Summary
وأظهرت تقنيات الفسيولوجية والتشريحية لمعالجة وظيفة وهيكل لproprioceptors المشتركة ومستقبلات توتر العضلات في الاطراف المشي القشريات.
Abstract
الغرض الأساسي من هذه الإجراءات هو إظهار لأغراض التدريس والبحث كيفية تسجيل نشاط الخلايا العصبية الحسية يعيشون الرئيسية المسؤولة عن استقبال الحس العميق كما هي الكشف عن موقف مشترك والحركة، وتوتر العضلات. يتم تسجيل النشاط الكهربائي من proprioceptors القشريات ومستقبلات التوتر الأجهزة العصبية الأساسية، ويتم استخدام محول لقياس القوة في وقت واحد التي يتم إنشاؤها من خلال تحفيز العصب المحرك. بالإضافة إلى ذلك، ونحن لشرح كيفية وصمة عار على الخلايا العصبية لإجراء تقييم سريع للترتيبها التشريحية أو لتثبيت دائم. تلطيخ يكشف منظمة التشريحية التي هو ممثل أجهزة chordotonal في معظم القشريات. مقارنة استجابات التوتر العصبي لاستجابات التحفيز هو أداة تعليمية فعالة في تحديد كيفية تعريف هذه الخلايا العصبية الحسية وظيفيا وكيف يرتبط التشريح إلى وظيفة. ثلاث تقنيات تلطيخوتعرض مما يسمح للباحثين ومدربين لاختيار الأسلوب الذي هو المثل الأعلى للمختبر بهم.
Introduction
استقبال الحس العميق هو الإحساس من موقف الطرف والحركة التي تمكن السلوك منسقة السيارات. تتكون Proprioceptors للموقف (ثابت) وحركة (حركي) المستقبلات. في الحشرات والقشريات، وأجهزة chordotonal هي الهياكل التي توفر هذه المعلومات إلى الجهاز العصبي المركزي 1. ليس كل الأجهزة chordotonal تمتد مشتركة لكنها ما زالت قادرة على رصد تحركات مشتركة بسبب تمسكهم على apodemes (وتر مثل هياكل) التي تغطي المشتركة والتحرك بالتعاون مع العضلات والهيكل العظمي وصياغة مشتركة. الساقين سلطعون دينا ستة المفاصل، ولكل منها واحد أو اثنين من أجهزة chordotonal 2. عادة ما يكون لديه جهاز chordotonal 60-100 أو أكثر الخلايا العصبية الحسية جزءا لا يتجزأ من داخل حبلا المرنة، والخلايا العصبية التي تدل على موقف مشترك ثابت، اتجاه وسرعة الحركة 3-6. ثم تتم معالجة المدخلات من الأجهزة chordotonal في كل المفاصل وساق مركزيا السماح حركات منسقة من قبل الحيوان.
> يتم الكشف عن القوى التي تنتج عضلات الساق أثناء تقلصات متساوي القياس ومتساوي التوتر عن طريق المستقبلات التوتر المرتبطة ألياف العضلات ومرفقاتها إلى apodemes7-9. في القشريات بروتوكولات الساق المشي التي تتبع نقدم منهجية لتسجيلات من الخلايا العصبية الحسية الأولية التي ترصد استقبال الحس العميق والخلايا العصبية التي تستجيب للقوات التي تم إنشاؤها بواسطة ألياف العضلات. وتقدم تقنية لتفعيل حركات الساق وقياس قوة الجيل أيضا، فضلا عن تقنيات التشريحية التي يمكن استخدامها لوصف ترتيب هذه الهياكل الجهاز العصبي المحيطي.
تمكين الإجراءات موضح أدناه التحليل البنيوي والوظيفي للخلايا العصبية التي يعصب كلا النوعين من المستقبلات النسبية لموقعها على حبلا مرونة chordotonal وapodeme. لتوضيح، ونحن نستخدم propodite-dactylopodite (PD) chordotonal الجهاز، الجهاز الذي يمتد القاصي معظم الجزء من الساق سرطان البحر 3.على الرغم بدأت الدراسات الكهربية مفصلة في 1930s و لا يزال يجري تنفيذها اليوم، أصبحت بعض جوانب معروف عن اتصالات قطعي في Proprioceptors في مختلف المفاصل ودورهم في مراقبة منسقة من muscles10-16. وإقامة العلاقة بين الهيكل وظيفة بين الأجهزة التحفيز والعضلات والجهاز العصبي مزيد من المساعدة في تحديد هذه الأدوار. على سبيل المثال، وصفها somata والنهايات البعيدة من الخلايا العصبية التوتر إدراجها في apodeme سوف تكشف عن الموقع النسبي لألياف العضلات 8،17-21.
نقدم ثلاث تقنيات لتلطيخ الساقين القشريات التي يمكن استخدامها في الأبحاث أو المختبرات الأكاديمية. يوفر تلطيخ الأزرق الميثيلين النقيض مناسبة للعضلات والأعصاب والنحو الموصى به من تقنية بسيطة للطلاب لتعلم علم التشريح. يمكن أن يكون مختبرات الاجهزة مضان المجهري إنجاز تلطيخ الخلايا العصبية أكثر انتقائية من خلال تعريض لفترة وجيزة العصبق إلى حيوية صبغ 4-دي-2-ASP. البديل الثالث هو كوكلي 2 الردم، التي بقع وإصلاح الخلايا العصبية، و لا يتطلب التصوير مضان. على الرغم من أنه هو العمل والوقت مكثفة، وهذه العملية تلطيخ يعطي تباين عالية وخصوصية للأعصاب التي يتم شغلها. معا هذه التقنيات يمكن استخدامها لمقارنة مختلف الأجهزة chordotonal، ليس فقط داخل أحد أطرافه أو بين أطرافه، ولكن أيضا من بين الأنواع الأخرى القشريات والحشرات 20-22. متوفرة السرطانات الزرقاء (C. sapidus) المستخدمة في التسجيلات الفسيولوجية والتشريحية لتلطيخ جميع أنحاء الحدود الجنوبية والجنوبية الشرقية للولايات المتحدة. يخدم هذا النوع كممثل للترتيبات العصبية والتوتر chordotonal وجدت في معظم السرطانات. سوف المختبرات على الساحل الغربي يفضلون استخدام أكبر بكثير سرطان البحر دونجينيس (الماجستير السرطان) لهذه التجارب.
Protocol
1. تشريح وتسجيل آخر الكهربائية من Propodite-dactylopodite (PD) العصب
- عقد السلطعون عبر درع من وراء، وتجنب مخالب، قرصة الجزء القريب من meropodite بالملقط. سوف الساق autotomize لمنع الحيوان من نزيف حتى الموت. توخي الحذر عند التعامل مع السرطانات الزرقاء لأنها عدوانية إلى حد ما وسريعة جدا.
الشكل 1. المشي الأولى الساق من السرطانات. يتم فرضه على الموقع التشريحي للأجهزة chordotonal (المناطق التي تحاك) على هذا التخطيطي. رئيس السهم المزدوج يشير إلى أين القطع الساق للتجارب PD العصبية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . - اجراء خفض بين propodite وcarpodite. تجاهل carpopodite ور قال انه يعلق meropodite (الشكل 1).
- خفض نافذة كبيرة في إهاب على المصطبغة (الوحشي) جانب من propodite مع مشرط بشفرة رقم 11 (الشكل 2 و 3) ملاحظة: لا تقطع بعمق.
- إزالة طبقة بشرة عن طريق تحريك شفرة مشرط تحت وموازية للبشرة. هذا يقطع ألياف العضلات التي تعلق على بشرة.
- باستخدام نفس تقنية خفض إطار أصغر على pigmentless (وسطي) جانب من propodite، ولكن ترك اللقمة (المفصل مأخذ أو يتوقف بين شرائح) مرفق سليمة.
الشكل 2. قطع على طول خط منقط على propodite. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
ن "سرك =" / files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg "العرض =" 500px "/>
الرقم 3. فضح العصب في إطار (السهام الخطوط العريضة لحزمة الأعصاب). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . - إعداد طبق Sylgard مبطنة تحتوي على سرطان البحر المالحة يعلقون إعداد أسفل ملاحظة: انظر الجدول 1 للأنواع وصفات المالحة محددة.
- تحديد موقع الجهاز PD التي تحقق بعناية مع الإبر الزجاج المصقول النار. حبلا مرنة تمتد مفصل لها مظهر الفضة.
- إزالة ألياف العضلات التي تحجب وجهة نظركم من الجهاز من الجانبين في وتر. كن حريصا جدا على ألا تجرح الجهاز PD أو أعصابها.
- مرة واحدة وقد تم إنجاز هذا، أعد بحزم إعداد إلى الطبق مع الجانب الصباغ (الوحشي) مواجهة (الشكل 4).
الشكل 4. مكشوف الجهاز PD والعصبية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
- اتبع الجهاز العصبي PD في propodite كما قريب قدر الإمكان من أجل تحرير-طول فترة طويلة من العصبية (1.5 سم) لأغراض التسجيل. يتم ذلك أفضل في حين لا تزال تعلق العصب PD إلى العصب الرئيسي الساق.
- بعد فصل العصب PD من العصب الرئيسي الساق مع المعونة من الإبر والزجاج، وقطع العصب PD قريب مع مقص القزحية ملاحظة: لا تمتد أو سحب على العصب أثناء تشريح.
- نقل dactylopodite الى موقف الموسعة واستعرضوا بشكل كامل. تأخذ ملاحظة حول حيث انثناء والإرشاد المواقف المتطرفة هي ونقطة منتصف الطريق لاستخدامها لاحقا.
- وضع سلك الأرض داخل حمام المالحة.
- بدوره على البريدأجهزة تسجيل lectrophysiology / البرامج ملاحظة: وقد وصفت الإعداد لدينا سابقا 23.
- وضع المجهر بحيث يتم تطل على المسرح المجهر. مرة واحدة يتم وضع طبق على المرحلة الإعدادية، وسوف تحتاج إلى ضبط الموقف من شدة إضاءة عالية شعاع لتصور أفضل إعداد.
- موقف micromanipulator وبالتالي فإن التجمع الشفط الكهربائي المرفقة سوف يكون من السهل الوصول إلى حمام المالحة والتحضير. هي التي شيدت القطب الشفط كما هو موضح في الفيديو على الانترنت 24.
- للكشف عن النشاط العصبي، ووضع نهاية قطع العصب PD في القطب الشفط.
- تحريك الإصبع في جميع أنحاء المواقف الموسعة واستعرضوا لعدة دورات مع المعونة من التحقيق الزجاج أو وتد خشبي.
- المقبل مراقبة النشاط عند مقيد الإصبع في مواقف الموسعة، استعرضوا، ومنتصف.
2. تسجيل النشاط الكهربائي من التوترالعصبية في حين رصد تكوين القوات
- تحديد الجانب الوحشي والإنسي من الساق. الجانب الإنسي لديه الناعمة الملمس التي يمكن أن يشعر بها معسر بلطف في المنطقة meropodite مع ظفر.
- وضع هذا بشرة ناعمة الجانب حتى في الطبق. العصب المحرك excitor أن يعصب العضلات فتحت أيضا يعصب العضلات نقالة في carpopodite.
- من أجل تحفيز العضلات فتاحة يتم عزل العصب المحرك نقالة في المنطقة carpodite وحفز مع القطب الشفط. تتم إزالة الجزء القريب من الساق قبل transecting في meropodite مع مقص.
- إزالة جزء من بشرة في المنطقة رسغ على الجانب الداخلي (الجانب الإنسي، 5A الشكل).
- قطع apodeme من العضلات بندر وإزالة العضلات بعناية كما لا لسحب العصب الرئيسي الساق من تجويف الساق (الشكل 5B، C لاحظ السهام حيث لبندر يتم فصل apodeme). العصب الرئيسي الساق وحمالة صدرNCH إلى العضلات نقالة يمكن بعد ذلك لاحظ (الشكل 5D).
- العثور على الأعصاب المتفرعة من حزمة الأعصاب الرئيسية لعضلة نقالة (الشكل 5E في السهم،). ويمكن خفض هذا قريب من العضلات وسحبت في القطب الشفط لتحفيز (أرقام 5F وG، السهم يصور فرع).
- استخلاص جزء من العصب أن المشاريع نحو فتحت دون معسر العصب. القطع العصب المحرك نقالة / فتحت.
- سحب العصب المحرك في القطب الشفط ومن ثم تحفيز ذلك.
- لفضح العضلات فتحت والتوتر العصبي إزالة العضلات أوثق والمنطقة البطنية من propodite. قطع العضلات أوثق مع مشرط بشفرة # 11 في propodite (الشكل 6) ملاحظة: لا قطع عميق في المنطقة القريبة لأنه قد يؤدي إلى تلف العصب المحرك فتحت.
الرقم 5. خطوات تشريح لتعريض الخلايا العصبية الحركية لتحفيز العضلات فتاحة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 6. قطع إهاب على النصف بطني من propodite لفضح العضلات أقرب بحيث يمكن إزالتها. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . - تبادل المالحة مع المياه المالحة المبردة الطازجة على مدار عملية تشريح للحفاظ على الخلايا العصبية على قيد الحياة. لمزيد من تشريح، ضع الطبق إعداد تحت المجهر تشريح واستخدام الألياف البصرية الإضاءة.
- قطع بعناية وتر أقرب من تمسكهوالإصبع باستخدام مقص حاد، وأشار المتوسطة الحجم.
- نكون حذرين للغاية على عدم تعكير صفو فروع لعضلة فتحت من العصب الرئيسي الساق التي ينبغي أن تكون واضحة للعيان.
- إزالة والتخلص من العضلات والأوتار أقرب.
- جعل ثقب في الإصبع مع دبوس تشريح. وسوف تستخدم هذه الحفرة في وقت لاحق لربط مسمار معدني على التوتر (القوة) محول، ولكن من الضروري لجعلها في هذه المرحلة من الإجراء.
- تحديد موقع فرع العصبية التي تتوقع لعضلة فتحت وapodeme في المنطقة البعيدة للعضلة فتحت. التحقيق بعناية العصب مع أداة الزجاج المصقول النار.
- مراقبة العصب التوتر الذي ينشأ من نهاية البعيدة للapodeme والعائدات إلى حزمة الأعصاب الحركية.
- للكشف عن النشاط العصبي، وملء القطب الشفط مع سرطان البحر المالحة ورسم نهاية قطع من فتحت التوتر العصبي في القطب. تأكد من أن القطب الشفط يناسب بإحكام على العصب.
- دراسة لneuraل المتعلقات من التوتر السلبي على apodeme فتحت. في حين تم تسجيل النشاط الكهربائي من العصبية والتوتر، وتناوب على الإصبع بسرعة إلى مشتركة موسعة (أي تمتد عضلة فتاحة).
- المقبل، اختبار قوة فاعلة في التنمية فيما يتعلق تردد التحفيز.
- بحزم إرفاق ربط المعادن بحيث غيض من ورطتها يمر عبر ثقب صغير في إصبع.
- . إرفاق الطرف الآخر من ربط المعادن إلى محول قوة ملاحظة: تأكد من أن محول هو في زاوية 90 درجة في كل مرة بحيث دبوس هو عمودي على محول للكشف القصوى من القوة المتولدة.
- سحب هوك والإصبع بحيث يكون في حوالي زاوية 45 درجة من المشترك فتحت.
- الآن تحفيز العصب المحرك عند 100 هرتز لمدة 250 ميللي ثانية وقياس القوة، فضلا عن تردد إطلاق العصب التوتر.
- وضع المشترك في موقف ممتدة بشكل كامل بحيث ألياف العضلات فتحت هي مترهلة.
- Stimulate العصب المحرك عند 100 هرتز لمدة 250 ميللي ثانية وقياس القوة، فضلا عن تردد إطلاق العصب التوتر.
- منحنى / ثني مفصل بحيث يتم استعرضوا بشكل كامل (~ 90 درجة). في هذا الموقف تعمل بكامل طاقتها ألياف العضلات من المباراة الافتتاحية. قد يكون هناك بعض القوة تقاس محول بسبب هذا الامتداد السلبي من العضلات.
- تحفيز العصب المحرك عند 100 هرتز لمدة 250 ميللي ثانية وقياس القوة، فضلا عن تردد إطلاق العصب التوتر.
- بعد قياس قوة، والمضي قدما في سلسلة من الترددات المختلفة: 20، 40، 60، 80، و 100 هرتز لمدة 8-10 ثانية في كل موقف مشترك.
- قياس استجابة مع بيان التوتر سريعة. ترتيب إعداد بحيث يمكن بسهولة أن دفعت هوك على محول القوة للخروج من حفرة في الإصبع.
- منحنى / ثني مفصل بحيث يتم استعرضوا بشكل كامل (~ 90 درجة). الآن تحفيز العصب المحرك عند 100 هرتز مع التحفيز المستمر من 5 ثوانى.
- بعد الثان Ù الأولىد أو أقل، والتوتر تراكمت على العضلات فتحت، ودفع دبوس من ثقب في الإصبع.
- دراسة تسجيل التوتر العصبي قبل وبعد الافراج عن دبوس عقد الإصبع.
- الآثار تغييري المواد neuroactive مثل أوكتوبامين، السيروتونين، وproctolin، الذي يغير الناتج من الخلايا العصبية والتوتر، يمكن تحديده من خلال إضافة هذه الجزيئات إلى وسائل الإعلام الاستحمام على العضلات فتحت المكشوفة وتكرار التجارب.
- استخدام ماصة وبالتنقيط 1-2 مل على إعداد.
3. تلطيخ الطرفية العصبي هياكل النظام في القشريات المشي الساقين
- تقنية الأزرق الميثيلين
- تمييع جزء واحد الميثيلين كلوريد الأزرق محلول المخزون (0.25٪) مع جزأين من الماء المقطر.
- إضافة إلى هذا الخليط من خمسة أجزاء مخزنة المالحة. بدقة لري مجال الاهتمام.
- تشريح الساق وفقا لبروتوكول في القسم 1. احتضان مسبقاparation في الحل الميثيلين الأزرق في 12-13 درجة مئوية.
- دراسة إعداد كل 10-15 دقيقة مع مجهر تشريح باستخدام انخفاض شدة الإضاءة لمتابعة التقدم المحرز في تلطيخ. في بعض الحالات سيتم الانتهاء من تلطيخ في ساعة واحدة، وفي حالات أخرى قد يستغرق بين عشية وضحاها.
- تقنية 4-دي-2-ASP
- الأصباغ الفلورية يمكن استخدامها لدعم ملء الخلايا العصبية PD أو وصمة عار مباشرة إعداد من الحمام. ومع ذلك المجهر مناسبة مع قدرات لعرض وصمة عار الفلورسنت هو مطلوب.
- تشريح الساق وفقا لبروتوكول في القسم 1.
- احتضان إعداد في تركيز 10 ميكرومتر من الحل 4-دي-2-ASP وترك إعداد في الثلاجة لمدة 15 دقيقة. استخدام حل عادل بما فيه الكفاية لتغطية التحضير.
- تصوير التحضيرات بسرعة وتجنب الإفراط في التعرض لضوء الزئبق. يتلاشى هذا صبغة الفلورسنت بعيدا بسرعة نسبيا.
- فضح العصب PD وفقا للبروتوكول في القسم 1 وابقائه مغمورة في المياه المالحة الباردة.
- جعل البترول هلام جيدا لعقد كوكلي 2. إذا تسرب أي كوكلي 2 في حمام المالحة وإعداد كامل وصمة عار سوداء، ويجب التخلص من التحضير.
- تنزلق قطع صغيرة من ورقة البوليسترين، لجعل منصة البلاستيك، ويعلقون عليه في مثل هذه الطريقة أنه لن تطفو بعيدا أو تصبح مغمورة في حمام المالحة (الشكل 7).
الرقم 7. ورقة من البوليستيرين مع دبابيس أن تعقد في مكان في الطبق. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . - إخراج الفازلين من إبرة تحت الجلد غرامة تثبيتها إلى الحقنة،ثم جعل حاجزا (دائرة قد تعمل بشكل جيد)، والذي ينبغي أن يكون حول 1-1.5 ملم عالية باستثناء "V" الضحلة في منتصف حيث سيتم رايات عبر العصب، وعلى رأس زلة من البوليسترين.
- جعل بركة صغيرة من المياه المالحة على جانبي الحاجز بالقرب من "V". مع الحرص على عدم تمدد أو قرصة العصب، رفع العصب بعناية من الطبق ووضعه في بركة المياه المالحة في البترول هلام جيدا.
- العمل بسرعة حتى يتسنى للقسم من العصب لا تجف، بعناية إخراج الفازلين لتغطية الأعصاب المكشوفة. الآن اختبار الحاجز مع المياه المالحة والتأكد من أنها لا تسرب.
- وصمة عار بعيدا المالحة في الداخل من الحاجز ومعرفة ما اذا كان يملأ عندما المالحة حمام مرتفع حول الجدار من الفازلين للتأكد من أن الجانبين معزولة عن بعضها البعض (الشكل 8).
- الفتيل بعيدا المالحة في البئر باستخدام قطعة من المناديل الورقية. تجنب ترك ورقة يختتم العصب.
- جعل بركة جديدة باستخدام بضع قطرات صغيرة من الماء المقطر، ثم خفض نهاية العصب. نكون حذرين للغاية على عدم سحب العصب من خلال حاجز عندما جعل خفض الانتاج. صدمة التناضحي من الماء المقطر سوف "البالون" محاور عصبية.
- في غضون 30 ثانية إضافة قطرة صغيرة من كوكلي 2 إلى الماء، امتصاص هذا الحل، ومن ثم إضافة ما يكفي كوكلي 2 لتشكيل بركة على هذا القسم تقصير من العصبية (الشكل 9). تبقى أفضل الاستعدادات المبردة في 13 درجة مئوية لمدة 12-24 ساعة.
tp_upload/51050/51050fig9.jpg "العرض =" 500px "/>
الرقم 9. وPD العصبية خفض التعرض لكوكلي 2. قطع العصب تتضخم في وجود الماء الذي يسهل ويسرع حركة جزيئات الصبغة من خلال محاور عصبية في أجسام الخلايا العصبية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر . - إزالة البرك الرطوبة. وصمة عار بعيدا الحل الكوبالت باستخدام الأنسجة ويغسل بقايا من الكوبالت مع العديد من التغييرات من المياه المالحة.
- نقل معزولة لإعداد كوب صغير طبق بتري تحتوي على حوالي 10 مل من سرطان البحر المالحة. يتم غسل الخلايا العصبية ويتم تنفيذ الخطوات التالية في الموقع. أدوات معدنية جيدة ليست لاستخدامها للتعامل مع إعداد بعد هذه الخطوة (يجب استخدام أدوات محددة ليست لاستخدامها في وقت لاحق لعلم وظائف الأعضاء).
- إضافة 1-2 قطرات من كبريتيد الأمونيوم (NH4) 2 S إلى المالحة. كأب (NH 4) 2 S زجاجة بإحكام ووضع مرة أخرى في غطاء محرك السيارة. مراقبة رد فعل في إعداد تشريح تحت المجهر
- في غضون 1-2 دقائق، وينبغي أن الخلايا العصبية مليئة الكوبالت وعملياتها تبدأ في الظهور لأنها وصمة عار سوداء.
- بعد 5-10 دقيقة، واستبدال الحل التنمية مع المياه المالحة العذبة.
- تأكد من أن الحل التنمية قمت تصب في استنزاف الحوض ويتبع طريق تشغيل مياه الصنبور لبضع دقائق أو في زجاجة النفايات مع غطاء.
- من اجل الخروج من المياه المالحة وإصلاح إعداد العصبية لمدة 15 دقيقة مع اثنين من التغييرات من حل تثبيتي بوان. لأنسجة العضلات الكبيرة مثل فتاحة (وصمة عار الخلايا العصبية التوتر)، وزيادة مدة التثبيت لمدة 30 دقيقة.
- يذوى في سلسلة من ترتيب تصاعدي من تركيز الإيثانول ابتداء من 70٪ (أي 70٪، 80٪، 90٪، 100٪). حوالي 10 دقيقة في كل تركيز كافية لالأنسجة الصغيرة.
- بعد حوالي 10-15 دقيقة في اثنين من التغييرات من الإيثانول بنسبة 100٪، مسح الأنسجة عن طريق استبدال الإيثانول بنسبة 100٪ ساليسيلات الميثيل. سوف البقاء في إعداد هذا الحل بشكل دائم لمشاهدة المتكررة. مع مرور الوقت سوف تملأ الخلايا تصبح أكثر وضوحا لأن الأنسجة المحيطة بها سوف تصبح أكثر وضوحا. طرق تكثيف يمكن استخدامها للمساعدة في منع يتلاشى مع مرور الوقت 25.
- استخدام نفس العملية لملء العصب التوتر مع كوكلي 2. ومع ذلك، وتغيير الحل الإيثانول عدة مرات في كل خطوة الجفاف الايثانول واحتضان إعداد داخل الكحول لمدة 20 دقيقة لكل خطوة إلى يذوى بدقة العضلات وتسمح لهم لمسح أيضا.
Representative Results
عندما يتمدد الجهاز PD من خلال توسيع تماما مشتركة، والنشاط في العصب PD قوية خلال حركة كما هو مبين في الثانية الأولى في الشكل 10. يبقى بعض النشاط في حين يقام أنه لا يزال في موقف فتح. هذا النشاط هو من الخلايا العصبية موقف ثابت الحساسة (النصف الثاني من تسجيل هو مبين في الشكل 10). حركة تثير استجابة أثناء النزوح، واطلاق موجودا في الغالب خلال تمتد من حبلا chordotonal (الشكل 11).
مزيد من التحليل للطفرات يمكن تناولها بسهولة عن طريق فرز سعة النسبية. هذا هو نهج لإظهار مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية الحسية تجنيدهم لشغل وظائف أو أنواع من الحركات 5. تتراوح سعة نموذجية ،25-1،5 بالسيارات، ولكن هذه القيم هي التي تعتمد على المقاومة (أي ضيق) من ختم شفط القطب. تردد التموج في رانه يتراوح حجم مختلف يمكن أيضا تمثيلها بيانيا للتحليل.
ويمكن مقارنة القوى التي تولدها العضلات فتحت فيما يتعلق تردد التحفيز عن طريق بتركيب آثار الجهد لمرة ومنها على رأس كل منهما الآخر (أرقام 13A و B). هذا ويمكن أيضا أن يؤديها لكل موقف مشترك في كل تردد التحفيز معين. نشاط العصب التوتر يمكن بعد ذلك يرتبط مقدار القوة النسبية المتولدة في كل تردد التحفيز، ولكل موقف مشترك. كما هو الحال في العصب PD، وينظر إلى مجموعة متنوعة من سعة ارتفاع في استجابة لتقلص العضلات فتحت (الشكل 13C).
لوحظ الترتيب التشريحي للخلايا العصبية في الساق المشي بشكل واضح مع الميثيلين الأزرق تلطيخ (الشكل 14). لاحظ مرونة chordotonal حبلا والتوتر الخلايا العصبية التي هي قريبة إلى apodeme. عدة somata بأقطار مختلفة ومواقع محددة د واضحة أيضا في هذا الرقم. يتم عرض كامل للعصب التوتر والعصبية الحركية نقالة في الشكل 15. وتظهر الخلايا العصبية الفردية من العصب PD مع تباين أعلى باستخدام 4-دي-2-ASP (الشكل 16) وكوكلي 2 (الشكل 17) الردم التقنيات. في تضخم عالية يمكن أن ينظر إلى النهايات الحسية داخل scolopales داعمة (أرقام 16B) 21،22،26.
الرقم 10. نقل وعقد في 0 درجة. الخلايا العصبية الحيوية هي قوية في إطلاق النار أثناء الحركة والمسامير من الخلايا العصبية الحساسة ثابتة موجودة في حين يتم الاحتفاظ مشتركة مفتوحة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر </ أ>.
الرقم 11. السريع فتح وإغلاق من استعرضوا بشكل كامل لتمديد (90-0 °) الموقف. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 12. المسامير خارج الخلية المسجلة من العصبية PD. تم تمديد مشتركة تماما ثم انتقل بسرعة إلى ½ استعرضوا الموقف وبعد ذلك عقدت يزال. لاحظ النشاط أثناء الحركة والنشاط انخفض عند ساكنة. انقر هنا لعرض أكبر معهد العالم العربي جنرال الكتريك.
الرقم 13. قوات النسبية التي يتم تطويرها مع المشترك استعرضوا بشكل كامل وحفز على ترددات مختلفة. (A) وتظهر آثار الجهد لمرة من محول القوة مع كل تردد التحفيز. (ب) يتم فرضه وآثار في لوحة وبألوان مختلفة لسهولة المقارنة. (C) الجهد لمرة وآثار النشاط الكهربائي المسجلة من العصبية التوتر عندما تم تحفيز العصب المحرك في 80 هرتز. لاحظ نمط منتظم من القطع الأثرية التحفيز بالمقارنة مع النشاط العصبي. أيضا، لاحظ سعة مختلفة من الاستجابات العصبية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
ithin صفحة = "دائما"> 
الرقم 14. الميثيلين الأزرق وصمة عار من إعداد الساق المشي. وتظهر SOMAS الفردية مع النهايات الحسية إسقاط بهم في حبلا مرونة. على مقربة من apodeme يظهر الخلايا العصبية التوتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 15. العصب التوتر الناجم عن نهاية البعيدة (الأسهم الحمراء) والانضمام إلى العصب المحرك (السهم الأخضر). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
ه = "دائما"> 
الرقم 16 (أ) A الظهر ملء العصب PD في الماجستير السرطان مع 4-دي-2-ASP. (B) التكبير العالي من النهايات الحسية. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
الرقم 17. الخلايا العصبية التي امتلأت كوكلي 2 ومعالجتها (A). مخطط تتبع من إعداد ملطخة عرض (B). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .
| ملحي | ز / L |
| كلوريد الصوديوم | 27.29 |
| بوكل | 0.81 |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 4.81 |
| و CaCl 2 • 2H 2 O | 1.85 |
| نا 2 SO 4 • 10H 2 O | 0.97 |
| 1.982 | |
| حمض HEPES | 0.476 |
| HEPES الملح | 2.08 |
| ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.1 مع هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك |
الجدول 1. صفات لسرطان البحر المالحة.
Discussion
الغرض من هذه المجموعة من التجارب هو 1) لتعليم ويحمل المبادئ الأساسية للتسجيلات خارج الخلية من جهاز التحفيز تحديدها والتوتر العصبي و2) التشديد على أهمية رسم الخرائط التشريحية فيما يتعلق ظيفة فسيولوجية معينة أنظمة حسية. هذا النهج التجريبية والنماذج الحيوانية المستخدمة هي غير مكلفة وسهلة نسبيا لإجراء التدريس في مختبرات الفسيولوجيا العصبية.
الخلايا العصبية من أجهزة chordotonal نوعان ظيفية محددة، وتلك التي تستجيب لتلك الحركة والاستجابة للمواقف ثابتة. تسجيلات خلية واحدة من مجموعة متنوعة من الأجهزة chordotonal، بغض النظر عن أي يتم فحص المشتركة، أظهرت أن تكون هذه هي الحال 3،5. في الواقع، وأجهزة chordotonal المرتبطة المفاصل antennal من الكركند تكشف عن نفسها نوعين الحسية والتشريح الأساسية 27. بالإضافة إلى أن يكون هناك نوعين الخلايا العصبية (الحركة وpositiعلى)، والخلايا العصبية تشترك في نفس الترتيب التشريحية على خيوط مرنة لكل منهما. وsomata كبيرة تقع قريب على حبلا تميل إلى تنتمي إلى ديناميكية الخلايا العصبية الحساسة الحركة. الخلايا العصبية التي تدل على مواقع ثابتة لها somata الصغيرة وتقع بشكل أقصى. هذه الخلايا تنشط tonically. المفصل PD يحتوي فقط على جهاز واحد chordotonal في حين أن هناك اثنين من أجهزة chordotonal في رسغ-propodus (CP) وmerus-رسغ (MC) المفاصل.
تشريح لفضح هياكل التحفيز في السرطانات الزرقاء (C. sapidus) لتسجيل الكهربية يتطلب استراتيجية تسمح الحركات المشتركة الذي سيعقد في المواقف الطبيعية أثناء التسجيل من الخلايا العصبية الحسية. العصب التوتر لعضلة الساق في المباراة الافتتاحية المشي هو العصب ناعم جدا تتكون من عدة خلايا عصبية. ما لم تتخذ الرعاية، العصب التوتر فضلا عن العصب المحرك التعصيب العضلات ليكون حافزا، يمكن أن تتلف خلال هذه تشريح. إلىتسجيلات الأمثل الأقطاب شفط تحتاج إلى أن يكون متلائما مع حجم العصب. تسجيلات يمكن الوصول إليها بسهولة في المختبر الطالب باستخدام 30-40X التكبير المجهر تشريح وmicromanipulators المنخفضة نهاية.
أن التجارب المستقبلية التي من شأنها أن تكون مثيرة للاهتمام لمتابعة مع الأجهزة chordotonal مشتركة تكون لدراسة الأوضاع الهيكلية والفسيولوجية خلال تجديد الساق في الأنواع المختلفة في مراحل مختلفة في دورة حياة كمتابعة لدراسة الأولية التي تستخدم لمكافحة السرطان الماجستير 19،26 . الأسئلة المتبقية التي يتعين معالجتها هي 1) لا توزيع وتنظيم الخلايا العصبية مجدد تعتمد على عمر الحيوان عند تجديد أحد أطرافه، 2) هي التوقعات محور عصبي إلى الجهاز العصبي المركزي (الحبل البطني العصب) في أحد أطرافه تجديد وظيفية أو يفعل يستغرق وقتا طويلا والاستخدام المشترك لتأسيس اتصالات وظيفية، و 3) ما يحدث للمحاور قطعت الأقرب إلى الطائرة انشطار ذاتي عند الطرف هو autotomized؟ 28
القشريات تتوافق مع الظروف البيئية ودرجة الحرارة المحيطة بها، ولكن من غير الواضح كيف الحفاظ على التنسيق داخل الدوائر العصبية الخلايا العصبية كما يغير نشاطهم في استجابة للتغيرات في درجة الحرارة. وبطء وتيرة التغيير قد تسمح للحيوان بعض الوقت للتأقلم في حين أن التغير السريع قد not29، 30. التغيرات الفسيولوجية في درجة الحموضة أو الأسمولية بسبب التمثيل الغذائي والسلوك 31، أو الأثر البيئي قد يطرح تحديات على غرار الدوائر العصبية المشاركة في استقبال الحس العميق. هذه الاستعدادات القشريات تعتبر مثالية لمعالجة هذه الأنواع من المشاكل بسبب وظيفتها ويتميز كذلك على مستوى خلية واحدة.
في هذا البروتوكول لقد أثبتنا أهمية الفسيولوجية للخلايا العصبية التوتر في رصد القوة التي تولدها العضلات فتحت. هذه المستقبلات التوتر يمكن أن تعزى إلى موقعها داخل apodeme باستخدام إجراءات تلطيخ. هؤلاءالخلايا العصبية، كما هو الحال في الثدييات، والكشف عن القوة على مختلف المستويات، وتجنيد الخلايا العصبية إضافية كما يزيد القوة. تردد في النشاط هو ذات الصلة إلى التردد تحفيز الخلايا العصبية الحركية حتى يتم التوصل إلى التشبع في الاستقبال. باستخدام بروتوكول الإفراج السريع مع المشترك إصبع استعرضوا والنشاط التوتر يختفي بسرعة ولكن بعد ذلك يعود على استعادة التوتر في مشتركة ممتدة بشكل كامل. هذا هو الإجراء التجريبي الكلاسيكي لتوضيح قوة تقاس مستقبلات التوتر. neuromodulators مختلفة يمكن تطبيقها على إعداد لنرى كيف يؤثر تطوير القوة والاستجابة العصبية. واحد من الجوانب المهم هو كيف تتم معالجة الردود العصبية ومتكاملة في الجهاز العصبي المركزي وتأثيرها على نشاط الخلايا العصبية الحركية. تقنيات أظهرنا تسمح لأحد للبدء في معالجة مزيد من المعلومات حول التوتر (الحسية) الأعصاب الحركية وظيفة الخلايا العصبية الدائرة، أي إشارة في الساق سليمة إلى العقدة والعودةإلى العضلات.
الإجراءات تلطيخ أثبتت هي المفتاح لفهم علم وظائف الأعضاء من الخلايا العصبية الحسية التي يعصب أجهزة التحفيز. الترتيب التشريحي للخلايا العصبية على أساس الوظيفة وحجم سوما متشابهة في مختلف الأجهزة chordotonal داخل الساقين سرطان البحر. ومن غير المعروف ما إذا تم العثور على ترتيبات مماثلة أيضا الخلايا العصبية في الأنواع أو الحشرات القشريات الأخرى. الجمع بين التسجيلات الفسيولوجية من الخلايا واحد ورسم خرائط الموقع يسمح العلاقات ظيفة الهيكل مباشرة. الحفاظ على المدى الطويل للترتيب التشريحية مع كوكلي 2 تلطيخ والتثبيت يسمح احد لجعل متكررة التدابير وتقييم الترتيبات الهيكلية.
استقبال الحس العميق واستقبال التوتر من عضلات الهيكل العظمي هي طرائق الحسية التي تمكن السلوكيات والردود على البيئة الخارجية والداخلية منسقة للحيوانات مفصلية في مجموعة متنوعة من تكوين العضلات والهيكل العظميق. الجهاز مستقبلات العضلات في البطن من جراد البحر هو إعداد أخرى موثقة جيدا (انظر مشروع Crawdad؛ http://www.crawdad.cornell.edu/ ) لأغراض التدريس من استقبال الحس العميق مع اثنين فقط من الخلايا العصبية في البطن نصفي الجزء 23 . أن تكون قادرة على تسجيل من الخلايا العصبية واحد لحزم العصب الحسي يوفر المزيد من التفاصيل التي تساعد في فهم المبادئ الأساسية لاستقبال الحسية. هذه الاستعدادات القشريات بسيطة نسبيا تسمح لأحد لمعالجة الجوانب الأساسية لاستقبال الحس العميق ورصد التوتر، مع القدرة على تحديد الدوائر العصبية التي تمكن التكامل المركزية للمدخلات الحسية التحفيز وغيرها من 9-12، 32، 33.
Disclosures
يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.
Acknowledgments
المؤلفون ممتنون للإسهامات الفنية Hyewon كوبر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| HEPES base | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
| CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
| Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Materials | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | Any company | ||
| Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | Any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | Any company | ||
| Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |
References
- Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
- Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).
- Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
- Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109 (2), 479-486 (1994).
- Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81 (4), 447-475 (2008).
- Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
- Hill, A. V. First and Last Experiments in Muscle Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, U.K. (1970).
- Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14 (3), 274-292 (1972).
- Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1 (1-4), 185-208 (1972).
- Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221 (2), 185-198 (1983).
- El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 337-349 (1991).
- Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88 (5), 2575-2588 (2002).
- Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78 (6), 3133-3143 (1997).
- Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
- Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38 (01), 01-143 (1959).
- Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157 (3), 355-362 (1985).
- Holsinger, R. The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. , University of Kentucky. (2013).
- Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211 (1), 139-149 (1980).
- Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72 (2), 391-399 (1982).
- Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180 (3), 215-221 (1997).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245 (725), 291-325 (1962).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248 (752), 437-456 (1965).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322 (2011).
- Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
- Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).
- Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).
- Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).
- Chung, Y. -S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).
- Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).
- Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. , (2013).
- Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).
