Summary
Fysiologiske og anatomiske teknikker er demonstreret at løse funktion og struktur for fælles proprioceptors og muskelspændinger receptorer i krebsdyr walking lemmer.
Abstract
Det primære formål med disse procedurer er at demonstrere for undervisnings-og forskningsformål hvordan du optager aktiviteten af levende primære sensoriske neuroner, der er ansvarlige for proprioception, da de er at opdage fælles position og bevægelse, og muskelspændinger. Elektrisk aktivitet fra krebsdyr proprioceptorer og spændingshovedpine receptorer registreres ved basisk neurofysiologiske instrumentering, og en transducer bruges til samtidig kraft, der er genereret ved at stimulere en motor nerve. Derudover viser vi, hvordan pletten neuronerne for en hurtig vurdering af deres anatomiske arrangement eller til permanent fiksering. Farvning afslører anatomiske organisation, der er repræsentativ for chordotonal organer i de fleste krebsdyr. Sammenligning af spænding nerve reaktioner på de proprioceptive responser er et effektivt pædagogisk redskab til at bestemme, hvordan disse sensoriske neuroner er defineret funktionelt, og hvordan anatomien er korreleret til funktionen. Tre farvningsteknikkerpræsenteres tillader forskere og undervisere til at vælge en metode, der er ideel til deres laboratorium.
Introduction
Proprioception er den fornemmelse af lemmer position og bevægelse, der giver mulighed for en koordineret motorisk adfærd. Proprioceptors består af position (statisk) og bevægelse (kinæstetiske) receptorer. I insekter og krebsdyr, chordotonal organer er de strukturer, der giver disse oplysninger til CNS 1.. Ikke alle chordotonal organer spænder over en fælles, men de kan stadig overvåge fælles bevægelser på grund af deres tilknytning til de apodemes (senen lignende strukturer), som spænder over fælles og flytte i samarbejde med skeletmuskulatur og fælles artikulation. Krabbeben har seks samlinger, der hver har en eller to chordotonal organer 2. Typisk en chordotonal organ har 60-100 eller flere sensoriske neuroner indlejret i et elastisk streng, neuroner, der signalerer statisk fælles position, retning og hastighed bevægelse 3-6. Inputtet fra chordotonal organer ved hver samling og ben er så centralt behandles tillader koordinerede bevægelser af dyret.
Procedurerne demonstreret nedenfor muliggøre strukturelle og funktionelle analyse af de neuroner, der innerverer begge typer af receptorer i forhold til deres placering på en chordotonal elastisk streng og apodeme. For at illustrere, bruger vi propodite-dactylopodite (PD) chordotonal orgel, orglet, der spænder over mest distale segment af krabbe ben 3.Selvom detaljerede elektrofysiologiske undersøgelser begyndte i 1930'erne og er stadig ved at blive gennemført i dag, har nogle aspekter blevet kendt om de segmenter forbindelser proprioceptors i de forskellige led og deres roller i koordineret kontrol af muscles10-16. Etablering af struktur-funktion forholdet mellem de proprioceptive organer, muskler og nervesystemet vil yderligere hjælpe med at definere disse roller. For eksempel vil mærkning af somata og distale endelser spændinger neuroner indsat i apodeme afsløre deres placering i forhold til muskelfibre 8,17-21.
Vi præsenterer tre farvningsteknikker for krebsdyrssygdomme ben, der kan bruges i forskning eller akademiske laboratorier. Methylenblåt farvning giver passende kontrast til muskler og nerver, og anbefales som en simpel teknik for studerende at lære anatomi. Labs, der har fluorescens mikroskopi opsætninger kan udrette mere selektiv neuronal farvning ved kortvarigt at udsætte nerves til den vitale farvestof 4-di-2-ASP. Det tredje alternativ er CoCI2 opfyldning, der farver og løser neuroner, og kræver ikke fluorescensimagografi. Selv om det er arbejds-og tidskrævende, denne farvning proces giver høj kontrast og specificitet for de nerver, der er fyldt. Sammen disse teknikker kan bruges til at sammenligne forskellige chordotonal organer, ikke kun inden for et lem eller mellem benene, men også blandt andre krebsdyr og insektarter 20-22. Blå krabber (C. sapidus), der anvendes i fysiologiske optagelser og anatomiske farvning er let tilgængelige over hele det sydlige og sydøstlige grænse i USA. Denne art fungerer som en repræsentant for de chordotonal og spænding nerve ordninger findes i de fleste krabber. Laboratorier på vestkysten vil foretrække at bruge den meget større Dungeness krabber (Cancer magister) for disse eksperimenter.
Protocol
1.. Dissektion og Recording elektrisk aktivitet fra Propodite-dactylopodite (PD) Nerve
- Hold krabbe over rygskjoldet bagfra, og undgå de kløer, klemme den proksimale del af meropodite med en pincet. Benet vil autotomize at forhindre dyret i at at forbløde. Vær forsigtig ved håndtering blå krabber, som de er temmelig aggressiv og meget hurtig.
Figur 1.. Første gang ben af en krabbe. Den anatomiske placering af chordotonal organer (skraverede områder) er overlejret på denne skematiske. Den dobbelte pilespids angiver, hvor at transektere benet for PD nerve eksperimenter. Klik her for at se større billede . - Lav et snit mellem propodite og carpodite. Kassér carpopodite og t han vedlagte meropodite (figur 1).
- Skær et stort vindue i neglebånd på pigmenteret (sideværts) side af propodite med en skalpel med en # 11 klinge (figur 2 og 3) Bemærk:. Der må ikke skæres dybt.
- Fjern neglebånd lag ved at skubbe skalpelblad under og parallelt med neglebånd. Det skærer muskelfibrene knyttet til neglebånd.
- Ved hjælp af samme teknik skære et mindre vindue på pigmentless (mediale) side af propodite, men lad kondyl (socket joint eller hængsel mellem segmenter) vedhæftet fil intakt.
Figur 2.. Klip langs den stiplede linje på propodite. Klik her for at se større billede .
n "src =" / files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg "width =" 500px "/>
Figur 3.. Expose nerven i vinduet (pilene skitsere nerve bundt). Klik her for at se større billede . - Forbered en Sylgard-foret skål indeholdende krabbe saltvand til pin præparatet ned Bemærk:. Se Tabel 1 for artsspecifikke saltholdige opskrifter.
- Find PD orgel ved omhyggeligt sondering med brand-poleret glas nåle. Den elastiske streng spænder over fælles har en sølv udseende.
- Fjern muskelfibre, som tilslører din opfattelse af orglet fra begge sider af senen. Vær meget omhyggelig med ikke at skade PD orgel eller dens nerve.
- Når dette er gennemført, fast vedhæfte forberedelse til fadet med pigmentet side (lateral) opad (figur 4).
Figur 4.. Udsat PD orgel og nerve. Klik her for at se større billede .
- Følg PD orgel nerve i propodite så langt proksimalt som muligt for at frigøre en lang længde af nerve (1,5 cm) til optagelse formål. Dette gøres bedst, mens PD nerve stadig er knyttet til de vigtigste ben nerve.
- Efter adskillelse af PD nerve fra de vigtigste ben nerve ved hjælp af glas nåle, afskære PD nerve proksimalt med iris saks Note:. Må ikke strække eller trække på nerven under dissektion.
- Flyt dactylopodite til en udvidet og fuldt bøjet stilling. Vær opmærksom om, hvor de ekstreme fleksion og ekstension holdninger er, og en halvvejs til senere brug.
- Placer en jordledning inde i saltvand bad.
- Tænd electrophysiology optagelse hardware / software Bemærk:. Vores setup er blevet beskrevet tidligere 23.
- Placer mikroskopet, således at den er over objektbordet. Når prep parabol er placeret på scenen, bliver du nødt til at justere positionen af den høje intensitet illuminator stråle til bedst visualisere præparatet.
- Placer mikromanipulator så vedlagte suge elektrode forsamling vil have nem adgang til saltvand bad og forberedelse. Suget elektrode er konstrueret som vist i en online video 24.
- For at detektere neurale aktivitet, tegne den afskårne ende af PD nerve ind i suge elektroden.
- Flyt dactyl hele udvidede og bøjede positioner for flere cykler ved hjælp af et glas sonde eller træ dyvel.
- Næste observere aktivitet, når dactyl er fastgjort i de udvidede, bøjet, og midt positioner.
2. Optagelse elektrisk aktivitet fra TensionNerve mens Overvågning styrkeopbygningsprocessen
- Bestem den laterale og mediale side af benet. Den mediale side har en blød konsistens, der kan mærkes ved at klemme forsigtigt på meropodite region med en fingernegl.
- Placer denne bløde neglebånd side op i skålen. Den Excitor motor nerve, der innerverer åbneren musklen innervates også båren muskel i carpopodite.
- For at stimulere åbneren muskel båren motor nerve i carpodite region isoleres og stimuleres med en suge elektrode. Den proksimale del af benet fjernes ved transecting den meropodite med en saks.
- Fjern en sektion af kutikula i håndroden region på indersiden (mediale side, figur 5A).
- Skær apodeme af Bender muskler og fjerne musklen omhyggeligt for ikke at trække de vigtigste ben nerve ud af benet hulrum (figur 5B, C Bemærk pilene hvor at Bender apodeme er adskilt). Den vigtigste ben nerve og en bhNCH til båren muskel kan så iagttages (figur 5D).
- Find den nerve afgrening fra den vigtigste nerve bundt til båren musklen (figur 5E, ved pil). Dette kan skæres tæt på muskler og trukket ind i en suge elektrode til at stimulere (figur 5F og G, pil skildrer filial).
- Drille en del af den nerve, der rager mod åbneren uden at klemme nerven. Transekt båren / åbneren motor nerve.
- Træk motorisk nerve i suge elektrode og derefter stimulere det.
- At udsætte åbneren muskler og spændinger nerve fjerne tættere muskler og den ventrale region af propodite. Skær tættere muskel med en skalpel med en # 11 klinge i propodite (Figur 6) Note:. Der må ikke skæres dybt i den proksimale region, fordi det kan beskadige åbneren motor nerve.
Figur 6. Skær neglebånd på den ventrale halvdel af propodite at blotlægge tættere musklen, så det kan fjernes. Klik her for at se større billede . - Udskift saltvand med frisk afkølet saltvand hele dissektion proces at holde neuroner i live. For yderligere dissektion placere forberedelse fad under et dissektionsmikroskop og bruge fiberoptisk belysning.
- Skær forsigtigt nærmere senen fra sin tilknytning tilden dactyl hjælp spids mellemstore saks.
- Vær meget forsigtig med ikke at forstyrre grene til åbneren muskel fra de vigtigste ben nerve, som bør være klart synlig.
- Fjern og kassér tættere muskler og sener.
- Lav et hul i dactyl med en dissektion stift. Dette hul vil senere blive brugt til at tilslutte metalstiften på spænding (kraft) transducer, men det er nødvendigt at gøre det på dette stadium af proceduren.
- Find nerve gren, som rager til åbneren muskler og apodeme i det distale område af åbneren muskel. Sonden forsigtigt nerve med brand-poleret glas værktøj.
- Overhold spænding nerve, der opstår fra den distale ende af apodeme og provenuet til motoren nerve bundt.
- For at detektere neurale aktivitet, fylde en suge elektrode med krabbe saltvand og trække den afskårne ende af åbneren spænding nerve ind i elektroden. Sørg for, at suge elektrode sidder stramt på nerven.
- Undersøg for neural korrelat for passiv spænding på åbneren apodeme. Under optagelse af elektrisk aktivitet fra spændingen nerve dreje dactyl sig til et udvidet fælles (dvs. strække åbneren muskel).
- Dernæst test aktiv kraft udvikling i forhold til stimulation frekvens.
- Sæt en metal krog, således at spidsen af krogen går gennem et lille hul i daktyl.
- Bemærk fastgøre den anden ende af metal krog til krafttransducer:. Kontroller, at transduceren er i en vinkel på 90 ° hver gang, så at stiften er vinkelret på transduceren for maksimal detektion af den kraft, der frembringes.
- Træk krogen og daktyl, så det er på omkring en vinkel på 45 ° af åbneren joint.
- Nu stimulere motorisk nerve ved 100 Hz til 250 msek og måle den kraft samt affyringen frekvensen af spændingen nerve.
- Placer joint til en fuldt udstrakt position, så åbner muskelfibrene er slatten.
- Stimulate motor nerve ved 100 Hz til 250 msek og måle den kraft samt affyringen frekvensen af spændingen nerve.
- Bend / flex joint, så det er fuldt bøjet (~ 90 °). I denne stilling muskelfibre af åbneren er fuldt udstrakte. Der kan være en vis kraft, der måles af transduceren på grund af denne passive strækning af musklen.
- Stimulere motorisk nerve ved 100 Hz til 250 msek og måle den kraft samt affyringen frekvensen af spændingen nerve.
- Efter måling af en kraft, fortsætte i en række forskellige frekvenser: 20, 40, 60, 80, og 100 Hz for 8-10 sek i hvert fælles position.
- Måle responsen med en hurtig spænding release. Anbring præparatet, således at krogen på krafttransducer let kan skubbes ud af hullet i daktyl.
- Bend / flex joint, så det er fuldt bøjet (~ 90 °). Nu stimulere motorisk nerve ved 100 Hz med en kontinuerlig stimulering af 5 sek.
- Efter den første sekund eller mindre, som spændinger har bygget op på åbneren muskel, skubbe stiften ud af hullet i dactyl.
- Undersøg spænding nerve optagelse før og efter udgivelsen af pinden holder dactyl.
- Modulerende virkninger af neuroaktive stoffer såsom octopamine, serotonin og proctolin, som ændrer produktionen af spændingen neuroner, kan bestemmes ved tilsætning af disse molekyler til badning medier over udsatte åbneren muskel og gentage forsøgene.
- Brug en pipette og dryppe 1-2 ml i præparatet.
3. Farvning perifere nervesystem Strukturer i Crustacean Gåture Legs
- Methylenblå teknik
- Ene side methylenblåt chlorid stamopløsning (0,25%) fortyndes med to dele destilleret vand.
- Denne blanding tilsættes fem dele pufret saltvand. Grundigt overrisle området af interesse.
- Dissekere et ben i henhold til protokollen i afsnit 1. Inkubér præparation i opløsning af methylenblåt ved 12-13 ° C.
- Undersøg præparatet hver 10-15 min med dissektionsmikroskop ved hjælp af lav intensitet belysning til at følge udviklingen i farvning. I nogle tilfælde farvning vil blive afsluttet i en time, i andre kan det tage natten over.
- 4-di-2-ASP teknik
- Fluorescerende farvestoffer kan bruges til back-fylde PD neuron eller direkte plette forberedelse fra badet. Men et egnet mikroskop med evner til at se den fluorescerende pletten er påkrævet.
- Dissekere et ben ifølge en protokol i § 1.
- Inkuber præparatet i en 10 uM koncentration af 4-di-2-ASP-løsning og lade præparatet i køleskab i 15 minutter. Brug lige nok løsning til at dække præparatet.
- Fotografere forberedelserne hurtigt og undgå overeksponering for kviksølv lys. Denne fluorescerende farvestof forsvinder relativt hurtigt.
- Expose PD nerve i henhold til protokollen i afsnit 1 og holde det nedsænkes i koldt saltvand.
- Lav en vaseline godt at holde CoCI2. Hvis nogen CoCI2 spild i saltvand badet hele forberedelse vil pletten sort, og præparatet bør kasseres.
- Slip et lille snit af en polystyren-ark, for at gøre en plast-platform, og pin det på en sådan måde, at det ikke vil flyde væk eller blive nedsænket i saltvand bad (figur 7).
Figur 7.. Polystyren plade med ben til at holde på plads i fad. Klik her for at se større billede . - Skub vaseline fra en fin kanyle fastgjort til en engangssprøjtederefter foretage en barriere (en cirkel kan fungere godt), der bør være omkring 1-1,5 mm høje bortset fra en overfladisk "V" på midtpunktet, hvor nerven vil blive draperet over oven på slip polystyren.
- Lav en lille pyt af saltvand på begge sider af barrieren i nærheden af "V". Pas på ikke at strække eller klemme den nerve, løft nerve forsigtigt fra fadet og læg den i saltvand pøl i vaseline godt.
- Arbejde hurtigt, så at den del af nerven ikke udtørrer forsigtigt skubbe vaseline for at dække det udsatte nerve. Nu teste barriere med saltvand og sørg for at det ikke er utæt.
- Dup væk saltopløsning på indersiden af barrieren og se, om den fyldes op, når badet saltopløsning er høj omkring væggen af vaseline for at være sikker på, at de to sider er isoleret fra hinanden (figur 8).
- Bortsuge saltvand i brønden ved hjælp af et stykke filtrerpapir. Undgå at lade papiret ombryde op nerve.
- Lav en ny pyt bruge et par små dråber af destilleret vand, og derefter skære den nerve ende. Vær meget forsigtig med ikke at trække nerve gennem barrieren, når de foretager snittet. Den osmotisk chok af destilleret vand vil "ballon" axoner.
- Inden for 30 sek tilføje en lille dråbe CoCI2 til vandet, opsuge denne løsning, og derefter tilføje nok CoCI2 at danne en pyt i denne forkortede afsnit af nerve (figur 9). Forberedelserne er bedst holdes nedkølet ved 13 ° C i 12-24 timer.
tp_upload/51050/51050fig9.jpg "width =" 500px "/>
Figur 9. Snittet PD nerve blive udsat for CoCI2. Snittet nerve svulmer op i tilstedeværelse af vand, der letter og accelererer bevægelsen af farvestof molekyler gennem axoner ind i neuron celle organer. Klik her for at se større billede . - Fjern befugtningsfunktionerne vandpytter. Dup væk coboltopløsningen hjælp af et væv og vaske væk resterne af kobolt med flere ændringer i saltvand.
- Overfør isolerede forberedelse til et lille glas petriskål indeholdende ca 10 ml krabbe saltvand. Neuroner vaskes og de følgende trin udføres in situ. Gode metalværktøj ikke skal bruges til at håndtere præparatet efter dette trin (du skal bruge konkrete værktøjer, som ikke skal bruges på et senere tidspunkt for fysiologi).
- Tilføj 1-2 dråber ammoniumsulfid (NH4) 2 S til saltvand. Cap (NH 4) 2 S flasken tæt og læg tilbage i hætten. Reaktionen i præparatet observere under et dissektionsmikroskop
- Indenfor 1-2 min, bør kobolt-fyldte neuroner og deres processer begynder at dukke op, fordi de vil pletten sort.
- Efter 5-10 min, udvikling opløsningen med frisk saltvand erstatte.
- Vær sikker på, at udviklingen løsning, du har hældt i vasken afløbet efterfølges af rindende vand i et par minutter eller affald flaske med låg.
- Hæld saltvand og løse forberedelse nerve for omkring 15 minutter med to ændringer i Bouin løsning fiksativ. For større væv som åbneren musklen (at plette spænding neuroner), øge varigheden af fiksering til 30 min.
- Dehydrer i en serie af stigende rækkefølge ethanol koncentration begynder ved 70% (dvs. 70%, 80%, 90%, 100%). Ca. 10 minutter ved hver koncentration er tilstrækkelig tilsmå væv.
- Efter ca 10-15 min i to ændringer i 100% ethanol, rydde væv ved at erstatte ethanol med 100% methyl salicylat. Præparatet vil forblive i denne løsning permanent til gentagen visning. Med tiden de fyldte celler vil blive mere indlysende, fordi det omgivende væv bliver tydeligere. Intensivering metoder kan bruges til at hjælpe med at forhindre fading over tid 25.
- Brug den samme proces til at fylde spændingen nerve med CoCI2. Dog ændre ethanolopløsning flere gange i hver ethanol dehydreringstrinnet og inkuber præparatet inde alkohol til omkring 20 min for hvert trin til grundigt at dehydrere muskler og give dem mulighed for at rydde godt.
Representative Results
Når PD orgel strækkes ved fuldt ud at udvide samlingen, aktiviteten i PD nerve er robust under bevægelsen som vist for det første sekund i figur 10.. Nogle aktivitet forbliver mens den holdes stadig i åben stilling. Denne aktivitet er fra de statiske position følsomme neuroner (anden halvdel af optagelsen er vist i figur 10). Bevægelse fremkalder en reaktion under forskydningen, og brændingen er hovedsagelig til stede under strækning af chordotonal streng (figur 11).
Yderligere analyse af de pigge kan let kontaktet ved at sortere de relative amplituder. Dette er en tilgang til at demonstrere forskellige populationer af sensoriske neuroner bliver rekrutteret til stillinger eller typer af bevægelser 5. Typiske amplituder spænder fra 0,25 til 1,5 mV, men disse værdier er afhængige modstand (dvs. tæthed) af suge elektrode forsegling. Hyppigheden af pigge i than forskellige størrelse intervaller kan også grafisk til analyse.
Kræfter, der genereres af åbneren musklen med hensyn til stimulering frekvens kan sammenlignes ved at sammenføje de respektive spænding-tid spor oven på hinanden (figur 13A og B). Dette kan også udføres for hver fælles position ved hver given stimulation frekvens. Aktivitet af spændingen nerve kan derefter korreleres med mængden af relativ kraft, der frembringes ved hver stimulation frekvens, og for hver fælles position. Som i PD nerve, er en række spike amplituder ses som reaktion på sammentrækningen af åbneren musklen (figur 13C).
Anatomisk arrangement af neuroner i walking ben er klart observeret med methylenblåt-farvning (figur 14). Bemærk den elastiske chordotonal streng og spænding neuron, der er tæt på apodeme. Adskillige somata med forskellige diametre end bestemte steder er også synlige i denne figur. Hele forløbet af spændingen nerve og båre motorisk nerve er vist i figur 15.. Individuelle neuroner i PD nerve vist med højere kontrast under anvendelse af 4-di-2-ASP (figur 16) og CoCl2 (fig. 17) efterfylde teknikker. Ved stor forstørrelse de sensoriske endelser kan ses inde i støttende scolopales (figur 16B) 21,22,26.
Figur 10. Flyt og hold ved 0 °. De dynamiske neuroner er robuste i fyring under bevægelsen og pigge fra statisk følsomme neuroner er til stede, mens samlingen holdes åben. Klik her for at se større billede </ A>.
Figur 11. Hurtig åbne og lukke fra helt bøjet til udvidet (90-0 °) position. Klik her for at se større billede .
Figur 12. Ekstracellulære pigge optaget fra PD nerve. Samlingen er trukket helt ud og derefter hurtigt flyttet til et ½ bøjet stilling og derefter holdt stille. Læg mærke til den aktivitet i løbet af bevægelse og nedsat aktivitet, når statisk. Klik her for at se større image.
Figur 13. De relative styrker, der er udviklet med fælles fuldt bøjet og stimuleret på de forskellige frekvenser. (A) Spænding-tid spor fra krafttransducer vises med hver stimulation frekvens. (B) Sporene i panel A er overlejret i forskellige farver for let i sammenligning. (C) Spænding-tid spor af elektrisk aktivitet optaget fra spændingen nerve, når motoren nerve blev stimuleret ved 80 Hz. Bemærk den regelmæssigt mønster af de stimulerende artefakter sammenlignet med den neurale aktivitet. Bemærk også, de forskellige amplituder af de neurale reaktioner. Klik her for at se større billede .
Figur 14.. Methylenblåt plet af præparatet gå ben. Individuelle SOMA er vist med deres sensoriske ender rager ind i elastiske streng. Tæt på apodeme en spænding neuron bliver vist. Klik her for at se større billede .
Figur 15.. Spændingen nerve skyldes distale ende (røde pile), og sammenføjning af motoren nerve (grøn pil). Klik her for at se større billede .
Figur 16. (A) En back-fill af PD nerve i Cancer magister med 4-Di-2-ASP. (B) Højere forstørrelse af sensoriske endelser. Klik her for at se større billede .
Figur 17. Neuroner, der var fyldt med CoCI2 og forarbejdede (A). Spores omrids af det farvede præparat vist (B). Klik her for at se større billede .
| Saline | g / L |
| NaCl | 27.29 |
| KCl | 0,81 |
| MgSO4 • 7H 2 O | 4,81 |
| CaCl2 • 2H 2 O | 1,85 |
| Na 2 SO 4 • 10H 2 O | 0.97 |
| 1,982 | |
| HEPES syre | 0.476 |
| HEPES salt | 2,08 |
| Juster til pH 8,1 med NaOH eller HCl |
Tabel 1.. Opskrifter til krabbe saltvand.
Discussion
Formålet med dette sæt af eksperimenter er 1) at undervise og udstille de grundlæggende principper for ekstracellulære optagelser fra en identificerbar proprioceptive orgel og spænding nerve og 2) at understrege betydningen af anatomisk kortlægning i forhold til fysiologiske funktion af bestemte sansesystemer. Denne eksperimenterende tilgang og dyremodeller udnyttet er billig og forholdsvis let at gennemføre i neurofysiologi undervisningslaboratorierne.
Neuronerne i chordotonal organer er af to specifikke funktionelle typer, dem, der reagerer på bevægelse og dem, der reagerer statiske positioner. Encellede optagelser fra en række chordotonal organer, uanset hvilken fælles undersøges, har vist, at dette er tilfældet 3,5. Faktisk chordotonal organer er forbundet med de antennal leddene af hummere afslører de samme to sensoriske typer og grundlæggende anatomi 27. Ud over at der er to neuron typer (bevægelses-og posion), neuroner deler den samme anatomiske arrangement på deres respektive elastiske tråde. Den store somata placeret proksimalt på strengen har tendens til at tilhøre de dynamiske bevægelse følsomme neuroner. Neuroner der signalerer statiske positioner har små somata og er placeret distalt. Disse celler er tonisk aktive. PD fælles indeholder kun en enkelt chordotonal orgel, mens der er to chordotonal organer i håndroden-propodus (CP) og Merus-håndroden (MC) leddene.
Dissektion at eksponere proprioceptive strukturer i blå krabber (C. sapidus) for elektrofysiologiske optagelse kræver en strategi, der giver mulighed for fælles bevægelser til at finde sted i de naturlige positioner, mens du optager fra sensoriske neuroner. Spændingen nerver åbneren muskel i walking ben er en meget fin nerve består af flere neuroner. Medmindre omhu, spændingen nerve samt motorisk nerve, som innerverer musklen skal stimuleres, kan blive beskadiget under denne dissektion. Foroptimale optagelser af sugeelektroder skal tilpasses til størrelsen af nerve. Optagelser er let tilgængelige i en studerendes laboratorium ved hjælp af en 30-40X forstørrelse dissektionsmikroskop og low-end mikromanipulatorer.
Fremtidige eksperimenter, der ville være interessant at forfølge de fælles chordotonal organer ville være at undersøge de strukturelle og fysiologiske profiler under ben regenerering i forskellige arter på forskellige stadier i livscyklussen som en opfølgning på en indledende undersøgelse, der brugte Cancer magister 19,26 . Spørgsmål resterende skal behandles, er 1) ikke distribution og organisering af regenererede neuroner afhænger af alder af dyret, når regenerere en lem, 2) er de axonale fremskrivninger til CNS (ventrale nerve ledning) i en regenererende lemmer funktionel eller gør det tage tid og fælles brug for at etablere funktionelle sammenhænge, og 3) hvad der sker med de afhuggede axoner proksimalt for autotomy plan, når benet er autotomized? 28
Krebsdyr i overensstemmelse med miljømæssige forhold og deres omgivende temperatur, men det er uklart, hvordan de opretholde koordinering inden en neurale kredsløb som neuroner ændre deres aktivitet som reaktion på temperaturændringer. En langsom ændring kan give dyret mulighed for lidt tid til akklimatisering mens en hurtig ændring kan not29 30. Fysiologiske ændringer i pH eller osmolaritet på grund af stofskiftet, adfærd 31 eller miljøbelastningen kan frembyde lignende udfordringer til neurale kredsløb, der er involveret i proprioception. Disse krebsdyr præparater er ideelle til at løse disse typer af problemer, fordi deres funktion er godt karakteriseret ved en enkelt celle niveau.
I denne protokol har vi vist den fysiologiske betydning af spænding neuroner i overvågningen kraft genereret af åbneren musklen. Disse spændinger receptorer kan spores til deres placering i apodeme ved hjælp farvningsprocedurer. Disseneuroner, som i pattedyr, opdage kraft på forskellige niveauer og rekruttere yderligere neuroner som den kraft stiger. Frekvensen i aktivitet er relateret til stimulering hyppigheden af motorneuroner til mætning i modtagelse er nået. Ved hjælp af en hurtig release protokol med bøjet dactylus fælles, spænding aktivitet forsvinder hurtigt, men derefter vender tilbage efter at genvinde spændinger i en fuldt udstrakt joint. Dette er en klassisk eksperimentelle procedure til at illustrere den kraft målt ved spændinger receptorer. Forskellige neuromodulatorer kan anvendes til forberedelse til at se, hvordan det påvirker udviklingen af kraft og neuronal respons. Et af de vigtige aspekter er, hvordan de neurale reaktioner behandles og integreres i det centrale nervesystem og deres indvirkning på aktiviteten af motoriske neuroner. De teknikker, vi har vist, at man kan begynde at behandle mere information om spændingen (sensorisk) nerve-motor neuron kredsløb funktion, dvs signal i en intakt benet til ganglion og tilbagetil musklen.
De farvningsprocedurer demonstreret er nøglen til at forstå fysiologi sensoriske neuroner, der innerverer proprioceptive organer. Anatomisk placering af neuroner baseret på funktion og størrelsen af soma er ens i de forskellige chordotonal organer i Krabbe ben. Det vides ikke, om lignende neuronale arrangementer også findes i andre krebsdyr arter eller insekter. Ved at kombinere fysiologiske optagelser fra enkelte celler og kortlægge placering giver direkte struktur funktion forhold. Den langsigtede bevaring af den anatomiske arrangement med CoCI2 farvning og fiksering tillader en at gentagne gøre foranstaltninger og vurdere strukturelle arrangement.
Proprioception og spænding modtagelse af skeletmuskulatur er sensoriske modaliteter, der muliggør koordinerede adfærd og reaktioner på eksterne og interne miljø for leddelte dyr i en bred vifte af skeletmuskulatur konfigurationsek. Musklen receptor orgel i maven af krebs er en anden veldokumenteret præparat (se Crawdad projektet; http://www.crawdad.cornell.edu/ ) til undervisningsbrug af proprioception med kun to neuroner pr abdominal hemi-segment 23. . At være i stand til at optage fra enkelte neuroner til sensoriske nerve bundter giver yderligere oplysninger, at støtte i at forstå de grundlæggende principper for sensorisk modtagelse. Disse relativt simple krebsdyr forberedelser tillader en at løse fundamentale aspekter af proprioception og spænding overvågning, med potentiale til at bestemme de neurale kredsløb, der muliggør central integration af proprioceptive og andre sensoriske inputs 9-12, 32, 33.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for de kunstneriske bidrag Hyewon Cooper.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| HEPES base | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
| CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
| Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Materials | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | Any company | ||
| Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | Any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | Any company | ||
| Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |
References
- Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
- Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).
- Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
- Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109 (2), 479-486 (1994).
- Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81 (4), 447-475 (2008).
- Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
- Hill, A. V. First and Last Experiments in Muscle Mechanics. , Cambridge University Press. Cambridge, U.K. (1970).
- Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14 (3), 274-292 (1972).
- Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1 (1-4), 185-208 (1972).
- Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221 (2), 185-198 (1983).
- El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 337-349 (1991).
- Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88 (5), 2575-2588 (2002).
- Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78 (6), 3133-3143 (1997).
- Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
- Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38 (01), 01-143 (1959).
- Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157 (3), 355-362 (1985).
- Holsinger, R. The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. , University of Kentucky. (2013).
- Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211 (1), 139-149 (1980).
- Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72 (2), 391-399 (1982).
- Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180 (3), 215-221 (1997).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245 (725), 291-325 (1962).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248 (752), 437-456 (1965).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322 (2011).
- Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
- Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).
- Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).
- Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).
- Chung, Y. -S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).
- Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).
- Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. , (2013).
- Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).
