Summary
Plasticidade neuronal é uma característica cada vez mais reconhecida, mas não suficientemente entendido do gastrointestinal (GI). Aqui, no exemplo de desordens pancreáticas humanas, apresentamos um ensaio neuroplasticidade in vitro para o estudo da plasticidade neuronal no tracto gastrointestinal, a nível tanto morfológica e funcional.
Abstract
A neuroplasticidade é uma característica inerente do sistema e gastrointestinal (GI) inervação nervoso entérico em condições patológicas. No entanto, o papel fisiopatológico neuroplasticidade em doenças GI permanece desconhecido. Novos modelos experimentais que permitem a simulação e modulação da GI neuroplasticidade pode permitir apreciação aprimorada da contribuição da neuroplasticidade em doenças gastrointestinais particulares, tais como o câncer de pâncreas (PCA) e pancreatite crônica (PC). Aqui, apresentamos um protocolo para a simulação da neuroplasticidade pancreático em condições in vitro, utilizando-nascido gânglios rato dorsal root (DRG) e plexo mioentérico (PM) neurônios. Esta abordagem dual-neurônio não só permite a monitorização de ambos neuroplasticidade órgão intrínseca e extrínseca, como também representa uma ferramenta valiosa para avaliar a morfologia neuronal e glial e eletrofisiologia. Além disso, permite a modulação funcional de conteúdos microenvironmental fornecidos para o estudo de sua Impact em neuroplasticidade. Uma vez estabelecido, o ensaio neuroplasticidade presente traz o potencial de ser aplicável ao estudo de qualquer órgão em neuroplasticidade GI.
Introduction
Alterações no (GI) morfologia gastrointestinal nervo e densidade chamaram a atenção de gastroenterologistas e patologistas por um longo tempo, mas a sua relevância para a fisiopatologia das doenças GI permanece desconhecida 1-3. De fato, vários distúrbios GI altamente comuns, tais como gastrite, esofagite de refluxo, colite, diverticulite e apendicite estão associados com o aumento da densidade de inervação em áreas de tecidos inflamados 1. No entanto, nenhuma atenção genuína até agora tem sido dada aos mecanismos e significado da neuroplasticidade no trato GI. Não nervos GI morfologicamente alteradas diferem dos nervos normais GI, ou seja, o estado normal do sistema nervoso entérico, em termos da sua função? Quais são as implicações de conteúdo neuropeptídeo / neurotransmissor alterado nos nervos plástico entéricas? A neuroplasticidade periférica sempre implica sinalização alterados para o sistema nervoso central? E onde estão as projeções centrais do extri plásticoNSIC caminhos neurais GI? Uma longa série de questões-chave pode ser facilmente gerada quando se olha para a escassez de nosso conhecimento sobre os aspectos funcionais do GI neuroplasticidade.
O estudo do GI neuroplasticidade a nível funcional requer modelos experimentais válidos, reprodutíveis e ainda facilmente aplicáveis. Em uma época de crescente popularidade e aceitação de modelos geneticamente modificados condicionais do mouse (GECoMM), tais em ambientes vivo suportar o potencial para elucidar anteriormente desconhecidas facetas do GI neuroplasticidade de uma forma realista 1. No entanto, o design e produção de GECoMM continua caro, trabalhoso e, principalmente, demorado. Além disso, elas requerem a priori selecção do alvo a ser condicionalmente modulada no rato geneticamente alterado (por exemplo, a sobre-expressão transgénica do factor de crescimento do nervo / NGF em células epiteliais intestinais). Assim, para a design de um GECoMM bem sucedido, os pesquisadores precisam de alguns indicadores (por exemplo, de dados experimentais anteriores) de um alvo de valor, ou seja, a molécula de interesse (aqui NGF) pode pelo menos esperar para exercer alguns efeitos biologicamente relevantes sobre os nervos gastrointestinais.
Tais indicadores podem ser facilmente derivadas a partir de modelos in vitro adequados, em que os subtipos de células isoladas a partir do microambiente complexo de um sistema in vivo podem ser co-cultivadas selectivamente de forma heterotípica 4-7. A modulação de alvos moleculares em tal configuração de cultura heterotípico é, em média, tecnicamente menos pesado, mais rápido, e pode, portanto, ajudar na pré-filtragem de alvos válidos para a verificação em estudos in vivo.
Recentemente, apresentamos um ensaio in vitro neuroplasticidade, que foi concebido para simular o aumento da densidade neural e hipertrofia de ne intrapancreáticarves em câncer pancreático humano (PCA) e pancreatite crônica (PC) tecidos. Aqui, os neurônios derivados de recém-nascido rato gânglios da raiz dorsal (DRG) ou plexo mioentérico (MP) foram expostos a extratos de tecidos de CaP ressecadas cirurgicamente ou CP tecidos espécimes e comparados com aqueles cultivados em pâncreas humano normal (NP) extratos de tecidos 5. Em vez de extratos de tecidos, também se pode usar sobrenadantes linha celular para estudar o impacto de tipos de células selecionadas em neuroplasticidade. Quando combinados com uma medição morfométrica padronizado, o ensaio neuroplasticidade apresentado permite a avaliação válidas e reprodutível de plasticidade neuronal em resposta a diferentes microambientes pancreáticas. Em particular, permite a simulação de um) neuroplasticidade morfológico, isto é, as alterações no crescimento de neurites, e de tamanho padrão de ramificação neuronal, e 2) a neuroplasticidade funcional, isto é, alterações na excitabilidade de neurónios periféricos. Além disso, não só periférica (isto é, (por exemplo, DRG ou segunda ordem espinal) neurónios pode ser incluído no presente ensaio, para avaliar a sua reacção morfológica e funcional para diferentes teores de tecido gastrointestinal. Neste vídeo tutorial, vamos demonstrar o protocolo técnico para a realização deste ensaio e discutir suas vantagens e fraquezas. Além disso, chamamos a atenção para a aplicabilidade da noção básica deste ensaio para o estudo da neuroplasticidade em qualquer órgão GI.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais em animais no protocolo de seguir as orientações de cuidados de animais da Technische Universität München, Alemanha.
1. Mídia / Extrato de Preparação
- Homogeneização Tissue
A qualidade de homogeneização de tecidos é crítica para a subsequente detecção de alterações neuroplásticas nos neurónios em cultura. Aqui, um homogeneizador é recomendado que permite a dissociação de tecidos sem grande aumento na temperatura do tecido.- Transferir 5 x 5 mm x 5 mm cubos de tecido pancreático directamente a partir de -80 ° C em azoto líquido e lugar numa fase sólida no homogenator tecido. O homogenator ideal seria dissociar o tecido rápido o suficiente, sem permitir que se descongelar.
- Imediatamente após a dissociação, ressuspender o, homogeneizado em pó semelhante a sólido em 300-500 ul de 0,1 x tampão fosfato salino (PBS). Aqui, não use qualquer tampão de lise (como RIPA), pois isso pode lisar os neurônios.
- Centrifugar os homogeneizados por pelo menos 15 minutos na velocidade máxima de sua centrífuga de bancada (por exemplo, 21.130 xg). Recolhe-se o sobrenadante claro, que representa o extracto de tecido.
- Sobrenadantes de linha celular
- Permitir que as células de interesse, pelo menos, atingir 70 - 80% de confluência em meio de crescimento normal.
- Normalmente, esses meios contêm componentes do soro e podem exercer efeitos incontroláveis no crescimento neuronal. Portanto, depois de atingir a densidade celular desejada, lavar as células com pelo menos 3x-cultura de células de grau PBS e colocá-las em meio sem soro (SFM) por até 48 horas.
Nota: Aqui, consideramos que algumas células (como células estreladas pancreáticas) pode precisar de soro em sua mídia em crescimento a fim de manter seu estado e estrutura normal. Nesses casos, realizar diluições de soro de série no meio da célula de interesse, a fim de encontrar o conteúdo soro possível menor necessário para functio celular intactan. - Medir a concentração de proteína do homogenato de tecido ou de sobrenadantes de células por meio de ensaio de proteína de Bradford. Embora estes valores variam dependendo do tipo de tecido e de células, por extractos de tecido pancreático, seria de esperar um intervalo de concentração entre 5-12 mg / mL, e de sobrenadantes de linha celular entre 3-8 mg / mL.
2. Alíquota de Extratos e sobrenadantes de células
Dependendo da concentração a ser utilizada no ensaio, a concentração final do extracto sobrenadante ou no meio neuronal deve ser de 100 ug / ml 5,8.
Nota: Para um ensaio com neurónios crescendo em 500 ul de meio, em cada poço de uma placa de 24 poços, o que precisa de 50 ug de proteína em cada extracto ou sobrenadante por poço. A uma concentração típica de cerca de 10 mg / mL do extracto, seria necessário 5 ul de extracto / sobrenadante de cada poço. Em cada setting realizada como uma triplicado, isto corresponderia a 15 ul de extracto / sobrenadante. Para diferentes tipos de tecidos ou células, realizar diluições seriadas do extrato final ou concentração do sobrenadante e comparar os efeitos neurotróficos observadas entre diferentes concentrações do extrato / sobrenadante.
3. Isolamento de neurónios
Uma vez que a coleta de extrato / sobrenadante é terminado, continue com o isolamento dos neurônios.
- Para neurônios DRG, colete cervical para lombar DRG de ratos recém-nascidos entre o dia pós-natal (P) 2-12 após decapitação e dissecação estereomicroscópica de DRG (Figura 1A). Para se ter neurônios DRG suficientes para uma placa de 24 poços, coletar todos cervical a lombar DRG de um rato recém-nascido (igualando 52 DRG) por placa.
- Cortar o periférico (neural) e as projeções centrais (raízes) de DRG por meio de microtesoura.
Deixando as projeções no lugar impede trituração e aumenta tele risco de contaminação por fibroblastos de cultura.
- Cortar o periférico (neural) e as projeções centrais (raízes) de DRG por meio de microtesoura.
- Para os neurónios MP, cortar o mesentério do intestino delgado e manual e cuidadosamente retirar seromuscular do intestino delgado (para um protocolo detalhado para o isolamento MP, referem-se a Schäfer et al. 9, Figura 1B). Para MP, recolher o plexo de dois ratos por 24 bem-placa.
Nota: Tente ser o mais suave possível, a fim de evitar as lágrimas na camada seromuscular uma vez que dificultam a sua separação bem sucedida do intestino delgado. - Recolhe-se o DRG e seromuscular em meio essencial mínimo gelada (MEM) fornecido com gentamicina (20 mg em média 500 ml) e o metronidazol (2,5 mg em 500 ml de meio).
- Após a recolha de DRG, incubar em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) fornecido com colagenase tipo II para 20-30 min. Para o isolamento do MP, incubar em colagenase de tipo entre 1-3 horas, dependendo da idadedo animal (Figura 1C).
- Para MP, recolher os pedaços MP net-like sob microscópio estereoscópico e transferir para MEM gelada.
- Em seguida, triturar o DRG e MP através de seringas com a diminuição do diâmetro.
Nota: trituração excessiva pode destruir os neurônios, mas menos que as células da glia. - Uma vez que o meio contendo o DRG ou MP tornou-se turva, centrifugar a suspensão a 93,9 g durante 5 min, o meio de descarte e ressuspender em meio Neurobasal (suplementado com 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 0,5 mM de L-glutamina e 2% de B-27).
- Contar o número total de células (isto é, neurónios e células da glia), por meio de um hemocitómetro.
Nota: o número de células necessário é dependente do parâmetro de medição. Para a quantificação da densidade de neurites, é preciso culturas mais densas e assim um número maior de células do que para a medição do crescimento de neurites, o tamanho perikaryonale padrão de ramificação de neurônios individuais. Para medições de densidade de neurite, use por exemplo, 10.000 células (neurônios + glia) / bem ou 1.500 neurônios / poço. Para a morfometria de neurônios individuais, breve (1 minuto de duração) trypsination de células e propagação de 2.500 células / poço ou 400 neurônios / bem é recomendado. O rendimento típico de células obtidas a partir de um rato é de cerca de 300.000-500.000 células. - Semente as células em lamelas de 13 mm, que foram revestidas com a noite anterior e no topo das cavidades com meio Neurobasal (suplementado com 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 0,5 mM de L-glutamina e 2% de B-27) (Figura 1D).
Nota: O uso de poli-D-lisina (40 mg / m 2) OU lamelas (1 mg / ml de cada um) revestida com revestimento de ornitina-laminina-e. Células anexar a poli-D-lisina extremamente rápida, tornando-o adequado para experiências em que são necessárias muitas células (isto é, as medições de densidade de neurites). Apego à laminina é de alguma geralo que mais fraca, mas a laminina é um promotor forte de proliferação de neuritos. Portanto, para medições em ramificação neuronal e duração da neurite, preferem ornitina / laminina-revestimento. - Permitir que as células anexar aos poços durante a noite. No dia seguinte, preparar os meio suplementado com extracto (a uma concentração de extracto / sobrenadante final de 100 ug / ml).
- Aspirar o meio de semeadura, e realizar uma lavagem opcional, muito gentil com PBS, em seguida, pipeta lentamente o / suplementados com sobrenadante mídia extrato (Figura 1E).
- Deixe as células crescem para 48 horas. Aspirar a mídia e corrigir em paraformaldeído a 4% para a imunocoloração (Figura 1F).
- Realizar coloração dupla imunofluorescência utilizando específico neurônio-(por exemplo beta-tubulina III) e específicos de células gliais (por exemplo glial fibriallary proteína ácida / GFAP) marcadores (Figura 1G).
- Para a morfometria, usar um microscópio de luz invertido equipado com uma câmera CCD em combinação wiª software automatizado que permite a medição da densidade de neurite (ver tabela).
- A densidade de neurite de culturas neuronais é medido em 4-5 fotomicrografias representativas com aumento de 200x de 4 regiões diferentes de crescimento mais denso em cada lamela sobrepondo a 50 mm x 50 mM grade e contando a densidade de fibras por metro quadrado medido nas fibras de cruzamento. Neuritos, número de ramificações por neurônio dizer, a duração média do ramo eo tamanho perikaryonal pode ser medido a partir de selecionados aleatoriamente 30 neurônios solitários de cada lamela marcando as neurites e pericários (Figura 1H).
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Representative Results
Neuroplasticidade morfológica
Na faixa etária indicada de ratos recém-nascidos (P2-12) e as densidades de semeadura, MP e DRG neurônios já construir redes neuronais densas após 48 horas (Figura 2A). Comparação da densidade neurite entre os neurônios cultivados em CaP, PB e extratos NP revela maior densidade de neurônios DRG neurite em CaP ou extratos CP do que em extrato NP (Figura 2A) 5. Nós particularmente prefiro neurônios MP para medições em neurônios individuais, uma vez que os neurônios MP tendem a dissociar mais facilmente a partir de células da glia em torno do que neurônios DRG. Aqui, os neurónios MP cultivadas em extractos de CaP ou CP também construir as neurites mais longas e exibem um padrão de ramificação mais complexo do que os neurónios MP crescente em NP-extracto contendo meio (Figura 2B) 5. A ausência desta diferença na morfologia neuronal induzida por NP, CP, e PCA extrai indica um problema técnico no umssay. Na maioria dos casos, isto pode ser devido a: 1) baixa qualidade do extracto preparado devido ao tempo de processamento longo, ou 2) devido a danos nos neurónios que ocorreram durante o processo de isolamento.
Estudos funcionais
O ensaio neuroplasticidade apresenta alta sensibilidade suficiente para detectar alterações induzidas pela presença ou ausência de determinadas moléculas alvo de interesse nos extractos ou sobrenadantes suplementados. Por exemplo, o bloqueio do factor de crescimento do factor neurotrófico artemina ou do nervo a partir de células de CaP (PCC) sobrenadantes pela adição de anticorpos bloqueadores específicos para o NGF ou por depleção induzida por Dynabead de resultados artemina na atenuação de formação de rede neuronal (Figura 2C) 10. Em um estudo recente, poderíamos mostrar um efeito muito semelhante para a contribuição do fator neurotrófico Neurturina a neuroplasticidade na CP em comparação simultânea com outros fatores neurotróficos, como NGF, glial-cell-line-derived factor neurotrófico (GDNF) ou factor de crescimento transformante-beta (TGF-beta), 11.
Glia
A mesma abordagem pode também ser aplicado para avaliar a reacção de células da glia por satélite associado-GDH ou glia entérico para os conteúdos do microambiente pancreáticas. Com efeito, um dos efeitos mais potentes de extractos de tecido de CaP sobre a glia DRG-ou MP-associado é proeminente aumento no crescimento de células da glia (Figura 3) 5. Além disso, este efeito é mais pronunciado em CaP que em CP. Aqui, deve-se considerar que a proliferação de células gliais não deve ser julgado com base na contagem da glia absolutos, mas sim sobre a proporção relativa de células da glia de neurônios (glia-neurônio-índice) 5. Isto é particularmente importante a considerar, pois o número de células da glia nestas culturas é mais difícil de controlar devido à potência a proliferação de células gliais em oposição aos neurónios.
Figura 1. Protocolo esquemática do ensaio neuroplasticidade in vitro. O presente ensaio faz uso de recém-nascido gânglios rato dorsal root (DRG) e plexo mioentérico (PM) neurônios para estudar o impacto dos extratos de tecidos pancreáticos ou sobrenadantes de células sobre a morfologia neuronal e glial. DRG são recolhidos após laminectomia anterior e MP contendo seromuscular após ressecção e remoção mecânica do intestino delgado (A, B). Após a digestão de colagenase tipo II, os neurónios são semeados na densidade necessária (ver texto para detalhes) ad cultivadas durante 24 horas (C, D). Em seguida, o pâncreas recentemente preparada (ou a partir de qualquer órgão de interesse GI) e os extractos de sobrenadantes de células são adicionados no meio de crescimento de neurónios, em concentrações previamente definidas (E).Após 48 horas, as culturas foram fixadas em 4% de paraformaldeído e imunocoraram-se duas vezes contra marcadores neuronais e gliais (F, G). A morfologia neuronal, incluindo densidade neurite, padrão de ramificação neural e tamanho perikaryonal são medidos por meio de um protocolo de software padronizada (H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Neuroplasticidade pâncreas induzida pelo câncer pancreático humano (PCA) e pancreatite crônica (PC). Extratos de tecidos pancreáticos humanos derivada cirurgicamente de pâncreas normal (NP), CP ou tecidos CaP induzir diferenças importantes na densidade de neurite DRG ne urons (A) e no padrão de ramificação neuronal dos neurônios MP (B). Aqui, extratos de tecidos APC ea CP exercer um efeito neurotrófico proeminente sobre DRG e MP neurônios. Semelhante aos extractos de tecido, também os sobrenadantes de tipos individuais de células (células de cancro do pâncreas aqui / PCC) também aumenta notavelmente a densidade de neurites de neurónios DRG (C). Este aumento, no entanto, é reversível, quando os factores neurotróficos, tais como seleccionados de artemina (ARTN) ou factor de crescimento do nervo (NGF) se esgotam ou bloqueados com estes sobrenadantes. Todos os neurônios histoquímica contra beta-III-tubulina. Todas as imagens em aumento de 100X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 3. Reação glial ao conteúdo do microambiente pancreático. Extratos tecido pancreático de CaP ou tecidos CP não só tem um efeito neurotrófico, mas também aumentar o crescimento glial e contagem de células gliais em DRG ou MP culturas. Células da glia histoquímica contra a proteína glial ácida fibrilar marcador glia (GFAP). Todas as imagens em aumento de 200X. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente protocolo destina-se a ilustrar a metodologia por trás do ensaio neuroplasticidade pancreática in vitro que foi recentemente desenvolvido pelo nosso grupo para estudar os mecanismos de neuroplasticidade na CaP e CP 5. O protocolo envolve um procedimento de três dias, que pode ser facilmente aplicado uma vez o cantor ganhou experiência suficiente no isolamento e cultivo de DRG e MP neurônios. Além disso, representa uma ferramenta valiosa para estudar a reacção concomitante do entérico e glia DRG-associado aos componentes do microambiente do pâncreas.
Em nossa opinião, uma das características mais interessantes deste ensaio é a sua capacidade de detectar e simular as alterações que ocorrem durante a APC ea CP (ie surgimento neural e hipertrofia) em um cenário simplificado in vitro. Na verdade, a aplicação de extractos de tecidos ou de sobrenadantes de células resulta em alterações na morfologia neuronal which podem ser detectadas com sensibilidade suficiente por meio de análise morfométrica sistemática. Recentemente, também foi capaz de demonstrar que este ensaio também é sensível para detectar as diferenças de potencial neurotrófico de várias entidades de cancro em comparação simultânea: Quando os atributos neurotróficos de linhas celulares da APC foi comparada com linhas celulares de cancro colorectal, as linhas celulares de CaP induzida significativamente maiores densidades neurite entre os neurônios DRG que linhas de câncer colorretal 8. Mesmo na comparação do rectal contra linhagens de células de câncer de cólon, linhas de células de câncer de cólon foram inferiores às células de câncer de reto em termos de seu potencial neuroplastic 8.
Uma das principais vantagens deste ensaio é a sua acessibilidade fácil para não só morfométricas, mas também análises eletrofisiológicas. Ao contrário de nos neurônios in situ em preparações fatia, gravações de neurônios em nosso ensaio de media definidos ou no umbsence / excesso de presença de fatores definidos tecnicamente não são exigentes e podem fornecer informações valiosas sobre o papel das moléculas selecionadas nesses microambientes sobre a atividade neuronal.
Certamente, o ensaio apresentado não deve ser considerado para ser apenas restrito ao estudo de questões relacionadas à neuroplasticidade pâncreas. A neuroplasticidade é uma característica proeminente da totalidade do tracto gastrointestinal, em condições patológicas, tais como neuropatias entéricos inflamatórias 1-3. Foram relatados Todas estas condições para ser associado com mudanças na morfologia inervação e atividade neuronal alterada 1-3. Por isso, é concebível para substituir extratos de tecidos pancreáticos ou linhas celulares por aqueles derivados de tecidos correspondentes e estudar o seu impacto sobre os neurônios e células gliais que o acompanha. Nossas análises recentes sobre a comparação de tecidos de câncer de pâncreas e colo-retal apoiar esta noção 8. No entanto, é também plausível presumindoe que os componentes de diferentes microambientes tecido pode não induzir alterações sensíveis e representativos como rotineiramente observar em componentes do tecido pancreático. Portanto, recomendamos a avaliação extensa anterior da morfologia neuronal induzida por "positivos" os tecidos de controle (ou seja, tecidos com hipertrofia neural por exemplo, histologicamente demonstrada) versus tecidos de controle "negativos" (ou seja, sem evidência histológica de hipertrofia neural).
As análises anteriores sobre a reacção dos astrócitos neste ensaio foram limitados a determinação da contagem de células gliais em diferentes microambientes pancreáticas. Células da glia possuem importância emergente em neurobiologia desde o reconhecimento do seu potencial neurogênico e aumento do interesse em correntes de cálcio ao longo da membrana glial 12. Portanto, as células da glia neste ensaio também são facilmente acessíveis para novas análises funcionaispor novas abordagens. No entanto, tais abordagens inovadoras adicionais precisam validação extensa anterior, antes de sua aplicação para estudos posteriores.
Como qualquer outro ensaio experimental, também o ensaio de neuroplasticidade apresentado tem alguma comparabilidade limitada de amostras de tecidos humanos obtidos de diferentes pacientes submetidos a cirurgia. É imperativo que estes tecidos a serem derivados de regiões mesmo tecido (por exemplo, cabeça do pâncreas, a partir da massa do tumor principal) para análises confiáveis 1. Além disso, mesmo quando este pré-requisito é cumprido, mais diferenças no tecido ou a biologia do tumor não pode ser excluída, considerando a grande variação no padrão de resposta biológica de diferentes indivíduos 1. Para contornar estas diferenças de tecido individuais, recomenda-se o desempenho do ensaio com os tecidos obtidos a partir de muitos pacientes quanto possível, isto é, com pelo menos 5-10 pacientes diferentes por entidade.
Como aspecto técnico chave, gostaríamos de chamar a atenção para o papel das substâncias de revestimento sobre o crescimento neuronal. Como também mencionado acima, nós preferimos poli-D-lisina para medições em densidade neurite, e revestimento ornitina / laminina para aqueles em neuronal padrão de ramificação / conseqüência individual. Nas nossas mãos, enquanto medida de crescimento neuronal pode também ser realizada em--lisina cobertas com poli-D superfícies, descobrimos que esta abordagem tende a diminuir a sensibilidade do ensaio para as diferenças reais. Por conseguinte, os investigadores que aplicam neste ensaio devem assegurar a utilização do material de revestimento ideal para a sua causa de interesse.
Em resumo, acreditamos que o ensaio neuroplasticidade apresentado representa uma valiosa ferramenta para se obter informação rápida e reprodutível em neuro-morfologia e função neuro-em diferentes microambientes tecido, como demonstrado no exemplo detecido pancreático. A detecção sensível a diferenças de neuro-morfologia como induzida por diferentes conteúdos de tecidos pancreáticos sublinha a reprodutibilidade in vitro da neuroplasticidade pâncreas em CaP humana e CP. Os futuros esforços devem visar a triagem preassay otimizada de sobrenadantes aplicados e extrai para atingir os meios de comunicação melhor definida para o estudo do GI-associado à doença neuroplasticidade.
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Disclosures
Os autores não têm interesses conflitantes e sem divulgações financeiras.
Acknowledgments
Todos os autores contribuíram para a criação e validação do ensaio apresentados e ao projecto do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1149 | |
| Ornithine/laminin | Sigma-Aldrich | P2533/L4544 | |
| 13 mm Coverslips | Merck | For use in 24-well plates | |
| Dismembranator S | Sartorius | ||
| Anti-Beta-III-tubulin antibody | Millipore | MAB1637 | 1:200 concentration |
| Anti-GFAP-antibody | DAKO | M0761 | 1:400 concentration |
| RIPA buffer + protease inhibitor | Any supplier | ||
| Neurobasal medium | Gibco/Life Sciences | 21103-049 | |
| B-27 Supplement | Gibco/Life Sciences | 17504044 | Quality of B-27 is known to depend on the lot number |
| Gentamicin/Metronidazol | Any supplier | ||
| Minimal essential medium | Gibco/Life Sciences | 31095-029 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco/Life Sciences | 24020133 | Improves collagenase activity when containing Ca/Mg |
| Collagenase type II | Worthington Biochemical | CLS-2 | Obtain lots with at least 200 U/mg activity |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco/Life Sciences | 25200056 | |
| 4% Paraformaldehyde | Any supplier | ||
| analySIS docu software | Olympus |
References
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