मूल्यवान हो सकता है. Transwell सेल आक्रमण परख का उपयोग की एक सीमा है कि सेल आक्रमण की उस समय व्यतीत डेटा है पारंपरिक माइक्रोस्कोपी के साथ पाने के लिए और इस प्रक्रिया की सेल इमेजिंग जटिल है जीना मुश्किल है.
सही परिणाम प्राप्त करने के लिए, कई महत्वपूर्ण कदम टीआरए के दौरान कर रहे हैंमहत्व के हैं कि nswell सेल प्रवास और आक्रमण assays. सेल प्रवास वेग व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं के बाद से पहली, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच कई प्रारंभिक प्रयोगों प्रक्रिया में उपयोग किया जाएगा कि एक विशिष्ट माइग्रेशन समय सीमा को अपनाने के लिए किया जाना चाहिए. दूसरा, chemo-attractant भी ब्याज की सेल प्रकार के लिए लागू किया जाना चाहिए. Chemo-attractants की एक विस्तृत श्रृंखला के अंतिम प्रवास और एक विशेष सेल प्रकार की आक्रमण क्षमता को मापने से पहले प्रयोगों पूर्ववर्ती में जांच की जानी चाहिए. Fibroblasts वातानुकूलित मध्यम सामान्यतः सेल प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक मजबूत chemo-attractant के रूप में प्रयोग किया जाता है. एक एकल शुद्ध chemo-attractant प्रयोग किया जाता है chemo-attractant के रिसेप्टर्स ब्याज की कोशिका प्रकार में व्यक्त कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें. अंत में, सेल आक्रमण परख के लिए Matrigel या अन्य बाह्य मैट्रिक्स की कोटिंग प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करने के क्रम में सजातीय है सुनिश्चित करें. अंत में, कुछ सीमाएं हैं, हालांकि अत्यधिकयहाँ वर्णित सुलभ सेल प्रवास assays जैविक अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयोगी होते हैं.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
References
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
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