Abstract
昆虫は生存のための重要なイベント（ 例えば 、食品、仲間、脅威）と、それらの刺激を関連付ける経験を通して刺激に対するそれらの応答を変更します。昆虫が顕著な関連付けを学習し、これらのイベントにそれらを関係を通して、いくつかの行動のメカニズムがあります。これは、農業のために有益である昆虫を支援することを目的に向けてのプログラムでこの行動の可塑性を理解することが重要です。この理解はまた、疾患ベクターおよび害虫として作用する昆虫によって作成された生物医学的及び農業の問題に対する解決策を発見するために使用することができる。テングザルの拡張レスポンス（PER）コンディショニングプロトコルは、彼らがどのように認識しているか研究し、蜜や花粉資源の生存のためのコロニーのニーズを知らせる花の臭い、について学ぶために50年以上前にミツバチ（ ミツバチ ）のために開発された。 PER手順はいくつかの異なる生態学的に関連するメカを研究するための堅牢かつ簡単に採用フレームワークを提供行動可塑性のニズム。これは、いくつかの他の昆虫種および他の行動反射神経との使用に容易に適合可能である。これらのプロトコルは、容易に電気またはバイオイメージングを介してCNSに神経活動を監視するため、または標的神経調節経路を操作するためのさまざまな手段と組み合わせて使用することができる。これは、急速に環境ストレス、毒素または殺虫剤によって引き起こされる行動に対する亜致死効果を検出するための堅牢なアッセイである。
私たちは、PERプロトコルは2つの手順を使用して実装するのは簡単であるかを示す。一つは、学生のための、または実験的治療の効果の迅速なアッセイのための実験室での運動などに適しています。もう一つは、行動のコンディショニングに関する研究のために重要である変数のより完全なコントロールを提供します。私たちは、バイナリはい/いいえから吻拡張の待ち時間と期間のような、より連続的な変数の範囲で行動反応にはいくつかの対策がhypotheseテストするために使用する方法を示して秒。そして、私たちは、彼らが最初に手順を使用する場合、研究者は、一般的に遭遇するいくつかの落とし穴を説明します。
Introduction
多くの昆虫は、生態学的に関連した刺激について学び、彼らはその後、自分の環境で新しい予測関係に適応するために、これらの刺激に対する彼らの行動反応を変更します。いくつかの異なるメカニズムが、この行動の可塑性の根底にある（ 例えば 、非会合、連想/パブロフ、およびオペラント/ 1インストゥルメンタル）。可塑性のこれらのタイプは、刺激がや行動は、食品の発生、メイト、または危険などの重要なイベントに関連している方法が異なります。可塑性のこれらの形態を理解することは、神経系は新しい思い出2をコード化するためにどのように変化するかの基礎研究のために非常に重要である。それは重要な病気のベクター（ 例えば 、ツェツェバエや蚊）と作物生産（ミツバチ）や害虫のいずれかとして、農業的に重要であり、昆虫である昆虫の適応行動を理解するためにも重要である。
どんなアニムに行動の可塑性を研究らは、フィールド1は達成できない変数の数以上の実験制御のレベルが必要です。これは、より制御された条件下で使用することができる強固なコンディショニングプロトコールを開発する必要が、依然として自然条件下での挙動に関連する。ミツバチ（ ミツバチ ） は 、行動の可塑性3,4の制御された分析を行うためのプロトコルを開発する方法のための優れたモデルです。ミツバチでのテングザルの拡張応答（PER）は、ミツバチが糖液と触角刺激に応答してその口吻を拡張している自然な行動の反射である。ミツバチが花に蜜を見つけたときに、通常の採餌行動時には、PERが発生します。幸いなことに、ミツバチは、容易に実験室でのこの単純かつ容易に定量挙動を示すことになる。これは、制御された環境で、この生態学的に関連する挙動5に影響を与えるメカニズムを研究することを可能にする。 CA PERnはまた可塑6の根底に行動および神経機構を明らかにするように設計された異なる処理条件の下で、刺激の知覚、学習および記憶を調査するためにコンディショニングプロトコル内で使用される。
桑原7による最初の研究以来、PERコンディショナーは、広く非会合、連想とミツバチ8における行動の可塑性の根底にあるオペラントメカニズムを解明するために用いられてきた。これらのメカニズムは、自由に飛んでいるミツバチ9の研究で明らかになったものと同一である。自由に飛んでいるミツバチの研究は違って、PER調整プロトコルは、電気生理学10,11または脳の生細胞蛍光イメージング12-14と結合することができる。また、PERプロトコルはそのようなneurなどのネットワークの特定のコンポーネントの役割についての仮説をテストするための薬理学的または分子遺伝学的治療を介した神経経路の実験的操作を可能にomodulators 15,16。 PERプロトコルも、環境条件だけでなく、健康への毒素やミツバチ17の採餌効率の亜致死影響を評価するための重要な方法を提供してきました。
この手順は、並列の2つの臭気送達方法を記載する。方法1は、臭気およびショ糖の報酬を提示するための安価で技術的に簡単な方法を提供し、臭いや無条件刺激（ショ糖）配送のバージョンです。この方法は、基本的な訓練のために良好であり、自動化ができない場合。それは、教室や授業研究室にこの技術を導入するための優れた方法です。より困難なタスクと匂いの知覚、学習または記憶の結合された生理学的評価を伴う実験のためのコンディショニング中には、正確かつ精密な刺激の開始、持続送達のタイミングを調節することが非常に重要である。最も信頼性の高い刺激の配達は、臭気の配信aを自動化する手段を使用するND報酬配送の正確な方法。方法2は、自動臭気の配信と、より正確なショ糖の配信を採用しています。それは、技術的にはより洗練されたで、方法1よりも初期セットアップのためにもっと必要としますが、それを大幅に調整するために用いた刺激のタイミングと量の一貫性を高め、可能な限り使用されるべきである。
Protocol
1臭気（条件刺激）カートリッジのセットアップ
- 実験の開始時に、セットアップ空調試験のために必要なすべての異なる悪臭のために複数の臭気のカートリッジ。
- 臭気の希釈及び臭気カートリッジを製造するためのヒュームフードを使用してください。匂いがラボ全体に急速に普及し、潜在的に調節する前に匂いにミツバチが公開されますので、そのヒュームフードの外側臭いの絶対にオープンボトル、。また、臭気カートリッジの設定中手袋を着用し、それらの処理中に匂いにミツバチの公開を回避するために徹底的にその後洗浄してください。
- 各臭気カートリッジが明確にそれが最初に使用された臭気の色分けされた標識で標識されていることを確認します。カートリッジの残留臭気があるかもしれないので、複数の臭気のため臭気カートリッジ（シリンジバレルまたはプランジャー）を使用しないでください。
- 臭いや臭気の混合物を準備する
- Dにヘキサンまたは鉱油のいずれかで臭いを希釈esired濃度。
注：臭気の濃度を変更するか、ミツバチが臭いを感知し、エアコンの関連付けを学習する方法の追加の態様の調査を可能にすることができる2つ以上の匂い物質の混合物を提示する。臭気混合物は、50:50二成分混合物として、あるいは自然の嗅覚刺激を模倣するいくつかの臭いのような複雑なのと同じくらい簡単です。臭気の濃度を低減することは、タスクの難易度を増加させる。- 臭気は、カートリッジの再利用（ 図2）との枯渇となります。枯渇の問題を回避するために十分なカートリッジを新しいカートリッジごとに10〜12の使用を切り替えることができるようになります。
- Dにヘキサンまたは鉱油のいずれかで臭いを希釈esired濃度。
- 臭気カートリッジの準備
- 方法1
- この方法では、臭気カートリッジのプランジャーのゴム端に固定濾紙の直径15mmの円との20mlプラスチック注射器を使用。
- シリンジからプランジャーを取り外し、filteの一部を添付する押しピンを使用プランジャーの末尾にRをセットします。
- ろ紙上に臭気を10μlを配置するためにマイクロピペットを使用し、シリンジバレルにプランジャーを挿入します。シリンジバレル15ミリリットルマークにプランジャーを押してください。
- 方法2
- この方法では、臭気カートリッジ用注射器の筒のワイド端での内部のろ紙のストリップ、ゴムまたはシリコーンリストリクタで1ccのガラスやプラスチックツベルクリン注射器（または同様のボリュームや形状の変更されたピペット）を使用しています。
- 1ccのツベルクリンシリンジバレルからプランジャーを外します。シリンジバレルは、臭気カートリッジの本体になります。
- シリンジプランジャから黒ゴムチップを取り外し、ラバー先端の閉鎖端をカット。
注：このゴムリングが途中でカートリッジからと控えめミツバチの上に臭気を描画しますアリーナでの気流、から吸引を減らすためにリストリクターとして機能します。代わりに、シリコンチューブ（4.8ミリメートルOUTE5mmの切片に切断r個の直径）は絞りとして働いています。
- 70％エタノールでシリンジバレルの内側とゴム/シリコンリストリクタをすすぐ（以前の使用から残留臭気の多くを除去するため）、それらに空気乾燥してみましょう。
- 紙は、開口を越えて1〜2センチメートルを拡張するように、バレルの広い開口部にろ紙の0.2×4cmのストリップを配置します。
- 臭気がシリンジバレルの終わりに触れるせることなく、ろ紙の上に臭気の3-10μLを配置するためにマイクロピペットを使用してください。ピペットチップは、同じ臭いのために再利用するが、次の臭気を設定するために、新鮮なヒントを使用してくださいすることができる。
- ろ紙は、チューブに迅速にスライドするように上向きにシリンジバレルの広い開口部を回します。シリンジバレルの広い開口部にリストリクターを挿入します。
- 各臭気カートリッジが明確にそれが最初に使用される臭気の色分けされた標識で標識されていることを確認します。臭気カートリッジ（シリンジバレルまたはRESTRは絶対に使用しないでくださいictor）複数の臭気のために、その上に残留臭気があるかもしれないからである。
- ボールアップリントフリーのティッシュの端を、70％エタノールでそれを浸し、そして徹底的にカートリッジの外側の残留臭気を除去するために、カートリッジの外表面を拭くためにそれを使用します。
- 方法1
2の収集、保全処分、および蜂摂食
- ビー保全処分ハーネスの準備
- （すべては内径約0.9センチメートルあり1〜2ミリメートルの壁の厚さを有する）プラスチックソーダストロー、硬質プラスチックチューブ、または機械加工された金属管の外にミツバチのためのシンプルな拘束ハーネスを作成します。手術を伴う処置のための丈夫ハーネスを使用してください。
- チューブの3cmの部分をカットします。その後、部分的にハーネスを固定しながら、それが簡単な場所に蜂を保持するために作るために離れてハーネスの上部1cmの約半分をトリミング。
- ダクトテープの0.2×6cmのストリップをカットし、ハチのハーネスの一方の側に一端を取り付け、LEA自由もう一方の端をヴィング。
- 働きバチの収集
- 彼らは植民地から逸脱する前に、またはそれらが採餌から戻るように一時停止するように植民地への入り口から労働者を収集します。
注：働きバチが通過クロールするための入り口がダウン帰国労働者を遅くし、彼らは植民地に入る前に、それが簡単にそれらをキャプチャすることができにわたり、十分な大き穴に、ワイヤメッシュの部分を配置する。 - それに取り込ま飛ぶまで蜂にわたってシンチレーションバイアルを置きます。蜂は、バイアルから上っ飛ばないように、その開口を水平または蓋が固定されている間下にして、バイアルを持ちます。各バイアルで唯一の蜂を置きます。蓋は十分なガス交換を可能にすることに穴があることを確認します。
- 彼らはバイアル中で費やす時間を最小限に抑えるために迅速にミツバチを収集します。日陰の小さなボックスにそれらの中にミツバチをバイアルに保管してください。
- ラボのバイアルおよびミツバチの箱を移し、氷水SLにバイアルを配置ミツバチが移動を停止するまで、アーリ。蜂が不動になると、寒さに露出オーバーを避けるために、すぐに氷上からバイアルを取り外し、拘束ハーネスに蜂を置く。
注：私たちは、ミツバチが寒さに過剰にさらされる結果として、不動になったときに監視することが困難であるため、冷蔵庫や冷凍庫に蜂を置くことはお勧めしません。 10以上のミツバチを活用すると、一度に氷水スラリーにわずか数蜂を転送します。
- 彼らは植民地から逸脱する前に、またはそれらが採餌から戻るように一時停止するように植民地への入り口から労働者を収集します。
- ミツバチを拘束
- ちょうどチューブの上端より上切取チューブの部分と、その頭に面する背側胸部にハーネスで蜂を置きます。その口器がチューブの端からはみ出すように静かにチューブの近くに蜂を押してください。頭と蜂の背側胸部の間にダクトテープのストリップをスライドさせ、しっかりとハーネスの側に自由端を接続します。
- ハーネス上のテープが滑らかでピンと張っていることを確認してください。何NotIであってはならない蜂ハーネスの前面とテープ、およびテープの間ceableギャップは、ハーネスの上に平らにする必要があります。ギャップがある場合には蜂が適切に口吻を拡張するか、それは逃げることができない場合があります。また、ハチの前脚はハーネスの前面とダクトテープとの間で突出していないことを確認してください。
- ちょうどチューブの上端より上切取チューブの部分と、その頭に面する背側胸部にハーネスで蜂を置きます。その口器がチューブの端からはみ出すように静かにチューブの近くに蜂を押してください。頭と蜂の背側胸部の間にダクトテープのストリップをスライドさせ、しっかりとハーネスの側に自由端を接続します。
- コンディショニング間隔にミツバチや摂食摂食
- ハーネス以下の約30分 - ミツバチが、初期設定から回復した後に - ミツバチ（水中）3-4μlの0.5 Mのショ糖を養う。この量は、3〜4時間の摂食·ツー·コンディショニング間隔で十分です。
- 一般的には、ミツバチがまだ間隔を生き残る条件付けの関連付けを学習する動機とされる空調の開始時に十分に空腹であることを確認するために供給および空調間の待機時間の約各時間の1μlの0.5 Mのショ糖を養う。研究室では、暖かい温度でまたはu場合に保っスクロースの異なる濃度を歌い、供給量やそれに応じて時間間隔を調整します。
注：24時間のコンディショニング間隔への給電により、空調が開始される前に、すべてのハチが0.5または1のスクロース、少なくとも24時間で満腹に供給されることを確認してください。これらは、コンディショニングプロトコルでよく反応するのに十分な動機づけされる前に、室温では、ミツバチは約24時間を必要とします。
注：学習性能18を減少させることができるコンディショニングの間に使用されるショ糖の濃度の影響を受けにくいなるのハチを防ぐために、コンディショニング中に報酬として使用される濃度よりもミツバチを供給するためのショ糖溶液のより低い濃度を使用してください。 - 十分に離れて訓練エリアからエリアに蜂を養う。コンディショニング前のコンディショニングコンテキストで無条件刺激（ショ糖）への暴露は、匂いの後にコンディショニングに影響を与える可能性があります。
- 一般的には、ミツバチがまだ間隔を生き残る条件付けの関連付けを学習する動機とされる空調の開始時に十分に空腹であることを確認するために供給および空調間の待機時間の約各時間の1μlの0.5 Mのショ糖を養う。研究室では、暖かい温度でまたはu場合に保っスクロースの異なる濃度を歌い、供給量やそれに応じて時間間隔を調整します。
- 摂食とCの間の間隔の間onditioning不必要な妨害を回避するために、実験室の静かなエリアにカウンター上の蜂を置く。研究室は、低周囲湿度がある場合は、時間間隔の間に湿ったペーパータオルでプラスチック容器内の蜂を置く。彼らは長期の時間帯の低湿度にさらされている場合は、ミツバチが死ぬかもしれないので、これは、乾燥を防ぎます。
注：実験内でハーネスと給電プロトコルを変更しないでください！セットアップとミツバチを供給し、ミツバチがすべて全く同じように扱われているように、各実験のためのコンディショニングを開始するとの唯一つの特定の時間間隔を使用してください。
- ハーネス以下の約30分 - ミツバチが、初期設定から回復した後に - ミツバチ（水中）3-4μlの0.5 Mのショ糖を養う。この量は、3〜4時間の摂食·ツー·コンディショニング間隔で十分です。
3コンディショニング
- スクロース感度のテスト
- コンディショニングを開始する前に数分は、0.5Mのショ糖溶液（供給の間使用されたのと同じ濃度）の小滴を自分のアンテナに触れて、養うためにミツバチのモチベーションをテストします。彼らは、このテスト中に食べないようにしてください。彼らはエクステすることによって応答する場合その口吻nding、彼らはおそらく習得するのに十分に意欲的であり、プロトコルのために使用することができます。
- 実験計画
注：このプロトコルは、ミツバチ '学習と記憶能力の多くの側面を調査するために、学習のプロトコルの広大な配列に適合するように変更することができます。試行間の間隔、与えられた時間、刺激間隔、種類と濃度や臭いの数で訓練ミツバチの数が、無条件刺激の種類と濃度、数や配列調整することができ、多くのパラメータの中には、試験の（ 図1;表1）19-21。各空調トライアルの正確なプロトコルを設計するとき、それは、個人間で一貫試行間の間隔を保つことが非常に重要です。ミツバチのパフォーマンスが低下する傾向が長すぎるか、一貫性のない、短すぎる間トライアル間隔。このトピックの完全な治療のための議論を参照してください。
注：ビーsはより迅速に、彼らは暖かい環境にいる場合、タスクを学習します。 （可能な場合は29〜30°C）をそのため、一貫性のある、温かいトレーニング環境の温度を保つ。 - 臭気の配信（条件刺激）
- 方法1
- 臭気デリバリーシステムのセットアップ
- それが安定しており、小端がハチの触角に直接面しているので、臭気処理したろ紙を搭載したプラスチック製の20ミリリットルの注射器を取り付けます。 15ミリリットルのマークでプランジャーを設定し、プランジャーが簡単にアクセスできるように注射器を置きます。
- 匂い刺激を提示
- そのアンテナは、匂いのカートリッジに向かって直接指摘して各試験の開始時に、空調の分野でペグにハーネスに蜂を置く。蜂は匂い刺激時の視覚的な環境の急激な変化による混乱を減らすために匂い刺激を開始する前に、15〜25秒間、アリーナに順応してみましょう。
- ハチは、それがコンディショニングの分野に配置された直後の臭いカートリッジへの対応を開始する場合は、カートリッジの先端の匂いがあるかもしれません。 70％エタノールに浸した糸くずの出ないティッシュでカートリッジを洗浄することによって汚染する臭いを除去します。それでも問題が解決しない場合は、カートリッジを交換します。
- プランジャーが完全に4秒以内に押されたように、安定した速度で、シリンジのプランジャーを押します。無条件刺激を提示する前に、匂いに蜂の応答を監視します。
- 各試行の後、ミツバチが別の15〜25秒間、空調分野で休むことができます。トライアル以下の早すぎる蜂を移動すると、大幅に各空調試験の有効性を減らすことができます。
- そのアンテナは、匂いのカートリッジに向かって直接指摘して各試験の開始時に、空調の分野でペグにハーネスに蜂を置く。蜂は匂い刺激時の視覚的な環境の急激な変化による混乱を減らすために匂い刺激を開始する前に、15〜25秒間、アリーナに順応してみましょう。
- 臭気デリバリーシステムのセットアップ
- 方法2
- 臭気デリバリーシステムのセットアップ
- エアフローソースおよび流量
- 臭気の配信のためのソース気流として研究室は、それが装備されている場合、水槽のエアレーターポンプや実験台の加圧空気の供給を使用しています。
注：典型的な水槽のエアレーターポンプは400ミリリットル/分（7ミリリットル/秒）に近い気流速度を持つことになります。 4秒臭刺激にわたり、空気の28ミリリットルは、1ミリリットルカートリッジを通して流れます。 - 空気供給のための流量を調節するために空気供給装置の配管に沿って流量計を使用する。流速400 ml /分になるまで流量計を調整する。独立した流量計で臭気カートリッジの開口部に流量を確認してください。
- プラスチックチューブやバルブのシステムを介して臭気カートリッジへの空気の流れを接続します。
注：以下で説明するタイミング·デバイスは、裁判での適切な時期にバルブを開きます。プラスチック製のコネクタは、カートリッジのシリンジバレルにルアーの種類の添付ファイルを介して臭気カートリッジへの空気の流れシステムを取り付けます。 - 関係なく、気流源の、MAに定期的に流量をチェックするケ確認回線はそのままで、流量が所望の速度に維持される。
- 臭気の配信のためのソース気流として研究室は、それが装備されている場合、水槽のエアレーターポンプや実験台の加圧空気の供給を使用しています。
- エアフローソースおよび流量
- 自動化された臭気配信
- 臭気の配信を自動化するために、プログラマブルロジックコントローラ（PLC）を使用する。
注：PLCは、（ボタンを押すことによって開始された）プログラムを開始した後、臭気送達空気流に6秒のバルブを開く4秒間開放弁を保持し、可聴給電信号を音、小型スピーカを介してするようにプログラムされているショ糖を配信する実験者に信号を送る臭気刺激開始後に3秒。 - 各試験中に匂い刺激のタイミングを示すために、小型LEDを使用してください。ハチ「光受容体が離れて長いからずれているので、赤色LED、利用可能な場合は[赤]波長と、彼らはそれをうまく見ることができないので、短い[UV]波長側。光が不注意条件刺激にならないように、彼らの視野の外に、背後にあると蜂の下のLEDに置きます。
注：LIGHTまたPLCが正しく動作していることを確認に役立ち、テストの試験中にハチの回答のビデオ記録を分析するのに有用である。
- 臭気の配信を自動化するために、プログラマブルロジックコントローラ（PLC）を使用する。
- エキゾーストシステム
- 蜂を過ぎて空気を引き出し、臭いの各プレゼンテーションのための離散時間枠を維持するために、コンディショニングアリーナから臭気を含んだ空気を排出するために助けるために蜂の背後にある排気システムをセットアップします。
注：実験室での真空システムがある場合は、真空ポートを変更し、コンディショニングアリーナを避難するのに必要な空気の流れを提供するために、乾燥機チューブの配管を接続します。真空システムがない場合、ヒュームフードまたは窓を通して導か乾燥機チューブに沿って収容された小型の電動ファンで十分である。
- 蜂を過ぎて空気を引き出し、臭いの各プレゼンテーションのための離散時間枠を維持するために、コンディショニングアリーナから臭気を含んだ空気を排出するために助けるために蜂の背後にある排気システムをセットアップします。
- 毎日の開始時に、臭気配信システムおよび排気システムの電気と空気の接続を確認してください。臭気デリバリーシステムのスタートボタンを押して、押し間の時間を追跡するボタンと開放弁（静かなクリックとLEDライトが点灯します）、キューが無条件刺激を提示する際に（可聴音）が聞こえたとき。臭気カートリッジに添付されますコネクターの前で湿った指先を置くことによって空気の配信を確認してください。バルブが開いている場合にのみ、強力な空気の流れがあるはずです。空気の流れを適切に調節アリーナから空気を排出するのに十分な強さを確認するために、排気系の開口部に糸くずの出ないティッシュを上に保持することによって排気システムをチェックしてください。
- 臭気デリバリーシステムのセットアップ
- 臭気カートリッジの取り付け
- 排気システムの正面にハチや臭いカートリッジを配置するためにスタンドカウンターや小さなプレキシグラスのいずれか、いくつかの粘土を置きます。粘土、ガラス臭気注射器を配置し、ワイド端での開口部が蜂の頭で指摘されているので、それを調整してください。注射器の先端は蜂中1〜cmとすべきである。この範囲内の距離を選び、一定であること。
- 確実にシリンジの狭いすりガラス端の上にエアチューブとバルブシステムにカートリッジを連結金具を配置します。
- 匂い刺激を提示
- 各試験の開始時に、そのアンテナとコンディショニングの分野でペグに活かさ蜂を置く臭カートリッジに向かって直接指摘した。それは、その新しい環境に慣れることができるように匂い刺激を開始する前に、15〜25秒間、舞台でミツバチの残りをしましょう。
注：蜂がすぐに空調分野で置かれた後の臭気カートリッジへの対応を開始する場合は、カートリッジの先端の匂いがあるかもしれません。 70％エタノールに浸した糸くずの出ないティッシュでカートリッジを洗浄することによって汚染する臭いを除去します。それでも問題が解決しない場合は、カートリッジを交換します。 - 臭気配信用タイミング機構を開始するためにスタートボタンを押します。刺激後の臭気に蜂の応答を監視する発症と無条件刺激の提示の前に。
- 各試行の後、ミツバチは、初期記憶形成を可能にするために、別の15〜25秒間、空調分野で休むことができます。トライアル以下の早すぎる蜂を移動すると、大幅に各空調試験の有効性を減らすことができます。
- 各試験の開始時に、そのアンテナとコンディショニングの分野でペグに活かさ蜂を置く臭カートリッジに向かって直接指摘した。それは、その新しい環境に慣れることができるように匂い刺激を開始する前に、15〜25秒間、舞台でミツバチの残りをしましょう。
- 方法1
- 配信スクロース（無条件刺激）
- 方法1
- この方法では、ショ糖を配信するためにつまようじを使用しています。
注：それは木製のつまようじが条件刺激にミツバチの回答に影響を与える臭気を持つことができるので、プラスチック爪楊枝を使用するのが最適です。 - ショ糖溶液中に爪楊枝の先端を浸し、そして、それは無条件刺激を提示する時間があるときに、蜂の前で爪楊枝を保持し、蜂が約1秒間爪楊枝からショ糖をなめることができます。
- SUの蓄積を避けるために、定期的につまようじを交換してくださいcrose。
- この方法では、ショ糖を配信するためにつまようじを使用しています。
- 方法2
- スクロース配信システム
注：無条件刺激を提供するためのより正確な方法が正確に少量の蔗糖報酬の（マイクロリットルの割）を提供することができますマイクロシリンジ、の使用によるものである。- 可能な限りバックシリンジのマイクロメータを巻く。ショ糖溶液とマイクロシリンジバレルをロードします。必ずガラス部分に気泡がないことを確認し、注射器を組み立てる。シリンジバレルの狭い方の端の上に配置する前にショ糖溶液を用いて、針のハブを埋める。針内の流体がショ糖ではなく、実際に針を洗浄からの水であることを確認するために、実験を開始する前に、前進1-2μLをマイクロメーターを巻く。
- スクロース配信システム
- スクロースプレゼンテーション
- 匂いが提示されている間約2cm蜂から針の先端を持ってください。防止するために、トレーニングアリーナのエッジを使用してください運動としてシリンジを振っして蜂をそらすことができます。それはまた、途中でスクロース臭いからミツバチの注意をシフトしているため、給電信号を見越して針が近づきすぎないようにしてください。
- 蜂がその口吻を拡張するまで、とすぐに紙信号が聞こえるように、軽くアンテナに触れ、その後蜂を養う。これはアンテナだけに非常に軽いタッチまたは2を要求する必要があります。
- 0.2と0.8μlの間で報酬額を使用してください。蜂は簡単に無条件刺激（〜1-2秒）に割り当てられた時間内で全体の液滴を消費する必要があります。蜂が数秒間点灯フィードが、完全に消費できない大滴から給紙「 アドリブ 」は使用しないでください。
- 報酬のその後の発表に蜂の応答を低減するアンテナ、上に蓄積ショ糖を監視します。これが発生した場合、給電手順を変更します。
- 臭気の正確なペアリングを確実にするために、キューおよびショ糖の報酬、トーン後できるだけ早く蜂にショ糖溶液の液滴を提示してください。
注：CS（臭い）および米国（ショ糖）の発症との間のタイミングが非常に重要です。理想的には、臭気のプレゼンテーションおよびショ糖プレゼンテーションを簡単にオーバーラップする必要があります。数秒以上は、CSの終わりと米国の配達の間に経過した場合、コンディショニング性能が低下します。
- 方法1
4。テスト
- 以下の条件付けミツバチが学んどれだけ評価し、および/または空調関連を覚えて補強されていないテストトライアルを使用しています。
注：コンディショニング試験における性能とテストトライアルとテスト臭気の数の目的の説明 'ハチに加えて、強化されていないテストの試行への応答'ミツバチを分析することの重要性の詳細な説明については、説明を参照してください。 - 圧密時間
- 以下エアコン、即時テストトライアルを管理したり、ミツバチが連結期間を通じて休息することができますどちらか。
注：統合期間の長さは、コンディショニングおよび試験間の時間間隔は、実験の目的に依存するであろう。目的は、学習差や短期記憶を調査する場合は、テスト試験に関するミツバチの性能は、直後または数時間コンディショニングした後に評価することができる。実験は、長期記憶の調査が含まれる場合、試験試験はコンディショニングの終了後少なくとも24時間を与えられるべきである。 - 試験試験はエアコン、以下の24以上の時間であれば、テストトライアルの前に12〜24時間まで、その後、少なくとも一日一回、0.5Mのスクロース、以下の条件付けで満腹にミツバチを供給して。
- 自分のアンテナに触れると、彼らはもはや対応して彼らの口吻を拡張しなくなるまで、それぞれいくつかの異なる回を養う、ミツバチが満腹に達していることを確認してくださいするにショ糖とメール。彼らは、飽食に到達するためにも40μLを消費することがあります。
- 連結期間中にそれらの乾燥剤や死を防ぐために、加湿容器内で蜂に保管してください。
- 以下エアコン、即時テストトライアルを管理したり、ミツバチが連結期間を通じて休息することができますどちらか。
- テストトライアル
- テスト用にのみ新たに用意した臭気カートリッジを使用してください。
注：取得のために使用済みカートリッジを差動枯渇する可能性があるので、テスト刺激は、したがって、大幅に結果の一貫性と堅牢性に影響を与える可能性があり、臨床試験、匂い、そして個人の蜂で一貫してとしません。 - 実験の条件調整段階で使用されるテスト中に、同じ試行間の間隔およびその他のパラメータを維持する。
- 報酬の存在は、潜在的にコンディショニングプロトコルまたは治療のより微妙な効果をマスキング、条件刺激にハチ '応答を変更するので、テスト·試験中に無条件刺激を提示しないでください。
- すべてのレコードの動画O試験トライアルfは後で臭い（複数可）に複数の側面のハチの応答を測定することができるようにする。
- テスト用にのみ新たに用意した臭気カートリッジを使用してください。
5。ミツバチの回答を記録する
- PERのバイナリ（存在/不在）スコアリング
- コンディショニング試験中および試験試験中にPERのバイナリスコアリングシステムを使用してください。正または負のいずれかのような反応をスコア。これは、処置群あたり20-40ミツバチのサンプルサイズでの分析の多くの種類のために十分である。応答の正確なトポロジは22複雑になることがあります。それは肯定的な反応のための基準を参照し、得点して簡単に確立することが重要である。
- 蜂が開か下顎の先端を接続することによって作ら線を越え、その口吻を拡張する際にプラス（+）のような蜂の反応をスコア。蜂は臭気発症後、オフセット臭気前に口吻を拡張する場合にのみ陽性反応を獲得。
- 負として蜂の応答スコア（ - ）はeが存在しない場合に吻は臭気物質のオフセット後に延長された場合、または試験中吻のあるXTension。
- 部分的な応答を獲得しようとしていないようにしてください。ミツバチの行動に細かく区別を行うには、以下に概説する映像解析技術を使用しています。
- コンディショニング試験中および試験試験中にPERのバイナリスコアリングシステムを使用してください。正または負のいずれかのような反応をスコア。これは、処置群あたり20-40ミツバチのサンプルサイズでの分析の多くの種類のために十分である。応答の正確なトポロジは22複雑になることがあります。それは肯定的な反応のための基準を参照し、得点して簡単に確立することが重要である。
- 追加のPER測定のビデオ分析（ 動画1）
- 匂いにハチさんの映像を解析することにより、行動試験からの追加情報を収集します。
注：これらの測定はまた、治療群間のPERの存在/不在スコアに差がない場合は特に、匂いに対するハチの回答の検査のために、より高い時間分解能を提供することができる。 - 動画の記録
- 常にビデオ録画のための強化されていないテストまたは絶滅試験を使用しています。報酬の存在は、口吻延長の期間を変更し、匂いにハチ '応答が変更されます。
- トレーニングアリーナ上記三脚にビデオカメラを設定し、ハチの頭の正面にカメラの焦点を合わせるため、アンテナと口吻は鋭く焦点が合う。
- 臭気発症および分析中にオフセットを識別するためにそれを使用するために映像に見える蜂の後ろの領域に、臭気刺激提示を示す小さなLED光を置き。
- 臭気発症前に20秒の記録を開始し、蜂を乱す前にオフセット臭した後、少なくとも20秒間記録を継続する。
- ビデオ分析
- ビデオ内の特定のフレーム間の時間間隔を測定する機能を備えた、などのiMovieやのFinal Cut Proなどのビデオ編集ソフトウェアにビデオをアップロードします。
- 匂い刺激（ 例えば 、10または20秒）の開始時に始めて、離散時間の間の臭いにハチ」の応答を分析します。
- PERを評価するための次のような共通の測定値を使用します。
- 測定吻は（前述の）下顎から下顎骨行を超える合計時間です口吻延長の期間。
注：蜂は10〜20秒の時間ウィンドウ中にその口吻を複数回拡張し、撤回することができる。個別口吻拡張を測定し、合計時間を計算します。各個別管部の延長の数および継続時間を分析することも有益な情報を提供することができる。 - LEDライトが点灯すると、臭気の発症との間の時間である口吻延長、および第1吻延長のレイテンシを測定します。
- 付臭剤の発症、最初の拡張、またはその他のタイミング·パラメータと比較して舌の拡張を数え、時間。
- また、特徴的な匂い志向の変化を示す触角の動き23を 、追跡します。
注： ムービー1では、触角の動きは触角の動きの変化を説明するために、ビデオのトラッキングソフトウェアで追跡されてきた私匂い刺激に対するnの応答。
- 測定吻は（前述の）下顎から下顎骨行を超える合計時間です口吻延長の期間。
- 匂いにハチさんの映像を解析することにより、行動試験からの追加情報を収集します。
Representative Results
私たちは、上記のPERプロトコルの使用の2つの例を提示する。最初の例では、ミツバチがCS 5,24,25として使用臭気分子類似性の関数として異なる匂いを知覚する方法勉強する方法2を利用した。第二には、方法1と研究室に空調実験ごとに使用し始めたときに注意しなければならない注意事項のいくつかの使用例である。
あるよう、本研究は、13または電気生理学的には26を解析し、生体イメージングと一緒にミツバチと蛾の嗅覚「知覚空間」を記述するために使用されてきた。ミツバチは、（N = 20）12フォワードペアリングコンディショナートライアル（ 図3A）を介して、ショ糖の補強と、付臭剤デカナールを関連付けるために調整した。ミツバチの約10％が正常である最初の試験、に「自然に」答えた。 responde割合その後ミツバチの100％が五裁判と後続のすべての裁判に応答するまで、次のいくつかの臨床試験の経過とともに増加dは。いくつかの研究は、応答におけるこの増加は、いくつかの重要な制御手順3に転送するペアリング状態（ 図1）相対的に特異的であることを示している。アクイジション·フェーズの後、各ミツバチは匂いCSにし、体系的に分子構造中のCSは異なっいくつかの他の匂い物質への暴露を関与補強されていないテスト一連の試験（ 図3B）、を行った。ミツバチは、CSに最も強く反応した。他の匂い物質に対する応答は、少なくともCSのような匂い物質に対する最低の応答と、構造の体系的な変化の関数として減少した。
図4では、方法1を使用して、ミツバチを調節する方法を学生が最初に、学習したもので、最近のワークショップの結果は、例示されている。学生モミ tはショ糖の補強（ 図4A）との上位ペアリングmethycyclohexanone（MCH）またはオクタノール（OCT）によるミツバチを条件付け。パーセント応答は最初の裁判に低かったとミツバチが臭気蔗糖関連を学んだことを示して、その後の試験に増加した。ミツバチは、学生のさまざまなグループ間の馴化関連を学んだ程度の差があった。われわれの経験では、違いがこれらの種類は、メソッド（方法1）での不正確な要素に、あるいは実験者のトレーニングレベルに、CSとした臭いが原因である可能性があります。第3のケースでは、パフォーマンスはすぐに実験者」の増加の経験を持つ、より一貫性になる。コンディショニング後、各ミツバチは、各臭気で二回試験した。予想通りに10月またはMCHのフォワードペアリングで調整していたミツバチの群では、応答は、エアコン臭（ 図4B）に最も強かった。
ENT "> 10月にペアリングを前方に経験したミツバチの第2のグループは、臭気10月後方ショ糖とペアにされた別のグループと並行して調整した。後方ペアリングが実証する制御手順のいくつかの種類の一つである反応の増加そのような感作からの非特異的な覚醒として、別のプロセスに起因するペアリングを転送しないように固有のものです。後方のペアリングのために、ショ糖、米国および臭気CSが図1に示したものと逆の順序で提示されている。後方ペアリングからの取得データであるCRは、ショ糖のプレゼンテーション後の臭気、CSのプレゼンテーションを与え採点することができないため、図示していない。連想コンディショニングのために予測されるように、10月に応答レベルは、下位グループ（ 図4C）に転送ペア、グループの相対で高かった。7fig1highres.jpg "幅=" 500 "/>
図フォワードペアリングを使用して調整するための実験計画の1ダイアグラム。この図で使用される用語の定義については、表1を参照してください。（A）CS（臭い）が先行し、米国（ショ糖/水溶液）と重なっている。示さCSと米国との関係は、コンディショニングミツバチと蛾に最適です。しかし、最適なISIは、コンディショニングプロトコルおよび動物種1に依存することができる。（B）の内訳とCS、CR、米国、およびURの相対的なタイミング。米国の発表の前または補強されていない「試験」試験中にいずれかが発生しCRが実験プロトコルの従属尺度である。
図2のカートリッジの再利用による臭気枯渇。これらのデータについては、臭気のカートリッジであったセットアップヘキサノールを使用してテキストを参照してください。ヘキサノールは、一般PER研究におけるCSとして使用される。しかし、枯渇の実際のレートは、臭気や溶剤に依存することになる。カートリッジは、4秒（40の用途に等しくなる標準実験で5ミツバチ/トライアルと仮定して）8回の試行毎分に一度使用された。 PER実験の比較的標準的であった、示された溶媒中の希釈液を、2.0Mの（A）と0.2 M（B）であった。（A、B）は臭いは、第1および固相への吸着による第八裁判後にサンプリングしたその後ガスクロマトグラフ上に脱着しマイクロ抽出（SPME）ファイバー。ピーク下相対面積は両溶媒のための第1〜第8トライアル相対した後、両方の濃度について高かった（ウィルコクソンのマッチドペア符号付き順位検定p <0.05 [*]以上）、あまり臭いがカートリッジから配信されたことを示しているカートリッジは、多数回使用された後（C、D）は 、同じデータがちょうど第八のtrを示す拡張され、y軸にIAL。これは、枯渇が鉱油ヘキサンに対しては少し大きいだけ低い濃度であったことを示している。
CSとコンディショニングの方法2として、デカナール使用して図3の取得およびテスト。 （A）トライアル·バイ·トライアル12フォワードペアリング試験（ 図1）上の寛解（CR）。データは5ミツバチずつの4グループにエアコンはn = 20、ミツバチからのものである。 ISIは3秒であり、ITIは6分であった。（B）炭素鎖の長さ及び/又はカルボニル炭素の位置によってデカナール異なる臭気を用いた非強化の試験。匂いは、4つのグループ間でランダム化された直列に発表されたとCRの絶滅を避けるために、デカナール（各二から三の試行）で強化された臨床試験が点在した。
ワークショップからの図4のデータは、その間の学生は （それぞれN = 23、15 Gpsの1及び2）、オクタノールに条件付けミツバチの三つのグループから、メソッドごと1（A）取得データを用いたミツバチを調整するように訓練された卒業生およびメチル（n = 10）に（B）の両方の匂いと補強されていない試験中のCR。 4グループ間でランダム系列で提示トライアル。ミツバチの二つのグループ内の両方の匂いと、（C）非強化のテスト、1フォワードがペア（GP 1、N = 23）と一つは、下位ペアた（n = 25）。
| ターム（略称） | 定義 | 関連する例 |
| 条件刺激（CS） | A最初はほとんど、あるいはまったく反応を誘発すると米国信号刺激 | 臭気 |
| 条件反応（CR）A | 米国との関連の後にCSへの応答 | テングザルEXTENSION |
| 無条件刺激（US） | 応答を誘発する生物学的に有意な刺激 | ショ糖/水溶液 |
| 無条件反応（UR）A | 米国への応答 | テングザルEXTENSION |
| 刺激間間隔（ISI） | CSの発症と米国の発症までの時間 | ショ糖間隔に臭気 |
| 試行間間隔（ITI） | 単一の動物のための連続したCS-USのペア間の時間 | 臭気の臭気（トライアルn）は（トライアルのn + 1）間隔 |
表1イムportant用語。団体、他のタイプのためにも、CRとURが同じである空調PERについては、これらの用語については、図1を参照し、CRとURが異なる場合が反射神経。
ムービー1。それは臭いに反応するように調整された後のPERを実行ミツバチの映像。臭気発症後蜂約1.5秒のPER応答に注意してください。追跡ソフトウェアは、臭気の提示に応じて、触角の動きをマップしました。ビデオの右上隅にプロットされたラインは、実際の触角の動きを示している。二つのXの画面を示して触角の動きの下部にあるグラフ（左）とY（右）座標。ビデオに示すグラフの縦の線は、右、ライトON、PERに委ね、示して消灯し、後退を長い鼻。
Discussion
このプロトコルは、PERプロシージャを使用して空調するための2つの信頼できる方法を提示した。これらは正常に27、21を採用されているいくつかの方法のうちの2つである。私たちは、それが一貫して信頼性があるとして、さらには異なる実験者全体で、PERを使用して、すべての実験的研究のための方法2使用している。
同じ基本的な手順が異なるコンディショニング刺激と異なる行動反射の使用を含むミツバチ、との研究の多くの異なる種類に適応されています。また、脳13,14,30、および調節および行動15,16,31の分子遺伝学的拠点に28,29の学習の違いの遺伝的基礎の調査、嗅覚と記憶の生理学的相関にリンクされている。そのため100年以上前にカール·フォン·フリッシュによる最初の研究を始め、ミツバチへの嗅覚学習の生態学的関連性、高度な知識の
基本的な手順は、他の種の問題を調査するために適用することができるという点で強力である。二つの蛾の種、 たばこスズメガとスポドプテラ·リトラリスは 、匂いの識別および各種の嗅覚学習能力32,33の神経基盤を調査するために、PERの研究に使用されている。ミバエとPER実験はchemosensationに関与する分子シグナル伝達カスケードに多くの洞察を提供し、34の学習している。あたりは最近、ノミ（Rhodniusのprolixus）35、重要な病気のベクトルに慣れを研究するために使用されています。
一般的には、この手順は方法の変化にロバストである。 Dの使用ifferent方法は、おそらく、治療群間の同じ相対的な差を生成する。比較的簡単な手順にもかかわらず、いくつかの問題が常に臭気蔗糖の関連付けを学習するからミツバチを防ぐことができます。次のトピックでは、プロトコルとPERコンディショニング中に発生する可能性のある一般的な問題のいくつかの可能な変化があります。
コンディショニングプロトコルにおける試験の数とタイプに関する考察
任意の学習プロトコルは、取得段階での試行回数にミツバチの露出が必要になります。この数は、主にタスクの難易度によって異なります。ミツバチは、単一の裁判の後、簡単なタスクを学ぶことができますが、それらは長期記憶形成を誘導するために、少なくとも3回の試験を必要としています。予想されたように、ミツバチが十分に困難な課題を学習するためにかなり多くの臨床試験が必要になります。一般的には、ミツバチがもはや大幅に改善しないそれを超える試行の最大数がありますIRパフォーマンス。この最大値は、特定のタスク、匂いの種類と濃度、およびショ糖濃度に依存する。
異なる臭気を有するトライアルつ以上のタイプを使用する場合、臭気のプレゼンテーションの単純なシーケンスを記憶する代わりに、臭気36との間の違いを学習するからハチを維持するために擬似ランダム·シーケンス内の異なる試行型を提示する。これらの擬似ランダム·シーケンスでは、臭気タイプごとに試験が同数のがなければならない。また、一臭気が先行し、同じ匂いが続くタイプ、または他の匂いのいずれかの試験の確率は、すべての臭いのために等しくなければならない。 ABBABAAB： - AとB - 2臭いについては、次のシーケンスを使用しています。 8件の試験にわたって各臭気を4回提示される。各臭気のための臨床試験の所望の数に到達するために同一の配列を連結します。
関係なく、実験的なデザインの、ままでなければならないいくつかのパラメータがあります学習を最適化するための定数。 CSと米国との間の重なりは、効果的なコンディショニングのために重要である。試行間間隔（ 図1、表1）は一定であるとムラや短すぎるか長すぎる試行間間隔が著しくコンディショニングプロトコール1の有効性に影響を与えることができるので、最適化される必要がある。
行動試験トライアルの重要性と設計上の考慮事項
CSと米国が一緒に提示されている実験の「捕捉段階」中に記録された応答は、便利です。しかし、匂いの提示条件は別の裁判のいずれかのタイプとは異なる場合があることに注意してください。補強試験中に、ショ糖、続いて臭気がハチの応答に影響を与えることができる視覚刺激（ショ糖液滴を送達するための装置の移動）に関連して提示される。そしてハチはわずか3秒を持っている（; 図1匂い刺激マイナススクロースを発表した1秒オーバーラップの4秒）の応答を示すための。実験は2匂いを区別するために学んで蜂が含まれている場合（ 例えば 、補強及び補強されていない）、別の試験に提示され強化されていない臭いが報酬提示の視覚刺激せずに発生し、ミツバチが応答する完全な4秒を持っている。したがって、2つの匂いに対する応答は、取得中に完全に比較することはできません。いずれのコンディショニングプロトコルで、取得カーブ1のみに依存しません。より良いミツバチが学んだことを確認するために、全ての刺激の試験は、同一の条件下で行われることが保証もない臭いが補強されている間の強化されていないテスト一連の試験を、ご紹介します。
実験の具体的な目的に応じて、テストはエアコン臭やエアコン外径を持つ一連の試験の単一のテストトライアルで構成することができますあるいは、または調整され、新たな臭気の組み合わせ。エアコン臭の単一のテストトライアルはミツバチが「エアコンの臭いを覚えているかどうかの単純なアッセイを提供する。ただし、最初のテストトライアルへの応答は、ミツバチのモチベーションレベルだけでなく、エアコンの臭いの彼らのリコールを反映することができる。試験一連の試験、エアコン臭気または馴化および1つ以上の新規な臭気の単一一連のテストの消光一連の試験のいずれか、また記憶を評価するために使用することができる。絶滅一連の試験は、ミツバチが「エアコンの関連付けを覚えてどのように強く評価することができます。条件反応を消すために必要な試験が、より多くのリコールも強い。空調や小説臭いのシングル一連のテストは、またエアコンの臭いの特異性ハチ '記憶を評価することができます。
これは、同じ時点で対照群と処置群の両方を調整し、テストするためにも不可欠である。比較例すぐに長い期間のために開催されたハチのコンディショニング後に蜂のパフォーマンスを覆うと理由飽食にミツバチを供給することにより、ショ糖、米国への露出の問題である。例えば、長い間隔の後にパフォーマンスの低下は、メモリ崩壊が原因であるか、結果があいまいなことによる米国への未強化の曝露によって誘発される動機づけ状態および/または学習の変化である可能性があります。したがって、治療群の性能は、常に調整され、同じ時点で試験した対照群と比較して判断すべきものである。
臭気濃度およびIntegrity
匂い（CS）の濃度と完全性が損なわれることができるいくつかの方法がある。臭気配信に最も普及している問題は、使いすぎた（ 図2）からの臭気カートリッジの枯渇である。この落とし穴を回避するために、カートリッジを10〜12の使用（5ミツバチのグループを持つすべての2または3試験）を交換してください。また、使用することが重要です使用済みカートリッジは差動で枯渇する可能性があるので、テスト試験の新鮮なカートリッジを見出し、本不等匂い刺激。別の一般的な問題は、それを完全にクリーニングすることなく、複数の臭気のためにカートリッジを使用することに起因する臭気カートリッジ汚染である。汚れていたり、汚染された空気の流れも意図せずに、追加の嗅覚刺激を（活性炭フィルタは、バックグラウンド汚染を防ぐことができます）を導入することができます。臭気に対する生理的応答の測定と調節PER結合する場合に、特に問題となる。漏洩臭気カートリッジは匂い刺激の顕現性を低下させる試験が始まる前にミツバチが臭気にさらされているので、問題を提示する。バルブが人為的に意図された臭気にハチ」の応答を低減すること、開いたときに臭気の配信のための空気供給にルーズフィッティングはほとんど、あるいは全く臭気配達になることがあります。
ショ糖溶液と無条件刺激（報酬）
Aマウントは、米国として使用ショ糖溶液の濃度、および完全性は、実験の成功に不可欠である。コンディショニングは、US 37として使用されるスクロース水溶液の量及び濃度の関数である。方法2で使用されるマイクロシリンジは、（0.2μLまで）非常に精密な米国の配信の制御を可能にし、私たちは説明した両方の方法のためにそれらを使用することをお勧めします。爪楊枝（方法1）の使用は、以下の予算を持つフィールドに大きな人のグループ、仕事の訓練中に、などの高価なシリンジを使用することができない状況のために適切である。タイミングはショ糖の蓄積（及び納入濃度）を回避するために、爪楊枝の定期交換で維持されているように、方法1を注意深く実装がある限り大丈夫です。しかし、爪楊枝を使用して正確に制御および調整研究1のために重要である量およびUSの大き送達を推定することはより困難である。に必要とされるショ糖の濃度タスクの難しさとハチの内部状態や時期に依存することが条件付け関連付けを学習する動機ミツバチを維持するのに十分な報酬を提供する。より困難なタスクがハチ '成功したタスクを学習するためのより高いショ糖溶液を必要とします。実験中にミツバチの健康と報酬の認識に影響を与え、溶液の完全性を損なうであろうとしても5℃ のショ糖溶液中での金缶の蓄積、。それは、数日おきにソリューションを交換するのが最善です。
高精度、タイミング、およびCSの一貫性と米国の配達
PER手続きの適正な実施についての最も重要な問題、またはそのことについては、コンディショニング手順は、精度、タイミングとCSと米国デリバリー（ 図1）の一貫性を必要とする。手順に慣れていない研究者は頻繁に一方または両方の刺激の配送について不正確である。 ISIのそれは、CSの重複を可能にするために失敗し、米国が悪いコンディショニング性能をもたらす。 PLCは、臭気の配信開始後、ショ糖3秒を配信する実験者のための可聴信号を自動化します。調べでは、信号の後に迅速な配達のためのミツバチの近くにショ糖/水滴を保持する必要があります。これらの手順は、一貫性のあるISIを同伴するのに役立ちます。空調アリーナによってストップウォッチを配置すると、裁判の都合の良いときの配置を可能にするだけでなく、刺激の分娩前と後の両方の分野でミツバチ」時間を監視する。そうすればITI年代は比較的一貫していることができ、全体の手順は、制御されたペースで実行することができます。長すぎるITIの短すぎるのは、たとえば1分以内、または貧弱なコンディショニング性能1につながることができます。
ミツバチパフォーマンス上、季節的、環境的、文脈効果
ミツバチのパフォーマンスが大幅にその周囲に影響され得る前および条件付けの間の両方。多くの場合、季節の移り変わりが付属して温度や食料の入手可能性の変動が学ぶためのミツバチのモチベーションが変更されます。花が咲いているときは、研究室で空調関連付けを学習するミツバチ意欲が38減少します。コロニーが強調されている場合には - 極端な温度、食糧不足、または疾患に関連するストレスから - ミツバチが '内部の学習性能の低下が表示されます。ミツバチは、しばらくの間うまく学ぶが、そこにあまりにも病気のストレスや老化が時間とともに彼らの学習性能が低下する可能性があり、飛行の部屋に保管。条件付けの間のコンテキストはまた、ハチのパフォーマンスを低下させることができる。余分な臭い、移動、他の刺激は、実験的な刺激からミツバチをそらすことができます。この問題を回避するには、合理的に一貫性のある、単純化された視覚的なコンテキストを維持。
遺伝子型と経験は、PERのパフォーマンスに影響
<Pクラス= "jove_content">ミツバチの労働者が原因タスク特化、遺伝子型、または他の環境要因20の任意のコンディショニング手順でパフォーマンスがかなり異なる場合があります。したがって、可能な限り、個体間のばらつきを低減するために、実験に使用される動物のタイプを標準化することが重要である。彼女は多くの異なったドローンと交配を意味し、オープン交尾女王率いるコロニーでは、労働者は父方の遺伝子型が異なります。遺伝的背景は、感覚応答39と学習性能29の劇的な違いにつながることができます。機器によって、単一の無人機28から精子によって受精女王率いるコロニーを使用すると、この個体間のばらつきを低減します。上記のプロトコルは、巣の入り口からミツバチの労働者を収集するための方法を含む。しかし、これらのミツバチは、年齢や行動タスクに関して互いに異なる。彼らは（inexperien若いかもしれCED）以上（より経験豊富な）飼料収穫機。彼らは第一の配向便を作る若いミツバチかもしれません。それとも、ガード蜂かもしれません。彼らは大人（年齢のために制御するために）、および/またはそれらは（経験のために制御するために）餌始めるなどとして浮上としてばらつきを低減するために、いずれかの速乾性エナメル塗料やマーキングタグでミツバチをマーク。その後、数日後、コンディショニングのための顕著なミツバチを集める。看護行動に従事している労働者は、ハイブ内のフレームから採取することができる。彼らは餌と内側幼虫の世話をするためにひな細胞中に頭を挿入すると、看護師は、積極的に識別することができる。
PERコンディショニングのためにヴァージンクイーンやドローンを使用する
ワーカーミツバチに加えて、バージンミツバチ女王とドローンは、容易に性能28の学習において異なるミツバチの遺伝的系統を開発することを目的と研究のためのPER手順で調整することができる。ヴァージン女王は目の後すぐに収集する必要がありますEYは蛹化から出現し、麻酔なしで拘束ハーネスに直接入れ。コロニー内部のひなコームから収集若い、未熟ドローンは、一般的に学ぶことがモチベーションではありません。彼らはフライトを交配始めた後は、無人偵察機は、容易にPERタスク28を学ぶ。彼らは、相手の飛行から戻るように収集され、女王を飼育するために使用コロニーの小さなケージに一晩維持されるべきである。彼らにコンディショニング前日を活用しようとしないでください。彼らはハーネス一晩でよく生存しない。数時間前にエアコンの無人機は、ケージから収集され、麻酔なしで拘束ハーネスに入れることができる。
結論
このPER手順は、メソッドのように、PER実験を設計するための出発点に達する。プロトコルはPERほとんどが概説された手順、実験とaccommodatの具体的な目標を実現するために何らかの方法で変更されることが必要になります電子複数の処置群。これは、実装が容易です。しかし、適切な実装を詳細かつ実践に注意を払う必要があります。一度それが異なる昆虫種にはいくつかの基礎および応用研究プログラムのための研究ツールとして追加するための強力な手続きでできるマスタリング。
Acknowledgments
アリゾナ州立大学;この研究は、NIH NCRR（BHSにR01 RR014166）、NIH NIDCD（R01 DC011422 BHS共同PI）、米国農務省（BHスミス共同PI JトランブルPI）からの資金によってサポートされていました。学生を訓練するためのワークショップのための資金（ 図4のデータ）は、チリの科学財団によって提供された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Odorant Compounds (for example) | |||
| 1-hexanol | Sigma-Aldrich | 471402-100ML | For additional examples |
| 2-octanone | Sigma-Aldrich | W280208-800G-K | of odorants, see any of |
| heptanol | Sigma-Aldrich | 51778-5ML | the papers on olfactory |
| gerianol | Sigma-Aldrich | 163333-25G | processing from the |
| nonanal | Sigma-Aldrich | 131210-100ML | Smith lab. |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-1L | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | Make sure it’s odorless. |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Scintillation vials | Sigma-Aldrich | Z190535-1PAK | Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials. |
| Bee harness | Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing. | ||
| Duct tape | |||
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956-1PAK | |
| Wash bottles | Sigma-Aldrich | Z560847-3EA | For the 70% ethanol. |
| Dryer tubing | |||
| FOR METHOD 1 ONLY | |||
| 20 ml disposable plastic syringes | Cole-Parmer | WU-07945-18 | |
| 15 mm filter paper circles | Sigma-Aldrich | Z274844-1PAK | |
| Pushpins | |||
| Toothpicks | |||
| FOR METHOD 2 ONLY | |||
| Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml | Cole-Parmer | EW-07840-00 | |
| Gilmont micrometer syringe tip | Cole-Parmer | EW-07841-00 | |
| 26 G 3/8” Leur hub hypodermic needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
| 1 cc tuberculin syringes (plastic/glass) | Sigma-Aldrich | Z181641-1EA OR Z192090-200EA | Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses. |
| Small rubber/silicone restrictors | Cole-Parmer | EW-95702-02 | Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| 75 x 100 mm filter paper | Sigma-Aldrich | Z695106-500EA | |
| Direct Logic 05 Programmable Logic Controller |  Koyo Electronics Industries Co, Ltd |
||
| 1 mm, 4 mm, & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing. |
| Polypropylene connectors & leur fittings | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes. |
| 65 mm Correlated Flowmeter | Cole-Parmer | EW-03216-08 | Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve. |
| OR | |||
| Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump | Aquacave |
AE-TETRA-300 | |
| LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E" | The Lee Company |
LFAA1200118H | Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW |
| PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer | RadioShack |
273-074 | |
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