Summary
Neuronal plasticitet er en stigende grad anerkendt, men utilstrækkeligt forstået funktionen af mave (GI) tarmkanalen. Her i eksemplet af menneskelige pankreassygdomme præsenterer vi et in vitro neuroplasticitet analyse til studiet af neuronal plasticitet i mave-tarmkanalen på både morfologiske og funktionelle niveau.
Abstract
Neuroplasticitet er et iboende træk ved det enteriske nervesystem og gastrointestinal (GI) innervation under patologiske tilstande. Men den patofysiologiske rolle af neuroplasticitet i GI lidelser er fortsat ukendt. Nye eksperimentelle modeller, der tillader simulering og modulering af GI neuroplasticitet kan muliggøre øget anerkendelse af det bidrag neuroplasticitet især GI sygdomme såsom kræft i bugspytkirtlen (PCA) og kronisk pancreatitis (KP). Her præsenterer vi en protokol til simulering af pancreas neuroplasticitet under in vitro-betingelser under anvendelse af nyfødt rotte dorsalrodsganglier (DRG) og plexus myentericus (MP) neuroner. Denne dobbelte-neuron tilgang ikke kun tillader overvågning af både orgel-iboende og-ydre neuroplasticitet, men repræsenterer også et værdifuldt redskab til at vurdere neuronal og glial morfologi og elektrofysiologi. Desuden giver det funktionelle modulering af medfølgende microenvironmental indhold for at studere deres impact på neuroplasticitet. Når de er etableret, den nuværende neuroplasticitet analysen bærer potentiale for at være anvendelig til studiet af neuroplasticitet i enhver GI orgel.
Introduction
Ændringer i gastrointestinal (GI) nerve morfologi og tæthed har fanget opmærksomheden af gastroenterologists og patologer i lang tid, men deres relevans for patofysiologien af GI-sygdomme er fortsat ukendt 1-3. Faktisk er flere meget almindelige GI lidelser såsom gastritis, refluxesophagitis, colitis, diverticulitis og blindtarmsbetændelse forbundet med øget innervation tæthed i betændte væv områder 1.. Der er dog ikke ægte opmærksomhed hidtil blevet udbetalt til de mekanismer og betydningen af neuroplasticitet i mave-tarmkanalen. Må morfologisk ændrede GI nerver afviger fra normale GI nerver, dvs normale tilstand af det enteriske nervesystem, i form af deres funktion? Hvad er konsekvenserne af ændrede neuropeptid / neurotransmitter indhold i plast enteriske nerver? Er perifer neuroplasticitet altid medføre ændret signalering til det centrale nervesystem? Og hvor er de centrale fremskrivninger af plast extriNSIC GI nervebanerne? En lang række af sådanne centrale spørgsmål kan nemt blive genereret, når man ser på manglen på viden om funktionelle aspekter af GI neuroplasticitet.
Studiet af GI neuroplasticitet på funktionsniveau kræver gyldige, reproducerbare og stadig let anvendelige eksperimentelle modeller. I en tid med stigende popularitet og accept af gensplejsede betingede musemodeller (GECoMM), såsom in vivo-indstillinger bærer potentialet til at belyse hidtil ukendte facetter af GI neuroplasticitet på en realistisk måde 1. Men design og produktion af GECoMM stadig dyrt, arbejdskrævende og især tidskrævende. Desuden kræver de a priori valg af mål, der skal betinget gradueres på genetisk ændret mus (fx transgene overekspression af nerve vækstfaktor / NGF i enteriske epitelceller). Derfor, for desIGN af en vellykket GECoMM, forskerne har brug for nogle indikatorer (f.eks tidligere eksperimentelle data) af et værdifuldt mål, nemlig at molekylet af interesse (her NGF) mindst kan forventes at udøve nogle biologisk relevante virkninger på GI nerver.
Sådanne indikatorer kan nemt udledes passende in vitro-modeller, hvor isolerede celle undertyper fra komplekset mikromiljø et in vivo system kan selektivt samdyrket i heterotypisk måde 4-7. Gradueringen af molekylære mål i sådan en heterotypisk kultur indstilling er i gennemsnit teknisk mindre besværlig, hurtigere, og kan derfor støtte i forfiltrering af værdifulde mål for verifikation i in vivo-undersøgelser.
For nylig præsenterede vi et in vitro neuroplasticitet assay, som var designet til at simulere den øgede neurale tæthed og hypertrofi af intrapankreatiske nerves i bugspytkirtelkræft menneske (PCA) og kronisk betændelse i bugspytkirtlen (CP) væv. Her blev neuroner afledt fra nyfødt rotte dorsalrodsganglier (DRG), eller plexus myentericus (MP) udsættes for vævsekstrakter fra kirurgisk resektion PCa eller CP væv prøver og i forhold til de dyrkes i normal human pancreas (NP) vævsekstrakter 5. I stedet for vævsekstrakter, kan man også bruge cellelinje supernatanter at undersøge virkningen af udvalgte celletyper om neuroplasticitet. Når det kombineres med et standardiseret morfometrisk måling, præsenterede neuroplasticitet Analysen tillader gyldig og reproducerbar vurdering af neuronal plasticitet som reaktion på forskellige pancreas mikromiljøer. Især giver det simulering af 1) morfologisk neuroplasticitet, dvs ændringer i neuritudvækst, forgrening mønster og neuronal størrelse, og 2) funktionelle neuroplasticitet, dvs ændringer i ophidselse af perifere neuroner. Desuden er det ikke kun perifert (dvs. (fx DRG eller anden orden spinal) neuroner kan indgå i det foreliggende assay for at vurdere deres morfologiske og funktionelle reaktion på forskellige GI væv indhold. I den nuværende video tutorial, vi demonstrere den tekniske protokol for udførelsen af denne analyse og diskutere sine fordele og svagheder. Derudover henleder vi opmærksomheden på anvendeligheden af den grundlæggende opfattelse af denne analyse til studiet af neuroplasticitet i enhver GI orgel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle animalske eksperimentelle procedurer i protokol følger retningslinjerne i Technische Universität München, Tyskland dyrepleje.
1.. Medier / Uddrag Forberedelse
- Tissue homogenisering
Kvaliteten af væv homogenisering er afgørende for den efterfølgende påvisning af neuroplastiske ændringer i de dyrkede neuroner. Her anbefales en homogenisator som muliggør væv dissociation uden større stigning i vævet temperatur.- Overfør 5 mm x 5 mm x 5 mm terninger af pancreasvæv direkte fra -80 ° C til flydende nitrogen og anbringes i en fast fase i vævet homogenator. Den ideelle homogenator ville adskille væv hurtigt nok, uden at lade det defreeze.
- Umiddelbart efter dissociation, resuspender fast, pulver-lignende homogenat i 300-500 ul 0,1 x phosphatbufret saltvand (PBS). Her skal du ikke bruge nogen lysisbuffer (såsom RIPA), da det kan lysere neuroner.
- Centrifuger homogenaterne i mindst 15 minutter ved den maksimale hastighed på din bænk centrifuge (fx 21.130 xg). Saml den klare supernatant, som repræsenterer vævsekstrakt.
- Cellelinie supernatanter
- Lad cellerne af interesse nå op på mindst 70 - 80% konfluens i normalt vækstmedium.
- Normalt er disse medier indeholder serum komponenter, og kan udøve ukontrollerbare virkninger på neuronal vækst. Derfor, efter at nå den ønskede celletæthed, vaske dine celler mindst 3x med celle-kultur kvalitet PBS og placere dem i serum-frit medium (SFM) i op til 48 timer.
Bemærk: Her mener, at nogle celler (ligesom bugspytkirtlen stjerneformige celler), kan have brug for serum i deres vækst medier for at opretholde deres normale tilstand og struktur. I sådanne tilfælde udføre serielle serumfortyndingerne i mediet af cellen af interesse for at finde den lavest mulige indhold nødvendige serum til intakt celle function. - Måle proteinkoncentrationen vævshomogenatet eller cellesupernatanter via Bradford protein assay. Mens disse værdier varierer afhængigt af væv og celler type, pancreas vævsekstrakter, ville man forvente en koncentration på mellem 5-12 mg / ul, og for cellelinie supernatanter mellem 3-8 pg / pl.
2. Alikvote Ekstrakter og cellesupernatanter
Afhængigt af koncentrationen, der skal anvendes i assayet, skal den endelige koncentration af ekstrakten eller supernatant i neuronal medium 100 pg / ml 5,8.
Bemærk: For en assay med neuroner vokser i 500 pi medium i hver brønd i en 24-brønds plade, er man nødt 50 ug protein fra hver ekstrakt eller supernatant pr godt. Ved en typisk ekstrakt koncentration på omkring 10 ug / ul, ville man brug for 5 pi ekstrakt / supernatant for hver brønd. I hvert setting udføres som en tredobbelt, ville det svare til 15 pi ekstrakt / supernatant. For forskellige væv eller celletyper, udføre serielle fortyndinger af det endelige ekstrakt eller supernatant koncentration og sammenligne de observerede neurotrofiske virkninger mellem forskellige ekstrakt / supernatantproteiner koncentrationer.
3.. Isolering af neuroner
Når ekstraktet / supernatant kollektion er færdig, fortsætte med isolering af neuroner.
- For DRG-neuroner, indsamle livmoderhalskræft at lumbal DRG af nyfødte rotter mellem postnatal dag (P) 2-12 efter halshugning og stereomikroskopisk dissektion af DRG (figur 1A). For at have tilstrækkelige DRG neuroner for en 24-brønds plade, indsamle alle livmoderhalskræft til lumbal DRG én nyfødt rotte (svarende 52 DRG) per plade.
- Skær den perifere (neurale) og centrale fremskrivninger (rødder) af DRG ved hjælp af microscissors.
Forlader fremskrivningerne i stedet hæmmer findeling og øger than forurening risiko for kultur ved fibroblaster.
- Skær den perifere (neurale) og centrale fremskrivninger (rødder) af DRG ved hjælp af microscissors.
- For MP neuroner, skåret væk mesenteriet fra tyndtarmen og manuelt og forsigtigt fratage ud seromuscular lag af tyndtarmen (for en detaljeret protokol om MP isolation henvises til Schäfer et al. 9, figur 1B). For MP, indsamle plexus fra to rotter hver 24-godt-plade.
Bemærk: Prøv at være så skånsom som muligt for at undgå tårer i seromuscular lag, da de hindrer dens vellykkede adskillelse fra tyndtarmen. - Saml DRG og seromuscular lag i iskold minimalt essentielt medium (MEM), der leveres med gentamicin (20 mg i 500 ml medium) og metronidazol (2,5 mg i 500 ml medium).
- Efter samling af DRG, inkubere dem i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), der leveres med collagenase type II i 20-30 minutter. For MP isolation, inkuberes i collagenase typen mellem 1-3 timer, afhængigt af alderaf dyret (figur 1C).
- For MP, indsamle netto-lignende MP stykker under stereomikroskop og overføre til iskold MEM.
- Så udriv DRG og MP gennem sprøjter med faldende diameter.
Bemærk: Overdreven trituration kan ødelægge neuroner, men fratrukket gliaceller. - Når mediet indeholdende DRG eller MP er blevet uklart, centrifugeres suspensionen ved 93,9 xg i 5 min, kasseres mellemlang og resuspender i Neurobasal medium (suppleret med 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 0,5 mM L-glutamin og 2% B-27).
- Tæl det samlede antal celler (dvs. neuroner og glia) ved hjælp af et hæmocytometer.
Bemærk: Antallet af nødvendige celler er afhængig af måleparameter. Til kvantificering af neurite tæthed, er man nødt tættere kulturer og dermed et større antal celler end til måling af neuritudvæksten, perikaryonal størrelseog forgrening mønster af individuelle neuroner. For målinger neurite tæthed, brug fx 10.000 celler (neuron + glia) / godt eller 1.500 neuroner / brønd. For morfometri på individuelle neuroner, korte (1 minut-lang) trypsination af celler og såning på 2.500 celler / brønd eller 400 neuroner / anbefales godt. Den typiske udbytte af celler opnået fra en rotte er ca 300,000-500,000 celler. - Frø cellerne på 13 mm dækglas, der er blevet belagt natten før og top brøndene med Neurobasal medium (suppleret med 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 0,5 mM L-glutamin og 2% B-27) (figur 1D).
Bemærk: Brug poly-D-lysin (40 mg / m 2) eller ornithin-og laminin-belagt (1 mg / ml hver) belagt dækglas. Celler tillægger poly-D-lysin ekstremt hurtigt, hvilket gør den velegnet til forsøg, hvor mange celler er nødvendige (dvs. målinger neurit tæthed). Tilknytning til laminin er generelt noglehvad svagere, men laminin er en stærk promotor af neuritudvækst. Derfor, for målinger på neuronal forgrening og neurite længde, foretrækker ornithin / laminin-coating. - Tillad cellerne tillægger brøndene natten over. Den næste dag, forberede ekstrakt-supplerede medier (ved en endelig ekstrakt / supernatant koncentration på 100 ug / ml).
- Aspirer seeding medium, og udføre en valgfri, meget blid vask med PBS, og derefter langsomt pipetteres ekstrakten / supernatant-suppleret medium (figur 1E).
- Lad cellerne vokse i 48 timer. Aspirere medierne og fastsætte i 4% paraformaldehyd til immunfarvning (figur 1F).
- Udfør dobbelt immunfluorescensfarvning ved anvendelse af neuron-specifik (fx beta III-tubulin) og glia-specifikke (f.eks glial fibriallary surt protein / GFAP) markører (fig. 1G).
- For morfometri bruge en omvendt lysmikroskop udstyret med et CCD-kamera i kombination with automatiseret software, der tillader opmåling af neurite densitet (se tabel).
- Den neurite tæthed af neuronale kulturer måles på 4-5 repræsentative mikrofotografier ved 200x forstørrelse fra 4 forskellige regioner i tætteste vækst på hver dækglas ved at lægge en 50 mM x 50 mM gitter og tælle fibertætheden per kvadrat måles i skærende fibre. Neuritudvækst, betyder antallet af filialer pr neuron, kan måles den gennemsnitlige gren længde og perikaryonal størrelse fra tilfældigt udvalgte 30 ensomme neuroner fra hver dækglas ved at markere neurites og perikarya (Figur 1 H).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Morfologisk neuroplasticitet
I den angivne aldersgruppe af nyfødte rotter (P2-12) og seeding tætheder, MP og DRG neuroner allerede opbygge tætte neuronale netværk efter 48 timer (figur 2A). Sammenligning af neurite tæthed mellem neuroner dyrket i PCa, CP, og NP ekstrakter afslører større neurite tæthed af DRG neuroner i PCa eller CP ekstrakter end i NP-ekstrakter (figur 2A) 5.. Vi foretrækker især MP neuroner til målinger på de enkelte neuroner, da MP neuroner tendens til lettere at tage afstand fra de omkringliggende gliaceller end DRG neuroner. Her MP neuroner dyrket i PCA eller CP ekstrakter også bygge længere neurites og udviser en mere kompleks forgrening mønster end MP neuroner vokser i NP-ekstrakt, der indeholder medium (figur 2B) 5.. Fraværet af denne forskel i neuronal morfologi induceret af NP, CP, og PCa udtrækker indikerer et teknisk problem i enssay. I de fleste tilfælde kan det skyldes 1) dårlige kvalitet af den forberedte ekstrakt på grund af lang sagsbehandlingstid eller 2) på grund af skader på neuroner, der opstod under isolation proces.
Funktionelle studier
Den neuroplasticitet assay bærer høj nok følsomhed over for ændringer induceret af tilstedeværelsen eller fraværet af visse målmolekyler af interesse i det supplerede ekstrakter eller supernatanter. For eksempel blokaden af neurotrofisk faktor artemin eller nervevækstfaktor fra PCa celle (PCC) supernatanterne ved tilsætning af særlige blokerende antistoffer NGF eller Dynabead-induceret udtømning af artemin resulterer i dæmpning af neuronale netværk dannelse (Figur 2C) 10. I en nylig undersøgelse, kunne vi vise en meget lignende virkning for bidrag neurotrof faktor Neurturin til neuroplasticitet i CP i samtidige sammenlignet med andre neurotrofiske faktorer, såsom NGF, glia-celle-line-derivudgave neurotrofisk faktor (GDNF) eller transformerende vækstfaktor-beta (TGF-beta) 11.
Glia
Den samme fremgangsmåde kan også anvendes til at vurdere reaktionen af DRG-associeret satellit gliaceller eller enterisk glia til pancreas microenvironmental indhold. Faktisk er en af de mest potente virkninger af PCA vævsekstrakter upon DRG-eller MP-associeret glia er fremtrædende stigning i væksten af glia (figur 3) 5. Desuden er denne effekt er mere udtalt i PCa end i CP. Her bør man overveje at spredning af glia ikke bør bedømmes på grundlag af absolutte glia tæller, men snarere på den relative andel af gliaceller til neuroner (glia-neuron-indeks) 5.. Dette er særlig vigtigt at overveje, da antallet af gliaceller i disse kulturer er mere vanskelig at styre på grund af spredningen styrken af glia i modsætning til neuroner.
Fig. 1. Skematisk protokol af in vitro neuroplasticitet assay. Den foreliggende assay gør brug af nyfødt rotte dorsal rod ganglier (DRG) og myenterisk plexus (MP) neuroner til at studere virkningen af pancreas vævsekstrakter eller cellesupernatanter ved neuronal og glial morfologi. DRG opsamles efter anterior laminektomi og MP-holdige seromuscular lag efter resektion og mekanisk fjernelse af tyndtarmen (A, B). Efter collagenase type II fordøjelse neuroner udsået i den nødvendige densitet (se tekst for detaljer) ad dyrket i 24 timer (C, D). Derefter frisklavet pancreas (eller fra enhver GI orgel af interesse) ekstrakter og cellesupernatanterne tilføjet i vækstmediet af neuroner ved tidligere definerede koncentrationer (E).Efter 48 timer kulturerne fikseret i 4% paraformaldehyd og dobbeltklik immunofarvet mod neuronale og gliale markører (F, G). Den neuronal morfologi, inklusive neurite tæthed, neurale forgrening mønster og perikaryonal størrelse måles ved hjælp af en standardiseret software-protokol (H). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2.. Pancreas neuroplasticitet induceret af bugspytkirtelkræft menneskelig (PCA) og kronisk pancreatitis (KP). Humane pancreas vævsekstrakter kirurgisk stammer fra normal bugspytkirtel (NP), CP eller PCA væv fremkalde fremtrædende forskelle i neurite tætheden af DRG ne urons (A) og i den neuronale forgrening mønster af MP neuroner (B). Her PCA og CP vævsekstrakter udøve en fremtrædende neurotrof virkning på DRG-og MP neuroner. Svarende til vævsekstrakter også supernatanterne fra individuelle celletyper (her bugspytkirtelkræftceller / PCC) også bemærkelsesværdigt øge neurit tætheden af DRG-neuroner (C). Denne stigning er dog reversible, når udvalgte neurotrofiske faktorer såsom artemin (Artn) eller nerve vækstfaktor (NGF) er opbrugt eller blokeret med disse supernatanter. Alle neuroner immunfarvet mod beta-III-tubulin. Alle billeder på 100X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
51049fig3.jpg "/>
Figur 3.. Glial reaktion på pancreas microenvironmental indhold. Pancreasvæv uddrag PCa eller CP væv ikke kun have en neurotrof effekt, men også øge glial vækst og gliale celletal i DRG-eller MP kulturer. Gliaceller immunfarvet mod glia markør glial fibrillært surt protein (GFAP). Alle billeder på 200X forstørrelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nuværende protokol er beregnet til at illustrere den metode bag in vitro pancreas neuroplasticitet assay som for nylig blev udviklet af vores gruppe til at studere mekanismerne i neuroplasticitet i PCa og CP 5.. Protokollen indebærer en tre-dages procedure, som let kan anvendes, når den udøvende kunstner har fået tilstrækkelig erfaring i isolering og dyrkning af DRG og MP neuroner. Desuden repræsenterer et værdifuldt værktøj til at studere samtidig reaktion af enteriske og DRG-associeret glia til pancreas microenvironmental komponenter.
Efter vores mening en af de mest interessante funktioner i denne analyse er dens evne til at opdage og simulere ændringer, der opstår under PCa og CP (dvs. neurale spiring og hypertrofi) i en forenklet in vitro indstilling. Faktisk anvendelse af vævsekstrakter eller cellesupernatanterne resulterer i ændringer i neuronal morfologi which kan påvises med tilstrækkelig følsomhed ved hjælp af systematisk morfometriske analyse. For nylig kunne vi også vise, at denne analyse er også følsom til at påvise forskelle i neurotrofe potentiale af flere kræft enheder i samtidige sammenligning: Når neurotrofiske egenskaber PCA cellelinier blev sammenlignet med cellelinjer fra tyktarms-og endetarmskræft, PCA cellelinjer inducerede markant større neuritlængder tætheder blandt DRG neuroner end kolorektal cancer linje 8. Selv i sammenligning af rektal vs tyktarmskræft cellelinjer, tyktarmskræft cellelinjer var ringere end rektal kræftceller i form af deres neuroplastiske potentiale 8..
En af de vigtigste fordele ved denne analyse er dens let tilgængelighed for ikke kun morfometrisk, men også elektrofysiologiske analyser. I modsætning til in situ neuroner i skive præparater, optagelser fra neuroner i vores analyse inden for definerede medier eller i etbsence / over-tilstedeværelse af definerede faktorer er teknisk set ikke krævende og kan levere værdifulde oplysninger om den rolle af udvalgte molekyler i disse mikromiljøer på neuronal aktivitet.
Bestemt, bør den præsenterede analyse ikke anses at være udelukkende begrænset til studiet af spørgsmål relateret til pancreas neuroplasticitet. Neuroplasticitet er et fremtrædende træk i hele mavetarmkanalen under patologiske tilstande, såsom inflammatoriske enteriske neuropatier 1-3. Alle disse betingelser blev rapporteret til at være forbundet med ændringer i innervation morfologi og ændret neuronal aktivitet 1-3. Derfor er det tænkeligt at erstatte pancreas vævsekstrakter eller cellelinjer af dem, der stammer fra de tilsvarende væv og studere deres specifikke virkning på neuroner og ledsagende glia. Vores seneste analyser i sammenligningen af pancreas og kolorektal cancer væv understøtte denne opfattelse 8. Men det er også rimeligt at assume, at komponenter af forskellige væv mikromiljøer kan ikke fremkalde så følsomme og repræsentative ændringer, som vi rutinemæssigt observere i pancreas væv komponenter. Vi anbefaler derfor, den tidligere omfattende vurdering af neuronal morfologi induceret af "positive" kontrol væv (dvs. væv med fx histologisk påvist neural hypertrofi) versus "negative" kontrol væv (dvs. uden nogen histologiske tegn for neural hypertrofi).
Vores tidligere analyser på reaktionen af glia i denne analyse var begrænset til fastsættelsen af gliale celletal i forskellige pancreas mikromiljøer. Gliaceller besidder stigende betydning i neurobiologi, da anerkendelsen af deres neurogen potentiale og øget interesse for calcium strømme langs glial membran 12. Derfor gliaceller i dette assay er også let tilgængelige for yderligere funktionelle analyseraf nye metoder. Men sådanne yderligere innovative tilgange brug tidligere omfattende validering, før deres ansøgning om yderligere undersøgelser.
Som enhver anden eksperimentel analyse, også præsenterede neuroplasticitet analysen bærer en vis begrænset sammenlignelighed af humane vævsprøver opnået fra forskellige patienter, der gennemgår kirurgi. Det er bydende nødvendigt for disse væv at være afledt af samme væv regioner (f.eks pancreas hoved, fra de vigtigste tumor masse) for pålidelige analyser 1. Selv når denne forudsætning er opfyldt, yderligere forskelle i væv eller tumor biologi kan ikke udelukkes i betragtning af den store variation i den biologiske reaktion mønster af forskellige personer 1. For at omgå disse individuelle væv forskelle, anbefaler vi udførelsen af analysen med væv fra så mange patienter som muligt, dvs med mindst 5 - 10 forskellige patienter per enhed.
Som central teknisk aspekt, vil vi gerne henlede opmærksomheden på den rolle, som belægning stoffer neuronal vækst. Som også nævnt ovenfor, foretrækker vi poly-D-lysin til målinger på neurite tæthed, og ornithin / laminin belægning for dem på individuel neuronal forgrening / udvækst mønster. I vores hænder, mens målingen af neuronal udvækst kan også udføres på poly-D-lysin-dækkede overflader, finder vi, at denne fremgangsmåde har tendens til at nedsætte følsomheden af analysen for de faktiske forskelle. Derfor bør forskere anvender dette assay sikre brugen af optimale coating-materiale til deres spørgsmål af interesse.
Sammenfattende mener vi, at den præsenterede neuroplasticitet analysen udgør et værdifuldt redskab til at opnå hurtig og reproducerbar oplysninger om neuro-morfologi og neuro-funktion i forskellige væv mikromiljøer, som demonstreret i eksemplet medpancreasvæv. Den følsomme påvisning af forskelle i neuro-morfologi som fremkaldt af forskellige pancreasvæv indhold understreger in vitro reproducerbarhed af pancreas neuroplasticitet i human PCa og CP. Fremtidige indsats skal sigte mod optimeret preassay screening af anvendte supernatanter og ekstrakter til at opnå den bedst defineres medier til studiet af GI-sygdom-associeret neuroplasticitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende interesser og ingen finansielle oplysninger.
Acknowledgments
Alle forfattere har bidraget til etablering og validering af den præsenterede analyse og til udkastet af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13 mm Coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life Sciences | 21103-049 | |
| B-27 Supplement | Gibco/Life Sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life Sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200 U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco/Life Sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
- Demir, I. E., Schafer, K. H., Tieftrunk, E., Friess, H., Ceyhan, G. O. Neural plasticity in the gastrointestinal tract: chronic inflammation, neurotrophic signals, and hypersensitivity. Acta Neuropathol. 125, 491-509 (2013).
- Vasina, V., et al. Enteric neuroplasticity evoked by inflammation. Auton. Neurosci. 126-127, 264-272 (2006).
- Lomax, A. E., Fernandez, E., Sharkey, K. A. Plasticity of the enteric nervous system during intestinal inflammation. Neurogastroenterol. Motil. 17, 4-15 (2005).
- Demir, I. E., et al. Neural Invasion in Pancreatic Cancer: The Past, Present and Future. 2, 1513-1527 (2010).
- Demir, I. E., et al. The microenvironment in chronic pancreatitis and pancreatic cancer induces neuronal plasticity. Neurogastroenterol. Motil. 22, 480-490 (2010).
- Schafer, K. H., Mestres, P. The GDNF-induced neurite outgrowth and neuronal survival in dissociated myenteric plexus cultures of the rat small intestine decreases postnatally. Exp. Brain Res. 125, 447-452 (1999).
- Schafer, K. H., Van Ginneken, C., Copray, S. Plasticity and neural stem cells in the enteric nervous system. Anat. Rec. 292, 1940-1952 (2009).
- Liebl, F., et al. The severity of neural invasion is associated with shortened survival in colon cancer. Clin. Cancer Res. 19, 50-61 (2012).
- Schäfer, K. H., Saffrey, M. J., Burnstock, G., Mestres-Ventura, P. A new method for the isolation of myenteric plexus from the newborn rat gastrointestinal tract. Brain Res. Brain Res. Protoc. 1, 109-113 (1997).
- Ceyhan, G. O., et al. Nerve growth factor and artemin are paracrine mediators of pancreatic neuropathy in pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. 251, 923-931 (2010).
- Demir, I. E., et al. Neuronal plasticity in chronic pancreatitis is mediated via the neurturin/GFRalpha2 axis. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 303, 1017-1028 (2012).
- Joseph, N. M., et al. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
