Summary
一般的に使用される、 インビトロで細胞遊走および浸潤を調べるための高度にアクセス可能な方法が記載されている。第一の方法は、細胞運動性を測定する細胞創傷閉鎖アッセイである。第二の方法は、走化性、細胞の浸潤能を評価するトランスウェル遊走および浸潤アッセイである。
Introduction
運動性は、生きた細胞の本質的な特徴である。細胞遊走は、生命、胚発生、免疫応答、並びに癌転移および炎症1-9のような多くの病理学的プロセスの概念に関与する。そのため、細胞移動挙動を研究するための方法は生物医科学、生物学、生物工学、および関連分野における専門分野の広い範囲のために非常に有用な研究ツールである。
癌患者の死亡の主な原因は、転移の進行に関連しているように、癌研究における細胞移動の研究は、特に重要である。体全体に広がり、普及させる癌のために、癌細胞は、移行する必要がありますし、intravasate血液循環中に、細胞外マトリックス（ECM）を介して侵入し、離れた部位に付着し、最終的には遠くの巣1,10-12を形成するために浸出。様々な生物学的方法が詳細にこれらの事象を研究するために用いることができる。細胞培養創傷閉鎖ANdは、トランスウェル遊走および浸潤アッセイが広く科学界1,10に使用される。これらのテストは、特定の細胞型が自然に移行または化学誘引物質に反応し、方向的にそれに向かって移動することができますどれだけの理解を可能にすることができる必要なデータを提供することができます。いくつかの渡り鳥の表現型が記載されている。細胞は、間葉またはアメーバ様運動で、または多細胞運動によって見られるような単細胞状に移動することができる13のストリーミング遊走または細胞集団を標識した。運動性細胞において使用される移動の方法は、容易に細胞培養創傷閉鎖アッセイ法を用いて観察することができる。
細胞移動を研究するための多くの方法の中でも、細胞創傷閉鎖アッセイは、最も簡単なの一つである。この方法は、全細胞塊の遊走能を決定するために有用である。さらに一歩撮影時には、移行中に14個々の細胞の形態学的特徴を観察するために使用することができる。創傷閉鎖の分析に続いて、多くの表現型を明らかにすることができる。コントロールと比較し時間をかけて、閉じた距離を測定することは、特定の移行変更やこれまで知られていなかった障害のある渡り鳥の表現型を明らかにすることができる。さらに、単一細胞葉状仮足の形成、尾部退縮、および方向移動は、関心対象14の細胞で損なわ又は増強することができる何の手 がかりを与えることができる。
トランスウェル遊走および浸潤アッセイは、それらが方向性ケモカイン、増殖因子、脂質、またはヌクレオチド4,5,8,15,16であるかどうかを、種々の化学誘引物質に応答する単一細胞の能力を分析するために使用されてもよい。それはまた、受容体1,14の過剰発現に差動回遊能力を評価することができる。これらのアッセイはまた、低分子量GTPase 2のRhoファミリーなどの細胞移動の重要な調節因子を同定および特徴付けるために使用することができる。これらの短い、以下、簡単にアクセスもてアクセスします試験、細胞移動のモードと3-Dマトリックスに浸潤する細胞の能力を決定することもできる。
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Protocol
1。細胞培養創傷閉鎖アッセイ
- 0.25％トリプシン-EDTA溶液を用いて組織培養プレートから細胞を剥離。ペレットを遠心分離により15ミリリットルの円錐管中の細胞上清を吸引し、培養培地中に再懸濁細胞。 24時間で100％のコンフルエンスのために6ウェルプレート中の適切な数の細胞をプレート。
注：試験による細胞型と同様に使用されているのサイズに100％の集密度を達成するための時間および細胞の数を決定するために必要とされてもよい（例えば、1×10 6個のB16F10メラノーマ細胞をウェルに播種し創傷の発生の24時間前に6ウェルプレート）。あるいは、12ウェルまたは24ウェルプレートを使用することができる。
注意：使用可能な場合は、細胞が傷プレキャストを作る処理した組織培養プレート上で培養インサート（ibidi LLCから）中に播種することができます。文化の挿入は、ピペットチップによる損傷から組織培養プレートの表面を保護することができる。文化挿入はオミットステップを使用している場合1.2。 - 無菌環境（通常はバイオセーフティフード）で組織培養プレートの上にしっかりと押して、速やかに細胞単層を通って下の縦傷を作るために200μlのピペットチップを使用しています。異なるサイズのピペットチップは、所望される創傷サイズを作製するために使用されてもよい。それは表面を傷つける可能性があるピペットチップで組織培養プレートに無理な力を加えないでください。創傷が予めキャストである場合、このステップは省略してもよい。
- 注意深く培地および細胞の破片を吸引する。ゆっくりウェルの底をカバーし、追加の細胞を剥離しないように十分に壁に対して十分な培養培地を追加します。傷の発生や検査次の初期画面は、注意が必要です。適切な温度およびCO 2濃度（通常37℃、5％CO 2）に設定したインキュベータ中で組織培養プレートを置き。
- いくつかの時点で、3時間ごとなど 、incubatからプレートを取り外しまたはスナップショット撮影すると、創傷閉鎖をチェックするために倒立顕微鏡下に置きます。タイムラプス顕微鏡を使用できる場合は、いつでも温度の持続時間と、CO 2制御室のために写真を（通常は5分ごとに始まる）分のすべてのXの数を取る。細胞型に依存して、創傷閉鎖時間は変わる場合があります。
- スナップショット画像の結果を分析するために、スケールバーを使用して、他の創傷の片側の距離を測定する。散布図や棒グラフなどの 図1を使用して分析し、時間の経過とともに明らかに存在創傷閉鎖。
- タイムラプス画像を分析するために、ビデオを作るために（http://rsb.info.nih.gov/ij/で自由に利用できる）ImageJソフトウェアに写真をインポートします。このオープンはImageJを行うには、ファイル、インポート、およびイメージシーケンスをクリックします。写真を使用してファイルを見つける。ファイル内の最初の写真をクリックしてください。 、ファイルを選択して、ビデオを保存として保存し、AVIファイル。シングル移動細胞は、キャラに観察されることがある方向の動きをcterize。さらに、このような葉状仮足の形成及び後縁の後退などの形態学的特徴（ 図2及び補助ビデオ）ならびに研究することができる。
2。トランスウェル細胞遊走および浸潤アッセイ
- 無菌環境（典型的には、バイオセーフティーフード）中で遠心分離することにより、非酵素的細胞解離緩衝液または0.25％トリプシン-EDTA溶液を用いてペレット細胞を組織培養プレートから細胞を剥離し、ペレット化した細胞を残す既存の培地を吸引除去する。 0.1％BSA（ウシ血清アルブミン）を含有する無血清細胞培養培地中で細胞を再懸濁する。
注：トリプシン-EDTAによる細胞表面17上の種々の受容体の切断に対する細胞の遊走および浸潤に影響を与える可能性が0.25％を調査される細胞株に依存して。
注：ml当たりの細胞数、細胞のサイズに依存する。さらなる試験は、プロ播種密度を見つけるために必要とされ得る最良の結果をvides。 24ウェルトランスウェルインサートを使用するとき、典型的には1×10 6細胞/ mlのほとんどの細胞型のための良い出発点である。トランスウェルインサートサイズの範囲と添加した細胞の数はそれに応じてのために調整されるべきでもある。 - プレート100トランスウェルインサート内フィルター膜の上に細胞溶液の液とは、37℃で10分間インキュベートし、5％のCO 2の細胞が落ち着いてできるようにする。
注：使用されるトランスウェル膜の特定の細孔サイズは、試料中の細胞の個々の大きさに依存する。細胞が小さすぎる場合は、それらは、移行を容易にするために、またはそれらが大きすぎる場合、それらが孔を通って適合しない場合を必要とせずに細孔を通過することができる。いくつかのトランスウェル3ミクロンまでの範囲の細孔径を有する挿入、5ミクロン、および細胞遊走アッセイのための8ミクロンがあります。トランスウェルインサートは、例えば、コーニング社のような会社から市販されている。
注：トランスウェルMigrationアッセイは、容易に細胞浸潤アッセイを行うために改変することができる。これを行うには、トランスウェル膜の上に、細胞外マトリックス（ECM）材料を追加してから、ECMの上にセルを追加。例えば、マトリゲルを解凍し、氷上で液化し、次いでマトリゲルの30〜50μlを、トランスウェルインサートを24ウェルに添加し、薄いゲル層を形成するために15〜30分間37℃のインキュベーター中で固化した。細胞溶液を細胞外マトリックスを介して侵入するのをシミュレートするためにマトリゲルコーティングの上に付加される。
注意：トランスウェル細胞遊走およびトランスウェル細胞浸潤アッセイの間に明確な違いがあります。トランスウェル細胞移動アッセイは、化学誘引物質に向かう細胞の走化性能力を測定する。トランスウェル細胞浸潤アッセイは、しかしながら、細胞外マトリックスを介して一般に癌の転移又は胚発生中に見出されているプロセスを細胞走化性および細胞の浸潤の両方を測定する。 - ピペットを用いて、非常にcarefully 24ウェルプレート内の下部チャンバーの底部に必要な化学誘引物質を600μlを加える。トランスウェルインサートを移動させずに化学誘引物質を加え、気泡を発生しないようにします。底に化学誘引液がうまく走化性勾配を形成するために、上だけでなく、膜と接触することを確認します。インキュベーション時間は、細胞の種類および使用される化学誘引物質に依存する。
注：さらなる試験は、インキュベーション期間を決定するために必要とされてもよい。
注：接着細胞の場合、移動した細胞を膜1,8の他方の側に付着する。移動した細胞の定量化は、ステップ2.4（2.4〜2.8は、無菌環境で実施される必要がないステップ）2.8以下を行うことができる。非接着細胞の場合は、移動した細胞を下部チャンバーにメディアにドロップします。遊走した細胞の数は血球計数器を用いて計数または5フローサイトメーターすることができる。 - プレートからトランスウェルインサートを削除する。慎重に損傷を与えることなく、膜の上から移行していないメディアや、残りの細胞を除去するために、必要に応じて何度でも綿棒を使用してください。
- 24ウェルプレートのウェルに70％エタノールを600〜1,000μLを加える。細胞固定を可能にするために10分間70％エタノール中にトランスウェルインサートを配置する。 24ウェルプレートからトランスウェルインサートを取り外し、膜の上から残りのエタノールを除去し綿棒を使用しています。トランスウェル膜（一般的に10〜15分）を乾燥することができます。
- 24ウェルプレートのウェルに0.2％クリスタルバイオレットの600〜1,000μLを加え、染色のために、その中に膜を配置する。 5〜10分間、室温でインキュベートする。
- そっとピペットチップや綿棒で膜の上からクリスタルバイオレットを削除します。非常に慎重に、過剰な結晶ヴィオレを除去するために、必要に応じて蒸留水に何度でもメンブレンを浸し、固定した細胞を洗浄オフ避けるためにT。トランスウェルメンブレンを乾燥させる。
- ビュー倒立顕微鏡の下や化学誘引物質に向かって、膜を通って移動し、膜の下側（ 図3）に付着した細胞の平均の合計を取得するために、ビューのさまざまな分野でのセルの数をカウントします。
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Representative Results
ここに提示創傷閉鎖アッセイ及びトランスウェル細胞移動アッセイをモデル系としてマウスB16F10メラノーマ細胞を用いて行った。創傷閉鎖アッセイでは、B16F10細胞を6ウェル組織培養プレートに播種し、24時間で100％のコンフルエンスまで増殖させた。約700μm幅の傷をタイムラプス顕微鏡を用いて記録したピペットチップ及び創傷閉鎖（細胞遊走）を用いて生成した。タイムラプス顕微鏡検査は、1利用できない場合、あるいは、創傷閉鎖はまた、異なる時点でのスナップショットを撮影することによって研究することができる。四つ0における経時系列からのピクチャ、4,8、および12時間の時点を図1に示す。創傷の幅に基づいて、我々は40.42ミクロンでの細胞移動の移動距離と速度を算出/時間（ 図1B）。タイムラプス画像もImageJのプログラム（補足ビデオ参照）を使用してビデオに組み立てた。目電子動的セル移行プロセスを研究することができる。 図2に示すように、葉状仮足（前縁）及び尾部（後縁）を用いて細胞の移行の形態は明瞭に観察された。
トランスウェル細胞遊走アッセイでは、コーニング社の24ウェルインサートを使用した。 B16F10メラノーマ細胞を、血清を含まないDMEM培地および0.1％BSAからなる緩衝液中で泳動1×10 6細胞/ mlの濃度で再懸濁した。 10％ウシ胎児血清を含むDMEM培地中で増殖させたNIH3T3線維芽細胞からの馴化培地を化学誘引物質として使用した。 B16F10細胞100μlを下室または移行バッファの同じボリュームに追加されましたが、上室および化学誘引物質600μlの中のトランスウェル膜の上に追加ネガティブコントロールとして追加されました。手順に記載のように細胞遊走を行った。遊走した細胞の数を顕微鏡の下又は中に計数することによって定量することができる撮影した画像（ 図3B）。図3に示すように、制御移動緩衝液（ 図3C）と比較して、化学誘引物質に向かって移動する細胞において15倍の増加があった。トランスウェルアッセイは、細胞走化性、化学誘引物質に向かって方向性細胞遊走を検査する。
図1 B16F10メラノーマ細胞創傷閉鎖アッセイ（A）中、16時間の創傷閉鎖アッセイの写真は、タイムラプス顕微鏡を用いて5分毎に採取した。代表0におけるピクチャ、4,8、および12時間を示し、スケールバー（400μm）を創傷幅測定のために添加される。（B）創傷の距離をμmで測定した。散布図は、経時的に創傷の幅を表示するために使用され、創傷閉鎖率を算出した。遺伝子にR 2の値を評価、線形回帰をグラフパッドプリズムソフトウェア（バージョン5.0、グラフパッドソフトウェア社）を使用して、創傷幅データ上で実行されました。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2。16時間の創傷閉鎖アッセイの写真の間に創傷閉鎖アッセイのタイムラプス顕微鏡。からB16F10細胞の移行の形態は 、5分ごとに採取された。すべての画像は、ImageJのプログラム（5フレーム/秒）を使用してビデオに組み立てた。電池分極、葉状仮足の伸長、及び後縁の後退を伴う細胞遊走が観察された。 34.6、36.6、ビデオの38.6秒の時点で発表されました（ビデオ時間は実際の時間経過移行時間に対応した（からの写真時間：分：秒）34.6秒、14時20分00秒; 36.6秒、15時10分00秒;それぞれ38.6秒、午前十六時00分00秒）。スケールバーは50μm。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
B16F10黒色腫細胞の図3トランスウェル遊走アッセイ。（A）細胞遊走および浸潤を測定するために使用されるトランスウェルインサート装置の図。（B）B16F10細胞トランスウェル遊走の代表的な写真。細胞遊走緩衝液およびNIH3T3細胞馴化培地を、それぞれ、陰性対照および化学誘引物質として下室に添加した。手順で説明したようにクリスタルバイオレットで細胞の移動および染色の後、移動した細胞（紫に染色）の写真は、MICRを用いて撮影した10倍の対物レンズ（総合倍率100倍）でOSCOPE。膜の細孔はまた、写真の中の多数の小さな丸いと暗い色のドットのように観察することができた。泳動バッファーまたは化学誘引物質（100倍の総合倍率で5ピクチャーフィールドの平均）に向かって遊走する細胞の（C）の定量化。 してくださいこの図の拡大バージョンを見るにはここをクリックしてください。
補足ビデオ。B16F10メラノーマ細胞創傷閉鎖アッセイのタイムラプスビデオ。ピクチャは、ピクチャ193を生成するために、16時間、5分ごとに採取した。すべての画像は、ImageJのプログラム（5フレーム/秒）を使用してビデオに組み立てた。ダウンロードの下の「Supplementary_Video_JOVE.avi "補足ファイルを参照してください。
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Discussion
細胞遊走は、癌研究において研究する重要な側面であり、それはまた、免疫学的発達および創傷治癒の研究に適用することができる。細胞培養は、閉鎖アッセイを巻き取り、トランスウェル細胞遊走および浸潤アッセイは、細胞遊走挙動の詳細な情報を明らかにし、細胞遊走1,2,10,14の分子機構を研究するために使用することができる。我々の研究は、B16F10メラノーマ細胞株の移動速度および浸潤能力を決定するために、これらの細胞運動性アッセイを用いる。
細胞創傷閉鎖アッセイは移動し、続いて細胞のコンフルエントなプレートで行われた創傷を閉鎖するための特定の細胞系の能力を調べる。このアッセイは、基本的な機器とし、既存の方法と比較して、基に高度にアクセス可能な細胞遊走を測定するための簡単な方法である。創傷閉鎖アッセイにおけるいくつかの変化は、個々の治療群に見られるが、そのMA、いくつかのステップがありますYはそれを軽減に役立つように注意する。ばらつきを低減する一つの潜在的な方法は、同期コンフルエンスを達成し、各実験の開始時に健康な細胞状態を維持するために、同数の細胞に各試料をメッキすることである。細胞培養実験のいくつかの試験は、独立したサンプル間で不変で合流し、健康な細胞の状態を達成するために必要とされる正確なめっき数を決定するために必要とされ得る。また、サンプルサイズを大きくすると、変動を減少させる。有意な遊走を観察するために24時間以上のインキュベーション時間を必要と遅い遊走細胞株の場合、それは潜在的に、アッセイの結果に影響を与える可能性があり、細胞数の変化を防止するために、アフィジコリンまたは他の増殖阻害剤を使用するのが便利である。
細胞創傷閉鎖アッセイを用いて細胞移動速度を研究する能力を習得した後、単一細胞遊走挙動の詳細な評価はまた、14を完了することができる。さらに、以下のWOUndは閉鎖アッセイ細胞を固定してもよいし、細胞骨格構造および動態に関与する種々のタンパク質が見2および免疫細胞化学を用いて評価することができる。この分析は、これまで知られていなかった、さらに詳細な生化学的変化につながる可能性があります。細胞創傷閉鎖アッセイは、経時的蛍光顕微鏡を使用して、マイグレーションのダイナミクスを研究するために、リアルタイムのライブセルイメージングに非常に適している。例えば、アクチン-GFP、GFP-チューブリン、およびパキシリン-GFP融合タンパク質は、細胞遊走又は接着18,19における異なる時点でのタンパク質の局在を表示するために、生細胞で発現させることができる。創傷閉鎖アッセイのいくつかの制限は、例えば、非接着細胞には適していないと、細胞走化性を測定しないことが挙げられる。さらに、いくつかの細胞株は、創傷が作られた直後に（ 例えば HEK293T細胞）をプレートから剥離する傾向がある。これらの細胞株について、プリキャスト創傷プレートまたはtranswを使用した方がよいエル遊走アッセイは、以下に説明する。
トランスウェル細胞遊走および浸潤アッセイは、特定の化学誘引物質を感知し、それに向けて、物理的障壁を通って移動する細胞の能力を徹底的に分析しています。この試験は、さらに、ECMの浸潤および血管外遊1,10のプロセスを模倣する細胞外マトリックスの層またはトランスウェル膜の上に内皮細胞の層を追加することによって、細胞浸潤を調べるために使用することができる。加えて、マトリゲルを介して浸潤以下、蛍光顕微鏡と組み合わせて、細胞骨格タンパク質の免疫学的染色は3-Dの侵入の間に形態学的研究のために価値がある。トランスウェル細胞浸潤アッセイを使用しての限界は、細胞浸潤の経時的データであり、従来の顕微鏡で達成することが困難であり、このプロセスの生細胞イメージングは複雑である。
正確な結果を得るためには、TRAの間にいくつかの重要なステップがあります重要であるnswell細胞遊走および浸潤アッセイ。細胞移動速度が大きく異なることがあるので、まず、異なる細胞型の間にいくつかの予備実験は、手順で使用される特定の移動時間枠を採用することが行われなければならない。第二に、化学誘引物質はまた、目的の細胞型にも適用可能でなければなりません。化学誘引物質の広い範囲が、特定の細胞型の最終的な移動および浸潤能を測定する前に、実験の前に検討すべきである。線維芽細胞馴化培地は、一般に、広範囲の細胞型のための強力な化学誘引物質として使用される。シングル、精製化学誘引物質を使用する場合は、化学誘引物質の受容体は、目的の細胞型に発現していることを確認してください。最後に、細胞浸潤アッセイのためにマトリゲルのコーティングまたは他の細胞外マトリックスは実験変動を最小限にするために、均質であることを確認してください。結論として、いくつかの制限があるが、高ここで説明するアクセス可能な細胞遊走アッセイは、生物学的研究の広い範囲のために有用である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
References
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