Simulazione pancreatica neuroplasticità: Published: April 14, 2014 doi: 10.3791/51049

DOI

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Ihsan Ekin Demir¹, Elke Tieftrunk¹, Karl-Herbert Schäfer², Helmut Friess¹, Güralp O. Ceyhan¹

¹Department of Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, ²Department of Biotechnology, University of Applied Sciences Kaiserslautern/Zweibrücken

Summary

Plasticità neuronale è una caratteristica del tratto gastrointestinale (GI) sempre più riconosciuta, ma non sufficientemente compreso. Qui, nell'esempio di disturbi pancreatici umani, presentiamo un neuroplasticity saggio in vitro per lo studio della plasticità neuronale nel tratto GI a livello sia morfologica e funzionale.

Abstract

Neuroplasticità è una caratteristica intrinseca del sistema e gastrointestinale (GI) innervazione nervoso enterico in condizioni patologiche. Tuttavia, il ruolo fisiopatologico delle neuroplasticità nei disturbi gastrointestinali rimane sconosciuto. Nuovi modelli sperimentali che consentono la simulazione e la modulazione di GI neuroplasticità possono consentire maggiore apprezzamento per il contributo della neuroplasticità in particolare le malattie gastrointestinali come il cancro del pancreas (PCA) e pancreatite cronica (CP). Qui vi presentiamo un protocollo per la simulazione della neuroplasticità del pancreas in condizioni in vitro utilizzando neonato gangli delle radici dorsali di ratto (DRG) e plesso mioenterico (MP) neuroni. Questo approccio dual-neurone permette non solo il controllo di entrambi neuroplasticità organo intrinseca ed estrinseca-, ma rappresenta anche un valido strumento per valutare la morfologia neuronale e gliale e di elettrofisiologia. Inoltre, consente la modulazione funzionale dei contenuti del microambiente forniti per studiare la loro IMPACt sulla neuroplasticità. Una volta stabilito, il presente saggio neuroplasticity porta il potenziale di essere applicabile allo studio della neuroplasticità in qualsiasi organo GI.

Introduction

Alterazioni nei gastrointestinale (GI) morfologia del nervo e la densità hanno catturato l'attenzione di gastroenterologi e patologi per molto tempo, ma la loro rilevanza per la fisiopatologia delle malattie gastrointestinali rimane sconosciuta ^1-3. Infatti, alcuni disturbi gastrointestinali molto comuni come la gastrite, esofagite da reflusso, colite, diverticolite e appendicite sono associati ad un aumento della densità innervazione nelle aree di tessuto infiammato ^1. Tuttavia, nessuna vera attenzione è stata finora versati ai meccanismi e significato della neuroplasticità nel tratto GI. Sei nervi GI morfologicamente alterati differiscono dalle normali nervi GI, cioè lo stato normale del sistema nervoso enterico, in termini della loro funzione? Quali sono le implicazioni di alterata contenuti neuropeptide / neurotrasmettitore nei nervi enterici di plastica? Fa neuroplasticità periferica comporta sempre la segnalazione alterata al sistema nervoso centrale? E dove sono le proiezioni centrali di Extri plasticaNSIC percorsi neurali GI? Una lunga serie di questioni fondamentali possono essere facilmente generati quando si guarda la scarsità delle nostre conoscenze sugli aspetti funzionali di GI neuroplasticità.

Lo studio di GI neuroplasticità a livello funzionale richiede modelli sperimentali validi, riproducibili e ancora facilmente applicabili. In un'epoca di crescente popolarità e l'accettazione di modelli geneticamente condizionato mouse (GECoMM), come nelle impostazioni vivo portano il potenziale per chiarire gli aspetti sconosciuti di GI neuroplasticità in modo realistico ^1. Tuttavia, la progettazione e la produzione di GECoMM resta costoso, alta intensità di lavoro e, soprattutto, in termini di tempo. Inoltre, essi richiedono a priori selezione del bersaglio da condizionale modulato nel topo geneticamente alterato (ad es transgenico sovraespressione del fattore di crescita nervoso / NGF in cellule epiteliali enterici). Quindi, per il design di un GECoMM di successo, i ricercatori hanno bisogno di alcuni indicatori (ad esempio, dati sperimentali precedenti) di un obiettivo utile, vale a dire che la molecola di interesse (qui NGF) può almeno aspettare di esercitare alcuni effetti biologicamente rilevanti sui nervi GI.

Tali indicatori possono essere facilmente derivate da adeguata in modelli in vitro in cui sottotipi di cellule isolate dal complesso microambiente di un sistema in vivo possono essere selettivamente co-coltivate in maniera eterotipica ^4-7. La modulazione di bersagli molecolari in un tale ambiente cultura eterotipica è in media tecnicamente meno ingombrante, più veloce, e può quindi aiutare nella prefiltraggio degli obiettivi validi per la verifica in studi in vivo.

Recentemente, abbiamo presentato un test in vitro neuroplasticità in cui è stato progettato per simulare la maggiore densità neurale e ipertrofia delle ne intrapancreaticarves nel cancro del pancreas umano (PCA) e pancreatite cronica (CP) tessuti. Qui, i neuroni derivati ​​da neonato di ratto gangli spinali (DRG) o plesso mioenterico (MP) sono stati esposti a estratti di tessuto da PCa chirurgicamente asportato o CP tessuti esemplari e rispetto a quelle coltivate in normali pancreas umano (NP) estratti di tessuto ^5. Invece di estratti di tessuto, si può anche utilizzare supernatanti della linea cellulare di studiare l'impatto di tipi cellulari selezionati TG. Quando combinato con una misurazione morfometrica standardizzato, il saggio neuroplasticità presentata consente di valutare valido e riproducibile di plasticità neuronale in risposta a diversi microambienti pancreatiche. In particolare, esso consente la simulazione di 1) neuroplasticity morfologica, cioè i cambiamenti nella crescita dei neuriti, ramificazione e dimensione neuronale, e 2) neuroplasticity funzionale, cioè alterazioni nella eccitabilità dei neuroni periferici. Inoltre, non solo periferica ( (es. DRG o spinale secondo ordine) neuroni possono essere incluse nella presente saggio per valutare la loro reazione morfologica e funzionale a diversi contenuti di tessuto GI. Nel presente tutorial video, dimostriamo il protocollo tecnico per l'esecuzione di questo saggio e discutere i suoi vantaggi e debolezze. Inoltre, attiriamo l'attenzione sulla applicabilità del concetto di base di questo test allo studio della neuroplasticità in qualsiasi organo GI.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali animali nel protocollo seguono le linee guida per la cura degli animali della Technische Universität München, Germania.

1. Media / Estratto di preparazione

1. Tissue omogeneizzazione
   La qualità di omogeneizzazione tessuto è fondamentale per la successiva rivelazione di alterazioni neuroplastici nei neuroni in coltura. Qui, un omogeneizzatore è raccomandato che consente dissociazione tessuto senza grande aumento della temperatura del tessuto.
   1. Trasferire 5 x 5 mm x 5 mm cubi di tessuto pancreatico direttamente da -80 ° C in azoto liquido e posto in una fase solida nel homogenator tessuto. Il homogenator ideale sarebbe dissociare il tessuto abbastanza veloce, senza farlo scongelare.
   2. Subito dopo dissociazione, risospendere il solido, omogenato polverulenti in 300-500 ml di 0.1x tampone fosfato salino (PBS). Qui, non utilizzare alcun tampone di lisi (come RIPA), in quanto puo 'lisi i neuroni.
   3. Centrifugare le omogeneizzati per almeno 15 minuti alla velocità massima del centrifuga da banco (es. 21.130 xg). Raccogliere il surnatante chiaro che rappresenta l'estratto del tessuto.
2. Supernatanti della linea cellulare
   1. Lasciate che le cellule di interesse raggiungono almeno il 70-80% di confluenza nel normale terreno di crescita.
   2. Di solito, questi mezzi contengono componenti siero e possono esercitare effetti incontrollabili sulla crescita neuronale. Pertanto, dopo aver raggiunto la densità cellulare desiderato, lavare le cellule almeno 3x con la coltura cellulare grade PBS e metterli in mezzo privo di siero (SFM) per un massimo di 48 ore.
      Nota: Qui, ritengono che alcune cellule (come le cellule stellate pancreatiche) possono avere bisogno di siero nel loro terreni di crescita, al fine di mantenere il loro stato e la struttura normale. In tali casi, eseguire diluizioni seriali di siero nel mezzo della cella di interesse al fine di trovare il possibile contenuto siero minima necessaria per funzio cellula intattan.
   3. Misurare la concentrazione proteica del tessuto omogenato o surnatanti cellulari tramite Bradford protein assay. Mentre questi valori variano a seconda del tipo di tessuto e di cellule, per gli estratti di tessuto pancreatico, ci si aspetterebbe un intervallo di concentrazione tra 5-12 mg / mL, e per supernatanti della linea cellulare tra 3-8 mg / mL.

2. Aliquota Estratti e surnatanti cellulari

A seconda della concentrazione da utilizzare nel saggio, la concentrazione finale dell'estratto o surnatante nel mezzo neuronale dovrebbe essere 100 pg / ml ^5,8.

Nota: Per un saggio con i neuroni crescono in 500 microlitri di media in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, uno ha bisogno di 50 mg di proteina da ogni estratto o surnatante per pozzetto. In una tipica concentrazione estratto di circa 10 mg / mL, uno avrebbe bisogno 5 ml di estratto / surnatante per ciascun bene. In ogni Setting esibito come triplice copia, questo corrisponderebbe a 15 ml di estratto / surnatante. Per i diversi tipi di tessuti o cellule, eseguire diluizioni seriali dell'estratto finale o la concentrazione surnatante e confrontare gli effetti neurotrofici osservati tra le diverse concentrazioni di estratto / surnatante.

3. Isolamento di neuroni

Dopo la raccolta estratto / supernatante è finito, proseguire con isolamento di neuroni.

1. Per neuroni DRG, raccogliere la cervicale lombare DRG di ratto appena nati tra il giorno postnatale (P) 2-12 dopo la decapitazione e la dissezione stereomicroscopio di DRG (Figura 1A). Al fine di avere i neuroni DRG sufficienti per una piastra a 24 pozzetti, raccogliere tutte cervicale per lombare DRG di un ratto neonato (pari a 52 DRG) per piastra.
   1. Tagliare la periferica (neurale) e le proiezioni centrali (radici) di DRG per mezzo di microscissors.
      Lasciando le proiezioni in luogo impedisce triturazione e aumenta tegli contaminazione rischio di cultura da parte dei fibroblasti.
2. Per neuroni MP, tagliare via il mesentere dal piccolo intestino e manualmente e togliere accuratamente lo strato seromuscular del piccolo intestino (per un protocollo dettagliato sull'isolamento MP, consultare Schäfer et al. ^9, Figura 1B). Per MP, raccogliere il plesso di due ratti per 24 pozzetti.
   Nota: Cercate di essere i più dolci possibili al fine di evitare strappi nel livello seromuscular in quanto impediscono la sua separazione con successo dal piccolo intestino.
3. Raccogliere il DRG e lo strato seromuscular in terreno minimo essenziale ghiacciata (MEM) fornito con gentamicina (20 mg in mezzo 500ml) e metronidazolo (2,5 mg in 500 ml di mezzo).
4. Dopo la raccolta di DRG, incubare in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) fornito con collagenasi di tipo II per 20-30 min. Per l'isolamento MP, incubare in collagenasi tipo fra 1-3 ore, a seconda dell'etàdell'animale (Figura 1C).
5. Per MP, raccogliere i MP pezzi netti come sotto stereomicroscopio e trasferimento MEM ghiacciata.
6. Poi triturare il DRG e MP attraverso siringhe con diametro decrescente.
   Nota: triturazione eccessiva può distruggere i neuroni, ma al netto delle cellule gliali.
7. Una volta che il terreno contenente il DRG o MP è diventata torbida, centrifugare la sospensione a 93,9 xg per 5 min, eliminare il mezzo e risospendere in Neurobasal medio (integrato con 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, L-glutamina 0,5 mm e 2% B-27).
8. Contare il numero totale di cellule (cioè neuroni e glia) mediante un emocitometro.
   Nota: Il numero di cellule necessarie dipende dal parametro di misura. Per la quantificazione della densità neurite, bisogna culture più dense e quindi un maggior numero di cellule che per la misura della crescita dei neuriti, dimensione perikaryonale la ramificazione modello di singoli neuroni. Per le misurazioni della densità dei neuriti, utilizzare ad esempio 10.000 cellule (neuroni + glia) e / o di 1.500 neuroni / e. Per la morfometria su singoli neuroni, breve (1 minuto a lungo) trypsination delle cellule e semina di cellule 2.500 / e o 400 neuroni / bene è raccomandato. La resa tipica di cellule ottenute da un ratto è di circa 300.000-500.000 cellule.
9. Seed le cellule su 13 vetrini mm che sono state rivestite la sera prima e l'alto i pozzetti con Neurobasal medio (integrato con 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina, 0.5 mM L-glutammina e il 2% B-27) (Figura 1D).
   Nota: Utilizzare poli-D-lisina (40 mg / m ²⁾ OR-ornitina e scivola copertura laminina rivestite (1 mg / ml ciascuna) rivestito. Cellule attribuiscono alla poli-D-lisina estremamente veloce, rendendo così adatto per esperimenti che richiedono molte cellule (cioè misurazioni di densità neurite). L'attaccamento al laminina è in qualche generalequello più debole, ma laminina è un forte promotore di crescita dei neuriti. Pertanto, per misure su ramificazione neuronale e la lunghezza dei neuriti, preferire ornitina / laminina-coating.
10. Consentire alle cellule attribuiscono ai pozzetti durante la notte. Il giorno successivo, preparare il dispositivo estratto supplementato (ad una concentrazione finale estratto / supernatante di 100 pg / ml).
11. Aspirare il mezzo semina, ed eseguire, lavaggio molto delicato opzionale con PBS, e poi lentamente pipetta media estrarre / surnatante-integrato (Figura 1E).
12. Lasciate che le cellule crescono per 48 ore. Aspirare i media e fissare nel 4% paraformaldeide per immunoistochimica (Figura 1F).
13. Eseguire doppia immunofluorescenza utilizzando neurone-specifico (ad esempio beta-tubulina III) e glia-specifica (ad esempio gliale fibriallary proteina acida / GFAP) marcatori (Figura 1G).
14. Per morfometria, utilizzare un microscopio ottico invertito dotato di una fotocamera CCD in combinazione with software automatizzato che consente la misurazione della densità dei neuriti (vedi tabella).
15. La densità neurite delle culture neuronali viene misurata su 4-5 microfotografie rappresentative a 200x ingrandimenti da 4 diverse regioni di crescita più densa su ogni vetrino sovrapponendo 50 micron x 50 micron griglia e contare la densità delle fibre per metro quadrato misurato in fibre di intersezione. Crescita dei neuriti, il numero di sportelli per neurone dire, la lunghezza del ramo media e la dimensione perikaryonal possono essere misurati da selezionati in modo casuale 30 neuroni solitarie di ogni vetrino contrassegnando le neuriti e perikarya (Figura 1H).

Representative Results

Neuroplasticità morfologica

Nella fascia di età indicata di ratti neonati (P2-12) e le densità di semina, MP e DRG neuroni già costruiscono reti neuronali dense dopo 48 ore (Figura 2A). Confronto di densità neurite tra neuroni coltivati ​​in CaP, CP, e estratti NP rivela maggiore densità neuriti dei neuroni DRG PCA o estratti CP rispetto estratti NP (Figura 2A) ^5. Abbiamo particolarmente preferiamo i neuroni MP per misure su singoli neuroni, dal momento che i neuroni MP tendono a dissociarsi più facilmente da circostanti cellule gliali che neuroni DRG. Qui, MP neuroni coltivati ​​in estratti prostatico o CP anche costruire neuriti più lunghi e presentano un modello di ramificazione più complesso di neuroni MP crescente in NP-estratto contenente medio (Figura 2B) ^5. L'assenza di questa differenza nella morfologia neuronale indotta da NP, CP, e PCA estrae indica un problema tecnico in unssay. Nella maggior parte dei casi, questo può essere dovuto a 1) scarsa qualità dell'estratto preparato a causa del tempo di elaborazione lungo o 2) a causa di danni ai neuroni che si sono verificati durante il processo di isolamento.

Studi funzionali

Il saggio neuroplasticity reca sensibilità sufficientemente elevata per rilevare alterazioni indotte dalla presenza o assenza di certe molecole bersaglio di interesse negli estratti o surnatanti completata. Ad esempio, il blocco del fattore Artemin o nervo fattore neurotrofico crescita da cellule PCA (PCC) surnatanti aggiungendo anticorpi bloccanti specifici per NGF o dynabead indotta deplezione dei risultati Artemin in attenuazione di formazione delle reti neuronali (Figura 2C) ^10. In un recente studio, abbiamo potuto mostrare un effetto molto simile per il contributo del fattore neurotrofico Neurturin a neuroplasticity in CP in confronto simultaneo con altri fattori neurotrofici come NGF, cellule gliali-line-derived il fattore neurotrofico (GDNF) o fattore di crescita trasformante-beta (TGF-beta) ^11.

Glia

Lo stesso approccio può essere applicato anche per valutare la reazione delle cellule gliali satelliti DRG-associato o glia enterica ai contenuti microambientali pancreatici. Infatti, uno degli effetti più potenti di estratti tissutali APC, alla glia DRG-o MP-associata è prominente incremento nella crescita della glia (Figura 3) ^5. Inoltre, questo effetto è più pronunciato in CaP rispetto al CP. Qui, si dovrebbe considerare che la proliferazione della glia non dovrebbe essere giudicata sulla base di conteggi glia assolute, ma piuttosto sulla proporzione relativa di cellule gliali ai neuroni (glia-neuroni-index) ^5. Ciò è particolarmente importante considerare quanto il numero di cellule gliali in queste culture è più difficile da controllare a causa della potenza proliferazione di glia al contrario di neuroni.

Figura 1. Schema di protocollo del test neuroplasticità in vitro. La presente analisi si avvale del neonato gangli di ratto radice dorsale (DRG) e plesso mioenterico (MP) neuroni per studiare l'impatto di estratti di tessuto pancreatico o surnatanti cellulari sulla morfologia neuronale e gliale. DRG raccolti dopo laminectomia anteriore e MP-strato contenente seromuscular dopo resezione e strippaggio meccanica del piccolo intestino (A, B). Dopo collagenasi di tipo II digestione, i neuroni sono seminate nella densità necessaria (vedi testo per i dettagli) annuncio coltivato per 24 ore (C, D). Poi, il pancreas appena preparata (o da qualsiasi organo GI di interesse) estratti e supernatanti cellulari sono aggiunti nel mezzo di crescita di neuroni a concentrazioni precedentemente definiti (E).Dopo 48 ore, le colture sono fissati in paraformaldeide al 4% e doppio immunostained contro marcatori neuronali e gliali (F, G). La morfologia neuronale, compresa la densità dei neuriti, neurale modello ramificazione e dimensione perikaryonal sono misurati per mezzo di un protocollo software standardizzato (H). Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Neuroplasticità del pancreas indotta da cancro umano del pancreas (PCA) e pancreatite cronica (CP). Estratti di tessuti pancreatici umani chirurgicamente derivano dal pancreas normale (NP), CP o tessuti PCa indurre differenze di rilievo nella densità neurite del DRG ne urons (A) e nel modello di ramificazione neuronale dei neuroni MP (B). Qui, estratti di tessuto prostatico e CP esercitano un effetto neurotrofico di primo piano su DRG e MP neuroni. Simili estratti tissutali, anche i surnatanti di tipi di cellule singole (cellule tumorali pancreatiche qui / PCC) anche notevolmente aumentare la densità dei neuriti dei neuroni DRG (C). Tale incremento, tuttavia, è reversibile quando i fattori neurotrofici selezionati quali artemin (ARTN) o fattore di crescita nervoso (NGF) sono esaurite o bloccati con questi surnatanti. Tutti i neuroni immunostained contro il beta-III-tubulina. Tutte le immagini a ingrandimento 100X. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Reazione gliale ai contenuti del microambiente del pancreas. Estratti di tessuto pancreatico da PCa o ​​tessuti CP non hanno solo un effetto neurotrofico, ma anche migliorare la crescita gliale e conta delle cellule gliali in colture di DRG o MP. Cellule gliali immunostained contro il marker gliale fibrillare glia proteina acida (GFAP). Tutte le immagini a 200 ingrandimenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il presente protocollo ha lo scopo di illustrare la metodologia alla base del pancreas test neuroplasticità in vitro che è stato sviluppato recentemente dal nostro gruppo per studiare i meccanismi di neuroplasticità in PCa e CP ^5. Il protocollo prevede una procedura in tre giorni, che può essere facilmente applicato una volta l'artista ha maturato un'esperienza sufficiente per l'isolamento e la cultura del DRG e MP neuroni. Inoltre, esso rappresenta un valido strumento per studiare la reazione concomitante di enterica e glia DRG associati ai componenti microambientali pancreatiche.

A nostro parere, una delle caratteristiche più interessanti di questo test è la sua capacità di individuare e simulare le alterazioni che si verificano durante PCa e CP (cioè germinazione neurale e ipertrofia) in un ambiente semplificato in vitro. Infatti, l'applicazione di estratti di tessuto o supernatanti cellulari provoca cambiamenti nella morfologia neuronale which può essere rilevato con sufficiente sensibilità per mezzo di analisi sistematica morfometrica. Recentemente, potremmo anche dimostrare che questo saggio è anche sensibile per rilevare le differenze di potenziale neurotrofico di diverse entità del cancro in confronto simultaneo: Quando gli attributi neurotrofici di linee cellulari prostatico è stato confrontato con linee cellulari da tumori colorettali, linee cellulari prostatico indotto significativo maggiore densità neuriti tra i neuroni DRG di linee di cancro del colon-retto ^8. Anche nel confronto dei rettale contro linee cellulari di cancro del colon, cancro del colon linee cellulari erano inferiori alle cellule tumorali rettali in termini di potenziale neuroplastico ^8.

Uno dei principali vantaggi di questo test è la sua facile accessibilità non solo per morfometrica, ma anche analisi elettrofisiologiche. Al contrario di neuroni in situ in fettine, le registrazioni da neuroni nel nostro test all'interno di supporti definiti o in unbsence / over-presenza di fattori di cui non sono tecnicamente esigente e in grado di fornire informazioni preziose sul ruolo delle molecole selezionate in questi microambienti sull'attività neuronale.

Certo, il saggio presentato non deve essere considerato da solo limitata allo studio delle questioni relative alla neuroplasticità del pancreas. Neuroplasticità è una caratteristica importante di tutto il tratto gastrointestinale in condizioni patologiche, come le neuropatie infiammatorie intestinali ^1-3. Sono stati segnalati Tutte queste condizioni per essere associate a cambiamenti di innervazione morfologia e alterata attività neuronale ^1-3. Quindi, è concepibile sostituire estratti tessuto pancreatico o linee cellulari da quelli derivati ​​dai tessuti corrispondenti e studiare il loro impatto specifico neuroni e glia accompagnamento. Le nostre recenti analisi sulla comparazione dei tessuti di cancro del pancreas e del colon-retto supportano questa nozione ^8. Tuttavia, è anche plausibile assume che i componenti di differenti microambienti tessuto non possono indurre alterazioni come sensibili e rappresentative come noi abitualmente osserviamo in componenti del tessuto pancreatico. Pertanto, si consiglia la precedente un'ampia valutazione della morfologia neuronale indotta da tessuti di controllo "positivi" (cioè con tessuti ad esempio istologicamente dimostrato ipertrofia neuronale) rispetto a tessuti di controllo "negativi" (cioè senza evidenza istologica di ipertrofia neurale).

I nostri ex-analisi sulla reazione della glia in questo saggio sono stati limitati alla determinazione della conta delle cellule gliali in differenti microambienti pancreatiche. Cellule gliali possiedono importanza emergente in neurobiologia quanto il riconoscimento del loro potenziale neurogena e crescente interesse correnti di calcio lungo membrana gliale ^12. Pertanto, le cellule gliali in questo saggio sono facilmente raggiungibili a ulteriori analisi funzionalida nuovi approcci. Tuttavia, tali approcci innovativi sono necessarie ulteriori precedente vasta convalida prima della loro applicazione per ulteriori studi.

Come qualsiasi altro saggio sperimentale, anche il saggio neuroplasticity presentato porta qualche comparabilità limitato di campioni di tessuti umani ottenuti da diversi pazienti sottoposti a chirurgia. E 'imperativo per questi tessuti che derivano dalle regioni stesse di tessuto (ad es testa del pancreas, dalla massa tumorale principale) per le analisi affidabili ^1. Inoltre, anche quando questo requisito è soddisfatto, ulteriori differenze nel tessuto o biologia del tumore non si possono escludere considerando la grande variazione nel modello di risposta biologica di diversi individui ^1. Per ovviare a queste differenze individuali di tessuto, si consiglia l'esecuzione del test con i tessuti ottenuti da altrettanti pazienti possibile, cioè con almeno 5-10 pazienti differenti per entità.

Come un aspetto tecnico fondamentale, vorremmo richiamare l'attenzione sul ruolo delle sostanze di rivestimento sulla crescita neuronale. Come già menzionato in precedenza, preferiamo poli-D-lisina per misure su densità neuriti, e rivestimento ornitina / laminina per chi individuo neuronale modello di ramificazione / escrescenza. Nelle nostre mani, mentre la misura di escrescenza neuronale può anche essere effettuata sul-lisina coperte poli-D superfici, troviamo che questo approccio tende a diminuire la sensibilità del saggio per le differenze reali. Pertanto, i ricercatori che applicano questo dosaggio devono garantire l'utilizzo del materiale di rivestimento ottimale per la loro domanda di interesse.

In sintesi, riteniamo che il saggio neuroplasticità presentato rappresenta uno strumento prezioso per ottenere informazioni veloci e riproducibili sulla neuro-morfologia e neuro-funzione in differenti microambienti tessuto, come dimostra l'esempio ditessuto pancreatico. La rivelazione sensibile delle differenze di neuro-morfologia indotta dai diversi contenuti tessuto pancreatico sottolinea la riproducibilità in vitro di neuroplasticità del pancreas in PCa umano e CP. Gli sforzi futuri mirano allo screening preassay ottimizzata di surnatanti applicate ed estrae per raggiungere la media più definito per lo studio dei GI-malattia-associata neuroplasticità.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P1149
Ornithine/laminin	Sigma-Aldrich	P2533/L4544
13 mm Coverslips	Merck		For use in 24-well plates
Dismembranator S	Sartorius
Anti-Beta-III-tubulin antibody	Millipore	MAB1637	1:200 concentration
Anti-GFAP-antibody	DAKO	M0761	1:400 concentration
RIPA buffer + protease inhibitor			Any supplier
Neurobasal medium	Gibco/Life Sciences	21103-049
B-27 Supplement	Gibco/Life Sciences	17504044	Quality of B-27 is known to depend on the lot number
Gentamicin/Metronidazol			Any supplier
Minimal essential medium	Gibco/Life Sciences	31095-029
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco/Life Sciences	24020133	Improves collagenase activity when containing Ca/Mg
Collagenase type II	Worthington Biochemical	CLS-2	Obtain lots with at least 200 U/mg activity
Trypsin-EDTA 0.25%	Gibco/Life Sciences	25200056
4% Paraformaldehyde			Any supplier
analySIS docu software	Olympus