Summary
Fizyolojik ve anatomik teknikler kabuklu yürüme bacaklarda eklem proprioseptörlere ve kas gerginliği reseptörleri için işlevini ve yapısını ele gösterilmiştir.
Abstract
Bu işlemlerin temel amacı, ortak konumunu ve hareketini tespit ve kas gerginliği gibi propriosepsiyon sorumlu primer duyusal nöronları yaşam aktivitesini kaydetmek için nasıl öğretim ve araştırma amaçlı göstermektir. Kabuklu proprioseptörlere ve gerilim reseptörlerinden elektriksel aktivitesi temel nörofizyolojik enstrümantasyon tarafından kaydedilir ve bir dönüştürücü aynı zamanda, bir motor sinir uyarıcı tarafından oluşturulan kuvvetini ölçmek için kullanılır. Buna ek olarak, biz onların anatomik düzenlemenin hızlı bir değerlendirme için veya kalıcı tespit için nöronlar leke nasıl gösterilmektedir. Boyama en kabuklularda chordotonal organların temsili anatomik organizasyon ortaya koymaktadır. Proprioseptif yanıtları gerginlik sinir yanıtları karşılaştırarak bu duyusal nöronlar fonksiyonel olarak tanımlanmış ve nasıl anatomi işlevine ilişkilidir nasıl belirlemede etkili bir öğretim aracıdır. Üç boyama teknikleriaraştırmacılar ve öğretim laboratuvar için ideal bir yöntem seçmek için izin sunulmaktadır.
Introduction
Propriyosepsiyon koordine motor davranış sağlayan ekstremite pozisyon ve hareket hissi olduğunu. Proprioseptörlere pozisyonunda (statik) ve hareket (kinestetik) reseptörleri oluşur. Böcekler ve kabuklular olarak, chordotonal organları MSS 1 bu bilgileri sağlayan yapılardır. Tüm chordotonal organların ortak bir yayılabilir ama onlar hala nedeniyle eklem yayılan ve iskelet kas ve eklem kıkırdağında ile birlikte hareket apodemes (yapılar gibi tendon) kendi eki eklem hareketlerini izleyebilirsiniz. Yengeç bacakları altı eklem, bir ya da iki chordotonal organları 2 olan her var. Tipik bir chordotonal organı elastik bir iplikçik içinde gömülü 60-100 veya daha fazla duyusal nöronlar, statik ortak pozisyon, yön ve hareket 3-6 hızını sinyal nöronlar vardır. Her eklem ve bacak chordotonal organlardan input merkezi hayvan tarafından koordineli hareketleri sağlayan işlenir.
Aşağıda gösterildiği prosedürleri chordotonal elastik iplikçik ve apodeme kendi konumuna göre reseptörlerinin her iki tür innerve nöronların yapısal ve fonksiyonel analiz sağlar. Göstermek için, biz propodite-dactylopodite (PD) chordotonal organı, yengeç bacağı 3 distal en segmentini kapsayan organı kullanın.Ayrıntılı elektrofizyolojik çalışmalar 1930'larda başladı ve bugün hala yürütülmektedir rağmen, bazı yönleri muscles10-16 koordineli kontrolünde çeşitli eklem ve rolleri proprioseptörlere segmental bağlantıları hakkında bilinen haline gelmiştir. Proprioseptif organlar, kaslar ve sinir sistemi arasındaki yapı-fonksiyon ilişkisini kuran ayrıca bu rolleri tanımlamak yardımcı olacaktır. Örneğin, somata ve apodeme yerleştirilen germe nöronların uzak uçları etiketleme kas liflerinin 8,17-21 için kendi göreli konum ortaya çıkaracaktır.
Biz araştırma veya akademik laboratuvarlarda kullanılan kabuklu bacaklar için üç boyama tekniklerini sunuyoruz. Metilen mavisi boyama kaslar ve sinirler için uygun kontrast sağlar ve öğrencilerin anatomi öğrenmek için basit bir teknik olarak önerilmektedir. Floresan mikroskopi kurulumları Labs kısaca siniri açığa daha seçici nöronal boyanma başarabilirsinizhayati boya 4-di-2-ASP s. Üçüncü bir alternatif nöronları lekeler ve düzeltmeleri CoCl2 dolgu, ve flüoresan görüntüleme gerektirmez. Emek ve zaman yoğun olmasına rağmen, bu boyama işlemi dolu sinirler için yüksek kontrast ve seçiciliğini verir. Birlikte bu teknikler, bir uzuv içinde veya komponentler arasında değil, aynı zamanda diğer kabuklu böcek türleri ve 20-22 arasında, çeşitli chordotonal organları karşılaştırmak için kullanılabilir. Fizyolojik kayıtları ve anatomik boyanması için kullanılan mavi yengeç (C. sapidus) tüm Amerika Birleşik Devletleri'nin Güney ve Güneydoğu sınır çevresinde hazır. Bu tür çoğu yengeçler bulunan chordotonal ve gerginlik sinir düzenlemelerin bir temsilcisi olarak hizmet vermektedir. Batı kıyısında Laboratuvarları bu deneyler için çok daha büyük Dungeness Yengeç (Cancer magister) kullanmayı tercih edecektir.
Protocol
1.. Propodite-dactylopodite (PD) Sinir gelen Diseksiyon ve Kayıt Elektrik Etkinliği
- Arkasından karapaksla karşısında Yengeç tutun ve pençeleri kaçınarak, forseps ile meropodite proksimal kısmını çimdik. Bacak ölüme kanama hayvan önlemek için autotomize olacaktır. Onlar yerine agresif ve çok hızlı olarak mavi yengeçler tutarken dikkatli olun.
Şekil 1. İlk yengeç bacağını yürüyüş. Chordotonal organların (taralı bölgeler) arasında anatomik konumu bu şekil üzerine bindirilmiş. Çift ok başı nerede PD sinir deneyler için bacak transect gösterir. resmi büyütmek için buraya tıklayın . - Propodite ve carpodite arasında bir kesim olun. Carpopodite ve t atın o (Şekil 1) meropodite eklenmiş.
- . Derinden kesmeyin: # 11 bıçak (Şekil 2 ve 3) Not ile bir neşter ile propodite pigmentli (lateral) taraftaki manikür büyük bir pencere kesti.
- Altında neşter bıçağı kaydırarak Kütikül çıkarın ve manikür paralel. Bu kütikül bağlı kas liflerinin koparır.
- Aynı tekniği kullanarak pigmentless propodite (medial) tarafında küçük bir pencere kesmek, ama (mafsal ya da bölümler arasındaki menteşe) kondilini bırakın eki bozulmamış.
Şekil 2. Propodite noktalı çizgi boyunca kesin. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
n "src =" / files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg "width =" 500px "/>
Şekil 3. Penceresinde siniri (oklar sinir demeti özetleyecek) Açığa. resmi büyütmek için buraya tıklayın . - Aşağı hazırlık pin yengeç tuzlu su içeren bir Sylgard kaplı çanak hazırlayın Not:. Türe özgü tuzlu yemek tarifleri için Tablo 1'e bakınız.
- Dikkatle yangın parlatılmış cam iğne ile araştırılarak PD organı bulun. Eklemi kapsayan elastik kordon gümüş bir görünüme sahiptir.
- Tendonun her iki taraftan organ görünümünü belirsiz kas liflerini çıkarın. PD organ veya onun sinir kesmemeye çok dikkatli olun.
- Bu sağlandıktan sonra, sıkıca (Şekil 4) yukarı bakacak (yanal) pigment tarafı ile çanak hazırlık yatıştırıldı.
Şekil 4. PD organ ve sinir Exposed. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
- Özgür-up sinir uzun bir uzunluğu (1.5 cm) kayıt amaçlı sırayla kadar proksimale mümkün Propodite yılında PD organı sinir izleyin. PD sinir hala ana bacak sinirine takılı iken bu en iyi yapılır.
- Cam iğneler yardımı ile ana bacak sinir PD sinir ayırdıktan sonra, iris makası ile proksimale PD sinir sever Not:. Diseksiyonu sırasında germek veya sinir çekmeyin.
- Uzatılmış ve tam fleksiyon konuma dactylopodite getirin. Aşırı fleksiyon ve ekstansiyon pozisyonları ve daha sonra kullanılmak üzere bir yarım noktası nerede not alın.
- Tuzlu su banyosu içinde bir topraklama kablosu yerleştirin.
- E açınlectrophysiology kayıt donanım / yazılım Not:. Bizim kurulum önce 23 tarif edilmiştir.
- Bu mikroskop sahne bakan böylece mikroskop yerleştirin. Hazırlık çanak sahnede yerleştirildikten sonra, en iyi hazırlık görselleştirmek için yüksek yoğunluklu aydınlatıcı ışınının konumunu ayarlamak gerekir.
- Ekli emme elektrot takımı tuzlu su banyosu ve hazırlanması kolay erişim böylece mikromanipülatör yerleştirin. Bir online video 24 de gösterildiği gibi, emme elektrodu inşa edilmiştir.
- , Nöral aktiviteyi tespit emme elektrot içine PD sinirin kesik ucunu çizmek için.
- Bir cam prob veya tahta takoz yardımı ile birkaç döngüleri için genişletilmiş ve fleksiyonda pozisyonlarda boyunca Dactyl taşıyın.
- Dactyl, genişletilmiş fleksiyonda ve orta pozisyonlarda tutturulmuş zaman bir sonraki etkinliği gözlemlemek.
2. Gerginlik Elektrik Hareketi KayıtKuvvet Nesil İzleme sinir ederken
- Bacağın lateral ve medial tarafı belirler. Medial tarafı bir tırnak ile Meropodite bölgede hafifçe sıkarak hissedilebilir bir yumuşak bir dokuya sahiptir.
- Çanak, bu yumuşak manikür tarafı yukarı yerleştirin. Açıcı kas innervates excitor motor sinir da Carpopodite sedye kas innerve.
- Açıcı kas uyarmak amacıyla carpodite bölgedeki sedye motor sinir izole edilir ve bir emme elektrodu ile uyarılır. Bacağın proksimal kısmı makasla meropodite kesilmesiyle çıkarılır.
- Iç taraftaki bilek bölgesindeki kütikül bir bölümünü (medial yan, Şekil 5A) çıkarın.
- Bükücü kas apodeme kesin ve bacak boşluğundan dışarı ana bacak sinir çekme olmayacak şekilde kas çıkarın (Şekil 5B, C apodeme ayrılır bender için oklara dikkat edin). Ana bacak sinir ve bir sutyenNCH sedye kas sonra (Şekil 5D) gözlenebilir.
- Sedye kas (ok at Şekil 5E) ana sinir demeti dallanma sinir bulun. Bu yakın kas kesmek ve uyarmak için bir emme elektrot içine çekilebilir (Şekil 5F ve G, ok dalı gösteriyor).
- Siniri sıkıştırmasıyla olmadan açacağı doğru çıkıntı sinirin bir bölümünü kızdırmak. Sedye / açacağı motor sinir transect.
- Emme elektrodu içine motor sinir çekin ve sonra uyarır.
- Açıcı kas ve sinir gerginlik maruz yakın kas ve propodite ventral bölgesini kaldırın. Propodite bir # 11 bıçak (Şekil 6) ile bir neşter ile yakın kas kesti Not:. Bunun açacağı motor sinirine zarar verebilir çünkü yakın bölgede derin kesmeyin.
Şekil 6,. Kaldırılamaz böylece yakın kas maruz propodite ventral yarısında manikür kesti. resmi büyütmek için buraya tıklayın . - Canlı nöronlar tutmak için diseksiyon işlemi boyunca taze soğutulmuş tuzlu suyla tuzlu değişimi. Daha fazla diseksiyon için, bir mikroskop altında hazırlanması çanak yerleştirin ve fiber optik aydınlatma kullanın.
- Dikkatli olan ek yakın tendon kestisivri uçlu orta boy makas kullanarak dactyl.
- Açıkça görünür olmalıdır ana bacak sinir açıcı kas dalları rahatsız etmemek için çok dikkatli olun.
- Çıkarın ve yakın kas ve tendon atın.
- Bir diseksiyon iğne ile Dactyl bir delik açın. Bu delik, bir gerilim (kuvvet) dönüştürücü metal pim bağlamak için daha sonra kullanılabilir, ancak bu işlem, bu aşamada yapmak gereklidir.
- Açıcı kas distal bölgesinde açıcı kas ve apodeme için projeler sinir dalı bulun. Dikkatle yangın parlatılmış cam aracı ile sinir prob.
- Motor sinir demetine apodeme hasılatı distal ucundan ortaya çıkan gerilim sinir dikkate alınmalıdır.
- , Nöral aktiviteyi tespit yengeç tuzlu su ile bir emme elektrot doldurmak ve elektrot içine açacağı gerilim sinirin kesik ucunu çizmek için. Emme elektrot sinir üzerine sıkıca oturduğundan emin olun.
- Neura için inceleyinaçacağı apodeme pasif gerginlik l bağlılaşığı. Gerginlik sinir elektriksel aktivite kaydederken, (yani açacağı kas germe) uzun bir eklem içine hızla Dactyl döndürün.
- Sonraki, stimülasyon frekansı ile ilgili test aktif güç geliştirme.
- Kanca ucu Dactyl küçük bir delikten geçer ve böylece sıkıca metal kanca takmak.
- . Kuvvet transformatörüne metal kanca diğer ucunu Not: pin dik üretilen kuvvetin maksimum tespiti için dönüştürücüye, böylece güç çevrim, 90 ° açı ile her zaman olduğundan emin olun.
- Bu açacağı eklemin yaklaşık 45 ° 'lik açıyla böylece kanca ve Dactyl çekin.
- Şimdi 250 msn için, 100 Hz'de, motor sinir uyarmak ve kuvvet gibi gerilim sinirin ateşleme frekansını ölçmek.
- Açıcı yumuşak kas lifleri, böylece, tam uzatılmış pozisyona ortak yerleştirin.
- S250 msn için, 100 Hz'de, motor sinir ve timulate kuvveti hem de germe sinirin ateşleme frekansını ölçmek.
- Tamamen (~ 90 °) fleksiyonda böylece viraj / eklemi esnetin. Bu konumda açıcının kas lifleri tamamen gerilir. Nedeniyle kas bu pasif germek dönüştürücü tarafından ölçülen bazı güç olabilir.
- 250 msn için, 100 Hz'de, motor sinir ve teşvik kuvveti hem de germe sinirin ateşleme frekansını ölçmek.
- Bir kuvvet ölçüm sonra çeşitli frekansların bir dizi devam: Her ortak konumda, 8-10 saniye boyunca 20, 40, 60, 80, ve 100 Hz.
- Hızlı bir gerilim sürümü ile tepkisini ölçmek. Kuvvet dönüştürücü üzerinde kanca kolayca Dactyl delikten dışarı itilmesi, böylece hazırlık düzenleyin.
- Tamamen (~ 90 °) fleksiyonda böylece viraj / eklemi esnetin. Şimdi 5 sn sürekli stimülasyon ile 100 Hz motor sinirini uyarır.
- İlk secon sonragerginlik açıcı kas inşa gibi d veya daha az, Dactyl delikten dışarı pimini itin.
- Dactyl tutan pimin yayımlanmasından önce ve sonra gerginlik sinir kaydını inceleyin.
- Bu gerilim nöronların çıkışını değiştirmek Octopamine, serotonin ve proctolin gibi nöro-aktif maddelerin modüle edici etkileri, açıktaki açıcı kas üzerinde banyo ortamı için bu moleküllerin eklenmesi ve tekrar deneyleri ile tespit edilebilir.
- Bir pipet kullanın ve hazırlanması üzerinde 1-2 ml damla.
3. Crustacean içinde boyama Periferik Sinir Sistemi Yapıları Ayakları Yürüyüş
- Metilen mavisi tekniği
- Damıtılmış su, iki parçalı bir parça metilen mavisi klorür stok solüsyonu (% 0.25) seyreltin.
- Tamponlu tuz beş parça için bu karışımı ekleyin. Iyice ilgi alanı sulayacak.
- 1. bölümdeki protokole göre bir bacak teşrih. Ön inkübe12-13 ° C'de metilen mavisi çözeltisi içinde Terkip
- Hazırlayıcıları boyamanın ilerleme takip düşük yoğunluklu aydınlatma kullanılarak mikroskop ile her 10-15 dk inceleyin. Boyama diğerleri, bir saat içinde tamamlanmış olacak bazı durumlarda bu gecede alabilir.
- 4-di-2-ASP tekniği
- Floresan boyalar geri-dolgu PD nöron veya doğrudan banyosundan hazırlanmasını leke için kullanılabilir. Ancak floresan boya görüntülemek için yetenekleri olan, uygun bir mikroskop gereklidir.
- 1. bölümdeki bir protokole göre bir bacak teşrih.
- 4-Di-2-ASP çözeltisi, 10 uM konsantrasyonda in hazırlanmasını inkübe edin ve 15 dakika boyunca buzdolabında hazırlanmasını bırakın. Hazırlık karşılamak için yeterli bir çözüm kullanın.
- Hızla hazırlıklarını fotoğraflamak ve cıva ışığa maruz kaldıktan kaçının. Bu floresan boya nispeten hızlı bir şekilde kaybolur.
- 1. bölümde protokolüne göre PD siniri ortaya çıkarmak ve soğuk tuzlu su içinde bekletildi tutun.
- CoCl2 tutmak için jöle de bir petrol olun. Herhangi bir CoCl2 tuzlu su dökülür durumunda tüm hazırlık kara leke, ve preparat atılmalıdır.
- , Bir polistiren levha küçük bir kesim Kayma plastik platformu yapmak için, ve uzakta yüzer veya (Şekil 7) tuzlu su banyosu dalmış haline olmaz böyle bir şekilde bunu pin.
Çanak yerinde tutmak için iğne ile Şekil 7.. Polistiren levha. resmi büyütmek için buraya tıklayın . - Bir tek şırıngaya tutturulmuş ince bir derialtı iğne vazelin çıkarın,sonra sinir polistiren kayma üstüne, üzerinde bol dökümlü olacak orta sığ bir "V" dışında yüksek yaklaşık 1-1.5 mm olmalıdır bir engel (bir daire işe yarayabilecek) yapmak.
- "V" yakın bariyerin iki tarafında tuzlu küçük bir su birikintisi yapın. Germek veya tutam sinir, çanak dikkatlice sinir kaldırın ve jöle de petrol tuzlu su birikintisi içinde yerleştirmek için özen.
- Sinir bölümü siniri açığa karşılamak için vazelin çıkarma dikkatle, kurumasına değil o kadar hızlı çalışır. Şimdi tuzlu su ile bariyer testi ve emin sızıntı olmadığından emin olun.
- Bariyerin iç tuzlu uzak kurutun ve banyo tuzlu iki tarafı (Şekil 8) birbirinden izole edilir emin olmak için vazelin çeperi etrafında yüksek olduğunda doldurur bakın.
- Iyi doku bir parça kağıt kullanarak tuzlu fitil. Kağıt sinir kadar tamamlamayı icar kaçının.
- Distile su birkaç küçük damla kullanarak yeni bir su birikintisi olun ve sonra sinir ucunu kesti. Kesim yaparken bariyer boyunca sinir çekmek için çok dikkatli olun. Distile su ozmotik şok olacak "balon" aksonlar.
- 30 saniye içinde, suya CoCl2 küçük bir damla bu çözüm emmesi ve daha sonra sinirin bu kısaltılmış bölüm (Şekil 9) üzerinde bir su birikintisi oluşturacak kadar CoCl2 ekleyin. Preparatlar en iyi, 12-24 saat boyunca 13 ° C'de buzdolabında saklanır.
tp_upload/51050/51050fig9.jpg "width =" 500px "/>
Şekil 9. Kesim PD sinir CoCl2 maruz. Kesim sinir nöron hücresi bedenlerine aksonlar aracılığıyla boya moleküllerinin hareketini kolaylaştırır ve hızlandırır suyun varlığında şişer. resmi büyütmek için buraya tıklayın . - Nemlendirme su birikintileri çıkarın. Bir dokusu kullanılarak kobalt çözüm uzak kurulayın ve tuzlu çeşitli değişiklikler ile kobalt kalıntıları silsin.
- Yengeç tuzlu çözeltinin yaklaşık 10 ml içeren bir küçük bir cam Petri tabağına izole edilmiş bir preparasyonunu aktarın. Nöronlar, yıkanır ve aşağıdaki adımları yerinde gerçekleştirilir. İyi metal aletler, bu adımdan sonra hazırlık (eğer fizyolojisi için daha sonraki bir zamanda kullanılmak üzere olmayan belirli araçları kullanmak gerekir) işlemek için kullanılacak değildir.
- (Amonyum sülfid 1-2 damla NH4) tuzlu 2 S. Sıkıca (NH 4) 2 S şişe kapağı ve arka kaputun içine yerleştirin. Bir mikroskop altında hazırlanmasında, reaksiyonu dikkate
- 1-2 dakika içinde, kobalt-dolu nöronlar ve bunların işlemleri onlar siyah leke çünkü görünmeye başlamalıdır.
- 5-10 dakika sonra, taze tuzlu çözelti ile geliştirme çözümü değiştirin.
- Eğer lavabonun drenaj dökülür var geliştirme çözümü birkaç dakika veya kapaklı bir çöp şişe akan musluk suyu ile takip emin olun.
- Tuzlu su dökün ve Bouin çözeltisi sabitleyici iki değişiklik ile yaklaşık 15 dakika boyunca sinir hazırlık düzeltin. Açıcı kas gibi daha büyük dokular için (gerilim nöronlar leke), 30 dakika tespitin süresini artırır.
- % 70 (örneğin% 70,% 80,% 90,% 100) başlayan etanol konsantrasyonuna göre artan bir dizi kurutmak. Her bir konsantrasyonda yaklaşık 10 dakika için yeterlidirküçük dokular.
- % 100 etanol iki kez değiştirilerek yaklaşık 10-15 dakika sonra,% 100 metil salisilat ile etanol değiştirerek doku temizleyin. Hazırlık tekrarlanan görüntüleme için sürekli bu çözüm kalacak. Çevredeki doku daha açık hale gelecektir, çünkü zaman ile doldurulmuş hücreler, daha fazla belirgin hale gelecektir. İntensifikasyon yöntemler zaman üzerinde 25 solmaya önlemek için kullanılabilir.
- CoCl 2 ile gerginlik sinir doldurmak için aynı işlemi kullanın. Bununla birlikte, her etanol dehidrasyon adımda etanol çözeltisi birden çok kez değiştirebilir ve iyice kas dihidrat ve onları iyi temizlenmesi için, her adım için yaklaşık 20 dakika boyunca alkol içinde hazırlanmasını inkübe edin.
Representative Results
PD organı tam olarak ortak uzanan ile gerildiği zaman, PD sinir aktivitesi açık konumda hala tutulduğu sürece. Bir miktar etkinlik kalır, Şekil 10 'de birinci, ikinci için gösterildiği gibi, hareket sırasında sağlamdır. Bu aktivite, statik pozisyonu duyarlı nöronlar (Şekil 10'da gösterilen kayıt ikinci yarısı) arasındadır. Hareket sırasında yerinden bir yanıt uyandıran ve ateşleme (Şekil 11) chordotonal şeridinin gerilmesi sırasında çoğunlukla mevcuttur.
Sivri başka bir analizi kolayca göreli genlikleri sıralayarak yaklaştı olabilir. Bu pozisyonlara veya hareketlerin 5 türleri için işe ediliyor duyusal nöronlar farklı popülasyonlar göstermek için bir yaklaşımdır. Tipik genlikleri 0.25-1.5 mV arasında değişir, ancak bu değerler emme elektrot mühür direnci (yani sıkılık) bağlıdır. T sivri SıklığıÇeşitli boyut aralıkları da grafik analizi için temsil edilebilir.
Uyarım frekansı ile ilgili olarak açıcı kas tarafından üretilen kuvvetler (Şekil 13A ve B) birbirlerinin üzerine ilgili gerilim-zaman-izleri üzerine bindirmek sureti ile karşılaştırılabilir. Bu, aynı zamanda, her belirli bir uyarım bir frekansta her bir ortak pozisyon için gerçekleştirilebilir. Germe sinir aktivitesi daha sonra her bir uyarım frekansında üretilen nispi kuvvet miktarı ile ilişkili, ve her bir pozisyon için ortak olabilir. PD sinir olduğu gibi, başak genlikleri çeşitli açıcı kas (Şekil 13C) kasılması görülür.
Yürüme bacak nöronların anatomik düzenleme açıkça metilen mavi lekeleme (Şekil 14) ile görülmektedir. Apodeme yakın elastik chordotonal iplikçik ve gerginlik nöron unutmayın. Farklı çaplara sahip çeşitli somata bird belirli yerleri bu şekilde de görülebilir. Gerilim sinir ve sedye motor sinirin tüm tabii ki, Şekil 15 'de gösterilmiştir. PD sinir bireysel nöronlar 4-Di-2-ASP (Şekil 16) ve CoCl 2 (Şekil 17) teknikleri Dolgu kullanarak yüksek kontrast ile gösterilir. Yüksek büyütmede duyusal sonlar destekleyici scolopales (Şekil 16B) 21,22,26 içinde görülebilir.
Şekil 10. Taşıyın ve 0 ° tutun. Dinamik nöronlar hareketi sırasında ateş sağlam ve ortak açık tutulurken statik duyarlı nöronların ani mevcuttur. resmi büyütmek için tıklayın </ A>.
Şekil 11. Rapid açık ve tamamen genişletilmiş (90-0 °) konumuna fleksiyonda den kapanış. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
PD sinir kaydedildi Şekil 12.. Ekstrasellüler sivri. Eklem tamamen uzatılmış ve daha sonra hızlı bir şekilde ½ taşındı konumunu fleksiyonda ve daha sonra yine yapılır. Hareketi sırasında etkinlik fark ve ne zaman statik aktivite azalmış. büyük ima görmek için buraya tıklayınge.
Şekil 13. Eklem ile geliştirilir bağıl güçleri tamamen fleksiyona ve çeşitli frekanslarda uyarılır. (A) güç dönüştürücüsünden gerilim-zaman-izleri her uyarım frekansı ile gösterilmiştir. (B) Panel A'da izleri karşılaştırıldığında kolaylığı için farklı renklerde birleştirilir. (C) Gerilim-zamanlı motor sinir 80 Hz uyarıldığı zaman gerginlik sinir kaydedilen elektriksel aktivite izleri. Nöral etkinlik ile karşılaştırıldığında uyarıcı eserler düzenli desen dikkat edin. Ayrıca, nöral yanıtların çeşitli genlikleri unutmayın. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Yürüme bacak hazırlık 14. Metilen mavisi leke rakam. Bireysel somas onların duyusal sonlar elastik iplikçik içine çıkıntı ile gösterilir. Bir gerilim nöron gösterilir apodeme yakın. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 15. Uzak ucuna (kırmızı oklar) kaynaklanan ve motor sinir (yeşil ok) katılmadan gerginlik sinir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
4-Di-2-ASP ile Kanser magister yılında PD sinirin Şekil 16.. (A) geri dolgu. (B) duyusal sonlar Yükseköğretim büyütme. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 17. COCI 2 ile dolu ve işlenmiştir Nöronlar (A). Gösterilen lekeli hazırlık takip anahat (B). resmi büyütmek için buraya tıklayın .
| Tuzlu | g / L |
| NaCl | 27.29 |
| KCl | 0.81 |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 4.81 |
| CaCl2 • 2 O 2H | 1.85 |
| Na 2 SO 4 • 2 O 10H | 0.97 |
| 1.982 | |
| Hepes asit | 0.476 |
| Hepes tuz | 2.08 |
| NaOH veya HCI ile pH 8.1 'e ayarlayın |
Tablo 1. Yengeç tuzlu için Tarifler.
Discussion
Bu deney setinin amacı 1) öğretmek ve sergi dışı kayıtların temel ilkelerini tanımlanabilir proprioseptif organ ve gerginlik sinir ve 2) belirli duyusal sistemlerin fizyolojik fonksiyonu ile ilgili anatomik haritalama önemini vurgulamak için. Kullanılan Bu deneysel yaklaşımı ve hayvan modelleri ucuz ve nörofizyoloji öğretim laboratuvarlarda yapmak nispeten kolaydır.
Chordotonal organların nöronlar iki özel fonksiyonel türleri, hareket yanıt olanlar ve statik pozisyonları yanıt olanlar bulunmaktadır. Chordotonal organların çeşitli tek hücre kayıtları olursa olsun, ortak incelendiğinde ki, bu durumda 3,5 olduğu gösterilmiştir. Nitekim, ıstakoz antennal eklem ile ilişkili chordotonal organlar aynı iki duyusal türleri ve temel anatomi 27 ortaya koymaktadır. Orada iki nöron türleri (hareket ve positi olmanın yanı sıra) hakkında, nöronlar ilgili elastik iplik üzerinde aynı anatomik düzenleme paylaşır. Iplikçikteki proksimale büyük somata dinamik hareket hassas nöronlara ait eğilimindedir. Statik pozisyonları sinyal Nöronlar küçük somata var ve distalde yer almaktadır. Bu hücreler, tonik olarak aktiftir. Bilek-propodus (CP) ve Merus-carpus (MC) eklemlerde iki chordotonal organ varken PD ortak tek bir chordotonal organı içerir.
Elektrofizyolojik kayıt için mavi yengeç (C. sapidus) propriosepsiyonda yapılarını göstermek için diseksiyon duyusal nöronlardan kayıt sırasında eklem hareketleri doğal pozisyonlarında yer almak için izin veren bir strateji gerektirir. Yürüyüş bacak açıcı kas gerginliği sinir birkaç nöronlardan oluşan çok ince bir sinir olduğunu. Bakım alınmadığı takdirde, gerginlik sinir yanı sıra motor sinir uyarıldığında edilecek kas innerve, bu diseksiyon sırasında zarar görebilir. Içinuygun kayıtları emme elektrotlar sinir boyutuna uygun olması gerekir. Kayıtlar 30-40X büyütme mikroskop ve düşük-uç mikromanipülatörler kullanan bir öğrenci laboratuvarda kolayca erişilebilir.
Eklem chordotonal organları ile takip etmek ilginç olacaktır Gelecek deneyleri olarak yaşam döngüsünün farklı aşamalarında çeşitli türlerde bacak rejenerasyon sırasında yapısal ve fizyolojik profillerini incelemek olacağını bir Cancer magister 19,26 kullanılan bir ilk çalışmaya kadar takip . Bir uzuv yenileyici ele alınması Kalan Sorular) 1 rejenere nöronların dağıtım ve organizasyon hayvanın yaşına bağlıdır yok, 2) fonksiyonel bir rejenerasyon uzuvun MSS (ventral sinir kablosu) için aksonal projeksiyonlar veya bunu yapar uzuv autot olduğunda fonksiyonel bağlantıları kurmak için zaman ve ortak kullanımı almak, ve 3) ne autotomy düzlemine yakın kopmuş akson oluromized? 28
Kabuklular çevre koşulları ve çevre sıcaklığına uygun, ama nöronlar sıcaklık değişimlerine tepki olarak faaliyetlerini değiştirmek gibi bir nöral devre içinde koordinasyonu sağlamak nasıl belirsizdir. Hızlı bir değişim, 30 not29 oysa değişim hızının az hayvana alışmaları için biraz zaman izin verebilir. Nedeniyle metabolizma, davranış 31, ya da çevresel etkilerle pH veya osmolaritesi fizyolojik değişiklikler propriosepsiyon katılan nöral devreleri benzer zorluklar olabilir. Bu kabuklu hazırlıklarını kendi işlevi de tek hücre düzeyinde karakterize edilir, çünkü bu tür sorunları ele almak için idealdir.
Bu protokolde açıcı kası tarafından üretilen kuvvet izlenmesinde gerginlik nöronların fizyolojik önemini göstermiştir. Bu gerginlik reseptörler boyama prosedürleri kullanarak apodeme içindeki konumlarına izlenebilmektedir. Bunlarnöronlar, memelilerde gibi, çeşitli düzeylerde kuvveti tespit eder ve kuvvet arttıkça ek nöronlar işe. Alımı, doygunluğa ulaşıncaya kadar aktivite sıklığı, motor nöronun uyarım frekansı ile ilgilidir. Fleksiyonda dactylus eklem ile bir çabuk protokolünü kullanarak, gerginlik aktivite hızla kaybolur ama sonra tamamen uzatılmış eklemde gerginlik kazanmak üzerine döner. Bu gerilim, reseptörler tarafından ölçülen kuvvet göstermek için, klasik bir deneysel işlemdir. Çeşitli nöromodülatörler Bu kuvvet ve nöronal yanıtın gelişimini etkileyen görmek için hazırlanmasına uygulanabilir. Önemli yönlerinden biri nöral tepkiler işlenir ve merkezi sinir sistemi ve motor nöron aktivitesi üzerindeki etkileri entegre nasıl. Biz göstermiştir teknikleri bir geri gerginlik (duyu) sinir-motor nöron devresi fonksiyon, gangliyona sağlam bir bacak yani sinyal ve hakkında daha fazla bilgi adres başlamak için izinkas.
Göstermiştir boyama işlemleri proprioseptif organları innerve duyu nöronlarının fizyolojisini anlamak için anahtardır. Fonksiyon ve soma boyutuna göre nöronların anatomik düzenleme Yengeç bacakları içinde çeşitli chordotonal organlarda benzerdir. Benzer nöronal düzenlemeler aynı zamanda diğer kabuklu türleri veya böcek bulunursa bilinmemektedir. Tek hücre fizyolojik kayıtları birleştirerek ve konumunu haritalama doğrudan yapı işlev ilişkileri sağlar. CoCl 2 boyama ve sabitleme ile anatomik düzenlemenin uzun vadeli koruma biri arkaya tedbirleri yapmak ve yapısal düzenleme değerlendirmenizi sağlar.
Propriyosepsiyon ve iskelet kaslarının gerginliği resepsiyon iskelet kas yapılandırma çeşitli belden hayvanlar için koordineli davranışları ve dış ve iç çevre yanıtları sağlayacak duyu modaliteleri vardırs. , Kerevit karın kas reseptör organı başka iyi belgelenmiş hazırlık (Crawdad Projesi görürsünüz http://www.crawdad.cornell.edu/ karın hemi-segmentinde 23 başına sadece iki nöronlar ile propriyosepsiyonunun öğretim amaçları için) . Duyusal sinir demetleri tek nöronlar kayıt edememek daha fazla detay duyusal alımı temel ilkelerini kavrayarak bu yardım sağlar. Bu nispeten basit kabuklu hazırlıklarını bir proprioseptif ve diğer duyusal girdilerin 9-12, 32, 33 merkezi entegrasyonu sağlamak nöral devreleri belirlemek için potansiyeli olan, propriosepsiyon ve gerilim izleme temel yönlerini ele verir.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar Hyewon Cooper'ın sanatsal katkılarından dolayı minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| HEPES base | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
| CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
| Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Materials | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | Any company | ||
| Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | Any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | Any company | ||
| Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |
References
- Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
- Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).
- Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
- Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109 (2), 479-486 (1994).
- Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81 (4), 447-475 (2008).
- Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
- Hill, A. V. First and Last Experiments in Muscle Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, U.K. (1970).
- Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14 (3), 274-292 (1972).
- Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1 (1-4), 185-208 (1972).
- Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221 (2), 185-198 (1983).
- El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 337-349 (1991).
- Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88 (5), 2575-2588 (2002).
- Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78 (6), 3133-3143 (1997).
- Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
- Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38 (01), 01-143 (1959).
- Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157 (3), 355-362 (1985).
- Holsinger, R. The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. , University of Kentucky. (2013).
- Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211 (1), 139-149 (1980).
- Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72 (2), 391-399 (1982).
- Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180 (3), 215-221 (1997).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245 (725), 291-325 (1962).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248 (752), 437-456 (1965).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322 (2011).
- Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
- Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).
- Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).
- Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).
- Chung, Y. -S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).
- Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).
- Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. , (2013).
- Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).
