Summary
Fysiologiske og anatomiske teknikker demonstreres for å løse funksjon og struktur for felles proprioceptors og muskelspenninger reseptorer i krepsdyr walking lemmer.
Abstract
Den primære hensikten med disse prosedyrene er å demonstrere for undervisnings-og forskningsformål hvordan å registrere aktiviteten til levende primære sensoriske nerveceller som er ansvarlige for propriosepsjon som de er å oppdage felles posisjon og bevegelse, og muskelspenninger. Elektrisk aktivitet fra krepsdyr proprioceptors og spenn reseptorer måles ved enkel nevrofysiologiske instrumentering, og en transduser blir brukt for samtidig å måle kraften som er generert ved å stimulere en motor nerve. I tillegg viser vi hvordan å farge nevroner for en rask vurdering av deres anatomiske ordning eller for permanent fiksering. Farging avslører anatomisk organisasjon som er representant for chordotonal organer i de fleste krepsdyr. Sammenligning av spenning nerve svar på de proprioceptive svar er et effektivt pedagogisk verktøy i å bestemme hvordan disse sensoriske nevroner er definert funksjonelt og hvordan anatomien er korrelert til funksjonen. Tre fargeteknikkerpresenteres slik at forskere og instruktører for å velge en metode som er ideell for sitt laboratorium.
Introduction
Propriosepsjon er følelsen av lem posisjon og bevegelse som gjør det mulig koordinert motor atferd. Proprioceptors bestå av stilling (statisk) og bevegelse (kinestetiske) reseptorer. I insekter og krepsdyr, chordotonal organer er de strukturene som gir denne informasjonen til CNS en. Ikke alle chordotonal organer spenner over et felles, men de kan fortsatt overvåke felles bevegelser på grunn av deres tilknytning på apodemes (sene lignende strukturer) som spenner over leddet og beveger seg i forbindelse med skjelettmuskulatur og felles artikulasjon. Krabbe ben har seks ledd, som hver har en eller to chordotonal organer 2. Vanligvis en chordotonal organ har 60-100 eller flere sensoriske nevroner er innebygd i en elastisk tråd, nevroner som signaliserer statisk felles posisjon, retning og hastighet av bevegelse 3-6. Innspillene fra chordotonal organer i alle ledd og ben blir så sentralt behandlet slik koordinerte bevegelser av dyret.
Prosedyrene demonstrert under aktivere strukturell og funksjonell analyse av nevroner som innerverer begge typer reseptorer i forhold til deres plassering på en chordotonal elastisk tråd og apodeme. For å illustrere, bruker vi propodite-dactylopodite (PD) chordotonal organ, det organ som spenner over distal mest segment av krabbe etappe tre.Selv om detaljerte elektrofysiologiske studier begynte i 1930 og er fortsatt blir utført i dag, har noen aspekter blitt kjent om segmentell sammenhenger av proprioceptors i de ulike leddene og deres roller i samordnet kontroll av muscles10-16. Etablering av struktur-funksjon forholdet mellom de proprioceptive organer, muskler og nervesystemet vil ytterligere bidra til å definere disse rollene. For eksempel vil merking av somata og distale avslutninger av spenning nevroner satt inn i apodeme avsløre deres plassering i forhold til muskelfibre 8,17-21.
Vi presenterer tre fargeteknikker for krepsdyr ben som kan brukes i forskning eller faglig laboratorier. Metylenblått farging gir kontrasten for muskler og nerver, og anbefales som en enkel teknikk for elevene å lære anatomi. Labs som har fluorescens mikros oppsett kan utrette mer selektiv nevronale farging av kort utsette nerves til det vitale fargestoff 4-di-2-ASP. Det tredje alternativet er CoCl to tilbakefylling, som flekker og fikser nervecellene, og krever ikke fluorescens bildebehandling. Selv om det er arbeids-og tidkrevende, gir dette farging prosessen høy kontrast og spesifisitet for nervene som er fylt. Sammen disse teknikkene kan anvendes for å sammenligne forskjellige chordotonal organer, ikke bare i løpet av et lem eller mellom lemmene, men også hos andre krepsdyr og insektarter 20-22. Blå krabber (C. sapidus) brukt i fysiologiske innspillinger og for anatomisk flekker er lett tilgjengelig over hele Sør-og Sørøst-grensen til USA. Denne arten fungerer som en representant for de chordotonal og spenning nerve ordninger som finnes i de fleste krabber. Laboratorier på vestkysten vil foretrekke å bruke den mye større Dungeness krabbe (Cancer magister) for disse eksperimentene.
Protocol
En. Disseksjon og opptak elektrisk aktivitet fra Propodite-dactylopodite (PD) Nerve
- Hold krabbe over ryggskjoldet bakfra, og unngå de klør, klype den proksimale delen av meropodite med pinsett. Beinet vil autotomize å hindre dyret fra å blø i hjel. Vær forsiktig når du håndterer blå krabber som de er ganske aggressiv og svært rask.
Figur 1. Først walking etappe av en krabbe. Den anatomiske plassering av chordotonal organer (klekket regioner) er lagt på dette skjematisk. Den doble pilen hodet indikerer hvor du skal skjære over beinet for PD nerve eksperimenter. Klikk her for å se større bilde . - Gjør et kutt mellom propodite og carpodite. Kast carpopodite og t han festet meropodite (Figur 1).
- Skjær et stort vindu i skjellaget på det pigmenterte (lateral) side av propodite med en skalpell med en # 11 blad (figur 2 og 3). Merk: Ikke kutt dypt.
- Fjern cuticle laget ved å skyve skalpell blad under og parallelt med skjellaget. Dette kutter muskelfibrene som er festet til hårstråene.
- Ved hjelp av samme teknikk kuttet et mindre vindu på pigmentless (mediale) siden av propodite, men la knokkelen (socket joint eller hengsel mellom segmenter) vedlegg intakt.
Figur 2. Skjær langs den stiplede linjen på propodite. Klikk her for å se større bilde .
n "src =" / files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg "width =" 500px "/>
Figur 3. Expose nerve i vinduet (pilene skissere nervebunt). Klikk her for å se større bilde . - Forbered en Sylgard-lined skål inneholder krabbe saltvann til pin utarbeidelse ned. Merk: Se tabell 1 for artsspesifikke saltvann oppskrifter.
- Finn PD organ ved forsiktig sondering med brann-polert glass nåler. Den elastiske tråd som spenner over felles har en sølv utseende.
- Fjern muskelfibre som obskure visningen av orgelet fra begge sider av senen. Vær veldig forsiktig for ikke å skade PD organ eller dens nerve.
- Når dette er gjort, fast feste forberedelse til parabolen med pigment side (lateral) vendt opp (figur 4).
Figur 4 Exposed PD orgel og nerve.. Klikk her for å se større bilde .
- Følg PD organ nerve i propodite så langt proksimalt som mulig for å frigjøre en lang lengde på nerve (1,5 cm) for opptak formål. Dette gjøres best mens PD nerve fremdeles er festet til hoved leg nerve.
- Etter separering av det PD nerve fra hovednerven benet ved hjelp av glass-nåler, kutte PD nerve proksimalt med iris saks Obs. Ikke strekk eller trekk på nerven under disseksjonen.
- Flytt dactylopodite til en utvidet og fullt bøyd stilling. Ta notat om hvor de ekstreme fleksjon og ekstensjon posisjoner er og en halvveis punkt for senere bruk.
- Plasser en jordledning inne i saltvann bad.
- Slå på electrophysiology opptak hardware / software. Vår oppsettet har blitt beskrevet tidligere 23.
- Plasser mikroskopet slik at det er utsikt mikroskopet scenen. Når prep fatet er plassert på scenen, må du justere plasseringen av den høye intensiteten lyset stråle til beste visualisere forberedelser.
- Plasser mikromanipluatoren slik vedlagte suge elektrode forsamlingen vil ha enkel tilgang til saltvann bad og forberedelse. Suge elektroden er utført som vist på en video 24..
- For å detektere nevral aktivitet, tegne kuttet ende av PD nerven inn i sugeelektrode.
- Flytt Dactyls gjennom lengre og bøyes posisjoner for flere sykluser ved hjelp av et glass sonde eller treplugg.
- Neste observere aktivitet når Dactyls er festet i den utvidede, bøyd, og midten av posisjoner.
2. Opptak elektrisk aktivitet fra TensionNerve mens Overvåking Force Generation
- Bestem den laterale og mediale side av benet. Den mediale side har en myk konsistens som kan bli følt ved å knipe forsiktig i meropodite regionen med en fingernegl.
- Plasser denne myke cuticle siden opp i fatet. Den Excitor motor nerve som innervates åpneren muskel innervates også båren muskel i carpopodite.
- For å stimulere åpneren muskelen båren motor nerve i carpodite regionen er isolert og stimulert med en sugeelektrode. Den proksimale delen av beinet er fjernet av transecting den meropodite med saks.
- Fjerne en seksjon av hårstråene i carpus region på den indre side (medial side, figur 5A).
- Skjær apodeme av bender muskler og fjerne muskelen forsiktig for ikke å trekke hoved etappe nerve ut av benet hulrom (figur 5B, C oppmerksom pilene hvor du Bender apodeme er skilt). Hoved etappe nerve og en BHnch til båren muskelen kan deretter bli observert (figur 5D).
- Finn nerve forgreninger fra hovednervebunt til båren muskler (figur 5E, ved pilen). Dette kan kuttes nær den muskel og trukket inn i en suge-elektrode for å stimulere (fig 5F og G, viser pilen grenen).
- Erte ut en del av den nerven som projiserer mot åpneren uten klemming nerve. Transektet båren / åpneren motor nerve.
- Trekk motor nerve inn i sugeelektrode og deretter stimulere den.
- For å avsløre åpneren muskel og spenning nerve fjerne nærmere muskel og ventral regionen i propodite. Klipp av nærmere muskel med en skalpell med en # 11 blad i propodite (figur 6). Merk: Ikke kutt dypt i proksimale regionen fordi det kan skade åpneren motor nerve.
Figur 6. Skjær skjellaget på ventral halvdel av propodite å eksponere nærmere muskel slik at den kan fjernes. Klikk her for å se større bilde . - Bytt saltvann med frisk avkjølt saltløsning gjennom disseksjon prosessen for å holde levende neuroner. For ytterligere disseksjon, plasser forberedelse fatet under et dissekere mikroskop og bruke fiberoptisk belysning.
- Skjær forsiktig nærmere senen fra sitt feste tilden Dactyls bruker spisse mellomstore saks.
- Vær veldig forsiktig for ikke å forstyrre grenene til åpneren muskel fra den viktigste etappe nerve som skal være godt synlig.
- Fjern og kast nærmere muskel og sene.
- Lag et hull i Dactyls med en disseksjon pin. Dette hull brukes senere til å hekte metallstiften på spenningen (kraften) svinger, men det er nødvendig for å gjøre det på dette stadium av fremgangsmåten.
- Finn nerve gren som projiserer til åpneren muskel og apodeme i distal regionen åpneren muskel. Sondere nerve nøye med brann-polert glass verktøy.
- Observer spenningen nerve som dannes fra den distale ende av apodeme og fortsetter til motoren nervebunt.
- For å detektere nevral aktivitet, fylle en sugeelektrode med krabbe saltvann og trekke kuttet ende av åpneren spenning nerven inn i elektroden. Påse at suge elektroden sitter tett på nerven.
- Undersøk for neural korrelerer av passiv spenning på åpneren apodeme. Mens du spiller elektrisk aktivitet fra spenningen nerve, rotere Dactyls raskt inn i en utvidet felles (dvs. strekker åpneren muskelen).
- Deretter test virksomme kraft utforming i forhold til frekvens stimulering.
- Fast feste en metallkrok, slik at spissen av kroken går gjennom et lite hull i Dactyl.
- . Fest den andre enden av metallkroken til krafttransduktor Merk: Kontroller at svingeren er på en 90 ° vinkel hver gang slik at bolten er vinkelrett på svingeren for maksimal påvisning av kraften genereres.
- Trekk kroken og Dactyl slik at det er omtrent 45 ° vinkel til åpnerens felles.
- Nå stimulere nerve motor ved 100 Hz for 250 millisekunder, og måle kraften samt avfyringsfrekvensen for spenningen nerve.
- Plasser felles inn i en helt ut slik at åpneren muskelfibre er slapp.
- Stimulate motor nerve ved 100 Hz for 250 millisekunder, og måle kraften samt avfyringsfrekvensen for spenningen nerve.
- Bend / bøye leddet slik at det er fullt bøyd (~ 90 °). I denne stilling muskelfibrer av åpneren er helt strukket. Det kan være noen kraft målt av transduseren som følge av denne passive strekning av muskelen.
- Stimuler motor nerve ved 100 Hz for 250 msek, og måle kraften samt avfyringsfrekvensen for spenningen nerve.
- Etter måling av en kraft, gå frem på en serie av ulike frekvenser: 20, 40, 60, 80, og 100 Hz i 8-10 sekunder i hvert ledd stilling.
- Måle responsen med en rask avspenning. Plasser preparatet, slik at kroken på krafttransduktor lett kan trykkes ut av hullet i Dactyl.
- Bend / bøye leddet slik at det er fullt bøyd (~ 90 °). Nå stimulere nerve motor ved 100 Hz med et kontinuerlig stimulering av 5 sek.
- Etter den første second eller mindre, så spenningen har bygget opp på åpneren muskler, presse pinnen ut av hullet i Dactyls.
- Undersøke spenningen nerve opptak før og etter utgivelsen av pinnen holder Dactyls.
- Regulerende effekt av neuroactive stoffer som octopamine, serotonin og proctolin, som endrer utgangen fra spennings nevroner, kan bestemmes ved å tilsette disse molekylene til bademateriale over de eksponerte åpneren muskel og gjenta eksperimentene.
- Bruk en pipette og drypp 1-2 ml over forberedelse.
Tre. Farging perifere nervesystemet Structures i Crustacean Walking Legs
- Metylenblått teknikk
- Fortynn en del metylenblått klorid stamløsning (0,25%) med to deler av destillert vann.
- Til denne blanding til fem deler av bufret saltløsning. Grundig vanne området av interesse.
- Dissekere en etappe i henhold til protokollen i § 1. Inkuber pregjøring i det metylenblå-oppløsning ved 12 til 13 ° C.
- Undersøk preparatet hver 10-15 min med dissekere mikroskop bruker lav intensitet belysning for å følge utviklingen av fargingen. I noen tilfeller flekker vil være ferdig i en time, i andre kan det ta hele natta.
- 4-di-2-ASP teknikken
- Fluorescerende fargestoffer kan brukes til å tilbake-fylle PD neuron eller direkte beis fremstillingen fra badekaret. Men en egnet mikroskop med evner til å vise den fluorescerende flekken er nødvendig.
- Dissekere en etappe i henhold til en protokoll i § 1.
- Inkuber ved fremstilling i en 10 mM konsentrasjon av 4-di-2-ASP-løsning, og la preparatet i kjøleskap i 15 min. Bruk akkurat nok oppløsning til å dekke fremstillingen.
- Fotografere forberedelsene raskt og unngå over eksponering for kvikksølv lys. Dette fluorescerende fargestoff fades bort relativt raskt.
- Utsett PD nerve i henhold til protokollen i § 1 og holde den nedsenket i kaldt saltvann.
- Lag en vaselin godt å holde CoCl to. Hvis noen CoCl to søl i saltvann badekaret hele forberedelse vil farge svart, og preparatet bør kastes.
- Slip et lite snitt av en polystyren-ark, for å lage et plast-plattform, og feste den på en slik måte at det ikke vil flyte bort eller bli nedsenket i saltholdig bad (figur 7).
Figur 7. Isopor ark med pinner for å holde på plass i fatet. Klikk her for å se større bilde . - Eject vaselin fra en fin kanyle festet til en engangssprøyte,deretter foreta en barriere (en sirkel kan fungere bra), som bør være omtrent 1-1,5 mm høy med unntak av en grunt "V" ved midtpunktet, hvor nerven blir drapert over, på toppen av slip av polystyren.
- Lag en liten dam av saltløsning på begge sider av barrieren nærheten av "V". Tar seg ikke å strekke eller klemmer nerve, løfte nerve nøye fra fatet og legg den i saltvann vanndam i vaselin godt.
- Arbeid raskt slik at den delen av nerve ikke tørker ut, nøye løse ut vaselin for å dekke utsatte nerve. Nå teste barriere med saltvann og sørg for at den ikke lekker.
- Blot bort saltvann på innsiden av barrieren og se om det fylles opp når badekaret saltvann er høy rundt veggen av vaselin for å være sikker på at de to sidene er isolert fra hverandre (figur 8).
- Transportere bort saltvann i brønnen ved hjelp av et stykke silkepapir. Unngå å la papiret bryte opp nerve.
- Lag en ny dam ved hjelp av noen små dråper destillert vann, og deretter kutte nerve slutt. Vær svært forsiktig med å trekke nerve gjennom barrieren når du gjør kuttet. Osmotisk sjokk av destillert vann vil "ballong" axons.
- Innen 30 sek legge en liten dråpe CoCl to til vannet, suge opp denne løsningen, og deretter legge nok CoCl to for å danne en dam enn dette forkortet delen av nerve (Figur 9). Forberedelsene er best holdes nedkjølt ved 13 ° C i 12-24 timer.
tp_upload/51050/51050fig9.jpg "width =" 500px "/>
Figur 9. Kuttet PD nerve blir utsatt for CoCl to. Kuttet nerve sveller opp i nærvær av vann som forenkler og akselererer bevegelsen av fargestoffer gjennom axons inn i nervecellen celle organer. Klikk her for å se større bilde . - Fjern de fuktig pytter. Blot bort kobolt løsning ved hjelp av en vev og vaske bort rester av kobolt med flere endringer av saltvann.
- Overfør den isolerte forberedelse til en liten glasspetriskål inneholdende omtrent 10 ml av krabbe saltvann. Nervecellene ble vasket og de følgende trinn utføres in situ. Gode metallredskaper skal ikke brukes til å håndtere preparatet etter dette trinnet (du bør bruke spesifikke verktøy som ikke skal brukes på et senere tidspunkt for fysiologi).
- Legg 1-2 dråper ammoniumsulfid (NH4) 2-S til saltvann. Cap (NH 4) 2 S flasken tett og legg tilbake i panseret. Legg merke til at reaksjonen i preparatet under et disseksjonsmikroskop
- Innen 1-2 min, bør kobolt-fylt nevroner og deres prosesser begynner å dukke opp, fordi de vil farge sort.
- Etter 5-10 min, erstatte utbyggingsløsning med friskt saltvann.
- Vær sikker på at den utbyggingsløsningen du har strømmet inn i vasken renne følges av rennende vann fra springen i noen minutter eller i en avfallsflaske med lokk.
- Hell ut saltvann og fikse nerve forberedelse for ca 15 min med to endringer av Bouin løsning fiksativ. For større vev som åpneren muskelen (for å flekke spenning nevroner), øke varigheten av fiksering til 30 min.
- Dehydrerer i en serie med stigende konsentrasjon av etanol som begynner ved 70% (dvs. 70%, 80%, 90%, 100%). Om 10 min ved hver konsentrasjon er tilstrekkelig forsmå vev.
- Etter ca 10-15 min i to endringer av 100% etanol, fjerne vev ved å erstatte etanol med 100% metylsalisylat. Utarbeidelsen vil bo i denne løsningen permanent for gjentatt visning. Med tiden de fylte celler vil fremgå at det omkringliggende vevet vil bli klarere. Intensive metoder kan brukes for å hindre falming over tid 25.
- Bruk samme fremgangsmåte for å fylle spenningen nerve med CoCl to. Imidlertid endrer etanol-løsning flere ganger i hvert etanol dehydratiseringstrinnet og inkuber preparatet inne alkohol i ca 20 min for hvert trinn for å grundig dehydrere musklene og tillate dem å fjerne godt.
Representative Results
Da PD-organ er strukket ved fullt forlenget felles, er aktiviteten i PD nerve robust under bevegelsen som vist for det første sekund i figur 10.. Noen aktivitet forblir så lenge den holdes fremdeles i åpen stilling. Denne aktiviteten er fra den statiske stilling sensitive neuroner (andre halvdel av opptaket er vist i figur 10). Bevegelse fremkaller en respons under forskyvning, og avfyring er for det meste til stede under strekking av chordotonal tråd (fig. 11).
Videre analyser av toppene kan lett nærmet ved å sortere de relative amplitudene. Dette er en tilnærming for å demonstrere ulike populasjoner av sensoriske nerveceller som blir rekruttert til stillinger eller typer av bevegelser fem. Typiske amplituder varierer 0,25 til 1,5 mV, men disse verdier er avhengig av motstanden (dvs. tetthet) av sugeelektrode tetning. Frekvens av toppene i tHan forskjellige størrelsesområder kan også grafisk vist for analyse.
Krefter som genereres av åpneren muskelen med hensyn til stimuleringen frekvensen kan bli sammenlignet ved å legge over de respektive spenningstids spor på toppen av hverandre (figurene 13A og B). Dette kan også bli utført for hver felles posisjon på hver gitt stimuleringsfrekvensen. Aktiviteten av spenningen nerve kan deretter korreleres med mengden av relative kraft generert ved hver stimuleringsfrekvens, og for hver felles posisjon. Som i PD nerve, har en rekke pigg amplituder sett som reaksjon på sammentrekningen av åpneren muskelen (figur 13C).
Anatomisk arrangement av nerveceller i gang beinet er tydelig observert med metylenblå farging (Figur 14). Merk strikken chordotonal strand og spenning nervecellen som er i nærheten av apodeme. Flere somata med forskjellige diametre end bestemte steder er også synlig i dette tallet. Den hele løpet av spenningen nerve og båre motor nerve er vist i figur 15.. Individuelle neurons av PD nerve er vist med høyere kontrast ved anvendelse av 4-di-2-ASP (figur 16), og CoCl 2 (figur 17) tilbakefyllingsteknikker. Ved høy forstørrelse de sensoriske avslutninger kan sees inne i de støttende scolopales (Tall 16B) 21,22,26.
Figur 10. Flytt og hold på 0 °. De dynamiske nevroner er robuste i skyting under bevegelsen og toppene fra statiske følsomme nerveceller er til stede mens leddet holdes åpen. Klikk her for å se større bilde </ A>.
Figur 11. Rapid åpne og lukke fra fullt bøyes til utvidet (90-0 °). Klikk her for å se større bilde .
Figur 12. Ekstracellulære pigger registrert fra PD nerve. Skjøten er trukket helt ut og deretter flyttet raskt til en ½ bøyd stilling og deretter holdt fremdeles. Legg merke til den aktiviteten under bevegelsen og redusert aktivitet når statisk. Klikk her for å se større image.
Figur 13. De relative krefter som er utviklet med det felles fullt bøyd og stimulert ved de forskjellige frekvenser. (A) Spenning-tid spor fra kraft transduseren er vist med hver stimuleringsfrekvensen. (B) Sporene i panel A er lagret i forskjellige farger for enkel i sammenligning. (C) Spenning-tiden spor av elektrisk aktivitet registrert fra spenningen nerve når motoren nerve ble stimulert ved 80 Hz. Legg merke til regelmessig mønster av stimulanse gjenstander som i forhold til den nevrale aktiviteten. Vær også oppmerksom på de ulike amplituder av de nevrale responser. Klikk her for å se større bilde .
Figur 14. Metylenblått flekken av walking etappe forberedelse. Individuelle Somas er vist med de sensoriske ender som rager inn i den elastiske tråden. Nær apodeme en spenning nevron vises. Klikk her for å se større bilde .
Figur 15. Spenningen nerve oppstår fra distal ende (røde piler) og bli med i den motoriske nerven (grønn pil). Klikk her for å se større bilde .
Figur 16. (A) En back-fill av PD nerve i Cancer magister med 4-Di-2-ASP. (B) Høyere forstørrelse av sensoriske avslutninger. Klikk her for å se større bilde .
Figur 17. Nevroner som ble fylt med CoCl 2 og bearbeidede (A). Spores omrisset av farget preparat vist (B). Klikk her for å se større bilde .
| Saline | g / L |
| NaCl | 27.29 |
| KCl | 0,81 |
| MgSo4 • 7H 2 O | 4,81 |
| CaCl 2 • 2H 2 O | 1,85 |
| Na 2 SO 4 • 10H 2 O | 0,97 |
| 1.982 | |
| HEPES syre | 0.476 |
| HEPES salt | 2,08 |
| Juster til pH 8,1 med NaOH eller HCl |
Tabell 1. Oppskrifter på krabbe saltvann.
Discussion
Hensikten med dette sett av eksperimenter er 1) å lære og oppviser de grunnleggende prinsipper for ekstracellulære opptak fra et identifiserbart proprioseptive organ og spenning nerve og 2) for å understreke betydningen av anatomiske kartlegging i forbindelse med fysiologisk funksjon av bestemte sensoriske systemer. Dette eksperimentell tilnærming og dyremodeller benyttes er billig og relativt enkelt å gjennomføre i nevrofysiologi undervisning laboratorier.
Nervecellene i chordotonal organer er av to spesifikke funksjonelle typer, de som reagerer på bevegelsen og de som svarer til statiske posisjoner. Encellete opptak fra en rekke chordotonal organer, uansett hvilken felles er undersøkt, har vist at dette er tilfelle 3,5. Faktisk chordotonal organer knyttet til antennal leddene hummer avsløre de samme to sensoriske typer og grunnleggende anatomi 27. I tillegg til at det finnes to typer nervecellen (bevegelse og posion), nervecellene har samme anatomiske arrangement på de respektive elastiske tråder. Den store somata plassert proksimalt på strand tendens til å tilhøre de dynamiske bevegelsessensitive nevroner. Nevroner som signaliserer statiske posisjoner har liten somata og ligger distalt. Disse cellene er tonically aktive. PD joint bare inneholder en enkelt chordotonal organ, mens det er to chordotonal organer i carpus-propodus (CP) og Merus-carpus (MC) leddene.
Disseksjon å eksponere proprioseptive strukturer i blå krabber (C. sapidus) for elektrofysiologisk registrering krever en strategi som gjør at felles bevegelser skal skje i de naturlige posisjoner mens du tar opp fra sensoriske nerveceller. Spenningen nerve for åpneren muskelen i gang benet er en meget fin nerve består av flere neuroner. Dersom forsiktighet er tatt, spenningen nerve så vel som den motor nerve innervating muskelen skal stimuleres, kan bli skadet under denne disseksjon. Foroptimalt opptak av suge elektroder må tilpasses til størrelsen av den nerven. Innspillinger er lett tilgjengelig i en student laboratorium med en 30-40X forstørrelse dissekere mikroskop og low-end micromanipulators.
Fremtidige eksperimenter som ville være interessant å forfølge med felles chordotonal organer ville være å undersøke de strukturelle og fysiologiske profiler under beinet regenerering hos ulike arter på ulike stadier i livsløpet som en oppfølging til en innledende studie som brukte Cancer magister 19,26 . Spørsmål som gjenstår å bli adressert er en) gjør fordeling og organisering av regenerert nevroner avhenge av alderen på dyret ved regenerering av et lem, 2) er de aksonale fremført til CNS (ventrale nerve ledningen) i en oppkvikkende lem funksjonell eller gjør det ta tid og felles bruk for å etablere funksjonelle forbindelser, og 3) hva som skjer med de avkuttede axoner proksimale til autotomy planet når lem er Autotomized? 28
Krepsdyr er i samsvar med miljøforhold og deres omkringliggende temperatur, men det er uklart hvordan de opprettholder koordinering innenfor en nevral krets som nevroner endre sin aktivitet i respons på temperaturendringer. En langsom hastighet på endring kan tillate dyret noen tid for akklimatisering mens en rask endring kan not29, 30.. Fysiologiske endringer i pH eller osmolaritet på grunn av stoffskiftet, atferd 31, eller miljøpåvirkning kan presentere lignende utfordringer til nevrale kretser som er involvert i propriosepsjon. Disse krepsdyr preparater er ideelle for å ta opp slike problemer fordi deres funksjon er også karakterisert ved en enkelt celle-nivå.
I denne protokollen har vi demonstrert den fysiologiske betydningen av spenning nevroner i overvåking kraft generert av åpneren muskelen. Disse spenn reseptorer kan spores tilbake til sin plassering i apodeme ved hjelp av fargingsprosedyrer. Dissenevroner, som i pattedyr, oppdage kraft på ulike nivåer og rekruttere flere nevroner som kraft øker. Frekvensen i aktivitet er relatert til stimulering frekvensen til motor neuron inntil metning i mottaket er nådd. Ved hjelp av en quick release protokoll med bøyd dactylus felles, spenning aktivitet forsvinner raskt, men deretter returnerer Når pasienten igjen spenning i en fullt utvidet felles. Dette er en klassisk eksperimentell prosedyre for å illustrere den kraft som måles av strekk reseptorer. Forskjellige neuromodulators kan anvendes ved fremstillingen for å se hvordan dette påvirker utvikling av kraft og neuronal respons. Ett av de viktige aspekter er slik neural responser bearbeides og integreres i det sentrale nervesystemet, og deres innvirkning på aktiviteten av motoriske nevroner. Teknikkene vi har vist at en til å begynne å ta opp mer informasjon om spenningen (sensorisk) nerve-motor nevron kretsen funksjon, dvs. signal i en intakt beinet til ganglion og tilbaketil muskelen.
De farvningsprosedyrer demonstrert er nøkkelen til å forstå fysiologi av sensoriske nevroner som innerverer proprioceptive organer. Anatomiske arrangement av nervecellene basert på funksjon og størrelsen av soma er like i de forskjellige chordotonal organer i krabbe. Det er ikke kjent om lignende nevrale ordninger er også funnet i andre krepsdyrarter eller insekter. Kombinere fysiologiske opptak fra enkeltceller og kartlegge plasseringen tillater direkte struktur funksjon relasjoner. Den langsiktige bevaring av anatomisk ordning med CoCl to flekker og fiksering gjør det mulig å gjentagelser gjøre tiltak og vurdere de strukturelle ordningen.
Propriosepsjon og spenning mottak av skjelettmuskulaturen er sensoriske modaliteter som gjør det mulig koordinert atferd og reaksjoner på ytre og indre miljø for rammestyrte dyr i en rekke av skjelettmuskulatur konfigurasjons. Muskelen reseptor orgel i magen av kreps er en annen veldokumentert preparat (se Crawdad prosjekt; http://www.crawdad.cornell.edu/ ) for undervisningsformål propriosepsjon med bare to nerveceller per abdominal hemi-segmentet 23 . Å kunne ta opp fra enkeltnerveceller til sensoriske nervebunter gir ytterligere detaljer som hjelpemiddel i å forstå de grunnleggende prinsippene for sensorisk mottak. Disse relativt enkle krepsdyr forberedelser tillater en å løse grunnleggende aspekter av propriosepsjon og spenning overvåking, med potensial til å bestemme de nevrale kretser som muliggjør sentrale integrering av proprioseptive og andre sanseinntrykk 9-12, 32, 33.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for de kunstneriske bidragene fra Hyewon Cooper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| HEPES base | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
| CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
| Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Materials | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | Any company | ||
| Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | Any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | Any company | ||
| Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |
References
- Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
- Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).
- Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
- Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109 (2), 479-486 (1994).
- Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81 (4), 447-475 (2008).
- Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
- Hill, A. V. First and Last Experiments in Muscle Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, U.K. (1970).
- Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14 (3), 274-292 (1972).
- Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1 (1-4), 185-208 (1972).
- Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221 (2), 185-198 (1983).
- El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 337-349 (1991).
- Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88 (5), 2575-2588 (2002).
- Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78 (6), 3133-3143 (1997).
- Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
- Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38 (01), 01-143 (1959).
- Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157 (3), 355-362 (1985).
- Holsinger, R. The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. , University of Kentucky. (2013).
- Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211 (1), 139-149 (1980).
- Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72 (2), 391-399 (1982).
- Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180 (3), 215-221 (1997).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245 (725), 291-325 (1962).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248 (752), 437-456 (1965).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322 (2011).
- Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
- Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).
- Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).
- Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).
- Chung, Y. -S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).
- Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).
- Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. , (2013).
- Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).
