Summary
Обычно используется, очень доступные методы для изучения миграции клеток и вторжение в пробирке описаны. Первый способ заключается клетка закрытия раны анализа, который измеряет подвижность клеток. Второй способ является Transwell миграции и вторжения анализ, который оценивает хемотаксического и инвазивной способности клеток.
Introduction
Подвижность является существенным признаком живых клеток. Миграция клеток участвует в концепции жизни, эмбрионального развития, иммунного ответа, и многих патологических процессов, таких как метастаза рака и воспаления 1-9. Поэтому методы для изучения миграционное поведение клеток очень полезные инструменты исследования для широкого круга дисциплин в области биомедицинских наук, биология, биотехнологии, и в смежных областях.
Изучение миграции клеток в исследовании рака представляет особый интерес, поскольку основной причиной смерти у больных раком связан с метастатическим прогрессии. Для того, чтобы рак распространения и распространение по всему организму, раковые клетки должны мигрировать и вторгнуться через внеклеточного матрикса (ECM), intravasate в кровь, приложить к далекой сайта, и, наконец, вытекать из сосудов в ткань, чтобы сформировать далекую очаги 1,10-12. Различные биологические методы могут быть использованы для изучения этих событий в деталях. Культура клеток рана закрытиег миграции Transwell и вторжения анализы широко используются в научном сообществе 1,10. Эти тесты могут представлять необходимые данные, которые могут позволить для понимания того, насколько хорошо конкретный тип клеток может самопроизвольно мигрировать или ответить на химио-аттрактанта и направленно мигрируют к нему. Несколько перелетные фенотипы были описаны. Клетки могут мигрировать в единой форме клеток, таких как видно на мезенхимальных или амебоидной-как движения или многоклеточного движения с надписью коллективную миграцию или ячейку потокового 13. Способ движения, используемого в подвижных клеток можно легко наблюдать с помощью культуры клеток закрытия раны анализа.
Среди многочисленных способов изучения миграции клеток, клетка закрытия раны анализ является одним из самых простых. Этот метод полезен для определения миграции способность целых масс клеток. При приеме на шаг дальше он может быть использован для наблюдения морфологических характеристик отдельной клетки во время миграции 14. После анализа закрытия раны многие фенотипы могут быть выявлены. Измерение замкнутую дистанцию со временем при сравнении с контролем может выявить конкретные изменения миграционных или с дефектами зрения миграционного фенотипа, который был неизвестен ранее. Кроме того, формирование одной клетки lamellipodium, хвост отвод, и направленное движение может дать ключ для того, что может быть нарушена или усиливается в клетках интерес 14.
Миграция Transwell и инвазии анализы могут быть использованы для анализа на способность отдельных клеток с целью непосредственного реагировать на различные химио-аттрактантов являются ли они хемокинов, факторов роста, липиды, или нуклеотиды 4,5,8,15,16. Он также может оценить дифференциальную миграционную способность в связи с чрезмерной экспрессией рецептора 1,14. Эти анализы могут быть также использованы для идентификации и характеристики ключевых регуляторов клеточной миграции, такие как семейства Rho малых GTPases 2. После них короткие и легкого доступаможных тесты, режим миграции клеток и способность клетки к вторжению в 3-D матрицы также может быть определена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Закрытие Анализ клеточной культуры Рана
- Отделить клетки от культуры ткани пластины с использованием 0,25% раствора трипсина-ЭДТА. Гранул клеток в 15 мл коническую пробирку центрифугированием, аспирата супернатант и вновь приостановить клеток в культуральной среде. Plate соответствующее количество клеток в 6-луночный планшет для 100% слияния в 24 часов.
Примечание: Испытания могут быть необходимы, чтобы определить время и количество клеток для достижения 100% слияния в связи с типом клеток и размера хорошо используется (например, 1 х 10 6 B16F10 меланомы клетки высевают в лунку 6-луночный планшет за 24 часа до генерации раны). В качестве альтернативы, можно использовать 12-луночных или 24-луночных планшетах.
Примечание: Если возможно, клетки могут быть посеяны в культуру-Insert (от ibidi ООО) на обработанной планшета для культуры ткани делает рану предварительно приведением. Культура-патрон может защитить поверхность планшета для культуры ткани от повреждения кончика пипетки. Если культура-вставки используется пропустить шаг1.2. - В стерильной среде (обычно биологической безопасности капот) используют пипетки 200 мкл нажать плотно прижата к верхней части планшета для культуры ткани и быстро сделать вертикальную рану вниз через клеточный монослой. Разного размера наконечник пипетки может быть использован, чтобы размер раны, которая является желательной. Не прилагайте чрезмерных усилий против планшета для культуры ткани с кончика пипетки, как это может повредить поверхность. Если рана предварительно отлиты, этот шаг может быть пропущен.
- Тщательно аспирата средств массовой информации и остатков клеток. Медленно добавить достаточно питательных сред против а стены, чтобы покрыть дно колодца и избежать отсоединения дополнительные ячейки. После генерации и проверки раны Исходная картина должны быть приняты. Поместите планшета для культуры ткани в инкубатор при соответствующей температуре и концентрации СО 2 (обычно 37 ° C и 5% CO 2).
- В разные моменты времени, например, каждые 3 часа, удалить пластину из incubatили и поместите его под инвертированным микроскопом, чтобы сделать снимок картины и для проверки наличия закрытия раны. Если покадровой микроскопии доступен, примите фото каждый X количество минут (обычно начиная с каждые 5 минут) для любой продолжительности времени в температуре и CO 2 контролируемой камере. В зависимости от типа клеток, время закрытия раны может изменяться.
- Для анализа результатов Снимки изображений, измерить расстояние от одной стороны раны к другому, используя масштабную линейку. Анализ и явно присутствует закрытие раны со временем, используя точечный график или гистограмма, например Рисунок 1.
- Для анализа покадровой фотографии, импортировать фотографии в ImageJ программного обеспечения (в свободном доступе на http://rsb.info.nih.gov/ij/), чтобы сделать видео. Для этого откройте ImageJ в меню Файл выберите Импорт и последовательности изображений. Найдите файл с фотографиями; нажмите первую фотографию в файле. Сохранить видео, выбрав Файл, Сохранить как, и AVI. Холост мигрирующие клетки можно наблюдать в чараcterize направленное движение. Кроме того, морфологические характеристики, такие как формирование ламеллиподий и задней кромки отвода могут быть изучены, а (рис. 2 и дополнительного видео).
2. Transwell сотовый Миграция и Вторжение Анализ
- В стерильных условиях (как правило, капот биобезопасности) отделить клетки от планшета для культуры ткани с использованием неферментативное буфер клеток диссоциации или 0,25% раствором трипсина-EDTA, гранул клеток путем центрифугирования, и аспирации существующая СМИ оставляя осажденные клетки. Повторное приостановить клеток в свободной клеточной культуральной среде сыворотки, содержащей 0,1% БСА (бычий сывороточный альбумин).
Примечание: В зависимости от клеточной линии под следствием 0,25% Трипсин-ЭДТА может повлиять на миграцию клеток и инвазии в связи с расщеплением различных рецепторов на клеточной поверхности 17.
Примечание: число клеток на мл зависит от размера клеток. Дальнейшие тесты могут быть необходимы, чтобы найти плотность посева, что ProVides лучшие результаты. Обычно 1 х 10 6 клеток / мл является хорошей отправной точкой для большинства типов клеток при использовании 24-а Transwell вставить. Существует целый ряд Transwell размеров вставки и количество клеток, добавленных должна быть скорректирована для соответствующим образом. - Тарелка 100 мкл раствора клеток в верхней части мембраны фильтра в Transwell вставки и инкубировать в течение 10 минут при 37 ° С и 5% СО 2, чтобы позволить клетки, чтобы успокоиться.
Примечание: Конкретный размер пор мембраны, используемой Transwell зависит от индивидуального размера клеток в образце. Например, если клетки слишком малы, они могут проходить через поры без необходимости для облегчения миграции или если они слишком велики, они не могут проходить через поры. Есть несколько Transwell вставки с размером пор, которые варьируются от 3 мкм, 5 мкм и 8 мкм для миграции клеток анализов. В Transwell вставки являются коммерчески доступными от таких компаний, как Corning.
Примечание: Transwell мigration анализ может быть легко модифицирована для выполнения вторжения клеток анализа. Чтобы сделать это, добавьте внеклеточный матрикс (ECM) материалов в верхней части Transwell мембраны, а затем добавить клетки в верхней части ECM. Например, Матригель оттаивают и сжиженный на льду, а затем 30-50 мкл Matrigel добавляется в 24-луночный Transwell вставить и затвердевает в инкубаторе 37 ° C в течение 15-30 минут, чтобы сформировать тонкий слой геля. Сотовый решение добавляется в верхней части покрытия Матригель имитировать вторжение через внеклеточного матрикса.
Примечание: Есть четкие различия между миграцией Transwell клеток и вторжения Transwell клеток анализов. Миграция анализ Transwell клеток измеряет хемотактическую возможности клеток в сторону химио-аттрактанта. Вторжение Transwell клеток анализ, однако, измеряет как сотовые хемотаксис и нашествие клеток через внеклеточного матрикса, процесс, который обычно находится в метастазами рака или эмбрионального развития. - С помощью пипетки, очень carefUlly добавить 600 мкл требуемой химио-аттрактанта в нижней части нижней камеры в 24-луночный планшет. Добавьте химио-аттрактант без перемещения Transwell вставку и избежать образования пузырьков. Убедитесь, что химио-аттрактант жидкость в нижней скважины вступает в контакт с мембраной в верхней скважины, чтобы сформировать градиент хемотаксиса. Время инкубации зависит от типа клеток и химио-аттрактанта используется.
Примечание: Дальнейшие тесты могут быть необходимы, чтобы определить, инкубационный период.
Примечание: адгезивных клеток, перенесенные клетки приложить к другой стороне мембраны 1,8. Количественное мигрировавших клеток могут быть выполнены следующие шаги 2,4 до 2,8 (шаги 2.4-2.8 не нужно быть выполнены в стерильной среде). Для не-прилипшие клетки, мигрировавшие клетки упадет в СМИ в нижней палате. Количество мигрировавших клеток можно пересчитать с помощью гемоцитометра или проточного цитометра 5. - Извлеките вставку Transwell от пластины. Используйте ватный-наконечником аппликатором столько раз, сколько необходимо тщательно удалить средства массовой информации и оставшиеся клетки, которые не переносятся из верхней части мембраны, не повреждая ее.
- Добавить 600-1000 мкл 70% этанола в лунку 24-луночного планшета. Поместите Transwell вставку в 70% этаноле в течение 10 минут, чтобы позволить прикрепление клеток. Удалить Transwell вставку из 24-луночного планшета и использовать ватным наконечником аппликатора для удаления оставшегося этанола из верхней части мембраны. Разрешить Transwell мембрана высохнуть (обычно 10-15 минут).
- Добавить 600-1000 мкл 0,2% кристаллическим фиолетовым в лунку 24-луночного планшета и поместите в него мембрану для окрашивания. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5-10 минут.
- Осторожно удалите кристаллический фиолетовый сверху мембраны с наконечником пипетки или хлопка наконечником аппликатора. Очень осторожно, чтобы избежать смывания фиксированные клетки, окуните мембрану в дистиллированной воде столько раз, сколько необходимо для удаления избытка кристально Violeт. Разрешить Transwell мембрана для просушки.
- Вид под инвертированным микроскопом и подсчета количества клеток в различных полей зрения, чтобы получить среднюю сумму клеток, которые мигрировали через мембрану к химио-и аттрактанта, прикрепленных на нижней стороне мембраны (рис. 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рана закрытие анализа и миграции Transwell клеток анализа, представленные здесь проводились с использованием мыши B16F10 клетки меланомы в качестве модельной системы. В анализе закрытия раны, B16F10 клетки высевали в культуре ткани пластины 6-луночный и выращивали до 100% слияния в течение 24 часов. Рана примерно 700 мкм в ширину был сгенерирован с помощью пипетки и закрытие раны (миграции клеток) был записан с помощью покадровой микроскопии. С другой стороны, закрытие раны также могут быть изучены, взяв фотоснимков в различные моменты времени, если покадровой микроскопии не доступен 1. Четыре картины из серии покадровой на 0, 4, 8 и 12-часовые временные точки приведены на рисунке 1. Основываясь на ширине раны, мы рассчитали расстояние миграции и скорость миграции клеток в 40,42 мкм / ч (фиг.1В). В покадровой фотографии были также собраны в видео с помощью программы ImageJ (см. дополнительный видео). Чтэ динамический процесс миграции клеток могут быть изучены. Как показано на рисунке 2, морфология мигрирующих клеток с ламеллиподий (по переднему фронту) и хвосты (задняя кромка) отчетливо наблюдались.
В клеточной миграции анализа Transwell, были использованы 24-а вставки из Corning. B16F10 меланомы клетки ресуспендировали при концентрации 1 × 10 6 клеток / мл в буфере миграции, состоящей из DMEM среде и 0,1% BSA без сыворотки. Кондиционированные среды от NIH3T3 клетки фибробластов, выращенных в DMEM среде, содержащей 10% фетальную бычью сыворотку использовали в качестве химио-аттрактанта. 100 мкл Клетки B16F10 был добавлен в верхней части Transwell мембраны в верхней камере и 600 мкл химио-аттрактант был добавлен в нижней камере или же объема миграции буфера добавляется в качестве отрицательного контроля. Миграция клеток проводили, как описано в процедуре. Количество мигрировавших клеток может быть определена количественно путем подсчета под микроскопом или вфотографии, сделанные (рис. 3б). Как показано на фиг.3, было увеличение в 15 раз в клетках, мигрирующих к химио-аттрактанта в сравнении с контрольной миграции буфера (фиг.3С). Transwell анализ рассматривает клеток хемотаксис, миграцию направленного клеток к химио-аттрактанта.
Рисунок 1. B16F10 клеток меланомы закрытие раны анализ. (А) во время 16-часовых закрытия раны анализа фотографии были сделаны каждые 5 минут с помощью покадровой микроскоп. Репрезентативные фотографии на 0, 4, 8 и 12 ч показаны и масштабные бара (400 мкм) добавляют для измерения ширины рана. (B), и это расстояние раны измеряли в мкм. Точечная диаграмма использовалась для отображения ширины раны со временем и была рассчитана скорость закрытия раны. Для генаоценить значение R 2, линейная регрессия была работать на данных ширины раны с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (версия 5.0, GraphPad Software, Inc). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Морфология миграции B16F10 клетки от покадровой микроскопии закрывающего рана анализа. Во время 16-часовых закрытия раны анализа фотографии были сделаны каждые 5 минут. Все фотографии были собраны в видео с помощью программы ImageJ (5 кадров / с). Наблюдалось Миграция клеток с участием клеток поляризацию, расширение ламеллиподий и заднего края опровержение. Фотографии с 34,6, 36,6, и 38,6-второй раз точках видео были представлены (время видео соответствующей фактической покадровой время миграции (HR: мин: сек) 34.6 секунд, 14:20:00; 36.6 секунд, 15:10:00; и 38,6 секунд, 16:00:00, соответственно). Шкала бар 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Transwell миграция анализ из B16F10 клеток меланомы. (A) схема устройства вставки Transwell, используемого для измерения миграцию клеток и инвазии. (B) Характерные картины B16F10 клеток Transwell миграции. Буфер миграции клеток и NIH3T3 кондиционированную среду клеток добавляли в нижнюю камеру в качестве отрицательного контроля и химио-аттрактанта, соответственно. После миграции клеток и окрашивания кристаллическим фиолетовым, как описано в порядке, фотографии перенесенных клеток (фиолетовый окрашенных) выполнены при помощи микрoscope с 10-кратным цели (общее увеличение 100x). Поры мембраны также можно было наблюдать, как многочисленные маленькие, круглые и темных точек на изображении. (С) Количественное определение клеток, мигрирующих к буфера миграции или химио-аттрактанта (Средняя из 5 картин полей на 100x общее увеличение). Пожалуйста, Нажмите сюда, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Дополнительный Видео. Покадровый видео из B16F10 клеток меланомы закрытия раны анализа. Фотографии получают на каждые 5 минут в течение 16 часов, чтобы генерировать 193 изображений. Все фотографии были собраны в видео с помощью программы ImageJ (5 кадров / с). См. "Supplementary_Video_JOVE.avi" дополнительную файл под Downloads.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Миграция клеток является важным аспектом для изучения в исследовании рака, а также может быть применен в развитии, иммунологических и заживление ран исследований. Культуру клеток закрытия раны анализа и миграции Transwell клеток и вторжения анализы показывают подробную информацию о миграционных поведения клеток и может быть использован для исследования молекулярных механизмов клеточной миграции 1,2,10,14. Наше исследование использовали эти подвижности клеток анализы для определения скорости миграции и вторжения возможности в B16F10 клеток меланомы линии.
Ячейка закрытия раны анализ рассматривает способность конкретной линии клеток мигрировать, а затем закрыть рану, достигнутый в сливной пластины клеток. Этот анализ является очень доступной для групп с основным оборудованием и в сравнении с существующими методами простой способ измерить миграцию клеток. Некоторые различия в закрытие раны анализа можно найти в отдельных группах лечения, но есть несколько шагов, которые мау приниматься, чтобы помочь уменьшить его. Одним из потенциальных способ для уменьшения вариации к пластине каждый образец с тем же числом клеток, чтобы достичь синхронного слияния и поддерживать состояние здоровой клетки в начале каждого эксперимента. Несколько испытания клеточной культуры экспериментов могут быть необходимы, чтобы определить точное число обшивки, которая необходима для достижения неизменно слияния и статус здорового клеток среди независимых выборок. Кроме того, с увеличением размера пробы также уменьшит изменение. Для медленных линиях клеток мигрирующих которые требуют за 24 часа времени инкубации наблюдать значительное миграции, удобно использовать афидиколина или другой ингибитор пролиферации, чтобы предотвратить номер мобильного изменения, которые потенциально могут повлиять на результат анализа.
После освоения возможность изучать скорость миграции клеток с помощью клеток закрытия раны анализ, детальную оценку отдельных перелетных поведения клеток может быть также завершен 14. Кроме того, после Wouй закрытие анализов клетки могут быть фиксированными и различные белки, связанные с цитоскелета структуры и динамики можно рассматривать и оценивать с помощью иммуноцитохимии 2. Этот анализ может привести к дальнейшему подробные биохимические изменения ранее неизвестных. Ячейка закрытия раны анализ также весьма поддаются режиме реального времени изображения живых клеток для изучения динамики миграции с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии. Например, актин-GFP, тубулин-GFP, и слитые белки паксиллин-GFP может быть выражена в живых клетках, чтобы посмотреть локализацию белков в различные моменты времени в миграции клеток или адгезии 18,19. Некоторые ограничения закрытия раны анализа включают, что, например, он не подходит для неадгезивных клеток и не измеряет сотовые хемотаксис. Кроме того, некоторые клеточные линии имеют тенденцию отделить от пластины немедленно после того, как рана выполнена (например, HEK293T клетки). Для тех клеточных линий, лучше использовать заранее литой раны пластины или transwлокоть миграция анализ обсуждается ниже.
Миграция Transwell клеток и вторжение анализ обеспечивает тщательный анализ способности клеток ощутить особую химио-аттрактант и мигрируют через физический барьер к ней. Этот тест может быть дополнительно использован для исследования вторжение клеток, добавляя слой внеклеточного матрикса или слой эндотелиальных клеток в верхней части мембраны Transwell имитировать процесс инвазии ЕСМ и экстравазации 1,10. Кроме того, после вторжения через Матригель, иммунологические окрашивание белков цитоскелета в сочетании с флуоресцентной микроскопии может быть ценным для морфологического исследования во время 3-D вторжения. Ограничение использования вторжения Transwell клеток анализа является то, что покадровой данные вторжения клеток трудно достичь с обычной микроскопии и живых изображений сотовый этого процесса является сложным.
Чтобы получить точные результаты, существует несколько важных шагов в течение TRAnswell миграции клеток и вторжения анализы, которые имеют значение. Во-первых, так как скорость миграции клеток может широко варьироваться между различными типами клеток несколько предварительные эксперименты должны быть выполнены, чтобы принять конкретную миграции временных рамок, который будет использоваться в процедуре. Во-вторых, химио-аттрактант должен также быть применимы к типу клеток, представляющего интерес. Широкий спектр химио-аттрактантов должны быть рассмотрены в предыдущих экспериментов перед измерением окончательный миграции и вторжения возможность определенного типа клеток. Фибробласты-кондиционированная среда обычно используется в качестве сильного химио-аттрактанта для широкого диапазона типов клеток. Если используется один очищенный химио-аттрактант убедиться, что рецепторы химио-аттрактанта выражаются в типе клеток, представляющих интерес. Наконец, для вторжения клеток анализа убедитесь, что покрытие Матригель или другого внеклеточного матрикса является однородным, чтобы минимизировать экспериментальную вариации. В заключение, хотя существуют некоторые ограничения, весьмадоступных миграции клеток анализы, описанные здесь, могут быть использованы для широкого круга биологических исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini | 100106 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| Trypsin EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| Crystal violet | Sigma | C0775-100G | Dissolved in water at 0.2% |
| Cell disassociation buffer | Gibco | 13151-014 | |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific | Model # 3145 | |
| SterilGARD biosafety hood | The Baker Company, Inc. | Model # VBM-600 | |
| EVOS Fl inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | Model # AMF-4302-US | |
| Tissue culture plate | Becton Dickinson | 353046 | Catalog number varies depending on the type of culture plate |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | Catalog number varies depending on the pore size of the membrane |
References
- Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor. Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).
- Hall, A. The cytoskeleton and cancer. Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84 (3), 359-369 (1996).
- Peter, C., et al. Migration to apoptotic "find-me" signals is mediated via the phagocyte receptor G2A. J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).
- Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).
- Buul, J. D., Hordijk, P. L. Signaling in leukocyte transendothelial migration. Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).
- Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis. 228 (4), 606-616 (2003).
- Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A. Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).
- Yoshida, M., Yoshida, K. Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+. Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).
- Albini, A. Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms. Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).
- Fidler, I. J. Critical determinants of metastasis. Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).
- Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).
- Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. Chemotaxis in cancer. Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).
- Zhang, Y., et al. Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells. Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).
- Junger, W. G. Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis. Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).
- Lazennec, G., Richmond, A. Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation. Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. J. Biomed. Sci. 17, (2010).
- Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration. J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).
- Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration. Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).
