Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

רצפטורים פרופריוספציה והמתח בסרטן איברים: תרגילי מעבדה הסטודנטים

doi: 10.3791/51050 Published: October 24, 2013

Summary

טכניקות האנטומי ופיסיולוגיות הם הפגינו כדי לטפל בתפקוד ומבנה לproprioceptors משותף וקולטניים מתח שרירים בגפיים הליכה סרטנים.

Abstract

המטרה העיקרית של הליכים אלה היא להדגים למטרות הוראה ומחקר כיצד להקליט את הפעילות של חיים עצב סנסורי עיקרי אחראי לפרופריוספציה כפי שהם מזהים מיקום ותנועה משותפים, ומתח בשרירים. פעילות חשמלית מproprioceptors הסרטנים וקולטניים מתח שתועדה על ידי מכשור נוירופיזיולוגיות בסיסי, ומתמר משמש למדידת כוח שנוצר על ידי גירוי עצב מוטורי בו זמנית. בנוסף, אנו מדגימים כיצד להכתים את הנוירונים להערכה מהירה של הסידור האנטומי שלהם או לקיבוע קבוע. מכתים מגלה ארגון האנטומי כי הוא נציג של איברי chordotonal ברוב הסרטנים. השוואה בין התגובות עצבי מתח לתגובות פרופריוצפטיביות היא כלי הוראה יעיל בקביעה כיצד נוירונים חושיים אלה מוגדרים מבחינה תפקודית וכיצד האנטומיה מתואמת לפונקציה. שלוש טכניקות צביעהמוצגים ומאפשר לחוקרים ומדריכים לבחירת שיטה שהוא אידיאלי למעבדה שלהם.

Introduction

פרופריוספציה היא התחושה של מיקום ותנועת גפיים המאפשר התנהגות מנוע מתואמת. Proprioceptors מורכב של עמדה (סטטית) ותנועת קולטנים (תנועתית). בחרקים וסרטנים, איברי chordotonal הם המבנים המספקים מידע כי למערכת העצבים המרכזית 1. לא כל איברי chordotonal span משותפים אבל הם עדיין יכולים לעקוב אחר תנועות מפרקות עקב ההתקשרות שלהם על apodemes (גיד כמו מבנים) אשר מקיף את המפרק ולעבור בשיתוף עם שרירי השלד ומפרקי ביטוי. יש רגלי סרטנים שישה פרקים, שכל אחד מן האיברים chordotonal אחד או שניים 2. בדרך כלל יש לו איבר chordotonal 60-100 או יותר נוירונים חושיים מוטבעים בתוך גדיל אלסטי, הנוירונים כי אות מצב סטטי משותף, כיוון ומהירות תנועת 3-6. הקלט מאיברי chordotonal בכל מפרק ובהרגל ולאחר מכן במרכז עיבוד המאפשר תנועות מתואמות על ידי בעלי החיים.

> הכוחות שרירי רגליים לייצר במהלך הצירים איזומטרי ואיזוטוני מזוהים על ידי קולטנים מתח הקשורים לסיבי שריר ונספחיהם לapodemes7-9. בפרוטוקולים רגל הליכה הסרטנים הבאים אנו מציגים מתודולוגיה להקלטות מתא העצב עיקרי חושי העוקב אחר פרופריוספציה ונוירונים המגיבים לכוחות שנוצרו על ידי סיבי שריר. טכניקה להפעלת תנועות רגליים וכימותי דור כוח היא גם מוצגת, כמו גם טכניקות אנטומיים שיכול לשמש כדי לאפיין את ההסדר של מבנים במערכת עצבים ההיקפיים אלה.

הנהלים יודגמו בהמשך לאפשר ניתוח מבני ותפקודי של תאי העצב המעצבבים את שני הסוגים של קולטנים ביחס למיקום שלהם על גדיל אלסטי chordotonal וapodeme. לשם המחשה, שאנו משתמשים propodite-dactylopodite (PD) איבר chordotonal, האיבר שמשתרע על פני המקטע ביותר הדיסטלי של רגל הסרטנים 3.למרות מחקרי אלקטרו מפורטים החלו את 1930s ועדיין מתבצעים היום, כמה היבטים הפכו ידועים על הקשרים המגזריות של proprioceptors במפרקים השונים ותפקידם בשליטה מתואמת של muscles10-16. הקמת הקשר בין מבנה לתפקוד בין איברי פרופריוצפטיביות, השרירים ומערכת העצבים יהיו עוד יותר לעזור להגדיר תפקידים אלה. למשל, תיוג somata והסופים הדיסטלי של נוירונים מתח מוכנסים לתוך apodeme יגלה ביחס למיקום שלהם לסיבי שריר 8,17-21.

אנו מציגים שלוש טכניקות צביעה לרגליים סרטנים שניתן להשתמש בם במחקר או מעבדות אקדמיות. מכתים מתילן כחול מספק ניגוד הולם לשרירים ועצבים, והוא מומלץ כטכניקה פשוטה לתלמידים ללמוד אנטומיה. מעבדות שיש setups מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכולות להשיג מכתים עצבי בררני יותר על ידי חשיפת העצבים לזמן קצרים לצבע 4-di-2-ASP החיוני. החלופה השלישית היא CoCl 2 מילוי, שכתמים ומתקן את תאי העצב, ואינה דורשת דימות פלואורסצנטי. למרות שזה עבודה והזמן אינטנסיבי, תהליך צביעה זה נותן ניגודיות גבוהה וספציפיות לעצבים, כי הם מלאים. יחד טכניקות אלה יכולים לשמש להשוואה בין איברי chordotonal שונים, לא רק באיבר או בין איברים, אלא גם בין מיני סרטנים וחרקים אחרים 20-22. סרטנים כחולים (sapidus ג) שימוש בהקלטות פיסיולוגיות ומכתים אנטומיים זמינים בכל רחבי הגבול הדרומי ודרום מזרחי של ארצות הברית. מין זה משמש כנציגם של הסדרי עצב chordotonal ומתח נמצאים ברוב הסרטנים. מעבדות בחוף המערבי יעדיפו להשתמש הסרטנים הרבה יותר גדולים Dungeness (מגיסטר הסרטן) לניסויים אלה.

Protocol

1. נתיחה והקלטת חשמל מפעילות עצבית Propodite-dactylopodite (PD)

  1. החזק את הסרטנים על פני השריון מאחור, והימנעות מהטפרים, לצבוט את החלק הפרוקסימלי של meropodite עם מלקחיים. הרגל תהיה autotomize כדי למנוע את בעל החיים מדימום למוות. בזהירות בעת טיפול בסרטנים כחולים כפי שהם ולא אגרסיביים ומאוד מהירים.
    איור 1
    איור 1. הליכה ברגל של סרטן ראשון. המיקום האנטומי של איברי chordotonal (אזורים בקעו) הם על גבי סכמטית זו. ראש החץ הכפול מציין היכן ויחצה את הרגל לניסויי עצב פ"ד. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
  2. לעשות חתך בין propodite וcarpodite. מחק את carpopodite ולא הוא מצורף meropodite (איור 1).
  3. לחתוך חלון גדול בציפורן בצד פיגמנט (לרוחב) של propodite עם אזמל עם להב # 11 (איור 2 ו 3) הערה:. לא לחתוך עמוק.
  4. להסיר את שכבת העור המת על ידי הזזה של להב סכין המנתחים מתחת ומקביל לציפורן. זה קוטע את סיבי השריר צמודים לציפורן.
  5. שימוש באותה הטכניקה לחתוך חלון קטן בצד נטול הצבע (מדיאלי) של propodite, אבל להשאיר את condyle (משותף שקע או ציר בין מגזרים) מצורף בשלמותה.
    איור 2
    איור 2. גזור לאורך הקו המקווקו בpropodite. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
    n "src =" / files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg "width =" "/> 500px
    איור 3. לחשוף את העצב בחלון (החיצים מתארים את צרור העצבים). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
  6. הכן צלחת מרופדת Sylgard המכילה תמיסת מלח הסרטנים להצמיד ההכנה למטה הערה:. ראה לוח 1 למתכונים מלוחים ספציפיים מינים.
  7. אתר את איבר פ"ד ידי חיטוט בזהירות עם מחטי זכוכית מלוטשת אש. יש גדיל אלסטי פורש משותפת מראה כסוף.
  8. הסר את סיבי שריר שמסתירים המבט של האיבר שלך משני צידי הגיד. להיזהר מאוד שלא לפגוע באיבר PD או העצבים שלה.
  9. ברגע שזה הושג, בתוקף לצרף את ההכנה לצלחת עם צד פיגמנט (לרוחב) פונה כלפי מעלה (איור 4).
    איור 4 איור 4. חשוף איברים פ"ד ועצב. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
  10. בצע את עצב איבר PD בpropodite ככל proximally ככל האפשר על מנת לשחרר-up אורך ארוך של עצב (1.5 סנטימטר) למטרות הקלטה. זו היא הטובה ביותר לעשות בזמן שעצב פ"ד הוא עדיין מחובר לעצבי הרגל העיקריים.
  11. לאחר שנפרד בעצב פ"ד מן עצב הרגל העיקרי בעזרת מחטי זכוכית, לנתק את עצב פ"ד proximally עם איריס המספריים הערה:. אין למתוח או למשוך על העצב במהלך הניתוח.
  12. הזז את dactylopodite לעמדה מורחבת ומכווצת באופן מלא. שימו לב על איפה עמדות כיפוף והארכה הקיצוניות ונקודת חצי דרך לשימוש מאוחר יותר.
  13. הנח חוט קרקע בתוך האמבטיה מלוחה.
  14. הפעל את הדוארחומרת הקלטת lectrophysiology / תוכנת הערה:. ההתקנה שלנו כבר תוארה בעבר 23.
  15. מקם את המיקרוסקופ כך שהוא משקיף על הבמה מיקרוסקופ. לאחר צלחת ההכנה ממוקמת על הבמה, אתה צריך להתאים את המיקום של אלומת הפנס בעוצמה הגבוהה כדי להמחיש את ההכנה הטובה ביותר.
  16. מקם את micromanipulator כך ההרכבה האלקטרודה יניקה המצורפת תהיה גישה קלה לאמבטיה מלוחה והכנה. האלקטרודה היניקה בנויה כפי שמוצגת בוידאו מקוון 24.
  17. כדי לזהות פעילות עצבית, לצייר את קצוות של עצב פ"ד להאלקטרודה היניקה.
  18. הזז את דקטיל ברחבי עמדות מורחבות ומכווצות במשך כמה מחזורים בעזרת בדיקה זכוכית או מסמרת עץ.
  19. הבא לבחון פעילות כאשר דקטיל הוא ניצח בעמדות מורחבות, מכווץ, והאמצע.

2. הקלטת פעילות חשמלית מהמתחעצב תוך ניטור חיל דור

  1. לקבוע צד לרוחב והמדיאלי של הרגל. יש הצד המדיאלי מרקם רך שיכול להיות מורגש על ידי צובט בעדינות באזור meropodite עם ציפורן.
  2. מניחים בצד עד לציפורן רכה זה בצלחת. העצב המוטורי שמעצבב עורר שריר הפותחן גם מעצבב את שריר האלונקה בcarpopodite.
  3. כדי לגרות את שריר פותחן העצב מוטורי אלונקה באזור carpodite מבודד ומגורה עם האלקטרודה יניקה. החלק הפרוקסימלי של הרגל הוסר על ידי transecting meropodite במספריים.
  4. הסרת קטע של הציפורן באזור carpus על הצד הפנימי (צד המדיאלי, איור 5 א).
  5. חותכים את apodeme של השריר בנדר ולהסיר את השריר בזהירות שלא למשוך את עצב הרגל העיקרי מתוך חלל הרגל (איור 5 ב, ג לב החיצים היכן נדר apodeme מופרד). עצב הרגל העיקרי וחזייהNCH ​​לשריר האלונקה אז יכול להיות שנצפה (איור 5D).
  6. מצא את העצבים המסתעפים מן צרור העצבים העיקרי לשריר האלונקה (איור 5E, בחץ). זה ניתן לחתוך קרוב לשריר ומשך אל האלקטרודה יניקה כדי לעורר (5F דמויות ו-G, חץ מתאר את הסניף).
  7. להקניט את סעיף של העצב שמקרין לכיוון הפותחן בלי לצבוט את העצב. Transect העצב מוטורי אלונקה / פותחן.
  8. משוך את העצב המוטורי לתוך האלקטרודה היניקה ולאחר מכן לגרות אותו.
  9. כדי לחשוף את שריר הפותחן ועצב מתח להסיר את השרירים קרובים יותר ובאזור הגחון של propodite. חותכים את השרירים ההדוקים יותר עם ​​אזמל עם להב # 11 בpropodite (איור 6) שים לב:. לא לחתוך עמוק באזור הפרוקסימלי כי זה עלול לגרום נזק לעצב מוטורי הפותחן.
    איור 5 איור 5. צעדי Dissection לחשיפת הנוירון המוטורי לגירוי שריר הפותחן. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
    איור 6
    איור 6. חותכים את הציפורן במחצית הגחון של propodite לחשוף את השרירים קרובים יותר כדי שניתן יהיה להסירו. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
  10. להחליף את תמיסת מלח עם מי מלח מקורר טרי לאורך כל תהליך הנתיחה כדי לשמור על תאי העצב בחיים. לנתיחה נוספת, מניח את צלחת ההכנה תחת מיקרוסקופ לנתח ולהשתמש בתאורת סיבים אופטיים.
  11. לחתוך את הגיד הקרוב יותר בזהירות מהזיקה לדקטיל באמצעות מספריים בגודל בינוני מחודדים.
  12. להיות זהיר מאוד שלא להפריע את הסניפים לשריר הפותחן מן עצב הרגל העיקרי שצריכה להיות לעין.
  13. להסיר ולסלק את השריר וגיד קרובים יותר.
  14. לעשות חור בדקטיל בסיכה לנתיחה. חור זה ישמש מאוחר יותר לחבר את סיכת המתכת על המתח רגשי (כוח), אבל יש צורך לעשות את זה בשלב זה של ההליך.
  15. לאתר את סניף העצב שמקרין לשריר הפותחן וapodeme באזור הדיסטלי של שריר הפותחן. לבחון בזהירות את העצב עם כלי זכוכית מלוטש אש.
  16. שים לב למתח העצב שעולה מהקצה הדיסטלי של apodeme ותמורה לחבילת העצב המוטורי.
  17. כדי לזהות פעילות עצבית, למלא האלקטרודה יניקה עם מי מלח סרטנים ולצייר את קצוות של עצב מתח הפותחן לאלקטרודה. להבטיח כי האלקטרודה היניקה מתאימה בחוזקה על העצב.
  18. בדוק עבור neuraלתאם ליטר של מתח פסיבי בapodeme הפותחן. בעת הקלטת פעילות חשמלית מעצב המתח, לסובב את דקטיל במהירות לתוך משותף מורחב (כלומר מתיחת שריר הפותחן).
  19. בשלב הבא, פיתוח כוח פעיל מבחן ביחס לתדירות גירוי.
  20. בתקיפות לצרף וו מתכת, כך שקצה הקרס עובר דרך חור קטן בדקטיל.
  21. . חבר את הקצה השני של וו המתכת למתמר כוח הערה: ודא המתמר הוא בזווית של ° 90 בכל פעם, כך שהסיכה היא בניצב מתמר לגילוי מקסימאלי של הכוח שנוצר.
  22. משוך את הקרס ודקטיל כך שזה בערך בזווית של ° 45 של מפרק הפותחן.
  23. עכשיו לגרות את העצב המוטורי ב100 הרץ ל250 אלפית שניים ולמדוד את הכוח, כמו גם את תדירות ההזרקה של עצב המתח.
  24. הנח המשותף לעמדה מורחבת באופן מלא, כך שסיבי שריר הפותחן הם רפויים.
  25. Stimulate העצב המוטורי ל250 msec 100 הרץ ולמדוד את הכוח, כמו גם את תדירות ההזרקה של עצב המתח.
  26. בנד / להגמיש את המפרק, כך שהוא מכווץ (~ 90 °) באופן מלא. בתפקידו זה את סיבי השריר של הפותחן נמתחים באופן מלא. אולי יש איזה כוח שנמדד על ידי מתמר בשל מתיחה פסיבית של השריר.
  27. לגרות את העצב המוטורי ל250 msec 100 הרץ ולמדוד את הכוח, כמו גם את תדירות ההזרקה של עצב המתח.
  28. לאחר מדידת כוח, המשך בסדרה של תדרים שונים: 20, 40, 60, 80, ו100 הרץ ל8-10 שניות בכל עמדה משותפת.
  29. למדוד את התגובה עם שחרור מתח מהיר. מסדרים את ההכנה כך הקרס על מתמר הכוח יכול בקלות לדחוף אותו מן החור בדקטיל.
  30. בנד / להגמיש את המפרק, כך שהוא מכווץ (~ 90 °) באופן מלא. עכשיו לגרות את העצב המוטורי ב100 הרץ עם גירוי מתמשך של 5 שניות.
  31. לאחר secon הראשוןד או פחות, כמו המתח בנה על שריר הפותחן, לדחוף את הסיכה מהחור בדקטיל.
  32. בדוק את הקלטת עצב מתח לפני ואחרי שחרורו של הפינים מחזיקים דקטיל.
  33. השפעות ויסות של חומרי neuroactive כגון octopamine, סרוטונין וproctolin, המשנה את התפוקה של נוירונים המתח, יכולות להיקבע על ידי הוספת המולקולות האלה לתקשורת הרחצה מעל שריר הפותחן החשוף ולחזור על הניסויים.
  34. השתמש טפטפת ולטפטף 1-2 מיליליטר על ההכנה.

3. מבני מערכת עצבים היקפיים מכתים בסרטנאים הליכה רגליים

  1. טכניקה מתילן כחולה
    1. לדלל פתרון תילן כלוריד חלק אחד כחול המניה (0.25%) עם שני חלקים של מים מזוקקים.
    2. להוסיף את התערובת לחמישה חלקים שנאגרו מלוח. יסודיות להשקות את השטח של עניין.
    3. לנתח את רגל בהתאם לפרוטוקול בסעיף 1. דגירה מראשparation בפתרון מתילן הכחול ב12-13 ° C.
    4. לבחון את ההכנה כל דקות 10-15 עם מיקרוסקופ לנתח באמצעות תאורה בעוצמה נמוכה כדי לעקוב אחר ההתקדמות של מכתים. במקרים מסוימים מכתים יושלם בעוד שעה, באחרים זה יכול לקחת בין לילה.
  2. טכניקה 4 di--2-ASP
    1. צבעי ניאון יכולים לשמש לגיבוי למלא את נוירון PD או ישירות להכתים את ההכנה מהאמבטיה. עם זאת מיקרוסקופ מתאים עם יכולות כדי להציג את כתם הניאון נדרש.
    2. לנתח את רגל בהתאם לפרוטוקול בסעיף 1.
    3. דגירה ההכנה בריכוז 10 מיקרומטר של פתרון 4-Di-2-ASP ולהשאיר את ההכנה במקרר במשך 15 דקות. השתמש רק פתרון מספיק כדי לכסות את ההכנה.
    4. לצלם את ההכנות במהירות ולהימנע מחשיפת יתר לאור הכספית. צבע פלואורסצנטי זה מתפוגג במהירות יחסית.
  3. טכניקת כלוריד קובלט
    1. לחשוף את עצב פ"ד פי הפרוטוקול בסעיף 1 ולשמור אותו שקוע במלח קר.
    2. הפוך נפט הריבה גם להחזיק CoCl 2. אם כל CoCl 2 נשפך לתוך האמבטיה מלוחה כל ההכנה תהיה כתם שחור, וההכנה צריכה להיות מושלכת.
    3. Slip חתך קטן של גיליון קלקר, כדי להפוך את פלטפורמת פלסטיק, ולהצמיד אותו באופן כזה שזה לא לצוף משם או להיות שקוע באמבטיה מלוחה (איור 7).
      איור 7
      איור 7. גיליון פוליסטירן עם סיכות כדי להחזיק במקום בצלחת. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
    4. הוצא וזלין ממחט מזרק עדין מהודקת למזרק חד פעמי,לאחר מכן להפוך את מכשול (מעגל יכול לעבוד גם), שאמורה להיות על 1-1.5 מ"מ גבוה למעט "V" רדוד בנקודת האמצע שבו העצב יהיה עטוף פני, על גבי תלוש של קלקר.
    5. הפוך שלולית קטנה של מלח משני צדי המחסום ליד "V". נזהר שלא למתוח או לצבוט את העצב, הרם את העצב בזהירות מהצלחת ומניח אותו בשלולית מלוחה בנפט ריבה כן.
    6. לעבוד במהירות, כך שהקטע של עצבים לא להתייבש, בזהירות להוציא וזלין כדי לכסות את העצב החשוף. עכשיו לבדוק את המחסום עם מי מלח ולוודא שהוא לא דולף.
    7. למחוק משם מלח בצד הפנימי של הגדר ולראות אם זה מתמלא כאשר תמיסת מלח האמבט הוא גבוהה סביב הקיר של וזלין כדי להיות בטוח ששני הצדדים מבודדים זו מזו (איור 8).
      איור 8
      ng> איור 8. פטרוליום ג'לי היטב עם העצב מלוח ופ"ד פורש כן. עצב פ"ד לא לחתוך עדיין. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
    8. פתיל משם מלח ובשימוש בחתיכת נייר טישו. הימנע לתת הנייר לעטוף את העצב.
    9. הפוך שלולית חדשה באמצעות כמה טיפות קטנות של מים מזוקקים, ולאחר מכן לחתוך את קצה העצב. להיזהר מאוד שלא למשוך את העצב מבעד למחסום בעת ביצוע החתך. ההלם האוסמוטי של המים מזוקקים יהיה אקסונים "הבלון".
    10. בתוך 30 שניות להוסיף טיפה קטנה של CoCl 2 למים, לספוג את הפתרון הזה, ולאחר מכן להוסיף מספיק CoCl 2 כדי ליצור שלולית על סעיף קיצר זה של עצב (איור 9). הכנות שמורות ביותר בקירור ב 13 מעלות צלזיוס במשך שעה 12-24.
      "Width =" tp_upload/51050/51050fig9.jpg "/> 500px
      איור 9. עצב פ"ד החתך שנחשף לCoCl 2. עצב החתוך מתנפח בנוכחות המים שמקלה ומאיצה את התנועה של מולקולות צבע דרך אקסונים לגופי תא נוירון. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
    11. הסר את שלוליות humidifying. למחוק משם פתרון קובלט באמצעות רקמות ולשטוף את השאריות של קובלט עם מספר שינויים של תמיסת מלח.
    12. העבר את ההכנה המבודדת לצלחת פטרי זכוכית קטנה המכילה כ 10 מיליליטר של תמיסת מלח הסרטנים. נוירונים נשטפים והשלבים הבאים מבוצעים באתרם. כלי מתכת טובים הם שלא להשתמש בהם כדי להתמודד עם ההכנה לאחר שלב זה (אתה צריך להשתמש בכלים ספציפיים, שאינם לשימוש במועד מאוחר יותר לפיזיולוגיה).
    13. להוסיף 1-2 טיפות של אמוניום גופרתי (NH4) 2 S למלוח. מכסה את בקבוק 2 S (NH 4) בחוזקה ומניח חזרה למכסת המנוע. שים לב לתגובה בהכנה תחת מיקרוסקופ לנתח
    14. בתוך 1-2 דקות, הנוירונים מלאים קובלט והתהליכים שלהם צריכים להתחיל להופיע, כי הם יהיו כתם שחור.
    15. אחרי 5-10 דקות, החלף את פתרון פיתוח עם מי מלח טרי.
    16. ודא כי פתרון הפיתוח שפכו לתוך הכיור ואחריו פועל במים ברז לכמה דקות או בבקבוק פסולת עם מכסה.
    17. יוצקים את תמיסת מלח ולתקן הכנת העצב ל-15 דקות עם שני שינויים של מקבע הפתרון של Bouin. לרקמות גדולות יותר כמו שריר הפותחן (להכתים נוירונים מתח), להגדיל את משך הזמן של קיבעון ל30 דקות.
    18. מייבשים בסדרה בסדר העולה של ריכוז אתנול החל משעת 70% (כלומר 70%, 80%, 90%, 100%). אודות 10 דקות בכל ריכוז מספיק עבוררקמות קטנות.
    19. לאחר כ 10-15 דקות בשני שינויים של 100% אתנול, נקה את הרקמה על ידי החלפת אתנול עם 100% סליצילט מתיל. ההכנה תישאר בפתרון זה באופן קבוע לצפייה חוזרת ונשנית. עם זמן התאים מולא יתבררו יותר בגלל הרקמה שמסביב תהפוך לברורה יותר. ניתן להשתמש בשיטות להגברת כדי לסייע במניעת דהייה לאורך זמן 25.
    20. השתמש באותו תהליך כדי למלא את עצב המתיחות עם CoCl 2. עם זאת, שינוי פתרון אתנול מספר רב של פעמים בכל שלב התייבשות אתנול דגירה ההכנה בתוך אלכוהול למשך כ20 דקות לכל שלב כדי ליבש היטב את השרירים ולאפשר להם לנקות היטב.

Representative Results

כאשר איבר פ"ד נמתח על ידי הרחבת המשותפת באופן מלא, הפעילות בעצב פ"ד היא איתנה במהלך התנועה כפי שמוצג לשנייה הראשונה באיור 10. פעילות מסוימות נותרת בזמן שהוא החזיק עדיין במצב הפתוח. פעילות זו היא מהנוירונים סטטי העמדה הרגישים (המחצית שנייה של ההקלטה שמוצגת באיור 10). תנועה מעוררת תגובה בזמן העקירה, והירי הוא בעיקר נוכח במהלך המתיחה של גדיל chordotonal (איור 11).

ניתוח נוסף של הקוצים ניתן לגשת בקלות על ידי מיון אמפליטודות יחסית. זוהי גישה להפגין אוכלוסיות שונות של תאי עצב תחושתיים שגויסו לתפקידים או סוגים של תנועות 5. אמפליטודות אופיינית נעה .25-1.5 mV, אולם ערכים אלו תלויים בהתנגדות (כלומר אטימות) של חותם האלקטרודה יניקה. תדר של קוצים בtהוא טווחי גודל שונים יכול גם להיות מיוצג באופן גרפי לניתוח.

כוחות שנוצרו על ידי שריר הפותחן ביחס לתדירות הגירוי ניתן להשוות על ידי superimposing עקבות בהתאמה מתח זמן על גב אחד את השני (13A דמויות ו-B). זה גם יכול להתבצע עבור כל עמדה משותפת בכל תדר גירוי נתון. פעילות של עצב המתח אז יכולה להיות מתואמת עם כמות הכוח יחסי שנוצר בכל תדר גירוי, ועבור כל עמדה משותפת. כמו בעצב פ"ד, מגוון רחב של אמפליטודות ספייק נראה בתגובה להתכווצות של שריר הפותחן (13C איור).

סידור האנטומי של תאי עצב ברגל ההליכה בבירור הוא ציין עם מכתים מתילן כחול (איור 14). שים לב לנוירון הגדיל ומתח chordotonal אלסטי כי הוא קרוב לapodeme. כמה somata בקטרים ​​שוניםמיקומים ספציפיים ד הם גם נראים בנתון זה. כמובן כולו של עצב המתח והעצב מוטורי אלונקה מוצגים באיור 15. נוירונים בודדים של עצב פ"ד מוצגים עם ניגודיות גבוהה יותר באמצעות 4-Di-2-ASP (איור 16) וCoCl 2 (איור 17) מילוי טכניקות. בהגדלה גבוהה ניתן לראות את קצות חושים פנימיים של scolopales התומכת (16B דמויות) 21,22,26.

איור 10
איור 10. העבר ומחזיק ב 0 °. הנוירונים הדינמיים הם חזקים בירי בתנועה וקוצים מהנוירונים רגישים סטטי נמצאים בזמן המשותף מוחזקים פתוח. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר </>.

איור 11
איור 11. ראפיד פתוח וסגירה ממכווצת באופן מלא לעמדה מורחבת (90-0 °). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 12
קוצים תאיים איור 12. נרשמו מעצב פ"ד. המשותף הוא פתוח לגמרי ולאחר מכן עבר במהירות ל½ מכווץ עמדה ולאחר מכן התקיים עדיין. שים לב לפעילות בתנועה וירידה בפעילות כאשר סטטי. לחץ כאן לצפייה בהר"י הגדול יותר ge.

איור 13
איור 13. הכוחות יחסי שהם פיתחו עם המפרק מכווץ באופן מלא ומגורה בתדרים השונים. () עקבות מתח פעמיות ממתמר הכוח מוצגות עם כל תדר גירוי. (ב) העקבות בפנל הן על גבי בצבעים שונים על מנת להקל בהשוואה. (C) מתח בזמן עקבות של פעילות חשמלית שנרשמו מעצבי המתח כאשר העצב המוטורי היה מגורה ב80 הרץ. שים לב לדפוס הקבוע של חפצי הגירוי בהשוואה לפעילות העצבית. כמו כן, שים לב לאמפליטודות השונות של התגובות עצביות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

ithin-page = "תמיד"> איור 14
איור 14. כתם כחול מתילן של הכנת רגל הליכה. somas הבודד מוצג עם הסיומות חושיות שלהם מקרינים לתוך גדיל אלסטי. קרוב לapodeme נוירון מתח מוצג. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 15
איור 15. עצב המתח הנובע מקצה הדיסטלי (חצים אדומים) ומצטרף לעצב המוטורי (חץ ירוק). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

e = "תמיד"> איור 16
איור 16. () חזרה מילוי של עצב PD במגיסטר הסרטן עם 4-Di-2-ASP. (ב) הגדלה גבוהה של סופים חושיים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 17
איור 17. נוירונים שהיו מלאים בCoCl 2 ומעובד (א '). מתווה לייחס של ההכנה המוכתמת מוצג (ב '). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

ing = "0" width = "392"> דקסטרוז (D-גלוקוז)
מלוח G / L
NaCl 27.29
KCl 0.81
O 4 • 7H 2 MgSO 4.81
CaCl 2 • 2H 2 O 1.85
Na 2 O 4 • 10H 2 SO 0.97
1.982
חומצת HEPES 0.476
מלח HEPES 2.08
התאם לpH 8.1 עם NaOH או HCl

טבלת 1. מתכונים למלוחים סרטנים.

Discussion

המטרה של קבוצה זו של ניסויים היא 1) ללמד ולהציג את עקרונות היסוד של הקלטות תאי מאיבר פרופריוצפטיביות זיהוי ועצבי מתח ו2) כדי להדגיש את החשיבות של מיפוי האנטומי ביחס לתפקוד פיסיולוגי של מערכות חושיות מסוימות. גישה זו ניסיונית והמודלים של בעלי החיים מנוצל הם זולים וקלים יחסית לביצוע במעבדות הוראת נוירופיזיולוגיה.

הנוירונים של איברי chordotonal הם משני סוגים תפקודיים ספציפיים, אלה המגיבים לתנועה ואלו מגיבים לעמדות סטטיות. הקלטות תא בודדות ממגוון רחב של איברי chordotonal, לא משנה באיזו משותף נבדק, הראו את זה כדי להיות המקרה 3,5. ואכן, איברי chordotonal קשורים מפרקי המחושים של לובסטרים לחשוף אותם שני סוגים חושיים ואנטומיה בסיסית 27. בנוסף לקיומן של שני סוגי תא עצב (תנועה וpositiב), הנוירונים חולקים את אותה סידור האנטומי בגדילי אלסטי המיוחסים להם. Somata הגדול הממוקם proximally על הגדיל נוטה להשתייך לנוירונים הרגישים התנועה הדינמית. יש נוירונים שלאותת עמדות סטטיות somata הקטן וממוקמים distally. תאים אלה הם tonically פעילים. משותף פ"ד מכיל רק איבר chordotonal אחת בעוד יש שני איברים chordotonal בcarpus-propodus (CP) וmerus-carpus מפרקים (MC).

הנתיחה כדי לחשוף מבני פרופריוצפטיביות בסרטנים כחולים (sapidus ג) להקלטת אלקטרו דורשת אסטרטגיה שמאפשרת משותפות תנועות להתקיים בעמדות טבעיות בעת הקלטה מתא עצב תחושתי. העצבים המתח לשריר הפותחן ברגל ההליכה הוא עצב דק מאוד מורכב מכמה תאי עצב. אלא אם טיפול נלקח, עצב המתח, כמו גם את העצב המוטורי innervating השרירים להיות מגורה, יכול להיות שניזוקו במהלך נתיחה זו. עבורהקלטות אופטימליות אלקטרודות היניקה צריכה להיות מותאמות לגודל של העצב. הקלטות הן נגישות בקלות במעבדה תלמיד באמצעות מיקרוסקופ לנתח הגדלת 30-40X וmicromanipulators הסוף נמוך.

ניסויים עתידיים שיהיו מעניין להמשיך עם איברי chordotonal המשותפים יהיו לבחון פרופילים המבניים ופיסיולוגיים במהלך התחדשות רגל במינים שונים בשלבים שונים במחזור החיים כהמשך למחקר ראשוני זה המשמש מגיסטר הסרטן 19.26 . שאלות שנותרו לטפל הן 1) אין החלוקה והארגון מחדש של תאי עצב תלוי בגילו של בעל החיים בעת התחדשות איבר, 2) הן תחזיות axonal למערכת העצבים המרכזית (חוט עצב הגחון) באיבר התחדשות תפקודי או עושה את זה לקחת את הזמן ומשותף שימוש לבסס קשרים פונקציונליים, ו3) מה קורה לאקסונים ניתקו הפרוקסימלי למטוס autotomy כאשר האיבר הוא autotomized? 28

סרטנים להתאים לתנאי סביבה וטמפרטורת הסביבה שלהם, אבל לא ברור כיצד הם שומרים על תיאום בתוך מעגל עצבי כמו נוירונים לשנות את הפעילות שלהם בתגובה לשינויי טמפרטורה. קצב איטי של שינוי עשוי לאפשר לבעלי החיים קצת זמן להתאקלמות ואילו שינוי מהיר עשוי not29, 30. שינויים פיסיולוגיים בpH או osmolarity בשל חילוף חומרים, ביום 31 בהתנהגות, או השפעה על הסביבה עשויים להציב אתגרים דומים למעגלים עצביים המעורבים בפרופריוספציה. הכנות סרטנים אלה הן אידיאליים לטיפול בבעיות מסוג זה משום שתפקידם מאופיין גם ברמת תא בודדת.

בפרוטוקול זה יש לנו הראה את החשיבות הפיזיולוגית של נוירונים מתח בניטור הכוח שנוצר על ידי שריר הפותחן. ניתן לעקוב אחרי הקולטנים מתח אלה למיקום שלהם בתוך apodeme באמצעות נהלים מכתים. אלהנוירונים, כמו ביונקים, לזהות כוח ברמות שונות ולגייס נוירונים נוספים כמו עליות הכוח. התדירות בפעילות קשורה לתדירות הגירוי של הנוירון המוטורי עד שהגיעה לרוויה בקבלה פן. באמצעות פרוטוקול שחרור מהיר עם מפרק dactylus מכווץ, פעילות המתח נעלמה במהירות, אך לאחר מכן חוזרת על החזרת מתח במפרק מורחב במלואו. זהו הליך ניסיוני קלאסי כדי להמחיש את הכוח שנמדד על ידי קולטנים מתח. ניתן ליישם neuromodulators השונים להכנה כדי לראות איך זה משפיע על פיתוח כוח והתגובה עצבית. אחד ההיבטים החשובים הוא איך התגובות עצביות מעובדות ומשולבת במערכת העצבים המרכזית ואת השפעתן על פעילותם של תאי עצב מוטוריים. הטכניקות שהראינו תאפשר אחד כדי להתחיל לטפל במידע נוסף על מתח פונקצית מעגל נוירון (חושית) עצבים מוטוריים, כלומר אות ברגל בשלמותה לגנגליון ובחזרהלשריר.

הנהלים מכתים הפגינו הם מפתח להבנת הפיסיולוגיה של תאי עצב תחושתיים המעצבבת את איברי פרופריוצפטיביות. סידור האנטומי של הנוירונים המבוססים על תפקוד והגודל של סומה דומה באיברי chordotonal השונים ברגלי הסרטנים. לא ידוע אם הסדרים עצביים דומים מצויים גם במינים סרטנים אחרים או חרקים. שילוב של הקלטות פיסיולוגיות של תאים בודדים ומיפוי המיקום מאפשר יחסי פונקצית מבנה ישיר. השימור ארוך הטווח של ההסדר עם אנטומיים CoCl 2 מכתים וקיבעון מאפשר אחת לעשות שוב ושוב צעדים ולהעריך את הסידור המבני.

פרופריוספציה וקבלת מתח של שרירי שלד הן מערכות חוש המאפשרים התנהגויות מתואמות ובתגובות לסביבה חיצונית ופנימית לבעלי החיים באו לידי ביטוי במגוון רחב של הגדרות שרירי שלדs. איבר קולט שרירים בבטן של הסרטנים הוא הכנה אחרת מתועדת היטב (ראה פרויקט crawdad; http://www.crawdad.cornell.edu/) למטרות הוראה של פרופריוספציה רק עם שני נוירונים לחמים-קטע בטן 23 . היכולת להקליט מתא עצב אחד לצרורות עצבים חושיות מספקת פרטים נוספים המסייעות בהבנת העקרונות הבסיסיים של קליטה חושית. הכנות סרטנים פשוטות יחסית אלה מאפשרים אחד כדי לטפל בהיבטים בסיסיים של פרופריוספציה וניטור מתח, עם הפוטנציאל כדי לקבוע את המעגלים העצביים המאפשרים שילוב של תשומות פרופריוצפטיביות ואחרות חושיות 9-12, 32, 33 מרכזי.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מודים לתרומה האמנותית של Hyewon קופר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard Dow Corning 182 silicone kit
NaCl Sigma-Aldrich S7653
KCl Sigma-Aldrich P9333
CaCl2 Sigma-Aldrich C5670
HEPES acid Sigma 3375 Free acid, crystalline
HEPES base Sigma
D-Glucose Sigma G7021
MgSO4•7H2O Sigma M2643
Na2SO4•10H2O Sigma 246980
Bouin’s solution fixative Sigma HT10-1-32 Caution: Hazardous material (Special shipping cost required)
CoCl2 Sigma Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations.
Methylene blue chloride Matheson Co., Inc Basic Blue 9, C.I. 52015
4-Di-2-ASP Molecular Probes 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide
Bleach Sigma-Aldrich To chloride silver wire
NaOH Sigma-Aldrich 221465 To adjust pH
HCl Sigma-Aldrich H1758 To adjust pH
Materials
Dissecting tools World Precision Instruments assortment
Intracellular electrode probe
Faraday cage
Insect Pins Fine Science Tools, Inc 26001-60
Dissecting microscope (100X)
Fiber optic lamp
Small adjustable mirror To direct light beam toward the preparation.
Glass electrodes Sigma-Aldrich CLS7095B5X Box of 200, suction electrodes
Micromanipulator World Precision Instruments MD4-M3-R Can fix for base or on a metal rod
Raised preparation stand
Silver wire (10/1,000 inch) A-M Systems 782500
Computer Any company
AC/DC differential amplifier A-M Systems Model 3000
PowerLab 26T AD Instruments 27T
Force transducer AD Instruments 0-50g MLTF050/ST
Head stage AD Instruments Comes with AC/DC amplifier
LabChart7 AD Instruments
Electrical leads Any company
Glass tools Make yourself For manipulating nerves
Cable and connectors Any company
Pipettes with bulbs Fisher Scientific 13-711-7 Box of 500
Beakers Any company
Wax or modeling clay Any company or local stores
Stimulator Grass Instruments SD9 or S88
Plastic tip for suction electrode Local hardware store (Watt’s brand) ¼ inch OD x 0.170 inch ID Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
  2. Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52, (3), 605-634 (1972).
  3. Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
  4. Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109, (2), 479-486 (1994).
  5. Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81, (4), 447-475 (2008).
  6. Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
  7. Hill, A. V. First and Last Experiments in Muscle Mechanics. Cambridge University Press. Cambridge, U.K. (1970).
  8. Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14, (3), 274-292 (1972).
  9. Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1, (1-4), 185-208 (1972).
  10. Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221, (2), 185-198 (1983).
  11. El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168, (3), 337-349 (1991).
  12. Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88, (5), 2575-2588 (2002).
  13. Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78, (6), 3133-3143 (1997).
  14. Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
  15. Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38, (01), 01-143 (1959).
  16. Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157, (3), 355-362 (1985).
  17. Holsinger, R. The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. University of Kentucky. (2013).
  18. Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211, (1), 139-149 (1980).
  19. Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72, (2), 391-399 (1982).
  20. Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180, (3), 215-221 (1997).
  21. Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245, (725), 291-325 (1962).
  22. Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248, (752), 437-456 (1965).
  23. Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
  24. Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322 (2011).
  25. Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
  26. Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25, (5), 461-471 (1994).
  27. Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81, (2), 187-202 (1972).
  28. Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201, (Pt 11), 1745-1752 (1998).
  29. Chung, Y. -S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2, (3), 75-86 (2012).
  30. Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158, (6), 689-696 (1989).
  31. Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1, (3), 36-42 (2011).
  32. Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. (2013).
  33. Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3, (1), 4-13 (2013).
רצפטורים פרופריוספציה והמתח בסרטן איברים: תרגילי מעבדה הסטודנטים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Majeed, Z. R., Titlow, J., Hartman, H. B., Cooper, R. Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (80), e51050, doi:10.3791/51050 (2013).More

Majeed, Z. R., Titlow, J., Hartman, H. B., Cooper, R. Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (80), e51050, doi:10.3791/51050 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter