Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

محاكاة البنكرياس المرونة العصبية: Published: April 14, 2014 doi: 10.3791/51049
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Department of Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Biotechnology, University of Applied Sciences Kaiserslautern/Zweibrücken

Summary

اللدونة العصبية هي ميزة المعترف بها على نحو متزايد، ولكن يفهم بشكل كاف من الجهاز الهضمي (GI) المسالك. هنا، في المثال من اضطرابات البنكرياس الإنسان، فإننا نقدم في المختبر فحص المرونة العصبية لدراسة اللدونة العصبية في الجهاز الهضمي على مستوى كل من المورفولوجية والوظيفية.

Abstract

المرونة العصبية هو سمة ملازمة للنظام والجهاز الهضمي (GI) المعوية العصبي والغدد العرقية في ظل ظروف مرضية. ومع ذلك، فإن دور المرضية في جسم المريض من المرونة العصبية في اضطرابات الجهاز الهضمي ما زال مجهولا. نماذج تجريبية الرواية التي تسمح المحاكاة والتشكيل من GI المرونة العصبية قد تمكين وتعزيز التقدير للمساهمة المرونة العصبية وبخاصة أمراض الجهاز الهضمي مثل سرطان البنكرياس (PCA) والتهاب البنكرياس المزمن (CP). هنا، نقدم بروتوكول للمحاكاة من المرونة العصبية البنكرياس في المختبر تحت ظروف استخدام الأطفال حديثي الولادة الظهري الفئران العقد الجذرية (DRG) والضفيرة العضلية المعوية (MP) الخلايا العصبية. هذا النهج المزدوج الخلايا العصبية يسمح ليس فقط رصد كل من المرونة العصبية، الجهاز الجوهرية وخارجي، ولكن أيضا تمثل أداة قيمة لتقييم ومورفولوجيا الخلايا العصبية الدبقية والكهربية. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح التشكيل وظيفية من محتويات microenvironmental الموردة لدراسة إيمباك بهمر على المرونة العصبية. بمجرد إنشائها، مقايسة المرونة العصبية الحاضر يحمل إمكانات قابلة للتطبيق على دراسة المرونة العصبية في أي جهاز GI.

Introduction

وقد اشتعلت تغييرات في الجهاز الهضمي (GI) التشكل العصبية وكثافة انتباه أخصائي أمراض الباطنة والأطباء لفترة طويلة، ولكن أهميتها لالفيزيولوجيا المرضية لأمراض الجهاز الهضمي ما زال مجهولا 1-3. في الواقع، وترتبط العديد من الاضطرابات الشائعة GI عاليا مثل التهاب المعدة، التهاب المريء الجزر، والتهاب القولون، انسدادات، والتهاب الزائدة الدودية مع زيادة كثافة تعصيب في مناطق الأنسجة الملتهبة 1. ومع ذلك، فقد تم حتى الآن دفع أي اهتمام حقيقي لآليات ومعنى المرونة العصبية في الجهاز الهضمي. لا الأعصاب GI تغير شكليا تختلف من الأعصاب GI العادي، أي دولة طبيعية في الجهاز العصبي المعوي، من حيث وظيفتها؟ ما هي الآثار المترتبة على تغير المحتوى نيوروبيبتيدي / الناقل العصبي في الأعصاب المعوية البلاستيك؟ لا المرونة العصبية الطرفية تنطوي دائما يشير إلى تغير في الجهاز العصبي المركزي؟ وأين هي التوقعات المركزية للextri البلاستيكNSIC مسارات GI العصبية؟ ويمكن بسهولة أن تتولد سلسلة طويلة من هذه الأسئلة الأساسية عند النظر إلى قلة معرفتنا عن الجوانب الفنية للGI المرونة العصبية.

دراسة GI المرونة العصبية على مستوى وظيفي يتطلب نماذج تجريبية صالحة، واستنساخه تزال تنطبق بسهولة. في عصر تزايد شعبية وقبول النماذج المعدلة وراثيا المشروطة الماوس (GECoMM)، مثل الإعدادات في الجسم الحي تحمل القدرة على توضيح جوانب لم تكن معروفة سابقا من GI المرونة العصبية بطريقة واقعية 1. ومع ذلك، فإن تصميم وإنتاج GECoMM تبقى مكلفة، وكثيفة العمالة، وخاصة، تستغرق وقتا طويلا. وعلاوة على ذلك، فإنها تتطلب بداهة اختيار الهدف المراد التضمين مشروط في الماوس المعدلة وراثيا (المعدلة وراثيا مثل overexpression من عامل نمو الأعصاب / نيسان الخليج في الخلايا الظهارية المعوية). وبالتالي، لقصرIGN من GECoMM ناجحة، يحتاج الباحثون بعض المؤشرات (مثل البيانات التجريبية السابقة) من هدف جدير بالاهتمام، أي أن جزيء من الفائدة (هنا NGF) يمكن على الأقل أن يتوقع أن تمارس بعض الآثار ذات الصلة بيولوجيا الأعصاب في معهد جوته.

ويمكن بسهولة أن تستمد هذه المؤشرات كافية من نماذج في المختبر الذي فرعية خلية معزولة عن المكروية معقدة لفي الجسم الحي النظام يمكن cocultured انتقائي بطريقة غيروي 4-7. التشكيل الأهداف الجزيئية في مثل هذا الإعداد الثقافة غيروي هو في المتوسط ​​من الناحية الفنية أقل تعقيدا، وأسرع، وبالتالي يمكن أن تساعد في prefiltering أهداف جديرة بالاهتمام للتحقق في في الدراسات المجراة.

في الآونة الأخيرة، قدمنا ​​في المختبر فحص المرونة العصبية التي صممت لمحاكاة زيادة كثافة العصبية وتضخم في شمال شرق داخل البنكرياسrves في سرطان البنكرياس الإنسان (PCA) والتهاب البنكرياس المزمن (CP) الأنسجة. هنا، تعرضت الخلايا العصبية المشتقة من الأطفال حديثي الولادة الظهري الفئران الجذر العقد (DRG) أو الضفيرة العضلية المعوية (MP) لمقتطفات من الأنسجة PCA مقطوعة جراحيا أو CP أنسجة العينات ومقارنة تلك المستزرعة في البنكرياس الإنسان العادي (NP) مقتطفات الأنسجة 5. بدلا من مقتطفات الأنسجة، ويمكن للمرء أيضا استخدام خط الخلية supernatants لدراسة تأثير أنواع الخلايا المحددة على المرونة العصبية. عند دمجها مع قياس كيمونسيجيا موحدة، المرونة العصبية مقايسة قدمت يسمح تقييم صالحة وقابلة للتكرار من اللدونة العصبية في البنكرياس استجابة لmicroenvironments مختلفة. خاصة، فإنه يسمح للمحاكاة 1) المرونة العصبية المورفولوجية، أي تغييرات في ثمرة neurite، المتفرعة نمط وحجم الخلايا العصبية، و2) المرونة العصبية الوظيفية، أي تغييرات في استثارة الخلايا العصبية الطرفية. علاوة على ذلك، ليس فقط الطرفية (أي (على سبيل المثال DRG أو الثانية الشوكي النظام) يمكن تضمين الخلايا العصبية في مقايسة الحاضر لتقييم رد فعل المورفولوجية والوظيفية لمختلف محتويات الأنسجة GI. في فيديو تعليمي الحاضر، ونحن لشرح بروتوكول التقنية لأداء هذا الاختبار ومناقشة مزايا ونقاط ضعفها. وعلاوة على ذلك، نود أن نلفت الانتباه إلى انطباق المفهوم الأساسي لهذا الفحص لدراسة المرونة العصبية في أي جهاز GI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

اتباع جميع الإجراءات التجريبية الحيوانية في البروتوكول المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة ميونخ التقني، ألمانيا.

1. الإعلام / استخراج إعداد

  1. الأنسجة التجانس
    نوعية تجانس الأنسجة أمر بالغ الأهمية لكشف اللاحقة من التعديلات المرونة العصبية في الخلايا العصبية مثقف. هنا، ينصح الخالط التي تمكن تفارق الأنسجة من دون زيادة كبيرة في درجة حرارة الأنسجة.
    1. نقل 5 مم × 5 مم × 5 مم مكعبات من نسيج البنكرياس مباشرة من -80 درجة مئوية إلى النيتروجين السائل ومكان في المرحلة الصلبة في homogenator الأنسجة. ان homogenator مثالية فصل الأنسجة بسرعة كافية، دون السماح لها defreeze.
    2. مباشرة بعد التفكك، resuspend والصلبة، مثل مسحوق جناسة في 300-500 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة 0.1X (PBS). هنا، لا تستخدم أي تحلل العازلة (مثل RIPA) لأن هذا قد ليز الخلايا العصبية.
    3. أجهزة الطرد المركزي في الخليط لمدة 15 دقيقة على الأقل في أقصى سرعة من أجهزة الطرد المركزي الخاصة بك مقاعد البدلاء (على سبيل المثال 21،130 x ج). جمع طاف واضحة والذي يمثل استخراج الأنسجة.
  2. supernatants خط الخلية
    1. السماح للخلايا الفائدة تصل إلى 70 على الأقل - 80٪ التقاء في وسط النمو الطبيعي.
    2. عادة، هذه الوسائط تحتوي على مكونات المصل وربما يؤدي الى تأثيرات لا يمكن السيطرة عليها على نمو الخلايا العصبية. لذلك، بعد أن وصلت كثافة الخلية المطلوبة، وغسل الخلايا الخاصة بك على الأقل 3X مع خلية ثقافة الصف PBS ووضعها في المصل خالية المتوسطة (SFM) لمدة تصل إلى 48 ساعة.
      ملاحظة: وهنا، نعتبر أن بعض الخلايا (مثل الخلايا النجمية البنكرياس) قد تحتاج المصل في وسائل الإعلام نموها من أجل الحفاظ على حالتها الطبيعية والبنية. في مثل هذه الحالات، نفذ التخفيفات التسلسلي في مصل المتوسطة من الخلية من الفائدة من أجل العثور على أدنى محتوى المصل ممكن اللازمة لfunctio خلية سليمةن.
    3. قياس تركيز البروتين من جناسة الأنسجة أو الخلايا supernatants عبر برادفورد فحص البروتين. في حين أن هذه القيم تختلف تبعا لنوع الأنسجة والخلايا، لمقتطفات الأنسجة البنكرياس، يتوقع المرء أن مجموعة تركيز بين 5-12 ميكروغرام / ميكرولتر، وsupernatants خط الخلية بين 3-8 ميكروغرام / ميكرولتر.

2. قسامة مقتطفات وSupernatants الخليوي

اعتمادا على تركيز لاستخدامها في الفحص، يجب أن يكون تركيز النهائي من استخراج أو طاف في المتوسط ​​العصبية 100 ميكروغرام / مل 5،8.

ملاحظة: للحصول على مقايسة مع الخلايا العصبية المتزايدة في 500 ميكرولتر المتوسطة في كل بئر من 24 لوحة جيدا، ويحتاج المرء 50 ميكروغرام من البروتين من كل مستخلص أو طاف لكل بئر. عند تركيز مستخلص نموذجية من حوالي 10 ميكروغرام / ميكرولتر، فإن المرء بحاجة إلى 5 ميكرولتر من استخراج / طاف لكل بئر. في كل settinز يؤديها باعتبارها ثلاث نسخ، وهذا يتوافق مع 15 ميكرولتر من استخراج / طاف. لأنواع مختلفة من الخلايا أو الأنسجة، نفذ التخفيفات التسلسلي للمستخلص النهائي أو تركيز طاف ومقارنة آثار عصبية وحظ بين مختلف تركيزات استخراج / طاف.

3. عزل الخلايا العصبية

بمجرد الانتهاء من جمع استخراج / طاف، الاستمرار في عزل الخلايا العصبية.

  1. لDRG الخلايا العصبية، وجمع عنق الرحم لقطني DRG من الفئران حديثي الولادة بين يوم ما بعد الولادة (P) 2-12 بعد قطع الرأس وتشريح stereomicroscopic من DRG (الشكل 1A). من أجل الحصول على الخلايا العصبية DRG كافية ل24 لوحة جيدا، وجمع كل عنق الرحم لقطني DRG أحد الفئران حديثي الولادة (ما يعادل 52 DRG) لكل لوحة.
    1. قطع بعيدا الطرفية (العصبية) والتوقعات المركزية (الجذور) من DRG عن طريق microscissors.
      ترك التوقعات في مكان يعوق سحن ويزيد رانه خطر التلوث الثقافة عن طريق الخلايا الليفية.
  2. لالخلايا العصبية MP، قطع بعيدا مساريق من الأمعاء الدقيقة ويدويا وبعناية تجريد قبالة طبقة الطبقتين المصلية و العضلية للأمعاء الدقيقة (عن بروتوكول مفصلة عن النائب العزلة، والرجوع إلى شيفر وآخرون. 9، الشكل 1B). لMP، جمع ضفيرة من اثنين من الفئران في 24 لوحة جيدا.
    ملاحظة: حاول أن تكون لطيف ممكن من أجل تجنب الدموع في طبقة الطبقتين المصلية و العضلية لأنها تعرقل فصل ناجحة في الفترة من الأمعاء الدقيقة.
  3. جمع DRG وطبقة الطبقتين المصلية و العضلية في الجليد الباردة الحد الأدنى من المتوسط ​​الأساسية (MEM) المتوفرة مع الجنتاميسين (حجز 20mg في المتوسط ​​500ML) وmetronidazol (2.5 ملغ في 500 مل متوسطة).
  4. بعد جمع DRG، واحتضان لهم في محلول ملح هانك المتوازن (HBSS) المتوفرة مع كولاجيناز النوع الثاني لمدة 20-30 دقيقة. لMP العزلة، واحتضان في نوع كولاجيناز بين 1-3 ساعة، وهذا يتوقف على عمرمن الحيوان (الشكل 1C).
  5. لMP، جمع مثل صافي النائب قطعة تحت stereomicroscope ونقل إلى MEM الجليد الباردة.
  6. ثم يسحن على DRG والنائب من خلال الحقن مع تناقص القطر.
    ملاحظة: سحن المفرط يمكن أن تدمر الخلايا العصبية، ولكن أقل من الخلايا الدبقية.
  7. بمجرد أن تصبح متوسطة تحتوي على DRG أو النائب غائم، الطرد المركزي تعليق على 93.9 x ج لمدة 5 دقائق، تجاهل المتوسطة وresuspend في المتوسطة Neurobasal (تستكمل مع 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، 0.5MM L-الجلوتامين و 2٪ B-27).
  8. عد العدد الكلي للخلايا (أي الخلايا العصبية والدبقية) عن طريق عدادة الكريات.
    ملاحظة: عدد الخلايا اللازمة يعتمد على المعلمة القياس. لتقدير حجم الكثافة محوار، ويحتاج المرء الثقافات أكثر كثافة وبالتالي عدد أكبر من الخلايا من لقياس ثمرة neurite، حجم perikaryonalوالمتفرعة نمط من الخلايا العصبية الفردية. لقياس كثافة محوار، مثل استخدام 10،000 الخلايا (الخلايا العصبية الدبقية +) / جيد أو 1،500 الخلايا العصبية / جيد. لقياس الأشكال على الخلايا العصبية الفردية، وجيزة (1 طويلة دقيقة) trypsination من الخلايا وزرع البذور من 2،500 خلايا / جيد أو 400 الخلايا العصبية / ويوصى أيضا. العائد نموذجي من الخلايا التي تم الحصول عليها من الفئران واحدة حوالي 300،000-500،000 الخلايا.
  9. البذور الخلايا على coverslips 13 ملم التي تم المغلفة في الليلة التي سبقت وتتصدر الآبار مع المتوسطة Neurobasal (تستكمل مع 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، و 0.5 ملي L-الجلوتامين و 2٪ B-27) (الشكل 1D).
    ملاحظة: استخدم بولي-D-يسين (40 ملغ / م 2) أو الأورنيثين و(1 ملغ / مل لكل منهما) المغلفة المغلفة laminin زلات الغطاء. خلايا نعلق على بولي-D-يسين سريع للغاية، وبالتالي مما يجعلها مناسبة للتجارب التي يلزم فيها العديد من الخلايا (أي قياسات كثافة محوار). التعلق Laminin الحالي هو في بعض العامةما أضعف، ولكن Laminin الحالي هو المروج قوية من ثمرة neurite. لذلك، لإجراء قياسات على الخلايا العصبية المتفرعة وطول محوار، تفضل الأورنيثين / laminin طلاء.
  10. السماح للخلايا نعلق على الآبار بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وإعداد وسائل الإعلام التي استكملت استخراج (في النهائي تركيز استخراج / طاف من 100 ميكروغرام / مل).
  11. نضح المتوسطة البذر، وإجراء اختياري، وغسل لطيف جدا مع برنامج تلفزيوني، ثم ماصة ببطء استخراج / تستكمل طاف وسائل الإعلام (الشكل 1E).
  12. السماح للخلايا تنمو لمدة 48 ساعة. نضح وسائل الإعلام والإصلاح في بارافورمالدهيد 4٪ لالمناعية (الشكل 1F).
  13. أداء مزدوجة المناعي تلطيخ باستخدام الخلايا العصبية محددة (على سبيل المثال بيتا III-تويولين) والدبقية محددة (على سبيل المثال الدبقية fibriallary الحمضية بروتين / GFAP) علامات (الشكل 1G).
  14. لقياس الأشكال، استخدام المجهر الضوئي مقلوب مجهزة بكاميرا CCD في تركيبة وايال البرنامج الآلي الذي يسمح مقياس كثافة محوار (انظر الجدول).
  15. يتم قياس كثافة محوار من الثقافات العصبية على 4-5 photomicrographs ممثل في التكبير 200X 4 من أكثف مناطق مختلفة من النمو على كل ساترة عن طريق تتراكب 50 ميكرومتر × 50 ميكرون الشبكة وعد كثافة الألياف لكل متر مربع تقاس في ألياف المتقاطعة. ثمرة neurite، يعني عدد من الفروع في الخلايا العصبية، وطول فرع الوسط وحجم perikaryonal يمكن قياسها من اختيارها عشوائيا 30 الخلايا العصبية الانفرادي من كل ساترة عن طريق وضع علامة neurites التي وperikarya (الشكل 1H).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المرونة العصبية المورفولوجية

في الفئة العمرية المشار إليها من الفئران حديثي الولادة (P2-12) وكثافة البذر، والنائب DRG الخلايا العصبية بالفعل بناء الشبكات العصبية الكثيفة بعد 48 ساعة (الشكل 2A). المقارنة بين الكثافة محوار بين الخلايا العصبية المزروعة في محكمة التحكيم الدائمة، CP، ومقتطفات NP يكشف أكبر كثافة محوار من الخلايا العصبية DRG في محكمة التحكيم الدائمة أو مقتطفات من CP في مقتطفات NP (الشكل 2A) 5. نحن نفضل الخلايا العصبية وبخاصة النائب عن القياسات على الخلايا العصبية الفردية، لأن الخلايا العصبية النائب تميل إلى فصل أكثر سهولة من الخلايا الدبقية المحيطة من الخلايا العصبية DRG. هنا، النائب الخلايا العصبية التي تزرع في محكمة التحكيم الدائمة أو CP مقتطفات أيضا بناء neurites التي تعد ويحمل نمط المتفرعة أكثر تعقيدا من الخلايا العصبية النائب نموا في NP-استخراج تحتوي المتوسطة (الشكل 2B) 5. غياب هذا الاختلاف في التشكل العصبية الناجمة عن NP، CP، وPCA مقتطفات يشير إلى وجود مشكلة فنية في لssay. في معظم الحالات، وهذا قد يكون راجعا إلى 1) نوعية رديئة من استعداد استخراج نظرا لوقت المعالجة طويلة أو 2) بسبب الأضرار التي لحقت الخلايا العصبية التي وقعت خلال عملية العزل.

الدراسات الفنية

مقايسة المرونة العصبية يحمل حساسية عالية بما يكفي للكشف عن تغيرات الناجمة عن وجود أو عدم وجود بعض الجزيئات المستهدفة من الاهتمام في مقتطفات تستكمل أو supernatants. على سبيل المثال، والحصار المفروض على عامل Artemin أو عامل نمو الأعصاب من خلية عصبية PCA (PCC) supernatants بإضافة الأجسام المضادة عرقلة محددة لنيسان الخليج أو عن طريق استنزاف الناجم عن dynabead النتائج Artemin في توهين تشكيل شبكة الخلايا العصبية (الشكل 2C) 10. في دراسة أجريت مؤخرا، ونحن يمكن أن تظهر تأثير مماثل جدا للمساهمة عامل التغذية العصبية Neurturin إلى المرونة العصبية في وقت واحد CP بالمقارنة مع عوامل عصبية أخرى مثل NGF، خلايا الدبقية خط-الاوعية إد عصبية عامل (GDNF) أو تحويل عامل النمو بيتا (TGF-بيتا) 11.

الدبقية

يمكن أيضا أن تطبق نفس النهج لتقييم رد فعل الخلايا الدبقية المرتبطة DRG الأقمار الصناعية أو الدبقية المعوية إلى محتويات microenvironmental البنكرياس. في الواقع، واحدة من الآثار أقوى من PCA مقتطفات الأنسجة على الدبقية DRG أو النائب المصاحب هو زيادة بارزة في نمو الدبقية (الشكل 3) 5. وعلاوة على ذلك، فإن هذا التأثير أكثر وضوحا في محكمة التحكيم الدائمة في من CP. هنا، ينبغي للمرء النظر لا ينبغي أن يحكم على أن انتشار الدبقية على أساس التهم الدبقية المطلقة، ولكن بدلا من ذلك على الحصة النسبية من الخلايا الدبقية إلى الخلايا العصبية (الخلايا العصبية الدبقية مؤشر) 5. هذا مهم بشكل خاص للنظر لأن عدد الخلايا الدبقية في هذه الثقافات هو من الصعب السيطرة عليها نظرا لقوة انتشار الدبقية بدلا من الخلايا العصبية.

في صفحة = "دائما"> الشكل 1
الشكل 1. بروتوكول تخطيطي للفحص في المختبر المرونة العصبية. يجعل الفحص الحاضر استخدام الأطفال حديثي الولادة الظهري الفئران العقد الجذرية (DRG) والضفيرة العضلية المعوية (MP) الخلايا العصبية لدراسة تأثير مستخلصات البنكرياس الأنسجة أو الخلايا supernatants على مورفولوجيا الخلايا العصبية والدبقية. يتم جمع DRG بعد الثقب الأمامي وMP-تحتوي على طبقة الطبقتين المصلية و العضلية بعد استئصال وتجريد الميكانيكية من الأمعاء الدقيقة (A، B). بعد نوع كولاجيناز الثاني الهضم، هي المصنفة الخلايا العصبية في الكثافة المطلوبة (انظر النص للحصول على التفاصيل) الإعلان المزروعة لمدة 24 ساعة (C، D). ثم، تضاف الطازجة البنكرياس (أو من أي جهاز GI الفوائد) عصائر وsupernatants خلية في المتوسط ​​نمو الخلايا العصبية بتركيزات محددة سابقا (E).بعد 48 ساعة، يتم إصلاح الثقافات في بارافورمالدهيد 4٪ ومضاعفة immunostained ضد علامات العصبية والدبقية (F، G). يتم قياس مورفولوجيا الخلايا العصبية، بما في ذلك الكثافة محوار، ونمط المتفرعة العصبية وحجم perikaryonal عن طريق برنامج بروتوكول موحد (H). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. المرونة العصبية الناجمة عن سرطان البنكرياس البنكرياس الإنسان (PCA) والتهاب البنكرياس المزمن (CP). مقتطفات نسيج البنكرياس جراحيا الإنسان المستمدة من البنكرياس الطبيعي (NP)، CP أو الأنسجة PCA لحث على الاختلافات البارزة في كثافة محوار من شمال شرق DRG urons (A) والمتفرعة في نمط الخلايا العصبية من الخلايا العصبية MP (B). هنا، PCA وCP مقتطفات الأنسجة ممارسة تأثير بارز على عصبية DRG والنائب الخلايا العصبية. مماثلة لمقتطفات الأنسجة، وأيضا supernatants من أنواع الخلايا الفردية (خلايا سرطان البنكرياس هنا / PCC) أيضا زيادة ملحوظة في الكثافة محوار من الخلايا العصبية DRG (C). هذه الزيادة، ومع ذلك، هو عكسها عندما تنضب عوامل عصبية مختارة مثل artemin (Artn) أو عامل نمو الأعصاب (NGF) أو مسدودة مع هذه supernatants. كل الخلايا العصبية immunostained ضد بيتا-III-تويولين. جميع الصور في التكبير 100X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

51049fig3.jpg "/>
الرقم 3. رد فعل الدبقية لمحتويات microenvironmental البنكرياس. مقتطفات من أنسجة البنكرياس PCA أو الأنسجة CP ليس فقط تأثير عصبية، ولكن أيضا في تعزيز النمو وعدد الخلايا الدبقية الدبقية في DRG أو النائب الثقافات. الخلايا الدبقية immunostained ضد الدبقية علامة الدبقية ييفي الحمضية البروتين (GFAP). جميع الصور في التكبير 200X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويهدف هذا البروتوكول لتوضيح المنهجية وراء البنكرياس في المختبر فحص المرونة العصبية التي تم تطويرها مؤخرا من قبل مجموعتنا لدراسة آليات المرونة العصبية في محكمة التحكيم الدائمة وCP 5. يتضمن البروتوكول إجراء لمدة ثلاثة أيام والتي يمكن بسهولة أن تطبق مرة واحدة اكتسبت خبرة كافية في أداء العزلة وثقافة DRG والنائب الخلايا العصبية. وعلاوة على ذلك، فإنه يمثل أداة قيمة لدراسة رد فعل يصاحب ذلك من المعوي والدبقية DRG المصاحب لمكونات microenvironmental البنكرياس.

في رأينا، واحدة من السمات الأكثر إثارة للاهتمام من هذا الاختبار هو قدرته على كشف ومحاكاة التغيرات التي تحدث أثناء PCA وCP (أي تنتشر العصبية وتضخم) في بيئة مبسطة في المختبر. في الواقع، وتطبيق مقتطفات الأنسجة أو نتائج supernatants خلية في التغييرات في مورفولوجية الخلايا العصبية ثhich يمكن أن يتم الكشف عن بحساسية كافية عن طريق تحليل المورفومترية منهجية. في الآونة الأخيرة، ونحن يمكن أن تثبت أيضا أن هذا الاختبار هو أيضا حساسة للكشف عن الاختلافات المحتملة في عصبية من عدة كيانات السرطان في وقت واحد مقارنة: عندما تمت مقارنة سمات عصبية من خطوط الخلايا PCA لخطوط الخلايا من السرطان القولون والمستقيم، وخطوط الخلايا PCA يسببها بشكل كبير أكبر كثافة الخلايا العصبية محوار بين DRG من خطوط سرطان القولون والمستقيم 8. حتى في المقارنة بين المستقيم مقابل خطوط الخلايا سرطان القولون، وخطوط الخلايا السرطانية إلى خلايا القولون السفلي سرطان المستقيم من حيث المرونة العصبية بهم المحتملين 8.

واحدة من المزايا الرئيسية لهذا الاختبار هو سهولة الحصول عليها من أجل المظهرية فحسب، ولكن أيضا تحليلات الكهربية. على عكس الخلايا العصبية في الوضع الطبيعي في الاستعدادات شريحة والتسجيلات من الخلايا العصبية في مقايسة لدينا في غضون سائل الإعلام المعرفة أو في لbsence / على وجود عوامل محددة ليتم من الناحية الفنية لا يمكن أن يحقق تطالب ومعلومات قيمة عن دور جزيئات محددة في هذه microenvironments على نشاط الخلايا العصبية.

بالتأكيد، لا ينبغي أن ينظر إلى فحص عرضها على أن يقتصر فقط على دراسة المسائل المتعلقة المرونة العصبية البنكرياس. المرونة العصبية هو سمة بارزة من الجهاز الهضمي بأكمله في ظل ظروف المرضية، مثل اعتلال الأعصاب المعوية الالتهابية 1-3. تم الإبلاغ عن كل هذه الظروف أن تترافق مع تغييرات في التشكل تعصيب وتغير نشاط الخلايا العصبية 1-3. وبالتالي، فمن المتصور ليحل محل مقتطفات نسيج البنكرياس أو خطوط الخلية عن طريق تلك المشتقة من الأنسجة المقابلة ودراسة تأثير معين على الخلايا العصبية والدبقية المرفقة. لدينا التحليلات الأخيرة على المقارنة بين أنسجة سرطان البنكرياس والقولون والمستقيم دعم هذه الفكرة 8. ومع ذلك، فمن المعقول أيضا assumه أن مكونات الأنسجة microenvironments مختلفة قد لا تحفز التعديلات كما حساسة وممثل كما نلاحظ بشكل روتيني في مكونات أنسجة البنكرياس. لذا، فإننا نوصي تقييم واسعة النطاق السابق مورفولوجيا الخلايا العصبية الناجمة عن الأنسجة "ايجابية" السيطرة (أي الأنسجة مع مثل أثبتت تشريحيا تضخم العصبية) في مقابل "السلبية" السيطرة الأنسجة (أي مع عدم وجود أدلة النسيجي للتضخم العصبية).

لدينا التحليلات السابقة على رد فعل الدبقية في هذا الاختبار كانت تقتصر على تحديد عدد الخلايا الدبقية في microenvironments البنكرياس مختلفة. الخلايا الدبقية تمتلك أهمية الناشئة في بيولوجيا الأعصاب منذ الاعتراف إمكاناتها العصبية وزيادة الاهتمام في التيارات الكالسيوم على طول الغشاء الدبقية 12. وبالتالي، والخلايا الدبقية في هذا الاختبار أيضا يمكن الوصول إليها بسهولة لإجراء المزيد من التحليلات الفنيةبواسطة نهج الرواية. ومع ذلك، مثل هذه الأساليب المبتكرة إضافية تحتاج المصادقة واسعة السابق قبل تطبيقها لمزيد من الدراسات.

مثل أي فحص تجريبية أخرى، وكذلك فحص المرونة العصبية قدمت يتحمل بعض المقارنة محدود من عينات الأنسجة البشرية تم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لعملية جراحية مختلفة. لا بد لهذه الأنسجة التي يمكن جنيها من مناطق نفس الأنسجة (مثل رأس البنكرياس، من كتلة الورم الرئيسي) للتحليلات موثوقة 1. علاوة على ذلك، حتى عندما يتم الوفاء بهذا الشرط المسبق، لا يمكن استبعاد مزيد من الاختلافات في أنسجة الورم أو البيولوجيا النظر في التباين الكبير في نمط الاستجابة البيولوجية من مختلف الأفراد 1. للتحايل على هذه الاختلافات الأنسجة الفردية، نوصي أداء مقايسة مع الأنسجة التي تم الحصول عليها من العديد من المرضى ممكن، أي مع ما لا يقل عن 5 - 10 مريضا مختلفة لكل كيان.

باعتبارها الجانب التقني الرئيسية، نود أن نسترعي الانتباه إلى دور المواد الطلاء على نمو الخلايا العصبية. كما ذكر أيضا أعلاه، نحن نفضل بولي-D-يسين لإجراء قياسات على كثافة محوار، والأورنيثين / laminin طلاء لتلك الموجودة على الخلايا العصبية الفردية نمط المتفرعة / ثمرة. في أيدينا، في حين أن قياس نمو الخلايا العصبية ويمكن أيضا أن يؤديها على مد المغطاة بولي يسين السطوح، نجد أن هذا النهج يميل إلى تقليل حساسية الفحص عن الاختلافات الفعلية. وبالتالي، يجب على الباحثين تطبيق هذا الاختبار ضمان استخدام المواد طلاء الأمثل لمسألة اهتمامهم.

باختصار، نحن نعتقد أن المرونة العصبية مقايسة قدم يمثل أداة قيمة للحصول على معلومات سريعة وقابلة للتكرار على الاعصاب التشكل والعصبية وظيفة في microenvironments الأنسجة المختلفة، كما هو موضح في المثال مننسيج البنكرياس. كشف حساسة من الاختلافات في العصبية التشكل كما الناجم عن محتويات مختلفة نسيج البنكرياس يؤكد استنساخ في المختبر من المرونة العصبية في البنكرياس PCA الإنسان وCP. يجب أن تهدف الجهود المستقبلية في الفحص الأمثل preassay من supernatants التطبيقية ومقتطفات لتحقيق وسائل الإعلام أفضل تعريف لدراسة GI-المرتبطة المرض المرونة العصبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم المصالح المتنافسة وليس الإفصاحات المالية.

Acknowledgments

ساهمت جميع المؤلفين نحو إنشاء والتحقق من صحة مقايسة المطروحة ومشروع للمخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1149
Ornithine/laminin Sigma-Aldrich P2533/L4544
13 mm Coverslips Merck For use in 24-well plates
Dismembranator S Sartorius
Anti-Beta-III-tubulin antibody Millipore MAB1637 1:200 concentration
Anti-GFAP-antibody DAKO M0761 1:400 concentration
RIPA buffer + protease inhibitor Any supplier
Neurobasal medium Gibco/Life Sciences 21103-049
B-27 Supplement Gibco/Life Sciences 17504044 Quality of B-27 is known to depend on the lot number
Gentamicin/Metronidazol Any supplier
Minimal essential medium Gibco/Life Sciences 31095-029
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco/Life Sciences 24020133 Improves collagenase activity when containing Ca/Mg
Collagenase type II Worthington Biochemical CLS-2 Obtain lots with at least 200 U/mg activity
Trypsin-EDTA 0.25% Gibco/Life Sciences 25200056
4% Paraformaldehyde Any supplier
analySIS docu software Olympus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
  2. Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
  3. Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
  4. Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
  5. Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
  6. Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
  7. Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
  8. Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
  9. Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
  10. Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
  11. Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
  12. Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).

Tags

الطب، العدد 86، أمراض الجهاز العصبي اللاإرادي النظام، الجهاز الهضمي الأورام، أمراض الجهاز الهضمي، أمراض البنكرياس، البنكرياس الأورام، التهاب البنكرياس، المرونة العصبية البنكرياس، الظهرية العقد الجذرية، الضفيرة العضلية المعوية، قياس الأشكال، وكثافة محوار، محوار المتفرعة، وتضخم perikaryonal، اللدونة العصبية
محاكاة البنكرياس المرونة العصبية:<em&gt; في المختبر</em&gt; ثنائي الخلايا العصبية اللدونة الفحص
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Demir, I. E., Tieftrunk, E.,… More

Demir, I. E., Tieftrunk, E., Schäfer, K. H., Friess, H., Ceyhan, G. O. Simulating Pancreatic Neuroplasticity: In Vitro Dual-neuron Plasticity Assay. J. Vis. Exp. (86), e51049, doi:10.3791/51049 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter