Summary
Nöronal plastisite gastrointestinal (Gİ) sistem giderek tanınan, fakat yeterince anlaşılır bir özelliktir. Burada, insan pankreas bozuklukların örnekte, morfolojik ve fonksiyonel hem düzeyinde GI nöronal plastisite çalışma için, bir in vitro deneyi nöroplastisite mevcut.
Abstract
Nöroplastisite patolojik koşullar altında, enterik sinir sistemi ve gastrointestinal (GI) innervasyonunun içsel bir özelliğidir. Ancak, GI bozuklukları nöroplastisitesi patofizyolojik rolü bilinmemektedir. Simülasyon ve GI nöroplastisitesi modülasyonu sağlayan yeni deneysel modeller gibi pankreas kanseri (PCA) ve kronik pankreatit (CP) olarak özellikle GI hastalıkların nöroplastisitesi katkısının gelişmiş takdir sağlayabilir. Burada, yeni doğan sıçan dorsal kök ganglionlar (DRG) ve myenterik pleksusu (MP) nöronlar kullanılarak in vitro koşullarda pankreas nöroplastisitesi simülasyonu için bir protokol mevcut. Bu çift-nöron yaklaşım hem organ içsel ve dışsal-nöroplastisite izlenmesini sağlar, ama aynı zamanda nöronal ve glial morfolojisi ve elektrofizyoloji değerlendirmek için değerli bir araç temsil değil sadece. Dahası, onların IMPAC eğitim için verilen microenvironmental içeriklerin fonksiyonel modülasyonu sağlarnöroplastisitesi t. Bir kez kurulan, mevcut nöroplastisite tahlil herhangi GI organ nöroplastisitesi çalışmaya uygulanabilir olma potansiyelini taşımaktadır.
Introduction
Gastrointestinal (Gİ) sinir morfolojisi ve yoğunluğu değişiklikler uzun bir süre için gastroenterolog ve patologlar dikkatini çekti, ama GI hastalıkların patofizyolojisi için kendi alaka 1-3 bilinmemektedir. Gerçekte, bu tür gastrit, reflüks yemek borusu iltihabı, kolit, divertikülit ve apandisit gibi birkaç derece yaygın GI hastalıkları, iltihaplı doku alanlarında 1 'de artan innervasyon yoğunluğuyla ilişkilidir. Ancak, gerçek bir ilgi kadar GI de mekanizmaları ve nöroplastisite anlamı ödenmiştir. Morfolojik değişmiş GI sinirler fonksiyon açısından, enterik sinir sisteminin normal devlet, yani normal bir GI sinirler farklı mı? Plastik enterik sinir değişmiş nöropeptid / nörotransmiter içeriği etkileri nelerdir? Periferik nöroplastisite her zaman merkezi sinir sistemi değişmiş sinyalizasyon gerektirmez mi? Ve nerede plastik kurtarmasına merkezi projeksiyonları vardırnsic GI sinir yolları? GI nöroplastisitesi fonksiyonel yönleri üzerinde bilgimizin azlığı bakarken gibi önemli soruların uzun bir dizi kolaylıkla oluşturulabilir.
Fonksiyonel düzeyde GI nöroplastisitesi çalışma, geçerli tekrarlanabilir ve hala kolayca uygulanabilir deneysel modeller gerektiriyor. Artan bir dönemde popülerlik ve bu vivo ortamlarda GDO'lu koşullu fare modelleri (GECoMM), kabulü gerçekçi bir şekilde 1 GI nöroplastisitesi önceden bilinmeyen yönleriyle aydınlatmak potansiyelini taşımaktadır. Ancak, GECoMM tasarım ve üretim, pahalı kalır emek-yoğun ve özellikle, zaman alıcıdır. Bundan başka, koşullu olarak genetik olarak değiştirilmiş fare (bağırsak epitel hücrelerinde sinir büyüme faktörü / NGF örneğin transgenik aşırı ekspresyonu) modüle edilecek hedefin önsel seçimi gerektirir. Bu nedenle, des içinBaşarılı bir GECoMM bir ign, araştırmacılar, bir değerli hedefin bazı göstergeler (örneğin önceki deneysel veri) gerekir (burada NGF) ilgilenilen molekül en az GI sinirler üzerinde bazı biyolojik ilgili etkiler yarattığı bekleniyor olabilir yani.
Bu tip göstergeler kolayca in vivo sistemin karmaşık mikro-izole edilmiş hücre alt tipi seçici bir heterotipik şekilde 4-7 kültüre edilebilir in vitro modellerde yeterli türetilebilir. Bir heterotipik kültür ortamda moleküler hedeflerin modülasyonu, daha hızlı, daha az ortalama teknik zahmetlidir ve bu nedenle in vivo çalışmalarda doğrulanması için değerli hedeflerin ön süzme yardımcı olabilir.
Son zamanlarda, intrapankreatik NE artan sinir yoğunluğu ve hipertrofisi taklit etmek için tasarlanmış bir in vitro deneyi nöroplastisite sunulmaktadırinsan pankreas kanseri (PCA) ve kronik pankreatit (CP) dokuları rves. Burada, yeni doğmuş fare dorsal kök ganglion (DRG) veya miyenterik pleksus (MP) türetilen nöronlar cerrahi olarak kesilmiş dokuları PCa ya da CP örneklerden doku özleri maruz kalmış ve normal insan pankreas (NP), doku ekstreleri 5 kültürlenmiş ile karşılaştırıldı. Bunun yerine, doku özleri, bir de nöroplastisitesi üzerine seçilen hücre türlerinin etkilerini incelemek için hücre hattı, üst fazlar kullanabilir. Standardize morfometrik ölçüm ile kombine edildiğinde, sunulan nöroplastisite tahlil farklı pankreas mikroçevrelerde yanıt nöronal plastisite geçerli ve tekrarlanabilir değerlendirmesini sağlar. Özel olarak, bu sağlayan nevrit dışa büyümesinin, desen ve nöronal dallanma boyutu, ve 2) fonksiyonel nöroplastisite, periferal sinir hücrelerinin uyarılabilirliğinin yani değişikler değişikliklerin, yani 1) morfolojik nöroplastisitesi simülasyon. Ayrıca, çevresel sadece (örn. (örn. DRG ya da ikinci derece spinal) nöronları farklı GI doku içeriğine morfolojik ve fonksiyonel reaksiyon değerlendirmek için, bu deneyde dahil edilebilir. Mevcut video ders, biz bu testin performans için teknik protokolünü göstermek ve avantajları ve zayıf yönlerini tartışmak. Ayrıca, herhangi bir GI organ nöroplastisitesi çalışmada bu testin temel kavramının uygulanabilirliğine dikkat çekmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokoldeki tüm hayvan deneysel prosedürleri Technische Universität München, Almanya'da hayvan bakım yönergeleri izleyin.
1.. Medya / Hazırlık Özü
- Doku homojenizasyon
Doku homojenizasyonu kalitesi kültürlenmiş nöronlar içinde nöroplastik değişiklikler daha sonra tespit edilebilmesi için çok önemlidir. Burada, homojenleştirici doku sıcaklık önemli bir artış olmadan, doku ayrılmasını sağlayan önerilir.- Aktarım 5 mm x 5 mm x 5 mm doğrudan doku homogenator bir katı fazda ve sıvı azot yerine -80 ° C ila pankreas dokusu küp. İdeal homogenator bu defreeze izin vermeden, yeterince hızlı doku ayırmak olacaktır.
- Hemen ayrıldıktan sonra, 0,1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) 300-500 ul katı, toz-benzeri Homojenat yeniden süspanse edin. İşte, bu nöronlar lyse olabilir çünkü (örneğin RIPA'da gibi) herhangi bir lizis tampon kullanmayın.
- Bench santrifüj (örneğin 21.130 xg) maksimum hızı en az 15 dakika boyunca homojenatlarına santrifüj. Doku özü temsil berrak süpernatant toplayın.
- Hücre hattı süpernatanlan
- Normal bir büyüme ortamı içinde% 80 izdiham -, ilgi konusu hücreler, en az 70 ulaşmak olsun.
- Genellikle, bu medya serum bileşenlerini içeren ve nöronal büyüme üzerinde kontrol edilemeyen etkiler yapabilir. Bu nedenle, istenen hücre yoğunluğuna ulaştıktan sonra, hücre kültürü dereceli PBS ile en az 3 kere hücreleri yıkamak ve en fazla 48 saat boyunca serumsuz ortamda (SFM) yerleştirin.
Not: Burada, (pankreas stellat hücreleri gibi) bazı hücreler normal durumunu ve yapısını korumak için kendi büyüme ortamı içinde serum gerekebilir düşünün. Bu gibi durumlarda, sağlam hücre functio için gerekli olası en düşük serum içeriği bulmak için ilgi hücrenin ortam içinde seri serum seyreltmeleri gerçekleştirmekn. - Bradford protein deneyi ile doku ya da hücre homojenatının süpernatantların protein konsantrasyonu ölçülür. Bu değerler, doku ve hücre tipine bağlı olarak farklı olsa da, pankreas doku özleri için, tek bir 5-12 mg / ml arasında bir konsantrasyon aralığı beklemek ve 3-8 ug / ul arasında hücre hattı için yüzer olacaktır.
2.. Kısım özleri ve Hücre üst fazlan
Deneyde kullanılması için konsantrasyona bağlı olarak, nöronal ortam içinde özü veya yüzer nihai konsantrasyonu, 100 ug / ml 5,8 olmalıdır.
Not: nöronlar, 24 çukurlu bir levhanın her bir çukuruna 500 ul ortam içinde büyüyen bir tahlil için, bir de başına her özü ya da süpernatanmdan proteinin 50 ug gerekmektedir. Yaklaşık 10 mg / ml bir konsantrasyonda, tipik özü, her bir oyuk için bir özü / yüzer 5 ul gerekir. Her setting, bir üç kopya olarak gerçekleştirilmiştir, bu özü / süpernatan 15 ul karşılık gelir. Farklı doku ya da hücre tipi için, son yüzer özü veya konsantrasyon seri seyreltileri yapmak ve farklı özü / yüzer konsantrasyonları arasında gözlenen nörotrofik etkilerinin karşılaştırılması.
Nöronlar 3. İzolasyonu
Extract / yüzer toplama bittiğinde, nöronların izolasyonu ile devam.
- DRG nöronlar için, doğum sonrası gün (P) 2-12 decapitation ve DRG stereomicroscopic diseksiyonu (Şekil 1A) sonra yenidoğan sıçanların DRG'yi lomber servikal toplamak. , 24-delikli plaka için yeterli DRG nöronlarını sahip plaka başına (52 DRG eşit), bir yeni doğmuş sıçan DRG lomber tüm servikal toplamak için.
- Microscissors vasıtasıyla periferik (sinirsel) ve DRG merkezi projeksiyonlar (kök) kesip.
Yerinde projeksiyonlar bırakmak öğütülmesinden engeller ve t artırırO fibroblastlar tarafından kültür riskini kontamine.
- Microscissors vasıtasıyla periferik (sinirsel) ve DRG merkezi projeksiyonlar (kök) kesip.
- MP nöronlar için, elle ince bağırsak ve gelen mezenteri kesip ve dikkatle ince bağırsak (MP izolasyon ayrıntılı bir protokol için, Schäfer ve diğ. 9 Şekil 1B bakınız) seromüsküler tabakası kapalı şerit. MP için, 24 kuyulu bir levha başına iki sıçan pleksus toplar.
Not: ince bağırsaktan başarılı ayrılmasını engelleyen beri seromüsküler katmanında gözyaşları önlemek için mümkün olduğunca nazik olmaya çalışın. - Gentamisin (500ml bir ortam içinde 20 mg) ve metronidazol (500 ml ortam içinde 2.5 mg) ile birlikte buz soğukluğunda minimal esas ortamı içinde DRG ve seromüsküler tabaka (MEM) toplayın.
- DRG toplanmasından sonra, 20-30 dakika boyunca kolajenaz Tip II ile birlikte Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde inkübe. MP izolasyonu için, yaşına bağlı olarak 1-3 saat arasında kollajenaz tip inkübehayvanın (Şekil 1C).
- MP için, stereomicroscope altında net gibi MP parçalarını toplamak ve buz gibi soğuk MEM transfer.
- Ardından çapı azalan şırınga yoluyla DRG ve MP çiğnemek.
Not: Aşırı triture nöronları yok, ama daha az glia hücreleri olabilir. - DRG veya MP içeren ortam, 5 dakika boyunca 93.9 xg'de bulutlu süspansiyon, santrifüj hale geldikten sonra, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 0.5 mM L-glutamin ile takviye edilmiş ortam içinde Neurobasal orta ve tekrar süspansiyon (atmak ve% 2 B-27).
- Bir hemasitometre ile hücrelerin toplam sayısını (örneğin, nöronlar ve glia) sayılır.
Not: gereken hücre sayısı ölçü parametresine bağlıdır. Nörit yoğunluğunun ölçümü için, bir nevrit dışa büyümesinin, perikaryonal boyutunun ölçülmesi için daha yoğun kültürleri ve böylece hücrelerin büyük bir sayıda ihtiyacıve bireysel nöronların desen dallanma. Nörit yoğunluk ölçümleri için, örneğin iyi 10,000 hücreleri (nöron + glia) / veya 1.500 nöronlar / iyi kullanın. Bireysel nöronlar, kısa (1 dakikalık uzun) hücrelerinin tripsinizasyon ve 2.500 hücre / kuyu veya 400 nöronlar / of ekimi üzerine morfometresi için de önerilir. Bir sıçandan alınan hücrelerin tipik bir verim yaklaşık 300.000-500.000 hücredir. - Gece önce kaplanmış 13 mm kapak hücreleri ve tohum (100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 0.5 mM L-glutamin ve% 2 B-27) Neurobasal ortamı (Şekil ile kuyu üst 1D).
Not: Kullanım poli-D-lisin (40 mg / m 2) ya da ornitin ve laminin ile kaplanmış kaplama (1 mg / ml her biri) kapak slipleri. Hücreler bu nedenle birçok hücreler ihtiyaç olduğu deneylerde (yani akson yoğunluk ölçümleri) için uygun hale, son derece hızlı poli-D-lisin eklemek. Laminine Ek genel bazılarında olduğuNe zayıf ama laminin nevrit dışa büyümesinin güçlü bir promoterdir. Bu nedenle, dallanma nöronal ve nörit uzunluğu ölçümleri, ornitin / laminin-kaplama tercih ederim. - Hücreler, gece boyunca oyuklara takmak izin verin. Bir sonraki gün, (100 ug / ml 'lik bir son özü / yüzer madde konsantrasyonunda) ekstresi ile takviye edilmiş ortam hazırlar.
- Tohumlama orta aspire ve PBS ile isteğe bağlı, çok nazik yıkama gerçekleştirmek, ve sonra yavaş yavaş extract / yüzer-desteklenmiş medya (Şekil 1E) pipetle.
- Hücreler 48 saat için büyümeye izin verin. Medya aspire ve (Şekil 1F) immünboyama için% 4 paraformaldehid düzeltmek.
- Nöron-spesifik (örneğin beta III-tubulin) ve glia-spesifik (örneğin, glial fibriallary asidik protein / GFAP) belirteçleri (Şekil 1G) kullanılarak çift immünofluoresans boyanma gerçekleştirin.
- Morfometresi için, kombinasyon wi bir CCD kamera ile donatılmış bir ters ışık mikroskobu kullanınnörit yoğunluk ölçümünü sağlar otomatik yazılım (bkz. Tablo) inci.
- Nöronal kültürlerin yoğunluğu, nevrit 50 um x 50 um ızgara uzanır ve bununla kesişen liflerin ölçülen kare başına lif yoğunluğu sayılarak her bir lamel üzerine yoğun büyüme 4 farklı bölgelerinden 200x büyütmede 4-5 Örnek fotomikrograflarında ölçülür. Nörit gelişimi, nöron başına düşen şube sayısı ortalaması, ortalama dal uzunluğu ve perikaryonal boyutu nevritlerle ve perikarya (Şekil 1H) işaretleyerek her lamel rastgele seçilen 30 yalnız nöronlardan ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Morfolojik nöroplastisite
Yeni doğmuş farelerin (P2-12) ile tohumlama yoğunluklarının belirtilen yaş aralığında, MP ve DRG nöronları daha önce 48 saat (Şekil 2A) sonra yoğun nöronal ağlar oluşturmak. PKa, CP yetiştirilmektedir nöronlar arasındaki nörit yoğunluğu ve NP özler karşılaştırması NP ekstrelerinde ya da daha PCa CP ekstrelerinde DRG nöronlarının nörit büyük yoğunluğa (Şekil 2A) 5 ortaya koymaktadır. MP nöronlar daha kolay DRG nöronlar daha çevreleyen glia hücrelerinden ayrılma eğilimi beri biz özellikle, bireysel nöronlar üzerinde ölçümler MP nöronlar tercih ederim. Burada, PCa'nın veya CP özleri yetişen MP nöronlar da uzun nevritlerle inşa içeren ve NP-özütü ortamında büyüyen MP nöronlar daha karmaşık bir dallanma deseni (Şekil 2B) sergilerler 5. NP, CP, ve PCa'nın özler tarafından uyarılan nöron morfolojisi bu farkın olmaması a teknik bir sorun olduğunu gösterirssay. Çoğu durumda, bu) nedeniyle uzun işlem süresi ya da 2) nedeniyle izolasyon işlemi sırasında meydana gelen nöronlara hasar hazırlanan ekstraktı kalitesiz 1 nedeniyle olabilir.
Fonksiyonel çalışmalar
Nöroplastisite deney takviye özleri ya da yüzer ilgi bazı hedef moleküllerin varlığında ya da yokluğunda neden olduğu değişiklikleri tespit etmek için yeterince yüksek bir hassasiyet taşır. Örneğin, NGF'ye spesifik bloke edici antikorlar ekleyerek ya da nöronal ağı oluşumu (Şekil 2C) 10 zayıflatılmasıyla Artemin sonuç Dynabead kaynaklı tükenmesi PCa hücreden nörotrofik faktör Artemin ya da sinir büyüme faktörü (PCC) üst sıvıları içinde engellenebilir. Yeni bir çalışmada, bu tür NGF, glial hücre-line-TÜREV gibi diğer nörotrofik faktörler ile eşzamanlı karşılaştırıldığında SP'de nöroplastisite nevrotrofik faktör Neurturin katkısı için çok benzer bir etki gösterebilired nörotrofik faktör (GDNF) ve transforme edici büyüme faktörü-beta (TGF-beta) 11.
Glia
Aynı yaklaşım, aynı zamanda pankreas microenvironmental içeriğine DRG birleşik uydu glia hücreleri veya enterik glia tepkisini değerlendirmek için uygulanabilir. Gerçekten de, DRG-ya da MP ilişkili glia upon PCa Doku özütlerinin en kuvvetli etkilerinden biri glia büyüme (Şekil 3) 5'te belirgin artıştır. Dahası, bu etki CP daha PCa'nın daha belirgindir. Burada, bir glia çoğalmasının mutlak glia sayılarına göre karar değil, nöronlar (glia-nöron-dizin) glia hücrelerinin rölatif oranına olmamalıdır düşünmelisiniz 5. Bu nöronlar aksine bu kültürlerde glia hücre sayısı nedeniyle glia yayılması gücüne kontrol etmek daha zordur çünkü dikkate almak önemlidir.
Şekil 1. In vitro nöroplastisite deneyinin şematik protokolü. Mevcut deney, yeni doğmuş fare dorsal kök ganglion (DRG) ve miyenteron pleksusu (MP) nöronları nöronal ve glial morfolojiye üzerine pankreas doku özleri veya hücre yüzer etkisini incelemek için kullanır. DRG anterior laminektomi ve rezeksiyon ve ince bağırsak mekanik soyma sonra MP-içeren seromüsküler tabakası sonra toplanır (A, B). Kollajenaz tip II sindirimden sonra 24 saat nöronlar ad (C, D) için yetiştirilen (ayrıntılar için metne bakınız) gerekli yoğunluğunda tohumlanır. Daha sonra, yeni hazırlanmış pankreas (veya ilgi duyulan herhangi bir organ GI) özü ve hücre üst sıvıları daha önce tanımlandığı konsantrasyonda (E) sinir hücrelerinin büyüme ortamı ilave edilir.48 saat sonra, kültürler% 4 paraformaldehit içinde sabitlenir ve nöron ve glial belirteçleri (F, G) karşı çift immüno. Nörit yoğunluğu, sinir dallanma deseni ve perikaryonal boyutu dahil olmak üzere nöronal morfoloji, standart bir yazılım protokolü (H) vasıtasıyla ölçülür. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Insan pankreas kanseri (PCA) ve kronik pankreatit (CP) tarafından uyarılan pankreas nöroplastisite. İnsan pankreas doku ekstreleri ameliyatla DRG NE nörit sayılarında belirgin farklılıklar neden, normal pankreas (NP), CP veya PCa'nın dokulardan elde edilen urons (A) ve MP nöronların (B) 'nin nöronal dallanma desen. Burada, PCa'nın ve CP doku ekstreleri DRG ve MP nöronlar üzerine önemli bir nörotrofık etki gösterirler. Doku ekstreleri, tek tek hücre tipleri (burada pankreas kanseri hücre / PCC) ayrıca yüzer da da oldukça DRG nöronlarının (C) 'nin nörit yoğunluğunu arttırır. Bu artış, ancak bu tür Artemin (ARTN) ya da sinir büyüme faktörü (NGF) gibi seçilmiş nörotrofik faktörler tükenmiş veya bunların süpernatanları ile bloke olduğunda tersine çevrilebilir. Tüm nöronlar beta-III-tubulin karşı immüno. 100X büyütmede tüm görüntüler. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
51049fig3.jpg "/>
Şekil 3,. Pankreas microenvironmental içeriğine Glial reaksiyonu. Pankreas PCa doku ekstreleri ya da CP dokular, nörotrofik bir etkiye sahip, ama aynı zamanda DRG veya MP kültürlerde glial büyüme ve glial hücre sayısını arttırmak değil. Glia hücreler glia işaretleyici glial fibriller asidik protein (GFAP) karşı immüno. 200X büyütmede tüm görüntüler. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut protokol son zamanlarda PCa'nın ve CP 5 nöroplastisitesi mekanizmaları incelemek için bizim grup tarafından geliştirilen in vitro pankreatik nöroplastisite tahlil arkasındaki metodoloji göstermek için tasarlanmıştır. Protokol sanatçı DRG ve MP nöronların izolasyonu ve kültürü yeterli deneyim kazanmıştır sonra kolayca uygulanabilir üç günlük bir prosedür içerir. Ayrıca, pankreas microenvironmental bileşenlere enterik ve DRG ilişkili glia birlikte reaksiyonu incelemek için değerli bir araç temsil eder.
Kanımızca, bu testin en ilginç özelliklerinden biri, bir in vitro basitleştirilmiş bir ortamda PCa'nın ve CP (yani sinir Çimlendirme ve hipertrofisi) sırasında meydana değişiklikleri tespit ve simüle edebilme yeteneğidir. Gerçekten de, W, nöronal morfoloji değişikliklere doku özleri veya hücre süpernatanları sonuç uygulamasıhich sistematik morfometrik analizi ile yeterli hassasiyet ile tespit edilebilir. Son zamanlarda, bu deney, eş zamanlı olarak kıyasla birçok kanser Unsurlar nörotrofik potansiyel farkları algılamak duyarlı olduğunu göstermek olabilir: PCa hücre çizgilerinin nörotrofik özelliklere kolorektal kanser hücre çizgilerine karşılaştırıldığında, PCa hücre çizgileri belirgin bir neden kolorektal kanser hücre dizilerinde 8 daha DRG nöronlarının nörit arasında daha yoğunlukları. Da kolon kanseri hücre çizgileri genel rektal karşılaştırılmasında, kolon kanseri hücre çizgileri bunların nöroplastik potansiyel 8 açısından rektal kanser hücrelerine düşüktür.
Bu deneyde en önemli avantajlarından biri, sadece morfometrik için kolay erişim, ama aynı zamanda bir elektrofizyolojik analizleri. Tanımlanmış ortam içinde bizim tahlilinde nöronların dilim preparatlar, kayıtları veya a in situ nöronların aksinetanımlanan faktörlere bsence / aşırı varlığı teknik talep edilmez ve nöronal aktivitenin bu mikroçevrelerde seçilen moleküllerin rolü hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
Elbette, sunulan tahlil sadece pankreas nöroplastisite ilgili soruların çalışmaya sınırlı olmak üzere kabul edilmemelidir. Nöroplastisite gibi enflamatuar bağırsak nöropatiler 1-3 gibi patolojik koşullar altında tüm GI sisteminin bir önemli özelliğidir. Bütün bu koşullar innervasyon morfolojisi ve nöronal aktivitenin değiştirilmiş 1-3 değişiklikler ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Bu nedenle, karşılık gelen dokulardan türetilmiş olanlar tarafından pankreas doku ekstreleri ya da hücre hatları yerine ve nöron ve glial eden kendi özel etkilerini incelemek için düşünülebilir. Pankreas ve kolorektal kanser dokularının karşılaştırılması bizim son analizler bu durumu 8 destekler. Ancak, aynı zamanda Assum için mantıklıdırBiz rutin pankreas doku bileşenleri gözlemlemek gibi farklı doku mikroçevrelerde bileşenleri gibi hassas ve temsili değişiklikler neden olabilir e. Bu nedenle, "negatif" kontrol dokular (yani sinir hipertrofisi için hiçbir histolojik kanıt) karşı "pozitif" kontrol dokularında (örneğin histolojik olarak sinir hipertrofisi yani dokular) tarafından uyarılan nöronal morfoloji önceki kapsamlı değerlendirmesini öneririz.
Bu deneyde glia reaksiyona Bizim önceki analizler Farklı pankreas mikroçevrelerde glial hücre sayımlarının belirlenmesi ile sınırlı kalmıştır. Glia hücreleri kendi nörojenik potansiyelinin tanınması ve glial zarı 12 boyunca kalsiyum akımları artan ilgi beri nörobiyoloji ortaya önem sahip. Bu nedenle, bu deneyde glia hücreleri, başka fonksiyonel analiz için kolayca erişilebiliryeni yaklaşımlarla. Bununla birlikte, bu tür ek yeni yaklaşımlar ileri çalışmalar için kendi uygulama öncesi önceki kapsamlı doğrulaması gerekir.
Başka bir deney tahlili gibi, aynı zamanda sunulan deney nöroplastisite cerrahi geçiren farklı hastalardan elde edilen insan doku örneklerinin sınırlı bir karşılaştırılabilir taşımaktadır. Bu dokular güvenilir analizler 1 (ana tümör kütlesinden, örneğin pankreas başı,) aynı doku bölgeleri elde edilmesi için şarttır. Bundan başka, bu ön koşul yerine getirildiği zaman bile, doku ya da tümör biyolojisi de farklılıklar farklı birey 1'in biyolojik tepki desen büyük varyasyon dikkate göz ardı edilemez. Varlık başına 10 farklı hastalar - bu doku, bireysel farklılıkları aşmak için, en az 5, örneğin, mümkün olduğunca çok sayıda hastadan elde edilen doku ile tayin performansını tavsiye.
Bir anahtar teknik açıdan olduğu gibi, biz nöronal büyüme üzerindeki kaplama maddelerin rolüne dikkat çekmek istiyorum. Yine yukarıda belirtildiği gibi, biz nörit yoğunluk ölçümü için poli-D-lisin sıralama ve bireysel nöronal dallanma / çıkıntı pattern olanlar için ornitin / laminin kaplama. Nöronal gelişim ölçüm da poli-D-lizin kaplı yüzeylerde gerçekleştirilebilir halbuki ellerde, bu yaklaşım, gerçek farklar için, tahlilin hassasiyetini azalma eğiliminde olduğunu bulmak. Bu nedenle, bu deney uygulanması araştırmacılar ilgi kendi soru için en uygun kaplama malzemesinin kullanımını sağlamalıdır.
Özet olarak, bir örnekte gösterildiği gibi, sunulan nöroplastisite deney, nöro-morfoloji ve farklı doku mikroçevrelerde nöro-fonksiyon hızlı ve yeniden üretilebilir bir bilgi elde etmek için değerli bir araç olduğuna inanıyoruzpankreas dokusudur. Farklı pankreas doku içeriği 'nin neden olduğu nöro-morfolojik farklılıklar hassas algılama insan PCa ve CP pankreatik nöroplastisitesi in vitro tekrarlanabilirlik altını çizmektedir. Gelecek çabalar uygulanan yüzer optimize preassay tarama amacı ve GI-hastalıkla ilişkili nöroplastisitesi çalışma için en iyi tanımlanmış bir ortam elde etmek için özleri eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması ve finansal açıklamaları var.
Acknowledgments
Tüm yazarlar sunulan analizin kurulması ve doğrulama doğru ve yazının taslak katkıda bulunmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13 mm Coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life Sciences | 21103-049 | |
| B-27 Supplement | Gibco/Life Sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life Sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200 U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco/Life Sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
