Simula Pancreatic Neuroplasticity: Published: April 14, 2014 doi: 10.3791/51049

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Ihsan Ekin Demir¹, Elke Tieftrunk¹, Karl-Herbert Schäfer², Helmut Friess¹, Güralp O. Ceyhan¹

¹Department of Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, ²Department of Biotechnology, University of Applied Sciences Kaiserslautern/Zweibrücken

Summary

Neuronal plasticitet är en alltmer erkänd, men otillräckligt förstådd inslag i gastrointestinala (GI) tarmkanalen. Här, i det exempel av humana pankreatiska störningar, presenterar vi en in vitro neuroplasticityen analys för studier av neuronal plasticitet i mag-tarmkanalen på både morfologisk och funktionell nivå.

Abstract

Neuroplasticity är en inneboende egenskap hos det enteriska nervsystemet och gastrointestinala (GI) innervation i patologiska tillstånd. Dock kvarstår det patofysiologisk roll neuroplasticityen i GI störningar okänd. Nya experimentella modeller som möjliggör simulering och modulering av GI neuroplasticity kan möjliggöra ökad uppskattning av bidraget från neuroplasticityen särskilt GI sjukdomar som cancer i bukspottkörteln (PCA) och kronisk pankreatit (CP). Här presenterar vi ett protokoll för simulering av bukspottskörteln neuroplasticityen under in vitro-betingelser som använder nyfödd råtta dorsalrotsganglier (DRG) och myentericus plexus (MP) nervceller. Denna dubbla neuron strategi inte bara tillåter övervakning av både orgel-inneboende och-yttre neuroplasticity, utan också utgör ett värdefullt verktyg för att bedöma neuronala och gliaceller morfologi och elektrofysiologi. Dessutom tillåter den funktionell modulering av medföljande microenvironmental innehåll för att studera deras IMPACt på neuroplasticity. När etablerade, bär det nuvarande neuroplasticity analysen potential att vara tillämplig på studiet av neuroplasticitet i någon GI-organ.

Introduction

Förändringar i gastrointestinal (GI) nerv morfologi och densitet har uppmärksammats av gastroenterologer och patologer under lång tid, men deras betydelse för patofysiologin av GI sjukdomar är okänd ^1-3. I själva verket är flera mycket vanliga GI sjukdomar såsom gastrit, refluxesofagit, kolit, divertikulit, och blindtarmsinflammation i samband med ökad innervation tätheten i inflammerade vävnadsområden ^1. Dock har ingen verklig uppmärksamhet hittills ägnats mekanismerna och betydelsen av neuroplasticityen i mag-tarmkanalen. Äger morfologiskt förändrade GI nerver skiljer sig från normala gastrointestinala nerver, dvs det normala tillståndet för det enteriska nervsystemet, i termer av deras funktion? Vilka är konsekvenserna av förändrad neuropeptid / signalsubstans innehåll i plastenter nerver? Anser perifer neuroplasticityen alltid innebär förändrad signalering till det centrala nervsystemet? Och var är de centrala projektioner av plast extriNSIC GI nervbanor? En lång rad av sådana nyckelfrågor kan lätt genereras när man tittar på bristen på kunskap om funktionella aspekter av GI neuroplasticitet.

Studien av GI neuroplasticityen på funktionell nivå kräver giltiga, reproducerbara och ändå lätt tillämpliga experimentella modeller. I en tid av ökande popularitet och acceptans av genetiskt modifierade modeller villkor mus (GECoMM), som in vivo-inställningar bära potential att belysa tidigare okända aspekter av GI neuroplasticity på ett realistiskt sätt ^1. Dock fortfarande kostsam konstruktion och produktion av GECoMM, arbetsintensiv och, framför allt, tidskrävande. Dessutom kräver de att a priori urval av målet som ska villkormoduleras i genetiskt förändrade musen (t.ex. transgena uttryck av nervtillväxtfaktorn / NGF i tarm epitelceller). Därför för den design av en framgångsrik GECoMM, forskare behöver vissa indikatorer (t.ex. tidigare experimentella data) i ett givande mål, det vill säga att åtminstone kan förväntas molekylen av intresse (här NGF) för att utöva några biologiskt relevanta effekter på GI nerver.

Sådana indikatorer kan lätt härledas från adekvat in vitro-modeller, där isolerade cell subtyper från komplexet mikromiljön av ett in vivo-system kan selektivt samodlades i en hetero sätt ^4-7. Moduleringen av molekylära mål på ett sådant hetero kultur inställning är i genomsnitt tekniskt mindre betungande, snabbare, och kan därför hjälpa till vid förfiltrering av värdefulla mål för verifiering i in vivo-studier.

Nyligen presenterade vi en in vitro neuroplasticity analys som var utformad för att simulera ökad neural densitet och hypertrofi av intrapancreatic nerves i human cancer i bukspottkörteln (PCA) och kronisk pankreatit (CP) vävnader. Här var neuroner härledda från nyfödd råtta dorsala rotganglier (DRG) eller plexus myentericus (MP) som utsätts för vävnadsextrakt från kirurgiskt resekerade PCa eller CP vävnader exemplar och jämfördes med de odlades i normal human pankreas (NP) vävnadsextrakt ^5. I stället för vävnadsextrakt, kan man även använda cellinje supernatanter att undersöka effekterna av utvalda celltyper på neuroplasticity. När den kombineras med ett standardiserat morfometrisk mätning tillåter presenteras neuroplasticityen analysen giltig och reproducerbar bedömning av neuronal plasticitet som svar på olika pankreatiska mikromiljöer. Särskilt tillåter simulering av 1) morfologisk neuroplasticity, det vill säga förändringar i neuritutväxt, förgrening mönster och neuronal storlek, och 2) funktionell neuroplasticity, det vill säga förändringar i retbarhet av perifera nervceller. Dessutom, inte bara perifera (dvs. (t.ex. DRG eller andra ordningen spinal) nervceller kan inkluderas i föreliggande analys för att bedöma deras morfologiska och funktionella reaktion på olika GI vävnadsinnehåll. I föreliggande video tutorial, visar vi den tekniska protokoll för utförandet av denna analys och diskutera sina fördelar och svagheter. Dessutom drar vi uppmärksamheten på tillämpligheten av den grundläggande föreställningen om denna analys till studiet av neuroplasticitet i någon GI-organ.

Protocol

Alla djurexperimentella förfaranden i protokollet följer riktlinjerna djurvårds av Technische Universität München, Tyskland.

1. Media / Utdrag Förberedelser

1. Tissue homogenisering
   Kvaliteten på vävnaden homogenisering är kritisk för efterföljande detektion av neuroplastic förändringar i de odlade neuroner. Här är en homogenisator rekommenderas som möjliggör vävnadsdissociering utan större ökning av vävnadstemperaturen.
   1. Överför 5 mm x 5 mm x 5 mm kuber av pankreatisk vävnad direkt från -80 ° C till flytande kväve och placera i en fast fas i vävnaden homogenator. Den ideala homogenator skulle dissociera vävnaden tillräckligt snabbt, utan att låta det defreeze.
   2. Omedelbart efter dissociation, resuspendera det fasta, pulverliknande homogenatet i 300-500 | il 0,1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Här ska du inte använda någon lyseringsbuffert (t.ex. RIPA) eftersom detta kan lysera nervceller.
   3. Centrifugera homogen i minst 15 minuter vid den maximala hastigheten på din bänkcentrifug (t.ex. 21.130 xg). Samla upp den klara supernatanten, som representerar vävnadsextrakt.
2. Cellinje supernatanter
   1. Låt cellerna av intresse når åtminstone 70 - 80% konfluens i normalt tillväxtmedium.
   2. Vanligtvis dessa medier innehåller serumkomponenter och kan utöva okontrollerbara effekter på nervtillväxt. Därför, efter att ha nått den önskade celltätheten, tvätta dina celler minst 3x med cellkulturgrad PBS och placera dem i serumfritt medium (SFM) i upp till 48 timmar.
      Anmärkning: Här, anser att vissa celler (t.ex. pankreasstellate celler) kan behöva serum i sina tillväxtmedier för att upprätthålla sitt normala tillstånd och struktur. I sådana fall utför serieserumspädningar i mediet i cellen av intresse för att hitta lägsta möjliga innehåll krävs serum för intakt cell funktion.
   3. Mät proteinkoncentration av vävnadshomogenat eller cellsupernatanter genom Bradford-proteinanalys. Även om dessa värden kan variera beroende på den vävnad och celltyp, för pankreatiska vävnadsextrakt, skulle man förvänta ett koncentrationsområde mellan 5-12 ug / ul och för cellinje supematanter mellan 3-8 ug / ul.

2. Alikvotera Extrakt och cellsupematanter

Beroende på koncentrationen som används i analysen, bör den slutliga koncentrationen av extraktet eller supernatanten i den neuronala mediet vara 100 mikrogram / ​​ml ^5,8.

Notera: För en analys med neuroner som växer i 500 | il medium i varje brunn i en 24-brunnsplatta, måste en 50 | ig protein från varje extrakt eller supematant per brunn. Vid en typisk extrakt koncentration av cirka 10 mikrogram / l, skulle man behöva 5 l av extrakt / supernatanten för varje brunn. I varje setting utförs som en tre exemplar, skulle detta motsvara 15 l av extrakt / supernatant. För olika vävnader eller celltyper, utföra seriespädningar av den slutliga extrakt eller supernatant koncentration och jämföra de observerade neurotrofa effekter mellan olika extrakt / supernatant koncentrationer.

3. Isolering av nervceller

När extraktet / supernatanten kollektionen är klar, fortsätt med isolering av nervceller.

1. För DRG nervceller, samla hals att ländryggen DRG för nyfödda råttor mellan postnatal dag (P) 2-12 efter halshuggning och stereomicroscopic dissekering av DRG (Figur 1A). För att få tillräckligt med DRG nervceller för en 24-brunnar, samla all livmoderhalscancer för ländryggen DRG av en nyfödd råtta (motsvarande 52 DRG) per platta.
   1. Skär bort den perifera (neurala) och centrala projektioner (rötter) i DRG genom microscissors.
      Lämnar prognoser i stället hindrar rivning och ökar tHan kontamine risk för kultur av fibroblaster.
2. För MP nervceller, skära bort tarmkäx från tunntarmen och manuellt och försiktigt skala bort seromuscular lager av tunntarmen (för ett detaljerat protokoll om MP isolering, se Schäfer et al. ^9, Figur 1B). För MP, samla plexus från två råttor per 24-väl-platta.
   Notera: Försök att vara så skonsam som möjligt för att undvika tårar i seromuscular skiktet eftersom de hindrar den framgångsrika separation från tunntarmen.
3. Samla DRG och seromuscular lager i iskallt minimal viktigt medium (MEM) som levereras med gentamicin (20 mg i 500 ml medium) och metronidazol (2,5 mg i 500 ml medium).
4. Efter insamling av DRG, inkubera dem i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) levereras med kollagenas typ II för 20-30 min. För MP isolering, inkubera i kollagenas typ mellan 1-3 timmar, beroende på ålderav djuret (figur 1C).
5. För MP, samla nätliknande MP bitar inom stereomikroskop och överföra till iskall MEM.
6. Sedan mal sönder DRG och MP genom sprutor med minskande diameter.
   OBS: Överdriven pulverisering kan förstöra nervceller, men minus gliaceller.
7. När mediet innehållande DRG eller MP har blivit grumlig, centrifugera suspensionen vid 93,9 x g under 5 min, kassera mediet och återsuspendera i Neurobasal-medium (kompletterat med 100 U / ml penicillin, 100 | ig / ml streptomycin, 0,5 mM L-glutamin och 2% B-27).
8. Räkna det totala antalet celler (dvs neuroner och glia) med hjälp av en hemocytometer.
   Obs: Antalet nödvändiga celler är beroende av den parameter mätning. För kvantifiering av neurite densitet, måste ett tätare kulturer och därmed ett större antal celler än för mätningen av neuritutväxt, perikaryonal storlekoch förgrening mönster av enskilda neuroner. För mätningar neurite täthet, använd t.ex. 10.000 celler (neuron + glia) / brunn eller 1.500 nervceller / brunn. För morfometri om enskilda nervceller, kort (1 minut långa) trypsinering av celler och sådd av 2500 celler / brunn eller 400 neuroner / väl rekommenderas. Det typiska utbytet av celler erhållna från en råtta är ca 300,000-500,000 celler.
9. Seed celler på 13 mm täckglas som har belagts kvällen innan och top brunnarna med Neurobasal medium (kompletterat med 100 U / ml penicillin, 100 mikrogram / ​​ml streptomycin, 0,5 mM L-glutamin och 2% B-27) (Figur 1D).
   Notera: Använd poly-D-lysin (40 mg / m ²⁾ eller ornitin-och laminin-belagda (1 mg / ml vardera) belagda täckglas. Celler fäster till poly-D-lysin extremt snabbt, vilket gör det lämpligt för experiment i vilka många celler behövs (dvs. mätningar neurite densitet). Tillägg till laminin är i allmänhet någotvad svagare, men laminin är en stark förespråkare för neuritutväxt. Därför, för mätningar på neuronal förgrening och neurite längd, föredrar ornitin / laminin-beläggning.
10. Låta cellerna fästa till brunnarna över natten. Nästa dag, förbereda extrakt-kompletterade medier (vid en slutlig extrakt / supernatant koncentration av 100 mikrogram / ml).
11. Aspirera sådd mediet, och utföra en valfri, mycket skonsam tvätt med PBS, och sedan långsamt pipet extraktet / supernatant-kompletterade medier (figur 1E).
12. Låt cellerna växa under 48 timmar. Aspirera media och fixa i 4% paraformaldehyd för immunfärgning (Figur 1F).
13. Utför dubbel immunofluorescensfärgning använder neuron-specifika (t.ex. beta-III-tubulin) och glia specifika (t.ex. gliaceller fibriallary surt protein / GFAP) markörer (figur 1G).
14. För morfometri, använd ett inverterat ljusmikroskop utrustad med en CCD-kamera i kombination with automatiserad mjukvara som möjliggör mätning av neurite tätheten (se tabell).
15. Den neurite densitet neuronala kulturer mäts på 4-5 representativa mikrofotografier vid 200x förstoring från 4 olika regioner i tätaste tillväxt på varje täckglas genom att lägga en 50 ìm x 50 ìm nätet och räknar fibertätheten per kvadratmeter, mätt i skärningsfibrerna. Neuritutväxt, menar antal grenar per neuron, kan den genomsnittliga grenlängd och perikaryonal storlek mätas från slumpmässigt utvalda 30 ensamma neuroner från varje täckglas genom att markera neurites och perikarya (figur 1H).

Representative Results

Morfologisk neuroplasticityen

I den angivna åldersgruppen nyfödda råttor (P2-12) och seedning densitet, MP och DRG nervceller redan bygga täta neuronala nätverk efter 48 h (Figur 2A). Jämförelse av neurite densitet mellan nervceller som odlas i PCa, CP, och NP extrakt avslöjar större neurite täthet av DRG nervceller i PCa eller CP extrakt än i NP extrakt (Figur 2A) ^5. Vi föredrar särskilt MP nervceller för mätningar på enskilda nervceller, eftersom MP nervceller tenderar att lättare ta avstånd från omgivande gliaceller än DRG nervceller. Här, MP nervceller som odlas i PCA eller CP extrakt bygga även längre neuriter och uppvisar ett mer komplext förgrening mönster än MP nervceller växer i NP-extrakt innehållande medium (Figur 2B) ^5. Frånvaron av denna skillnad i neuronal morfologi inducerad av NP, CP, och PCa extrakt indikerar ett tekniskt problem i enssay. I de flesta fall kan detta bero på att en) dålig kvalitet av det beredda extraktet på grund av lång bearbetningstid eller 2) till följd av skada på neuroner som inträffade under isoleringsprocessen.

Funktionella studier

Den neuroplasticityen assay bär tillräckligt hög känslighet för att detektera förändringar som induceras av närvaron eller frånvaron av vissa målmolekyler av intresse i den kompletterade extrakt eller supernatanter. Exempelvis blockaden av neurotrofisk faktor artemin eller nervtillväxtfaktor från PCa cell (PCC) supernatanter genom att lägga till specifika blockerande antikroppar mot NGF eller av Dynabead-inducerad utarmning av artemin resulterar i dämpning av neuronala nätverket bildning (Figur 2C) ^10. I en nyligen genomförd studie, kunde vi visa en liknande effekt för bidraget från den neurotrophic faktorn Neurturin till neuroplasticity i CP i samtidig jämförelse med andra neurotrofa faktorer såsom NGF, glia-cell-line-derived neurotrofisk faktor (GDNF) eller transformerande tillväxtfaktor-beta (TGF-beta) ^11.

Glia

Kan också tillämpas samma metod för att bedöma reaktionen av DRG-associerad satellit gliaceller eller enter glia till pankreasmicroenvironmental innehållet. I själva verket är en av de mest potenta effekter av PCA vävnadsextrakt upon DRG-eller MP-associerad glia framträdande ökning i tillväxten av glia (Figur 3) ^5. Dessutom är den här effekten mer uttalad i PCa än i CP. Här bör man överväga att spridningen av glia bör inte bedömas utifrån absoluta glia räknas, utan snarare på den relativa andelen av gliaceller till neuroner (glia-neuron-index) ^5. Detta är särskilt viktigt att beakta eftersom antalet gliaceller i dessa odlingar är svårare att reglera på grund av spridningen potensen hos glia som motsatt till neuroner.

Figur 1. Schematisk protokoll av neuroplasticitet-analysen in vitro. Den nuvarande analysen använder nyfödd råtta dorsalrotsganglier (DRG) och myentericus plexus (MP) nervceller för att studera effekten av pankreasextrakt vävnad eller cellsupematanter på neuronala och gliaceller morfologi. DRG samlas efter främre laminektomi och MP-innehållande seromuscular lager efter resektion och mekanisk färgborttagning av tunntarmen (A, B). Efter kollagenas typ II digestion är de neuroner ympades i behövs densitet (se text för detaljer) ad odlades under 24 h (C, D). Därefter är den nylagade pankreas (eller från någon GI-organ av intresse) extrakt och cellsupematanter läggs i tillväxtmediet av nervceller vid tidigare definierade koncentrationer (E).Efter 48 timmar är de kulturerna fixeras i 4% paraformaldehyd och dubbel immunostained mot neuronala och gliaceller markörer (F, G). Den neuronal morfologi, inklusive neurit densitet, neurala förgrening mönster och perikaryonal storlek mäts med hjälp av ett standardiserat programvaruprotokoll (H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Bukspottskörteln neuroplasticityen inducerad av mänsklig cancer i bukspottkörteln (PCA) och kronisk pankreatit (CP). Human pankreas vävnadsextrakt kirurgiskt härrör från normal pankreas (NP), CP eller PCa vävnader inducerar framträdande skillnader i neurite täthet av DRG ne urons (A) och i den neuronala förgreningsmönstret av MP neuroner (B). Här, PCA och CP vävnadsextrakt utövar en framträdande neurotrophic effekt på DRG och MP nervceller. I likhet med vävnadsextrakt, också de supernatanter av individuella celltyper (här pankreatiska cancerceller / PCC) också anmärkningsvärt öka neurite densitet av DRG-neuroner (C). Denna ökning är dock reversibel när utvalda neurotrofiska faktorer såsom artemin (Artn) eller nervtillväxtfaktorn (NGF) är uttömda eller blockeras med dessa supernatanter. Alla neuroner immunostained mot beta-III-tubulin. Alla bilder i 100 gångers förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

51049fig3.jpg "/>
Figur 3. Gliaceller reaktion på pankreas microenvironmental innehållet. Inte bara pankreasvävnadsextrakt från PCa eller CP vävnader har en neurotrophic effekt, men också öka gliaceller tillväxt och gliaceller cellräkningar i DRG eller MP kulturer. Gliaceller immunostained mot Glia markör gliafibrillärt surt protein (GFAP). Alla bilder i 200 gångers förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det nuvarande protokollet är avsett att illustrera metodiken bakom bukspottskörteln neuroplasticity-analysen in vitro som nyligen utvecklats av vår grupp för att studera mekanismerna bakom neuroplasticitet i PCA och CP ^5. Protokollet innebär en tredagars förfarande som lätt kan appliceras en gång utövande har fått tillräcklig erfarenhet av isolering och odling av DRG och MP nervceller. Dessutom utgör den ett värdefullt verktyg för att studera samtidig reaktion av enter och DRG-associerad glia till pankreas microenvironmental komponenter.

Enligt vår mening är en av de mest intressanta funktionerna i denna analys sin förmåga att upptäcka och simulera de förändringar som sker under PCA och CP (dvs. neurala groning och hypertrofi) i ett förenklat in vitro inställning. Faktum tillämpning av vävnadsextrakt eller cellsupematanter resulterar i förändringar i neuronal morfologi which kan detekteras med tillräcklig känslighet medelst systematisk morfometrisk analys. Nyligen kunde vi också visa att denna analys är också känslig för att upptäcka skillnader i neurotrophic potentialen av flera cancer enheter i samtidig jämförelse: När neurotrofiska attribut av PCA cellinjer jämfördes med cellinjer från kolorektal cancer, PCa cellinjer inducerade avsevärt större neurite tätheter bland DRG nervceller än kolorektal cancer linjer ^8. Även i jämförelse med ändtarms mot tjocktarmscancer cellinjer, tjocktarmscancer cellinjer var sämre än ändtarms cancerceller när det gäller deras neuroplastic potential ^8.

En av de viktigaste fördelarna med denna analys är det lätt tillgänglighet för inte bara morfometrisk, men också elektrofysiologiska analyser. Till skillnad från in situ nervceller i slice förberedelser, inspelningar från nervceller i vår analys inom definierade media eller i ettbsence / över närvaro av definierade faktorer är inte tekniskt krävande och kan ge värdefull information om den roll av utvalda molekyler i dessa mikromiljöer på nervaktivitet.

Visst bör det presenterade analysen inte anses vara enbart begränsad till studier av frågor relaterade till bukspottkörtel neuroplasticity. Neuroplasticity är ett framträdande inslag i hela mag-tarmkanalen i patologiska tillstånd, såsom inflammatoriska tarm neuropatier ^1-3. Alla dessa förhållanden rapporterades vara förknippade med förändringar i innervation morfologi och förändrad nervaktivitet ^1-3. Därför är det tänkbart att ersätta pankreasextrakt vävnad eller cellinjer från sådana som härrör från motsvarande vävnader och studera deras specifika effekter på nervceller och medföljande glia. Vår senaste analyserna på jämförelse av bukspottkörtel-och kolorektal cancer vävnader stödja sådana misstankar ^8. Emellertid är det också rimligt att assume som komponenter i olika vävnadsmikromiljöer inte kan framkalla så känsliga och representativa förändringar som vi rutinmässigt följa i pankreas vävnadskomponenter. Därför rekommenderar vi den tidigare omfattande bedömning av neuronal morfologi inducerad av "positiva" kontrollvävnader (dvs vävnader med t.ex. histologiskt visat neurala hypertrofi) kontra "negativa" kontrollvävnad (dvs. utan histologiska bevis för neural hypertrofi).

Våra tidigare analyser på reaktionen av glia i denna analys var begränsad till fastställande av gliaceller cellräkningar i olika pankreasmikromiljöer. Gliaceller besitter växande betydelse i neurobiologi, eftersom erkännande av neurogen potential och ökat intresse för kalcium strömmar längs gliaceller membran ^12. Därför gliaceller i denna analys är också lättillgängliga för ytterligare funktionella analysermed nya metoder. Men sådana ytterligare innovativa strategier behöver tidigare omfattande validering innan deras ansökan till fortsatta studier.

Precis som alla andra experimentell analys, även presenterade neuroplasticity analysen bär viss begränsad jämförbarhet av humana vävnadsprover från olika patienter som genomgår kirurgi. Det är absolut nödvändigt att dessa vävnader komma från samma vävnadsområden (t.ex. pankreas huvudet, från huvudtumörmassan) för tillförlitliga analyser ^1. Dessutom, även om det här kravet är uppfyllt ytterligare skillnader i vävnad eller tumörbiologi kan inte uteslutas med tanke på den stora variationen i den biologiska svarsmönstret hos olika individer ^1. För att kringgå dessa enskilda vävnadsskillnader, rekommenderar vi utförandet av analysen med vävnaderna från så många patienter som möjligt, det vill säga med minst 5 - 10 olika patienter per enhet.

Som en viktig teknisk aspekt, vill vi fästa uppmärksamheten på den roll som beläggningsmaterial på neuronal tillväxt. Såsom också nämnts ovan, föredrar vi poly-D-lysin för mätningar på neurite densitet, och ornitin / laminin beläggning för de på enskilda neuronala förgrening / utväxt mönster. I våra händer, medan mätningen av neuronal utväxt även kan utföras på poly-D-lysin-täckta ytor, finner vi att denna metod tenderar att minska känsligheten hos analysen för de faktiska skillnaderna. Därför bör forskare som tillämpar denna analys säkerställa användningen av det optimala beläggningsmaterial för sin fråga av intresse.

Sammanfattningsvis tror vi att den presenterade neuroplasticity analysen utgör ett värdefullt verktyg för att få snabba och reproducerbara information om neuro-morfologi och neuro-funktion i olika vävnadsmikromiljöer, vilket visas i exemplet påpankreatisk vävnad. Den känslig detektion av skillnader i neuro-morfologi som induceras av olika pankreasvävnadsinnehåll understryker reproducerbarhet in vitro av bukspottskörteln neuroplasticityen i mänsklig PCa och CP. Framtida insatser ska syfta till optimerad preassay screening av tillämpade supernatanter och extraherar att uppnå bäst definierade media för studier av GI-sjukdomsassocierade neuroplasticitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1149
Ornithine/laminin	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm Coverslips	Merck		For use in 24-well plates
Dismembranator S	Sartorius
Anti-Beta-III-tubulin antibody	Millipore	MAB1637	1:200 concentration
Anti-GFAP-antibody	DAKO	M0761	1:400 concentration
RIPA buffer + protease inhibitor			Any supplier
Neurobasal medium	Gibco/Life Sciences	21103-049
B-27 Supplement	Gibco/Life Sciences	17504044	Quality of B-27 is known to depend on the lot number
Gentamicin/Metronidazol			Any supplier
Minimal essential medium	Gibco/Life Sciences	31095-029
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco/Life Sciences	24020133	Improves collagenase activity when containing Ca/Mg
Collagenase type II	Worthington Biochemical	CLS-2	Obtain lots with at least 200 U/mg activity
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco/Life Sciences	25200056
4% Paraformaldehyde			Any supplier
analySIS docu software	Olympus