Summary
Amoebal 공 배양 선택적 같은 아메바 및 대 식세포와 같은 식세포에 저항 할 수 세포 내 병원체를 성장 자기편 아메바를 사용하여 세포 배양 시스템이다. 그것은 따라서 새로운 감염원을 발견 할 수있는 중요한 도구를 나타냅니다. Amoebal 농축 새로운 amoebal 종과 특정 세포 내 박테리아의 발견을 할 수 있습니다.
Abstract
이러한 레지오넬라 균, 결핵균과 클라미디아 같은 생물로 세포 내 병원균은 종종 전혀 보통 박테리아를 배양하는 데 사용되는 선택적 미디어에 저조한 여부 성장하기 때문에 분리하기가 어렵습니다. 이러한 이유로, 이러한 병원체의 대부분은 단지 최근에 발견되거나 중요한 발병을 다음 하였다. 이 병원균은 종종 호스트 세포의 역할과 박테리아의 생존과 성장을 할 수 아메바와 관련이있다. amoebal 공 배양 및 amoebal 농축 : 우리는 임상 및 환경 샘플에서 세포 내 병원균의 분리 및 특성이 존재 수있는 두 가지 기술의 데모를 제공하기 위해 여기를하려고합니다. Amoebal 공 배양 샘플에 존재하는 세포 내 세균에 의해 감염 용해 할 수있는 amoebal 잔디에 조사 된 샘플을 접종하여 세포 내 박테리아의 복구를 할 수 있습니다. Amoebal 농축은 임상 적 또는 환경 샘플에서 아메바의 복구가 존재 할 수 있습니다. 일또한이 아메바에 특히 성장의 새로운 세포 내 박테리아의 새로운 amoebal 종의 발견으로 이어질 수있다. 함께,이 두 가지 기술은 아메바에서 성장할 수 새로운 세포 내 박테리아를 발견하는 데 도움이됩니다. 때문에 아메바 감염 및 식균 작용에 저항 할 수있는 능력으로,이 세포 내 박테리아는 또한 대 식세포에 의해 포식 작용을 피할 수 있으며, 따라서 더 높은 진핵 생물에 대한 병원성.
Introduction
분자 진단의 도래하기 전에, 환경 틈새 시장 또는 임상 샘플에 존재하는 미생물은 종종 주로 배양 접시에있는 한천에, 다른 선택 배지에 그들을 양성으로 검출되었다. 세균성 식민지와 그들의 신진 대사 활동의 표현형은 종 수준에서 세균의 분류를 허용했다. 다시 물은 또한 검출의 민감도를 증가시키기 위해 사용될 수있다. 그러나 두 기술의 모든 미디어에 천천히 여부 성장 박테리아의 복구를 허용하지 않습니다. 이 분자 접근 방식이 널리 오늘날 사용되는 이유입니다. 그럼에도 불구하고, DNA의 검출은 세균의 생존에 대한 단서를 제공하지 않습니다. 또한, 반하여 문화, 분자 접근은 더욱 특성화 될 수있는 변형을 초래하지 않습니다.
성장 고체 미디어 또는 그 필요 세포에 제대로 성장 병원체를 공부하는 것은 복잡하다. 이들의 대부분은 박테리아가 까다로운 INTR은 "어려운 성장 전망"무 세포 박테리아, 종종 발견하고 레지오넬라 뉴모 필라의 경우와 같이 큰 발생 다음과 같은 특징. 이 박테리아는 미국 재향 군인회의 대회 기간 동안 발생한 발발 다음과 같은 특징이되었다. 많은 182과 같은 사람은 감염 29 인해 심각한 폐렴 1,2에 사망했다. 그것은 나중에 아메바는 자연이 박테리아의 호스트와 호텔 에어컨 시스템과 물 네트워크에서 자신의 존재가 소위 군단의 병사의 질병 3의 발발의 원점이라고 있다고 설명했다.
아메바는 전 세계적으로 존재하고 토양, 공기, 물, (4 검토) 지원자의 코 점막에서 분리되었다. 이러한 "자유 생활"아메바는 일반적으로 환경에서 자율적으로 분할되지만 가끔 관대 한 호스트 5에 침입 할 수 있습니다. HY으로 식균 작용 및 후속 리소좀 소화를 통해 다양한 미생물에 아메바 공급drolases 6. 많은 통성 또는 의무 세포 내 박테리아가 소화에 저항하기 때문에 감염 예 레지오넬라 균, 클라미디아 관련 세균이나 진균 등 아메바에 나누어 (7 검토하고 8) 할 수 있습니다. 자유 생활 아메바 가능성이 아직 발견되지 않은 세포 내 박테리아의 중요한 잠재적 인 저수지를 나타냅니다. 이 로잔에있는 다른 그룹은 다양한 환경 시료 9-15에서 여러 가지 새로운 의무를 세포 내 미생물을 분리 할 수 amoebal 공 배양 및 amoebal 농축이라는 두 가지 주요 기술을 구현하기 위해 그룹을 이끌었다.
아메바 세균에 방목 전문 식세포 때문에, 식균 작용에 저항하고있는 원생 생물 안에 성장할 수 박테리아는 인간의 식세포 집락과 인간을 향한 병원성 수 있습니다. 이는 부분적으로 이러한 Waddlia 초와 같은 일부 클라미디아 관련 박테리아에 대한 입증되었다ndrophila. W. chondrophila은 아메바에서뿐만 아니라, 포유류의 상피 세포, 대 식세포, 물고기 세포주 16-18로 여러 종류의 세포에서뿐만 아니라 증가 할 수 있습니다. amoebal 공 배양는 크게 다른 세균 종 (21) 오염 의자 등의 임상 샘플 19, 20, 세포 내 박테리아를 검출 관련이 나타납니다.
무균 미디어 아메바의 (b)는 성장과 대장균 박테리아 잔디 및 (c) 선정 및 특성, 여기에서 우리는 환경이나 임상 시료의 () 처리를 포함, amoebal 공 배양 및 amoebal 농축의 주요 단계를 설명 세포 내 박테리아의.
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Protocol
1. Amoebal 공 배양
1.1 시료 준비
- 환경 샘플
- 물 샘플
0.22 ㎛의 공극 크기 막을 통해 물 샘플 (1 L에, 500 ㎖)을 고를. 그런 다음, (페이지의 아메바 식염수 매체 PAS에 막 흔들 염화나트륨 120 ㎎, 망초 4 MG • 7H 2 O, 염화칼슘 4 MG • 2H 2 O, 나 2 HPO 4 142 ㎎, 및 KH 136 밀리그램 증류수 1 L의 2 PO 4). - 고체 샘플
증류수 또는 PBS에서 활성 슬러지와 같은 흙이나 모래 샘플 및 반 고형 시료와 같은 고체 샘플을 재현 탁하고 0.22 μm의 기공 크기의 세포막을 통해 그들을 필터링합니다. 그런 다음, PAS에 막 흔들. - 높은 내생 아메바와 원생 동물로 오염 된 샘플
먼저 저속 원심 분리 (180 XG) FO하여 샘플을 침전R 10 분 또는 5 ㎛의 공극 크기 막을 통해 고를. 또한 1.1.1 에서처럼 상등액 (각각 여과 액)을 가공한다.
참고 : 30 분 동안 50 ° C에서 샘플을 가열하거나 산성 또는 염기성 용액 (14) 치료 : 기타 오염 제거 기술은 더 환경 시료의 오염을 제거하는 데 사용할 수 있습니다.
- 물 샘플
- 임상 샘플
자신의 물리 화학적 특성에 따라 임상 샘플을 처리합니다. 큰 불순물을 제거하는 필터 또는 원심 분리기 액체. 고체 시료를 Resuspend. , 조직을 사용 다운스 homogeneiser 또는 유리 구슬을 사용하여 예를 들어, 그들을 분쇄하고, 세포 내 박테리아를 무료로 세포를 용해하기.
1.2 아메바 준비
- 국물 준비
; proteose 펩톤 100g, 효모 추출물 10g, 망초 • 7H 2의 4.9 g 펩톤, 효모 추출물과 포도당 (PYG를 포함하는 리치 미디어 다음 미디어를 준비합니다O, 구연산 나트륨 5 g의 • 2H 2 O, 철 (NH 4) 0.1 g을 2 (SO 4) 2 • 6H 2 O, KH 2 PO 4, 나 2 HPO 4 1.97 g 1.7 g • 7H 2 O , 포도당 45g, 증류수 5 L에 염화칼슘의 0.295 g) 및 같은 아메바 종 PAS 같은 비 영양 매체. - Amoebal 문화
- PYG 배지 30 ㎖를 포함하는 세포 배양 플라스크에 25 ° C에서 아메바 (아메바 우선적으로 castellanii ATCC 30010 또는 A.의 polyphaga 링컨-AP1)를 재배하고 있습니다.
- 플라스크의 활발한 흔들어 아메바를 수확하고 1,500 X g에서 10 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기. PAS 매체로 두 번 펠렛을 씻으십시오. KOVA 슬라이드에 세포를 세어 밀리리터 당 5 × 105 세포의 현탁액을 얻기 위해 볼륨을 조정한다.
- 마이크로 플레이트에 amoebal 현탁액을 전송합니다. 24 승 - 1 12 웰 당 ML을 사용하여엘 플레이트, 48 잘 접시 96 - 웰 플레이트 300 μL 500 μL. 25 ℃에서 최소 2 시간 동안 마이크로 플레이트를 품어 이 잘 침전과 아메바의 부착 각의 바닥에 있습니다.
1.3 공 배양
- 샘플 접종
- 희석 시료 100 μL로 시작하는, 일반적으로 10 배 희석 시리즈, 1.1 또는 1.2에서 샘플의 일련의 희석과 2.3.3에서 판을 접종한다.
- 샘플의 미생물이 잠재적으로 존재하는 amoebal 잔디밭에 침전물에 10 분 동안 1,800 XG에서 마이크로 플레이트를 원심 분리기. 이 아메바에 의한 접촉과 미생물의 식균 작용을 증가시킨다.
- 25 ° C에서 45 분 동안 접시를 품어 신선한 PAS와 미디어를 대체하여 PAS로 3 회 세척한다. bacteri에 따라 (스트렙토 마이신, 페니실린, 겐타 마이신 및 / 또는 반코마이신) 또는 항생제의 첨가없이 PAS 잘 당 1 ㎖를 추가검색됩니다 알 종.
- 아메바의 encystment을 방지하기 위해 가습 분위기에서 32 ° C에서 마이크로 플레이트를 품어. 아메바를 침해하고 용해하는 박테리아의 존재를 감지하는 20X의 목적으로 매일 아니라 각을 준수하십시오.
- 용해의 경우, 약 10 5 아메바 / ㎠의 단층에 공 배양의 100 μl를 접종하여 신선한 아메바의 배양을 수행합니다. 구체적으로 주어진 종의 박테리아를 분리하려면 다음과 세균 (레지오넬라 균 종에 대한 즉 BCYE 한천.)을 위해 설계 특정 한천 매체는 또한 접종.
- 용해의 부재에서, 4-7일 첫 번째 접종 후 공 배양의 100 μl를 타고 24 웰 플레이트에 900 μL의 신선한 amoebal 문화를 접종. 아메바의 빠른 용해가 박테리아의 확산이 관찰되는 경우, 바이러스가 존재할 수 있습니다. 이 경우, 0.22 μm의에 뜨는을 필터링하고 신선한 아메바 감염 필터링 된 서스펜션을 사용합니다.
1.4 세균의 분리 및 특성
- 세균의 염색
마이크로 플레이트 24도에서 유리 커버 슬립에 직접 공 배양을 수행합니다. 매체를 제거하고 염색 또는 면역을 수행합니다.- 수정 Romanowsky 염색
- coverslip에 건조 보자. 커버 슬립에게 정착 용액 (2 ㎎ / L 빠른 그린 메탄올)에서 다섯 번 담가.
- 염색 용액에 coverslip에 다섯 번 담가 I (1.22 g / L 에오신 G 인산염 완충액 pH를 6.6)
- 마지막으로, 염색 액 II (인산염 완충액 pH가 6.6에서 1.1 g / L의 티아)에 coverslip에 5 배를 체험.
- 증류수로 샘플을 씻어. 건조하자 현미경으로 관찰한다.
- Ziehl-Neelsen 염색
- coverslip에 건조 보자. Ziehl의 푹신와 샘플을 커버. 증기가 나올 때까지 불꽃 염료를 가열한다.
- 적어도 5 분 동안 상온에서 차가운및 증류수로 씻어. 2 분 이소프로판올 3 % 염산 용액에 샘플을 커버하고 증류수로 씻어.
- 메틸렌 블루 30 초 동안 덮고 증류수로 씻어. 건조하자 현미경 (22)에 의해 관찰합니다.
- Gimenez 염색
- 100 10 % 기본 푹신 ㎖ (100 ㎖의 95 % 에탄올에 기본 푹신 10 g)을 250 ㎖의 4 % 수성 페놀 및 증류수 650 ㎖를 혼합하여 기본 푹신 주식 솔루션을 준비합니다. 사용하기 전에 48 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다.
- coverslip에 불꽃을 전달하여 건조 및 고정 할 수 있습니다. 2 분 동안 (10 ㎖의 0.1 M 인산 나트륨 완충액, pH를 7.45로 염기성 푹신 스톡 용액 4 ㎖) 갓 여과 염기성 푹신 가진 샘플을 커버.
- 물 샘플을 헹구고 10 초 동안 말라카이트 그린 (증류수 0.8 %)에서 배양한다. 물로 다시 씻어 말라카이트 그린 염색을 반복합니다. 물로 세척한다. coverslip에 말리면, M그것을 ount 및 현미경 (23)에 의해 관찰합니다.
- 면역 형광
- 10 분 동안 4 %에서 5 분 동안 또는 파라 포름 알데히드와 메탄올에 배양하여 커버 슬립을 수정.
- PBS로 3 회 세척하고 실온에서 (PBS 0.1 % 사포닌을 5 % BSA)를 차단 솔루션에서 2 시간 동안 배양한다.
- 관심의 미생물에 대해 제기 항체를 포함하는 솔루션을 차단에 1 시간 동안의 coverslip을 품어.
- PBS에 다시 세 번 세척하고 일차 항체에 대한 감독 및 형광에 연결된 보조 항체로 1 시간 동안 배양한다. PBS로 3 회 세척, 커버 슬립을 탑재하고 형광 현미경으로 관찰한다.
- 수정 Romanowsky 염색
- PCR에 의한 DNA 검출
amoebal 공 배양의 100 ~ 200 μL에서 DNA를 추출합니다. 이러한 마이코 박테리아 (24)와 같은 관심 종의 16S rRNA 유전자 또는 특정 프라이머를 대상으로 보편적 인 프라이머와 미생물을 검출, 레지오넬라 균 25 Chlamydiales 26의 멤버.
2. Amoebal 심화
2.1. 샘플 준비
텍싱하여 PAS 고체 및 반고체 샘플을 Resuspend. 10 분 동안 저속 (180 XG)에서 현탁액을 원심 분리기. 이 펠릿에있는 자유 생활 아메바의 농축 수 있습니다. 상등액 amoebal 공 배양과 amoebal 농축 21 펠릿을 위해 사용될 수있다.
2.2. 중간 준비
- PAS 100 ㎖에 한천 1.5 g을 추가하고 121 ℃에서 중간 15 분 압력솥 페트리 접시에 따뜻한 매체를 붓고 실온에서 응고 수 있습니다.
- 37 ℃에서 하룻밤 LB 또는 티오 글리콜 산 국물에 대장균 (ATCC 25922)을 성장 PBS로 두 번 박테리아를 씻어 PAS 매체에서 그들을 재현 탁. PAS에 10 배 희석하고 PAS 한천 플레이트에이 희석 2 ~ 3 ㎖의 확산 및 건조 할 수 있습니다.
판의 한쪽면에 샘플의 드롭 (또는 필터 매)를 추가하고 접시의 중앙 라인을 형성하는 페트리 접시 위에 흐르게.
2.4. Amoebal 성장과 amoebal 배양
- 매일 페트리 접시를 관찰합니다. amoebal 이주 전면이 검출되는 경우, 이주 전면 한천의 작은 조각을 잘라내어 E.의 잔디 덮여 신선한 NNA 페트리 접시에 접종 대장균.
- 관련 amoebal 균주의 순수 배양을 위하여, 시료의 순도에 따라 reinoculation 여러 번 반복.
2.5. 아메바와 박테리아 특성
- 세포를 긁고 PAS에서 그들을 재현 탁.
- DNA를 추출하여 PCR 및 시퀀싱 (박테리아 16S rRNA를 증폭, RESP. 18S rRNA의 아메바 및 시퀀싱, 예를 들어)로 아메바 및 / 또는 세균 endosymbionts의 신원을 확인합니다. <리> 신선한 아메바 접종 및 샘플의 가능성이 존재하는 박테리아를 검출하는 amoebal 공 배양을 수행하는 PAS 이러한 긁어 세포를 사용합니다.
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Representative Results
amoebal 공 배양과 amoebal 농축을 사용하여, 환경 및 / 또는 병원성 세균의 전체 범위는 (표 1)를 발견 하였다.
Amoebal 공 배양은 환경 시료, 물 처리 플랜트, 물 분배 시스템을 분석하는 단체와 다른 사람들에 의해 사용되었다. 미생물의 넓은 범위는이 기술로 분리 할 수 있습니다. amoebal 공 배양하여 분리하는 가장 일반적인 박테리아가 물 처리 공장에서 물 네트워크 13,14,24,27,28에서 복구 할 수있는 마이 코박 테 리움 속의 구성원입니다. 레지오넬라 및 α-테오 종은 물 처리 공장에서 고립 될 수있다 병원 물 네트워크 14,24,28-31에서. 여러 클라미디아 관련 종은 예 에스트 렐라 lausannensis (그림 2B-C 12,15,32,33은, 강물, 물 처리 시설에서 분리되었다.
34-36로 발견되었다. 이 바이러스는 모든 감염과 증식 아메바 내에서 자신의 바이러스 성 생활의 전형적인 일식 상을 제시 할 수 있습니다. 이 폐렴 37 고통 실험실 기술자의 실수로 감염에 연루 된 이후 Mimivirus의는 온화한 인간의 폐 병원체로 간주됩니다. 다른 거대한 바이러스의 잠재적 인 병원성은 아직 조사 할 필요가있다.
Amoebal 농축 종종 공 배양을 amoebal 위해 병렬로 사용 하였다. 수처리 설비 시스템과 하류 물 네트워크를 조사 할 때 따라서, 25 다른 amoebal 균주 12는 새로운 종 (14)에 대응하는 건 검출되었다. 아메바는 오존과 염소 이러한 원생 생물의 저항을 나타내는 정수 및 유통의 모든 단계에 존재했다. 세포 내 박테리아의 공동ULD 또한 세포 내 박테리아 14의 송신에 고유 아메바의 중요성을 나타내는 이들 아메바에서 검출 될 수있다. 또 다른 연구에서, 아메바는 병원 (24)의 물 분배 시스템으로부터 분리 될 수있다. 이 연구에 고립 된 균주의 대다수는 자연적으로 상대적으로 높은 온도에서 생존 할 수있는 Hartmannella의 vermiformis에 맞습니다. 이러한 레지오넬라 뉴모 필라 등 여러 가지 세균, 원주민 아메바 (24)에서 검출 될 수있다. 특정 아메바에서 발견 된 박테리아의 또 다른 예는 Parachlamydia의 acantamoebae입니다. 이 클라미디아 관련 세균은 amoebal 농축 (그림 2A) (9)에 의해 여성 자원 봉사자의 코 점막에서 분리 된 폐렴 (38)의 잠재적 인 에이전트했다. 이것은 다시 immunocompromis에 특히 병원성 수도 세균성 병원체의 유지 보수 및 분산액 아메바의 중요성을 보여준다(39) 환자 에드.
그림 1. amoebal 공 배양이 두 기술의 중요한 단계를 설명 amoebal 농축의 개요. (40에서 적응). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 1,000 X의 배율 감염 후 수정 Romanowsky 방법 24 시간, 함께 Parachlamydia acanthamoebae 홀의 구균 감염 아메바의 amoebal 공 배양 및 다른 염색 방법과 자신의 관찰에 의해 발견 된 박테리아의 예. A) 염색 박테리아 (파란색으로 물들에스트 렐라의 rrows). BC) 전자 현미경 소체 (화살표)의 전형적인 스타의 형태를 보여주는 lausannensis.
| 클래스 | 종 (种)의 예 | 참고 | |
| α-테오 | Odyssella thelassonicensis | 10 | |
| B-테오 | 부르크 홀데 리아 세파 시아의 | 36 | |
| G-테오 | 레지오넬라 drancourtii | 26 | |
| Chlamydiae | 에스트 렐라 lausannensis | (30) | |
| Flavobacteriae | Amoebophilus asiaticus | 37 | |
| Actinobacteria | 마이코 박테리아 종. | 38 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glucose monohydrate | Merck, Darmstadt, Germany | 108342 | |
| 0.22 μm pore size membrane | Merck Millipore, Darmstadt, Germany | SCVPU11RE | |
| proteose peptone | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 211693 | |
| yeast extract | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 212750 | |
| Cell culture flasks | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 353135 | |
| Kova slide | Hycor, Indianapolis, IN | 87144 | |
| cell culture microplates | Corning Inc, Corning, NY | 3524 | |
| Diff-Quik staining kit | Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany | 130832 | |
| Ziehl fuchsin | Fluka, St-Louis, MI | 21820 | |
| basic fuchsin | Sigma, St-Louis, MI | 857843 | |
| Phenol | Sigma, St-Louis, MI | P1037 | Corrosive and mutagenic |
| malachite green oxalate | Fluka, St-Louis, MI | 63160 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15710 | |
| Saponin | Sigma, St-Louis, MI | 84510 |
References
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