Abstract
Insekter ändra sina svar på stimuli genom erfarenhet att associera dessa stimuli med händelser viktiga för överlevnad (t.ex. mat, kompisar, hot). Det finns flera beteende mekanismer genom vilka en insekt lär framträdande föreningar och relaterar dem till dessa händelser. Det är viktigt att förstå detta beteende plasticitet för program som syftar mot att hjälpa insekter som är till nytta för jordbruket. Denna förståelse kan också användas för att upptäcka lösningar på biomedicinska och jordbruks problem som insekter som fungerar som sjukdomsspridare och skadedjur. SNABEL Extension Response (PER) konditione protokoll utvecklades för honungsbin (Apis mellifera) mer än 50 år sedan för att studera hur de uppfattar och lära sig om blommor lukter, som signalerar de nektar och pollen resurser en koloni behöver för överlevnad. Den PER Förfarandet ger en robust och enkel att anställa ramverk för att studera flera olika ekologiskt relevant mechanismer för beteende plasticitet. Det är lätt att anpassa för användning med ett flertal andra insektsarter och andra beteende reflexer. Dessa protokoll kan lätt användas i samband med olika medel för övervakning av neural aktivitet i CNS via elektrofysiologi eller bioimaging, eller för att manipulera riktade neuromodulatory vägar. Det är en robust analys för att snabbt detektera subletala effekter på beteende som orsakas av miljöpåverkande faktorer, toxiner eller bekämpningsmedel.
Vi visar hur PER-protokollet är enkel att genomföra med hjälp av två förfaranden. En är lämplig som en laboration för studenter eller för snabba analyser av effekten av en experimentell behandling. Den andra ger mer noggrann kontroll av variabler, vilket är viktigt för studier av beteendekonditionering. Vi visar hur flera åtgärder för beteendesvaret, från binära ja / nej till mer kontinuerlig variabel som latens och varaktighet snabel förlängningen kan användas för att testa Hypothesear. Och vi diskutera några fallgropar som forskare möter ofta när de använder förfarandet för första gången.
Introduction
Många insekter lära sig om ekologiskt relevanta stimuli, och de ändrar sedan deras beteendemässiga reaktioner på dessa stimuli för att anpassa sig till nya prediktiva relationer i sin omgivning. Flera olika mekanismer kan ligga bakom denna beteende plasticitet (t.ex. nonassociative, associativa / Pavlovsk och operant / instrumen 1). Dessa typer av plasticitet skiljer sig åt i hur de stimuli eller beteenden är förknippade med viktiga händelser, såsom förekomsten av mat, en kompis, eller fara. Att förstå dessa former av plasticitet är mycket viktigt för grundläggande forskning om hur nervsystemet förändras för att koda nya minnen 2. Det är också viktigt för att förstå de adaptiva beteenden av insekter som är viktiga vektorer för sjukdoms (t.ex. tsetse och mygga) och insekter som är jordbrukssynpunkt viktiga, antingen i växtodlingen (honungsbin) eller som skadedjur.
Studera beteende plasticitet i någon animal kräver en nivå av experimentell kontroll över ett antal variabler som inte kan uppnås i fält 1. Det kräver utveckling av en robust konditioneprotokoll som kan användas under mer kontrollerade förhållanden, men som fortfarande är relevanta för beteende under naturliga förhållanden. Honungsbiet (Apis mellifera) är en utmärkt modell för hur man kan utveckla ett protokoll för att utföra kontrollerade analyser av beteende plasticitet 3,4. SNABEL Extension Response (PER) i honungsbin är ett naturligt beteende reflex där honungsbiet utökar sin snabel som svar på antennal stimulering med en sockerlösning. Under normal födosöksbeteende, inträffar PER när honungsbiet finner nektar i en blomma. Lyckligtvis kommer honungsbin lätt uppvisar denna enkla och lätta att kvantifiera beteenden i laboratoriet. Detta gör det möjligt att studera, i en kontrollerad miljö, de mekanismer som påverkar det ekologiskt relevant beteende 5. PER CAn också användas inom en konditione protokoll för att undersöka stimulans perception och inlärning och minne under olika behandlingsförhållanden, som är utformade för att avslöja de beteendemässiga och neurala mekanismer som ligger bakom den plasticitet 6.
Eftersom de första studierna av Kuwabara 7 har PER konditionering i stor utsträckning använts för att avslöja nonassociative, associativ och operanta mekanismer som ligger bakom beteende plasticitet i honungsbin 8. Dessa mekanismer är identiska med de visade i studier av fritt flygande honungsbin 9. Till skillnad från studier av fritt flygande honungsbin kan PER protokoll konditione kopplas med elektrofysiologi 10,11 eller levande celler fluorescens avbildning 12-14 av hjärnan. Dessutom PER-protokoll möjliggör experimentell manipulation av nervbanor via farmakologiska eller molekylärgenetiska behandlingar för att testa hypoteser om roller specifika komponenter i nätverket, t.ex. neuromodulators 15,16. PER-protokoll har också ett viktigt sätt att utvärdera subletala effekterna av miljöförhållanden liksom gifter om hälsa och födosök effektivitet honungsbin 17.
Här beskrivs två luktleveransmetoder parallellt. Metod 1 är en version av lukt och obetingat stimulus (sackaros) leverans som ger ett billigt och tekniskt enkel metod för att presentera lukt och sackaros belöning. Denna metod är bra för grundutbildning och när automatisering är inte möjligt. Det är ett utmärkt sätt att introducera denna teknik till ett klassrum eller undervisningslaboratorium. Under konditionering för experiment med svårare uppgifter och kopplade fysiologiska bedömningar av lukt perception, inlärning, eller minne, är det mycket viktigt att exakt och precist reglera start, varaktighet leverans tidpunkten för stimuli. För den mest pålitliga stimulans leverans, använd ett sätt att automatisera luktleverans and en exakt metod för belöning leverans. Metod 2 sysselsätter automatiserad lukt leverans och mer exakt sackaros leverans. Det är tekniskt mer sofistikerad och kräver mer för den första installationen än metod 1, men det avsevärt ökar konsekvensen av tidpunkten och mängden av stimuli som används för konditionering och bör användas när det är möjligt.
Protocol
1 Lukt (betingad stimulus) Patron Setup
- I början av experimentet, ställa in flera lukt patroner för alla olika lukter som behövs för försöken konditione.
- Använd ett dragskåp för lukt utspädning och förberedelse luktpatron. Öppna aldrig flaskor av lukter utanför denna dragskåp, eftersom lukter kommer sprids snabbt över hela labbet och potentiellt utsätter de honungsbin till lukten innan konditionering. Också använda handskar när du installerar den lukt patroner och tvätta noga efteråt för att undvika att utsätta honungsbin för lukter när du hanterar dem.
- Se till att varje luktpatron är tydligt märkta med en färgkodad etikett lukten som den används för första gången. Använd aldrig en luktpatron (sprutcylinder eller kolv) för mer än en doft, eftersom det kan finnas rester lukt på patronen.
- Förberedelse Lukter och lukt Blandningar
- Späd lukter i antingen hexan eller mineralolja i en desired koncentration.
OBS: Ändring av koncentrationen av lukt eller presentera blandningar av två eller flera luktämnen kan möjliggöra utredning av ytterligare aspekter av hur bin känna lukter och lära sig rade föreningen. Lukt blandningar kan vara så enkelt som en 50:50 binär blandning eller så komplicerat som flera lukter som efterliknar naturliga lukt stimuli. Minskning av koncentrationen av lukt även ökar svårigheten av uppgiften.- Lukter blir utarmat med återanvändning av patronen (Figur 2). För att undvika problem från utarmning gör tillräckligt patroner för att kunna byta till en ny patron varje 10-12 använder.
- Späd lukter i antingen hexan eller mineralolja i en desired koncentration.
- Förbereda Lukt Patroner
- Metod 1
- För denna metod använder 20 ml plastsprutor med en cirkel 15 mm diameter på filterpapper satte upp på gummi änden av kolven för lukt patroner.
- Ta kolven ur sprutan och använda en kartnål för att fästa bit filter papper till änden av kolven.
- Använd en mikropipett för att placera 10 | il av odören på filterpapperet, och sätt tillbaka kolven in i sprutcylindern. Tryck in kolven till 15 ml kvar i sprutan.
- Metod 2
- För denna metod, använd 1 cc glas eller plast tuberkulinsprutor (eller modifierade pipetter med liknande volym och form) med en remsa av filterpapper inuti och en gummi eller silikon strypningen i den breda änden av sprutcylindern för lukt patroner.
- Avlägsna kolven från en 1 cc tuberkulinspruta fat. Den sprutcylindern blir kroppen av lukt patronen.
- Ta bort den svarta gummispets från sprutkolven och klipp av den slutna änden av gummispetsen.
OBS: Denna gummiring kommer att fungera som en strypning för att minska sug från luftflödet i arenan, som i förtid kommer att dra lukt ur patronen och över återhållsam honungsbiet. Alternativt, silikonslang (4,8 mm outer diameter) skars i 5 mm sektioner arbetar som begränsare.
- Skölj insidan av sprutbehållaren och gummi / silikon strypning med 70% etanol (för att ta bort mycket av den kvarvarande lukt från tidigare användning) och låt dem lufttorka.
- Placera en 0,2 x 4 cm remsa av filterpapper i den breda öppningen av pipan så att papperet sträcker 1-2 cm utanför öppningen.
- Använd en mikropipett för att placera 3-10 ul av odören på filterpapperet utan att låta odören vidrör änden av sprutcylindern. Pipettspetsen kan återanvändas för samma lukten, men se till att använda en ny spets för att ställa in nästa lukt.
- Vrid brett öppnande av sprutcylindern uppåt så filterpapper glider snabbt in i röret. Sätt i strypningen i den breda öppningen av sprutcylindern.
- Se till att varje luktpatron är tydligt märkta med en färgkodad etikett lukten första användning för. Använd aldrig en luktpatron (sprutcylinder eller restrictor) för mer än en lukt, eftersom det kan finnas restlukt på den.
- Ball upp i slutet av en luddfri trasa, blöt den med 70% etanol, och använda den för att grundligt torka den yttre ytan på patronen för att avlägsna eventuellt kvarvarande lukt på utsidan av patronen.
- Metod 1
2. Uttagning, Hålla tillbaka, och Feeding the Bees
- Förbereda Bee Fasthållande Selar
- Gör enkla hållande selar för honungsbin av plast soda sugrör, hård plastslang eller bearbetad metallrör (alla är ca 0,9 cm innerdiameter och har 1-2 mm väggtjocklek). Använd kraftigare selar för förfaranden som innebär operation.
- Klipp 3 cm sektioner av slangen. Sedan, delvis klippa bort ungefär hälften av de övre 1 cm från selen för att göra det lättare att hålla bee på plats medan fästa selen.
- Skär en 0,2 x 6 cm remsa av tejp och fäst en ände till en sida av bi sele, leaving den andra änden fri.
- Samla Worker Bees
- Samla arbetare från ingången till kolonin som de paus innan avgår från kolonin eller när de återvänder från födosök.
OBS: Placera en bit av trådnät, med hål precis stort nog för arbetstagare bin att krypa igenom, över ingången saktar de åter arbetarna ner och gör det lättare att fånga dem innan de kommer in i kolonin. - Placera en scintillationsflaska över bee tills den flyger upp i den. Håll flaskan med dess öppning horisontellt eller nedåt medan locket är fäst så biet inte flyger upp ur flaskan. Placera bara ett bi i varje flaska. Se till att locket har ett hål i den för att möjliggöra adekvat gasutbyte.
- Samla bina snabbt för att minimera den tid de tillbringar i flaskorna. Förvara rören med bin i dem i en liten ruta i skuggan.
- Överför lådan med flaskorna och bin till labbet, och placera flaskorna i en is-vatten slUrry tills bina stannar. När ett bi är orörlig, ta bort flaskan från isen omedelbart för att undvika överexponering för kallt, och placera biet in i en återhållande sele.
OBS: Vi rekommenderar inte att placera bina i kylskåpet eller frysen eftersom det är svårt att följa när bina blir orörliga, vilket resulterar i överdriven exponering för kyla. När utnyttja mer än 10 bin, överföra endast några bin till is-vatten-uppslamning i taget.
- Samla arbetare från ingången till kolonin som de paus innan avgår från kolonin eller när de återvänder från födosök.
- Besöksförbud bina
- Placera bi i sele med sin bröstkorg dorsala vänd mot bortskuren del av slangen och dess huvud precis ovanför den övre delen av slangen. Tryck försiktigt biet nära slangen så dess mundelar överskrider kanten på slangen. Skjut remsa av tejp i mellan huvudet och bröstkorgen på ryggsidan av biet och stadigt fästa den fria änden på sidan av selen.
- Se till att tejpen på selen är slät och spänd. Det bör inte vara anmäldaceable mellanrum mellan framsidan av bee sele och bandet, och bandet ska ligga platt på toppen av selen. Om det finns luckor biet kanske inte kan utvidga sin snabel ordentligt, annars kan fly. Se också till att biets frambenen inte sticker ut mellan framsidan av selen och silvertejp.
- Placera bi i sele med sin bröstkorg dorsala vänd mot bortskuren del av slangen och dess huvud precis ovanför den övre delen av slangen. Tryck försiktigt biet nära slangen så dess mundelar överskrider kanten på slangen. Skjut remsa av tejp i mellan huvudet och bröstkorgen på ryggsidan av biet och stadigt fästa den fria änden på sidan av selen.
- Matning av bin och utfodring Conditioning Intervall
- Ca 30 min efter utnyttjande - efter bina har återhämtat sig från den första installationen - mata bina 3-4 pl 0,5 M sackaros (i vatten). Detta belopp kommer att vara tillräckligt för en matning till conditioning intervall på 3-4 timmar.
- Generellt foder 1 pl 0,5 M sackaros för cirka varje timme väntetiden mellan utfodring och konditionering för att säkerställa bina överlever intervallet ännu är hungriga nog i början av konditionering för att bli motiverade att lära sig rade föreningen. I ett laboratorium som hölls vid en varm temperatur eller om usjunga en annan koncentration av sackaros, justera beloppet matas eller tidsintervallet i enlighet därmed.
OBS: Med en matningskonditioneintervall på 24 timmar, se till att alla bina matas till mättnad med 0,5 eller 1 M sackaros minst 24 timmar före konditionering börjar. Vid rumstemperatur, bin kräver approximativt 24 h före de är tillräckligt motiverade att svara väl i ett konditioneringsprotokoll.
OBS: Använd en lägre koncentration av sackaros lösning för att mata bina än koncentrationen som används som belöning under konditione att förhindra att bina blir mindre känslig för koncentrationen av sackaros används vid konditionering, vilket kan minska inlärningsprestanda 18. - Mata bina i ett område långt borta från träningsområdet. Exponering för den obetingat stimulus (sackaros) i konditione sammanhang före konditionering kan påverka efterföljande konditionering till lukten.
- Generellt foder 1 pl 0,5 M sackaros för cirka varje timme väntetiden mellan utfodring och konditionering för att säkerställa bina överlever intervallet ännu är hungriga nog i början av konditionering för att bli motiverade att lära sig rade föreningen. I ett laboratorium som hölls vid en varm temperatur eller om usjunga en annan koncentration av sackaros, justera beloppet matas eller tidsintervallet i enlighet därmed.
- Under intervallet mellan utfodring och conditioning placera bin på bänkskivan i ett lugnt område i labbet för att undvika onödiga störningar. Om laboratoriet har låg luftfuktighet, placera bin i en plastbehållare med våta pappershanddukar under tidsintervallet. Detta förhindrar uttorkning, eftersom bina kan dö om de exponeras för låg fuktighet under långa tidsperioder.
OBS: Ändra inte utnyttjande och utfodring protokoll inom ett experiment! Använd endast en viss tidsintervall mellan att inrätta och mata bina och börjar konditionering för varje experiment så bina är alla behandlas på exakt samma sätt.
- Ca 30 min efter utnyttjande - efter bina har återhämtat sig från den första installationen - mata bina 3-4 pl 0,5 M sackaros (i vatten). Detta belopp kommer att vara tillräckligt för en matning till conditioning intervall på 3-4 timmar.
3. Conditioning
- Testning för Sackaros Känslighet
- Några minuter före början konditionering, testar bina motivation att föda genom att röra sina antenner med en liten droppe av 0,5 M sackaroslösning (samma koncentration som används vid utfodring). Låt inte dem att föda under detta test. Om de svarar genom exteENDE sina snabel, de är förmodligen tillräckligt motiverade att lära sig och kan användas för protokollet.
- Experiment Design
OBS: Detta protokoll kan ändras för att passa ett brett spektrum av utbildningsprotokoll för att utreda många aspekter av honung binas inlärning och minne kapacitet. Bland de många parametrar som kan justeras är: Inter-rättegången intervall, antalet bin som utbildats vid en given tidpunkt, inter-stimulus intervall, typ och koncentration och antal lukter, typ och koncentration av obetingat stimulus, antalet och sekvensen försök (Figur 1, Tabell 1) 19-21. Vid utformningen av exakta protokoll för varje konditione rättegång, är det mycket viktigt att hålla inter rättegången intervall konsekvent mellan individer. En interprovintervall som är för kort, för lång eller inkonsekvent försämrar bina prestationer. Se diskussionen för en fullständig behandling av detta ämne.
OBS: Bees kommer att lära uppgiften snabbare om de är i en varm miljö. Därför hålla temperaturen av träningsmiljö konsekvent och varma (29-30 ° C om möjligt). - Leverera Lukt (betingad stimulus)
- Metod 1
- Ställa in Lukt Delivery System
- Montera plast 20 ml spruta laddad med det luktbehandlade filterpapper så att den är stabil och den mindre änden är vänd direkt vid biets antenner. Ställ kolven vid 15 ml-märket och placera sprutan så kolven är lättillgänglig.
- Presentera odören Stimulus
- I början av varje försök, placera bi i sele på tappen i konditione arenan med sina antenner pekade direkt mot luktpatron. Låt biet acklimatisera sig till arenan för 15-25 sekunder innan lukten stimulans för att minska störningar som orsakas av plötslig förändring av dess visuella omgivning under lukt stimulans.
- Om biet börjar reagera på lukten patronen så snart den är placerad i konditione arenan, kan det finnas lukt på kassetten spets. Ta bort förorenande lukt genom att tvätta patronen med en luddfri trasa indränkt i 70% etanol. Om det inte löser problemet, byt ut patronen.
- Tryck på sprutkolven i jämn takt så att kolven är helt intryckt i 4 sek. Övervaka bee svar på lukten innan presentera obetingat stimulus.
- Efter varje försök, tillåter biet vila i konditione arena för ytterligare 15-25 sek. Flytta biet för tidigt efter rättegången kommer att avsevärt minska effektiviteten av varje konditione rättegång.
- I början av varje försök, placera bi i sele på tappen i konditione arenan med sina antenner pekade direkt mot luktpatron. Låt biet acklimatisera sig till arenan för 15-25 sekunder innan lukten stimulans för att minska störningar som orsakas av plötslig förändring av dess visuella omgivning under lukt stimulans.
- Ställa in Lukt Delivery System
- Metod 2
- Ställa in Lukt Delivery System
- Airflow Källa och Flöde
- Som källa luftflöde för lukt leveransanvända ett akvarium luftare pump eller en laboratoriebänk tryckluften, om laboratoriet är utrustad med det.
OBS: En typisk akvarium luftare pump kommer att ha en luftflöde nära 400 ml / min (7 ml / sek); över 4 sek lukt stimulans, kommer 28 ml luft att strömma genom en 1 ml patron. - Använd en flödesmätare i linje med röret för lufttillförselapparat för att reglera flödeshastigheten för lufttillförseln. Justera flödesmätaren tills flödeshastigheten är 400 ml / min. Kontrollera flödet vid öppnandet av luktpatron med en separat flödesmätare.
- Anslut luftflödet till luktpatron genom ett system av rör och ventiler i plast.
OBS: Tidpunkten enhet diskuteras nedan öppnar ventilerna vid lämplig tidpunkt i rättegången. Plast kontakter fäster luftflödet systemet till luktpatron genom en bilaga Luer typ till kassettens sprutcylindern. - Oberoende av luftflödet källa, kontrollera flödet periodiskt för att make till att linjen är intakt och flödet hålls i önskad takt.
- Som källa luftflöde för lukt leveransanvända ett akvarium luftare pump eller en laboratoriebänk tryckluften, om laboratoriet är utrustad med det.
- Airflow Källa och Flöde
- Automatiserad Lukt Leverans
- Använd en programmerbar logisk styrenhet (PLC) för att automatisera leveransen av lukt.
OBS: PLC är programmerad att öppna ventilerna till lukten leverans luftflödet 6 sekunder efter initiering av programmet (initierat genom att trycka på en knapp), hålla ventilerna öppna för 4 sekunder, och avge ett ljudmatningssignal, via en liten högtalare, 3 sekunder efter lukt stimulans debut att signalera försöksledaren att leverera sackaros. - Använd en liten lysdiod som indikerar tidpunkten för lukt stimulans under varje försök. Om möjligt använder en röd lysdiod, eftersom binas fotoreceptorer flyttas bort från längre [röd] våglängder och mot kortare [uv] våglängder så att de inte kan se det också. Placera LED bakom och under bi, utanför deras synfält, så att ljuset inte kommer att bli en oavsiktlig rade stimulus.
OBS: LIGht hjälper också kontrollera att PLC fungerar korrekt och är användbar vid analys av videoinspelningar av bina svar under testförsök.
- Använd en programmerbar logisk styrenhet (PLC) för att automatisera leveransen av lukt.
- Avgassystemet
- Inrätta ett avgassystem bakom biet för att dra luft förbi biet och att evakuera luktbemängd luft från behandlings arena för att hålla en diskret tidsram för varje form av lukt.
OBS: Om det finns ett vakuumsystem i laboratoriet, ändra vakuumporten och bifoga en ledning av torkslangen för att ge luftflöde för att evakuera konditione arenan. Om det inte finns ett vakuumsystem, en liten elektrisk fläkt inrymd i linje med torkan slangen ledde till ett dragskåp eller genom ett fönster kommer att räcka.
- Inrätta ett avgassystem bakom biet för att dra luft förbi biet och att evakuera luktbemängd luft från behandlings arena för att hålla en diskret tidsram för varje form av lukt.
- I början av varje dag, ta de elektriska och flygförbindelser i luktleveranssystemet och avgassystemet. Tryck på startknappen på luktleveranssystemet och spåra tiden mellan att trycka påknappen och när ventilerna öppna (en lugn klick och LED-lampan tänds) och när kö för att presentera den obetingat stimulus (en ljudsignal) ljuder. Kontrollera luftleverans genom att placera en fuktig fingertopp framför kontakt som ska fästas på luktpatron. Det bör finnas en stark luftström endast när ventilerna är öppna. Kontrollera avgassystemet genom att hålla en luddfri vävnad upp till öppnandet av avgassystemet för att kontrollera att luftflödet är tillräckligt starkt för att på rätt sätt evakuera luft från konditione arenan.
- Ställa in Lukt Delivery System
- Montering av Lukt patron
- Placera några modellera antingen på bänkskivan eller på en liten plexiglas står att placera bee och luktpatron direkt framför avgassystemet. Placera glas lukt sprutan i lera och ställ in så att öppningen i den breda änden är riktad mot biets huvud. I slutet av sprutan bör vara 1-2 cm från biet. Välj ett avstånd inom detta område och vara konstant.
- Säkert placera kopplingen ansluter patronen till luftslangen och ventilsystem över den smala slipad änden av sprutan.
- Presentera odören Stimulus
- I början av varje försök, placera utnyttjas biet på tappen i konditione arenan med sina antenner pekade direkt mot luktpatron. Låt biet resten i arenan för 15-25 sekunder innan lukten stimulans för att kunna vänja sig vid sin nya omgivning.
OBS: Om biet börjar reagera på lukten patronen direkt efter att ha placerats i konditione arenan, kan det finnas lukt på kassetten spets. Ta bort förorenande lukt genom att tvätta patronen med en luddfri trasa indränkt i 70% etanol. Om det inte löser problemet, byt ut patronen. - Tryck på startknappen för att starta tidsmekanism för lukt leverans. Övervaka bee svar på lukten efter stimulansdebut och före presentation av obetingat stimulus.
- Efter varje försök, tillåter biet vila i konditione arena för ytterligare 15-25 sek för att möjliggöra inledande minnesbildning. Flytta biet för tidigt efter rättegången kommer att avsevärt minska effektiviteten av varje konditione rättegång.
- I början av varje försök, placera utnyttjas biet på tappen i konditione arenan med sina antenner pekade direkt mot luktpatron. Låt biet resten i arenan för 15-25 sekunder innan lukten stimulans för att kunna vänja sig vid sin nya omgivning.
- Metod 1
- Leverera Sackaros (obetingat stimulus)
- Metod 1
- För denna metod, använd en tandpetare för att leverera sackaros.
OBS: Det är bäst att använda en plast tandpetare eftersom trä tandpetare kan ha en doft som kommer att påverka binas svar på betingat stimulus. - Doppa spetsen på tandpetare i sackaroslösningen, och, när det är dags att presentera den obetingat stimulus, håll tandpetare framför biet och låta biet att slicka sackaros från tandpetare under ca 1 sekund.
- Byt ut tandpetare regelbundet för att undvika uppbyggnad av suCrose.
- För denna metod, använd en tandpetare för att leverera sackaros.
- Metod 2
- Sackaros Delivery System
OBS: Ett mer exakt sätt att leverera obetingat stimulus är genom användning av mikrometer sprutor, som noggrant kan leverera små mängder (tiondelar av en mikroliter) av sackaros belöning.- Vira mikrometer av sprutan tillbaka så långt som möjligt. Ladda mikrometer sprutcylindern med sackaroslösningen. Se till att det inte finns några bubblor i glaset delen och montera sprutan. Fyll navet i nålen med sackaroslösningen innan den placeras på den smala änden av sprutcylindern. För att se till att vätskan i nålen är faktiskt sackaros och inte vatten från tvätt nålen, linda mikrometer framåt 1-2 ul innan experimentet.
- Sackaros Delivery System
- Sackaros Presentations
- Håll nålspetsen approximativt 2 cm från biet medan lukt presenteras. Använd kanten på träningsarenan för att förhindraskaka sprutan som rörelsen kan distrahera biet. Bli inte nålen för nära i väntan på matningssignalen, eftersom det också för tidigt förskjuta bee uppmärksamhet från doft till sackaros.
- Så snart som matningssignalen ljuder, lätt på antennerna tills biet förlänger sin snabel, mata sedan biet. Detta bör kräva endast en mycket lätt beröring eller två till antennerna.
- Använd en belöning mängd mellan 0,2 och 0,8 | il. Biet bör enkelt konsumera hela droppen inom den tid som avsatts för obetingat stimulus (~ 1-2 sek). Använd inte "efter behag" matning från en stor droppe som biet lever på några sekunder, men kan inte helt konsumera.
- Se upp för sackaros bygga upp på antennen, vilket kommer att minska bee svar på efterföljande presentationer av belöningen. Ändra utfodring förfarandet om detta inträffar.
- För att säkerställa korrekt ihopkoppling av luktcue och sackaros belöning, se till att presentera droppen sackaros lösning på biet så snart som möjligt efter tonen.
OBS: Timing mellan uppkomsten av CS (lukt) och US (sackaros) är kritisk. Helst ska lukt presentation och sackaros presentation kort lappar. Om mer än ett par sekunder mellan slutet av CS och leverans av USA kommer konditione prestanda försämras.
- Metod 1
4. Testning
- Efter konditionering använda oarmerade prov, för att bedöma hur väl bina lärt sig och / eller minns rade föreningen.
OBS: Se diskussionen för en detaljerad förklaring om vikten av att analysera binas svar på oarmerade prov, utöver binas prestationer i försöken konditionering och en förklaring av syftet med antal testförsök och test lukter. - Konsolidering Tid
- Efterkonditionering, antingen administrera ett omedelbart prov rättegång eller låta bina att vila igenom en konsolideringsperiod.
NOTERA: Längden av konsolideringsperiod, tidsintervallet mellan konditionering och provning, kommer att bero på målet med experimentet. Om syftet är att undersöka inlärningsskillnader eller korttidsminne, kan binas resultat på prov, utvärderas omedelbart efter eller flera timmar efter konditionering. Om försöket innebär att undersöka långtidsminne, bör prov, ges minst 24 timmar efter slutet av konditione. - Om testförsök är mer än 24 timmar efter konditionering, mata bina till mättnad med 0,5 M sackaros efter konditionering och minst en gång per dag efteråt fram till 12-24 timmar innan testförsök.
- För att se till att bina har nått mättnadskänsla, mata var och en av dem flera olika tillfällen tills de inte längre förlänga sina snabel som svar på att röra sin antenne med sackaros. De kan konsumera så mycket som 40 l för att nå mättnad.
- Håll bina i en fuktig behållare för att förhindra att de tork och dör under konsolideringsperioden.
- Efterkonditionering, antingen administrera ett omedelbart prov rättegång eller låta bina att vila igenom en konsolideringsperiod.
- Test Trials
- Använd endast nyligen förberedda lukt patroner för testning.
OBS: Patronerna används för förvärvet kan differentiellt uttömda, så testet stimulans kommer inte att vara likartad i studierna, lukter och enskilda bin och därmed väsentligt kan påverka konsistens och robustheten i resultaten. - Under testning bibehålla samma inter-försöksintervallet och andra parametrar som används i konditioneringsfasen av försöket.
- Inte presentera obetingat stimulus under tekniska prov, eftersom närvaron av en belöning kommer att förändra binas svar på konditionerad stimulus, potentiellt maskering mer subtila effekter av den konditione protokoll eller en behandling.
- Spela in videoklipp i alla of test prövningar för att kunna senare mäta flera aspekter av binas svar på lukten (s).
- Använd endast nyligen förberedda lukt patroner för testning.
5. Inspelning binas svar
- Binary (närvaro / frånvaro) Målgörare av PER
- Använd ett binärt poängsystem av PER under rättegångar konditione och under testförsök. Betyg svar som antingen positivt eller negativt; detta är tillfredsställande för många typer av analyser med stickprovsstorlek på 20-40 bin per behandlingsgrupp. Den exakta topologi av svaren kan vara komplexa 22. Det är viktigt att upprätta en lätt att se och göra mål kriterium för ett positivt svar.
- Betyg ett bi svar som positiv (+) när biet framför sina snabel utanför linjen görs genom att ansluta tips av de öppnade mandibles. Bara ge ett positivt svar när biet förlänger sitt snabel efter lukt debut men före lukt offset.
- Betyg ett bi svar som negativt (-) när det inte finns någon eXTension av snabel under rättegången eller om snabel förlängs efter förskjutningen av luktämnen.
- Undvik att försöka göra mål partiella svar. För att göra finare distinktioner i binas beteende, använda videoanalysteknik som beskrivs nedan.
- Använd ett binärt poängsystem av PER under rättegångar konditione och under testförsök. Betyg svar som antingen positivt eller negativt; detta är tillfredsställande för många typer av analyser med stickprovsstorlek på 20-40 bin per behandlingsgrupp. Den exakta topologi av svaren kan vara komplexa 22. Det är viktigt att upprätta en lätt att se och göra mål kriterium för ett positivt svar.
- Video Analys av extra per Mått (film 1)
- Samla in ytterligare information från beteendetester genom att analysera videor från en bee svar till en lukt.
OBS: Dessa mätningar kan också ge en högre tidsupplösning för granskning av binas svar på lukter, speciellt när det inte finns någon skillnad i närvaro / frånvaro poängsättning av PER mellan behandlingsgrupperna. - Inspelning av filmer
- Använd alltid oarmerade prov eller utdöende prövningar för videoinspelningar. Närvaron av belöning kommer att förändra binas svar på lukt, modifiering av varaktigheten av snabel förlängning.
- Ställ en videokamera på ett stativ ovanför träningsarenan och fokusera kameran på framsidan av binas huvud, så antennerna och snabel är i skarpt fokus.
- Placera små LED-ljus, vilket indikerar lukt stimulans presentation, i ett område bakom biet som syns i videon för att kunna använda det för att identifiera lukt tillslag och hävning under analysen.
- Börja spela in 20 sekunder innan lukt debut och fortsätta inspelningen i minst 20 sekunder efter lukt offset innan störa biet.
- Video Analysis
- Ladda upp videoklipp till videoredigeringsprogram, t.ex. iMovie eller Final Cut Pro, med möjlighet att mäta tidsintervall mellan specifika bildrutor i videon.
- Analysera binas svar på lukt under en diskret tidsperiod som börjar vid början av det lukt stimulus (t.ex., 10 eller 20 sek).
- Använd följande gemensamma mätningar för att utvärdera PER:
- Mätvaraktighet snabel förlängning, vilken är den totala tid som det snabelliknande organet sträcker sig bortom underkäken till käke linje (beskriven ovan).
OBS: Ett bi kan skjuta ut och dra sina snabel flera gånger under 10-20 sek tid. Mät varje snabel förlängning för sig, och beräkna den totala tiden. Analysera antalet och varaktigheten för varje enskild snabel förlängning kan också ge värdefull information. - Mät latens för snabel förlängning, vilket är den tid mellan lukt debut, när LED lampan tänds och den första snabel förlängning.
- Räkna och tid Glossal förlängningar i förhållande till uppkomsten av luktämnen, den första förlängningen eller andra parametrar tids.
- Spåra antennal rörelser 23, som även är karaktäristiska luktorienterade förändringar.
OBS: I Film 1, de antennal rörelser har spårats med video spårningsprogram för att illustrera förändringen i antennal rörelser in svar på ett lukt stimulans.
- Mätvaraktighet snabel förlängning, vilken är den totala tid som det snabelliknande organet sträcker sig bortom underkäken till käke linje (beskriven ovan).
- Samla in ytterligare information från beteendetester genom att analysera videor från en bee svar till en lukt.
Representative Results
Vi presenterar två exempel på användning av PER protokoll som beskrivs ovan. Det första exemplet görs användning av Metod 2 för att studera hur honungsbin uppfattar olika lukter som en funktion av den molekylära likhet med lukt användas som CS 5,24,25. Det andra är ett exempel på användning av Metod 1 och några av de försiktighetsåtgärder som måste vidtas när du börjar använda PER experiment konditione i forskningslaboratorium.
Studier som denna har använts för att beskriva lukt "perceptuell rymden" av honungsbin och nattfjärilar i samband med Bioimaging 13 eller elektrofysiologiska analyser 26. Honungsbin (n = 20) konditionerades att associera luktämnen dekanal med sackaros förstärkning över 12 framåtparningskonditione försök (Figur 3A). Ungefär 10% av honungsbin svarade "spontant" på första försöket, vilket är normalt. Efter att andelen som responded öka under de närmaste prövningar förrän 100% av honungsbin svarade på femte försöket och varje efterföljande rättegång. Flera studier har visat att denna ökning av svaret är specifik för den framåthoppar villkoret (figur 1) i förhållande till flera viktiga kontrollförfaranden 3. Efter förvärvsfasen, fick varje honungsbiet utsatts för en serie oarmerade tekniska prov (Figur 3B), som innebar exponering för lukt CS och flera andra odörer som systematiskt skilde från CS i molekylära strukturer. Honungsbin reagerade starkast till CS. Deras svar på de andra odörer sjönk som en funktion av de systematiska förändringar i strukturen, med lägst svar på odörer minst som CS.
I figur 4, resultaten från en nyligen workshop där eleverna lärt sig, för första gången, hur man skick honungsbin som använder metod 1 illustreras. Studenter granar t rade honungsbin av framåthoppar methycyclohexanone (MCH) eller oktanol (oktober) med sackaros förstärkning (Figur 4A). Procent svar var lägre på första försöket och ökade på efterföljande prövningar, vilket tyder på att bina lärt lukt sackaros föreningen. Det fanns skillnader i den grad att bina lärt den betingad association mellan olika grupper av studenter. Enligt vår erfarenhet kan sådana skillnader bero på lukt som användes som CS, de vaga inslag i metoden (metod 1), eller till träningsnivån praktiker. I det tredje fallet, blir prestanda snabbt mer i linje med de praktiker "ökad erfarenhet. Efter konditionerades varje honungsbi testas två gånger med varje doft. I grupper om honungsbin som hade rade med framåt parning av oktober eller MCH, var svaret som väntat starkast till rade lukten (Figur 4B).
ent "> Den andra gruppen av honungsbin som upplevt fram pairing till oktober konditionerades parallellt med en annan grupp där lukten oktober var bakåt parat med sackaros. Bakåthoppar är en av flera typer av kontrollförfaranden för att visa att ökningen av svar är specifika för vidarebefordra parning och inte på grund av en annan process, till exempel icke-specifik upphetsning från allergi. För bakåtihopkopplingen av sackaros USA och lukt CS presenteras i omvänd ordning för att det som visas i figur 1. Förvärvs data från bakåthoppar är visas inte på grund av att CR inte kan görs med tanke på presentationen av lukt CS efter presentationen av sackaros. Som skulle förutsägas för associativ konditionering, var svarsnivåer till oktober högre i den främre parade Gruppen jämfört med bakåt gruppen (Figur 4C).7fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Diagram för experimentell design för konditione använder framåtihopkoppling. Se tabell 1 för definitioner av de termer som används i denna figur. (A) CS (lukt) föregår och överlappar med USA (sackaros / vattenlösning). Förhållandet mellan CS och USA visat är optimal för konditione honungsbin och malar. Men det optimala ISI kan bero på konditione protokoll och djurarter 1. (B) Uppdelning och relativa tidpunkten för CS, CR, USA, och UR. CR som sker antingen före amerikanska presentation eller under oarmerade "test" försök är den beroende mått för försöksprotokoll.
Figur 2 Lukt utarmning med återanvändning av patronerna. För dessa uppgifter, lukt patroner varinstallation med hexanol som beskrivs i texten. Hexanol används ofta som ett CS i PER studier; dock kommer den faktiska hastigheten för utarmning bero på lukt och vätska. Patroner användes sedan en gång för 4 sekunder varje minut över åtta studier (förutsatt 5 honungsbin / rättegång i ett standardexperiment som skulle motsvara 40 användningar). Späd i det angivna lösningsmedlet, som var relativt standard för PER experiment, var 2,0 MSEK (A) och 0,2 (B). (A, B) Lukten samplades efter den första och åttonde prövningar genom adsorption på en fast fas mikroextraktion (SPME) fiber som sedan desorberades på en gaskromatograf. De relativa områden under topparna var högre efter den första rättegången i förhållande till den åttonde för både lösningsmedel och för båda koncentrationer (Wilcoxon matchade par signed rank test p <0,05 [*] eller högre), vilket visar att mindre lukt levererades från patronen efter patronen hade använts ett antal gånger. (C, D) Samma uppgifter som visar just den åttonde tr IAL med y-axeln expanderas. Det visar att utarmning var något större för hexan relativt mineralolja, men bara på den lägre koncentrationen.
Figur 3 Förvärv och test med dekanal som CS och metod 2 konditione. (A) Försöks-för-prov svar (CR) över 12 framåt hopkoppling försök (Figur 1). Uppgifterna kommer från n = 20 honungsbin rade i fyra grupper om fem honungsbin vardera. ISI var 3 sekunder och ITI var 6 min. (B) Oarmerade tester med lukter som skiljer sig från dekanal genom kolkedjelängd och / eller position karbonylkolet. De lukter presenterades i en randomiserad serie över de fyra grupperna och varvades med förstärkta försök med dekanal (var 2-3 försök) för att undvika utrotning av CR.
Figur 4. Data från en workshop under vilken doktorander utbildades att betinga honungsbin använder PER metod 1. (A) Förvärvs data från tre grupper av honungsbin rade att oktanol (n = 23 och 15 för Gps 1 respektive 2) och metylcyklohexanon (n = 10) (B) CR under oarmerade tester med både lukt. fyra försök som presenteras i slumpmässig serie över grupper. (C) Oarmerade tester med båda lukter i två grupper av honungsbin, en framåt parade (GP 1, n = 23) och en bakåt parade (n = 25).
| Term (förkortning) | Definition | Relevant Exempel |
| Betingad stimulus (CS) | Ettstimulans som framkallar lite eller inget svar först och signalerar USA | LUKT |
| Betingad respons (CR) en | Svaret på CS efter association med USA | SNABEL Extension |
| Obetingat stimulus (US) | En biologiskt signifikant stimulus som framkallar ett svar | SACKAROS / vattenlösning |
| Obetingade Response (UR) en | Svaret på den amerikanska | SNABEL Extension |
| Inter-Stimulus Intervall (ISI) | Tiden mellan starten av KS och uppkomsten av den amerikanska | LUKT till sackaros intervall |
| Inter-Trial intervall (ITI) | Tiden mellan successiva CS-amerikanska ihopkopplingar för ett enskilt djur | LUKT (trial n) till LUKT (rättegång n + 1) intervall |
Tabell 1 Imtigt Terminologi. Se Figur 1 för en illustration av dessa termer. a För PER konditione CR och UR är desamma, även för andra typer av föreningar och reflexer CR och UR kan skilja sig.
Film 1. En video av en honungsbiet utför PER efter det hade betingats att svara på en lukt. Notera PER respons bee ca 1,5 sek efter lukt debut. Tracking programvara kartlagt antennal rörelser som svar på presentationen av lukten. Linjerna ritas i det övre högra hörnet av videon skildrar den verkliga antennal rörelser. De två graferna längst ner på skärmen visar antennal rörelser på X (vänster) och Y (höger) koordinater. De vertikala linjerna i diagrammet som visas i videon visar, från vänster till höger, ljus PÅ, PER, tända av och snabel indragning.
Discussion
Detta protokoll presenterades två tillförlitliga metoder för konditione använder PER proceduren. Dessa är två av flera metoder som framgångsrikt används 27, 21. Vi använder Metod 2 för alla experimentella studier med PER eftersom det är konsekvent tillförlitlig, även över olika praktiker.
Samma grundläggande förfarande har anpassats till många olika typer av studier med honungsbin, inbegripet användning av olika konditione stimuli och olika beteende reflexer. Det har också varit knuten till undersökningar av den genetiska grunden för skillnader i att lära 28,29, de fysiologiska korrelat till lukt perception och minne i hjärnan 13,14,30 och modulerande och molekylärgenetiska baser beteende 15,16,31 . På grund av den avancerade kunskaper om den ekologiska betydelsen av luktsinnet lärande för honungsbin, som inleddes med de första studierna av Karl von Frisch över 100 år sedan
Den grundläggande proceduren är kraftfull i att den kan tillämpas för att undersöka problem i andra arter också. Två moth arter, Manduca sexta och Spodoptera littoralis, har använts i PER studier för att undersöka den neurala grunden för luktidentifiering och varje arternas luktinlärningsförmåga 32,33. PER experiment med fruktflugor har gett många insikter i de molekylära signaleringskaskader som deltar i chemosensation och lärande 34. Och PER har nyligen använts för att studera tillvänjning i loppan (Rhodnius prolixus) 35, en viktig smittbärare.
I allmänhet är det förfarande väl vid förändringar i metoden; användningen av different metoder kommer sannolikt producera samma relativa skillnaden mellan behandlingsgrupperna. Trots det relativt enkelt förfarande, kan flera problem ibland hindrar honungsbin från att lära av lukt sackaros föreningen. Följande ämnen är möjliga ändringar i protokollet och några av de vanligaste problemen som kan uppstå under PER conditioning.
Överväganden om antal och typ av försök i Conditioning protokollet
Varje inlärningsprotokoll kräver exponering av bin till ett antal försök i förvärvsfasen. Detta antal beror till stor del på svårigheten i uppgiften. Honungsbin kan lära sig en enkel uppgift efter en enda rättegång, men de behöver minst en tre försök att inducera långtidsminnet bildning. Som väntat kommer honungsbin kräver betydligt fler försök att på lämpligt sätt lära sig en svår uppgift. Generellt finns det ett maximalt antal försök efter som bina inte längre väsentligt förbättrair prestanda. Denna maximala beror på den specifika uppgiften, de typer lukt och koncentrationer, och sackaroskoncentrationen.
Vid användning av mer än en typ av försök med olika dofter, presentera de olika försöks i en pseudoslumpsekvens för att hålla bina från att memorera en enkel sekvens av lukt presentationer istället för att lära sig skillnaderna mellan lukt 36. I dessa pseudoslumpsekvenser, måste det finnas lika många försök för var och en av lukttyper. Också, att sannolikheten för att ett prov av en lukt typ föregås av och följt av samma lukt, eller någon av de andra lukter, måste vara lika för alla lukter. För två lukter - A och B - använd följande sekvens: ABBABAAB. Över åtta försök varje lukt presenteras fyra gånger. Sammanfoga identiska sekvenser för att nå det önskade antalet försök för varje doft.
Oavsett den experimentella designen, finns det några parametrar som måste förblikonstant för att optimera inlärning. Överlappningen mellan CS och USA är avgörande för effektiv konditionering. Den inter rättegången intervall (figur 1, tabell 1) måste vara konstant och optimeras eftersom oegentligheter eller en för kort eller för lång inter rättegång intervall kan avsevärt påverka effektiviteten av konditione protokoll 1.
Överväganden om vikten och design av Behavioral Testing Trials
Svaren som registrerats under förvärvsfasen "av ett experiment, då CS och US presenteras tillsammans, kan vara användbart. Men se upp så att de luktpresentationsförhållanden kan skilja sig från en typ av försök till en annan. Under förstärkta studier är lukten, följt av sackaros presenteras i samband med en visuell stimulus (förflyttning av anordningen för att leverera den sackaros droppen) som kan påverka bee svar. Och bina har bara tre sekunders för att visa ett svar (fyra sekunder av luktstimulering minus en sekund lappar sackaros presentation, figur 1). Om försöket innebär bina lär sig att skilja två lukter (t.ex. förstärkta och oförstärkta), den oförstärkta lukt presenteras på alternativa prövningar sker utan den visuella stimulans av belönings presentation och bina har hela fyra sekunder att reagera. Därför svaren på de två lukter är inte helt jämförbara vid förvärvet. Med någon konditioneprotokoll, inte enbart förlita sig på förvärvs kurvorna 1. För att bättre ta reda på vilka bin har lärt, införa en rad oarmerade tekniska prov, då varken lukt förstärks, vilket gör att testning av alla stimuli sker under identiska förhållanden.
Beroende på det specifika syftet med försöket, kan testning bestå av enskilda test prövningar av rade lukt eller en serie försök med rade odeller eller en kombination av de konditionerade och nya lukter. En enda test test av rade lukten ger en enkel analys av om binas minns rade lukt. Dock kan svaret på den första test rättegången spegla bina motivation nivå samt deras återkallande av rade lukt. En serie testförsök, antingen en serie utdöende prövningar av rade lukt eller en serie enkla tester av konditionerat och en eller flera nya lukter, kan också användas för att bedöma minnet. Serien av släckförsök kan bedöma hur starkt binas minns rade föreningen. Ju starkare recall det större antalet försök som behövs för att släcka betingad respons. En serie enkla tester av betingade och nya lukter kan också bedöma specificiteten binas minne av rade lukt.
Det är också viktigt att konditionera och testa både kontroll och behandlade grupper vid samma tidpunkter. Comparing prestanda bin strax efter konditionering för bin som innehas för längre tidsperioder är problematisk på grund av exponering för sackaros USA genom att mata bina till mättnad. Till exempel kan en minskning i prestanda efter långa mellanrum bero på minnes röta eller det kan bero på förändringar i motiverande tillstånd och / eller lära inducerade av oarmerad exponering mot USA, vilket gör resultaten tvetydiga. Därför bör prestanda hos ett behandlingsgrupp alltid bedömas i förhållande till en kontrollgrupp konditioneras och testas på samma tidpunkter.
Lukt Koncentration och integritet
Det finns flera sätt på vilka koncentrationen och integriteten av lukt (CS) kan äventyras. Den mest förekommande problemet med lukt leverans är utarmningen av lukt patroner från överanvändning (Figur 2). Byta bläckpatroner 10-12 användningar (var 2 eller 3 försök med grupper om fem honungsbin) för att undvika denna fallgrop. Det är också viktigt att användafärska patroner för tekniska prov, eftersom begagnade patroner kan differentiellt utarmat och därmed nuvarande ojämlika luktstimuli. Ett annat vanligt problem är luktpatron kontamination grund av att använda kassetten för mer än en doft utan att helt rengöra den. En smutsig eller kontaminerad luft flöde kan också oavsiktligt införa ytterligare lukt stimulans (kolfilter kan förhindra bakgrundskontaminering). Detta är särskilt problematiskt när koppling PER konditionering med mätningar av fysiologiska reaktioner på odören. Läckande lukt patroner utgör ett problem eftersom honungsbin exponeras för lukt innan rättegången inleds, vilket minskar framträdande av lukt stimulans. Löst sittande på lufttillförseln för lukt leverans kan resultera i liten eller ingen lukt leverans när ventilen öppnar, på konstgjord väg minska binas svar på den avsedda lukt.
Sackaros Solution och obetingat stimulus (Belöning)
Den enmount, koncentration och integritet sackaroslösningen som USA är avgörande för framgången av experimentet. Conditioning är en funktion av mängden och koncentrationen av sackaros-vattenlösning som används som USA 37. De mikrometer sprutor som används i Metod 2 möjliggör mycket exakt (ner till 0,2 pl) kontroll över amerikanska leverans, och vi rekommenderar att du använder dem för båda beskrivna metoderna. Användning av tandpetare (Metod 1) är tillräckligt för omständigheter som de dyra sprutorna inte kan användas, till exempel, i utbildning stora grupper av studenter, arbete på fältet, eller med lägre budgetar. Noggrann genomförande av metod 1 är bra så länge timing upprätthålls med regelbundet byte av tandpetare för att undvika ackumulering av sackaros (och koncentrationen levererade). Men med hjälp av tandpetare är det svårare att noggrant kontrollera och uppskatta mängden och omfattningen av USA levererade, vilket är viktigt för studier konditione 1. Koncentrationen av sackaros som behövs för atten tillräcklig belöning för att hålla bina motiverade att lära sig rade föreningen kan bero på svårigheten i uppgiften och binas inre tillstånd eller tid på året. De svårare uppgifter kräver en högre sackaros lösning för bin "för att framgångsrikt lära sig uppgiften. Mögel kan uppbyggd i sackaroslösningar även vid 5 ° C, vilket kommer att äventyra integriteten i den lösning, som påverkar binas hälsa och uppfattning av belöningen under experimentet. Det är bäst att ersätta lösningen med några dagars mellanrum.
Precision, Timing, och konsekvens av CS och US Delivery
Den mest kritiska frågan om ett korrekt genomförande av ett PER förfarande, eller för den delen någon konditioneförfarande innebär precision, timing och konsekvens i CS och US leverans (Figur 1). Utredarna som är nya förfarandet är ofta oprecisa om leverans av en eller båda stimuli. ISI: ssom misslyckas med att tillåta överlappning CS och US resultera i dålig konditionering prestanda. PLC automatiserar en hörbar signal för försöksledaren att leverera sackaros 3 sek efter debuten av lukt leverans. Utredarna ska hålla sackaros / vattendroppe nära biet för snabb leverans efter signalen. Dessa procedurer hjälper medbringa en konsekvent ISI. Placera ett stoppur vid konditione arenan möjliggör lämplig tidpunkt placering av rättegången samt övervakning binas tid i arenan både före och efter leverans av stimuli. På så sätt ITI ter kan vara relativt konsekvent och hela förfarandet kan köras vid en kontrollerad takt. ITI: s som är för korta, till exempel mindre än 1 min, eller för lång kan leda till dålig konditionering prestanda 1.
Säsongs, miljömässiga och kontextuell Effekter på Honey Bee Performance
Honungsbin prestationer kan påverkas avsevärt av omgivningenbåde före och under konditioneringen. Ofta kommer de variationer i temperatur och födotillgång som kommer med årstidernas växlingar förändra bina motivation att lära. När blommorna blommar, för att bina motivation lära rade föreningen i labbet minskar 38. När kolonin är stressad - från extrema temperaturer, brist på mat, eller sjukdomsrelaterad stress - binas kommer att visa en minskning av sitt lärande prestanda inuti. Honungsbin förvaras i en flygrummet kan lära bra ett tag, men även där påfrestningen av sjukdomen och åldrande försämra deras lärande prestanda över tiden. Sammanhanget under konditione kan också minska binas prestanda. Eventuella främmande lukter, rörelser och andra stimuli kan distrahera biet från experimentella stimuli. För att undvika detta problem, hålla en någorlunda konsekvent, förenklad visuell kontext.
Genotyp och erfarenhet Påverkar PER Performance
<p class = "jove_content"> Honey bee arbetare kan skilja sig avsevärt i prestanda på någon konditioneförfarande på grund av uppgiften specialisering, genotyp, eller andra miljöfaktorer 20. Därför är det viktigt att standardisera så mycket som möjligt, de typer av djur som används i ett experiment för att minska interindividuella variationer. I en koloni som leds av en öppen parad drottning, vilket betyder att hon parad med många olika drönare, kommer arbetarna skiljer sig i faderns genotyp. Genetisk bakgrund kan leda till dramatiska skillnader i sensorisk känslighet 39 och inlärningsresultaten 29. Använda kolonier ledda av drottningar instrumentinseminerade med sperma från enstaka drönare 28 reducerar denna interindividuella variationer.De protokoll som beskrivs ovan, finns en metod för att samla honung bee arbetare från boet entrén. Emellertid är dessa honungsbin skiljer sig från varandra med avseende på ålder eller beteende uppgift. De kan vara unga (inexperienced) eller äldre (mer erfarna) hackar. De kan vara unga honungsbin gör sin första orienteringsflyg. Eller de kan vara vakt bin. För att minska variabiliteten, markera bin med ett snabbtorkande lackfärg eller märkning taggar antingen som de dyker upp som vuxna (kontrollera för ålder) och / eller när de börjar födosök (kontrollera för erfarenhet). Sedan ett par dagar senare, samlar de markerade bina för konditione. Arbetstagare som är engagerade i vårdbeteende kan hämtas från ramarna i kupan. Sjuksköterskor kan fastställas när de sätter sina huvuden i en barnaskara cell att föda och ta hand om larven inuti.
Använda Virgin Queens eller Drones för PER Conditioning
Förutom arbetar honungsbin kan jungfruhonungsbiet drottningar och drönare lätt rade i en PER förfarande för studier som syftar till att utveckla genetiska linjer av honungsbin som skiljer sig i inlärningsresultaten 28. Virgin drottningar ska samlas snart efter they fram ur förpuppning och placeras direkt i hållande selar utan bedövning. Unga, omogna drönare som samlats in från yngel kammen inuti kolonin är i allmänhet inte är motiverade att lära sig. Efter att de har börjat parning flyg, drönare lär lätt PER uppgifter 28. De ska samlas in när de återvänder från en parning flygning och underhålls över natten i en liten bur i en koloni som används för uppfödning av drottningar. Försök inte att utnyttja dem dagen innan konditionering; att de inte överlever väl i selar över natten. Ett par timmar före konditione drönarna kan samlas in från burarna och placeras i de återhållande selar utan bedövning.
Slutsatser
Detta PER förfarande, i vägen för metoder, utgör en utgångspunkt för utformningen PER experiment. De flesta PER protokoll kräver att det förfarande som beskrivs ändras på något sätt för att genomföra de konkreta målen för försöket och accommodate flera behandlingsgrupper. Det är lätt att genomföra. Dock kräver korrekt genomförande uppmärksamhet på detaljer och praktik. En gång bemästrat det kan vara ett kraftfullt sätt för att lägga till som ett forskningsverktyg för flera grundläggande och tillämpade forskningsprogram med olika insektsarter.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av medel från NIH NCRR (R01 RR014166 till BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS co-PI), US Department of Agriculture (J Trumble PI, BH Smith co-PI) och Arizona State University. Finansiering för verkstaden att utbilda studenter (data i Figur 4) lämnades av Science Foundation i Chile.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Odorant Compounds (for example) | |||
| 1-hexanol | Sigma-Aldrich | 471402-100ML | For additional examples |
| 2-octanone | Sigma-Aldrich | W280208-800G-K | of odorants, see any of |
| heptanol | Sigma-Aldrich | 51778-5ML | the papers on olfactory |
| gerianol | Sigma-Aldrich | 163333-25G | processing from the |
| nonanal | Sigma-Aldrich | 131210-100ML | Smith lab. |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-1L | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | Make sure it’s odorless. |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Scintillation vials | Sigma-Aldrich | Z190535-1PAK | Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials. |
| Bee harness | Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing. | ||
| Duct tape | |||
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956-1PAK | |
| Wash bottles | Sigma-Aldrich | Z560847-3EA | For the 70% ethanol. |
| Dryer tubing | |||
| FOR METHOD 1 ONLY | |||
| 20 ml disposable plastic syringes | Cole-Parmer | WU-07945-18 | |
| 15 mm filter paper circles | Sigma-Aldrich | Z274844-1PAK | |
| Pushpins | |||
| Toothpicks | |||
| FOR METHOD 2 ONLY | |||
| Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml | Cole-Parmer | EW-07840-00 | |
| Gilmont micrometer syringe tip | Cole-Parmer | EW-07841-00 | |
| 26 G 3/8” Leur hub hypodermic needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
| 1 cc tuberculin syringes (plastic/glass) | Sigma-Aldrich | Z181641-1EA OR Z192090-200EA | Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses. |
| Small rubber/silicone restrictors | Cole-Parmer | EW-95702-02 | Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| 75 x 100 mm filter paper | Sigma-Aldrich | Z695106-500EA | |
| Direct Logic 05 Programmable Logic Controller |  Koyo Electronics Industries Co, Ltd |
||
| 1 mm, 4 mm, & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing. |
| Polypropylene connectors & leur fittings | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes. |
| 65 mm Correlated Flowmeter | Cole-Parmer | EW-03216-08 | Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve. |
| OR | |||
| Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump | Aquacave |
AE-TETRA-300 | |
| LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E" | The Lee Company |
LFAA1200118H | Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW |
| PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer | RadioShack |
273-074 | |
References
- Rescorla, R. A. Behavioral studies of Pavlovian conditioning. Annu Rev Neurosci. 11, 329-352 (1988).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). Journal of Comparative Psychology. 97, 107-119 (1983).
- Giurfa, M., Sandoz, J. C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn Mem. 19, 54-66 (2012).
- Smith, B. H., Wright, G. A., Daly, K. S. The Biology of Floral Scents. Dudareva, N., Pichersky, E. , CRC Press. 263-295 (2006).
- Menzel, R., Giurfa, M. Dimensions of cognition in an insect, the honeybee. Behav Cogn Neurosci Rev. 5, 24-40 (2006).
- Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene, Apis mellifera. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Zoology. 13, 458-464 (1957).
- Menzel, R. The honeybee as a model for understanding the basis of cognition. Nat Rev Neurosci. 13, 758-768 (2012).
- Menzel, R. Neurobiology of comparative cognition. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum. 237-292 (1990).
- Hammer, M., Menzel, R. Learning and memory in the honeybee. Journal of Neuroscience. 15, 1617-1630 (1995).
- Strube-Bloss, M. F., Nawrot, M. P., Menzel, R. Mushroom body output neurons encode odor-reward associations. J Neurosci. 31, 3129-3140 (2011).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body. Front Syst Neurosci. 2, (2008).
- Fernandez, P. C., Locatelli, F. F., Person-Rennell, N., Deleo, G., Smith, B. H. Associative conditioning tunes transient dynamics of early olfactory processing. J Neurosci. 29, 10191-10202 (2009).
- Locatelli, F. F., et al. Nonassociative plasticity alters competitive interactions among mixture components in early olfactory processing. Eur J Neurosci. 37, 63-79 (2013).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23, 5370-5380 (2003).
- Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
- Hladun, K. R., Smith, B. H., Mustard, J. A., Morton, R. R., Trumble, J. T. Selenium toxicity to honey bee (Apis mellifera L.) pollinators: effects on behaviors and survival. PLoS One. 7, e34137 (2012).
- Wiegmann, D. D., Smith, B. H. International Journal of Comparative Psychology. 22, 141-152 (2009).
- Drezner-Levy, T., Shafir, S. Parameters of variable reward distributions that affect risk sensitivity of honey bees. J Exp Biol. 210, 269-277 (2007).
- Drezner-Levy, T., Smith, B. H., Shafir, S. The effect of foraging specialization on various learning tasks in the honey bee (Apis mellifera). Behavioral Ecology & Sociobiology. 64, 135-148 (2009).
- Shafir, S., Menda, G., Smith, B. H. Caste-specific differences in risk sensitivity in honeybees, Apis mellifera. Animal Behaviour. 69, 859-868 (2005).
- Smith, B. H., Menzel, R. An analysis of variability in the feeding motor program of the honey bee; the role of learning in releasing a modal action pattern. Ethology. 82, 68-81 (1989).
- Erber, J., Pribbenow, B., Kisch, J., Faensen, D. Operant conditioning of antennal muscle activity in the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Comparative Physiology A-Sensory Neural & Behavioral Physiology. 186, 557-565 (2000).
- Smith, B. H., Menzel, R. The use of electromyogram recordings to quantify odorant discrimination in the honey bee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 35, 369-375 (1989).
- Stopfer, M., Bhagavan, S., Smith, B. H., Laurent, G. Impaired odour discrimination on desynchronization of odour-encoding neural assemblies. Nature. 390, 70-74 (1997).
- Daly, K. C., Christensen, T. A., Lei, H., Smith, B. H., Hildebrand, J. G. Learning modulates the ensemble representations for odors in primary olfactory networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10476-10481 (2004).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J Neurosci Methods. 211, 159-167 (2012).
- Chandra, S. B., Hosler, J. S., Smith, B. H. Heritable variation for latent inhibition and its correlation with reversal learning in honeybees (Apis mellifera). Journal of Comparative Psychology. 114, 86-97 (2000).
- Chandra, S. B., Hunt, G. J., Cobey, S., Smith, B. H. Quantitative trait loci associated with reversal learning and latent inhibition in honeybees (Apis mellifera). Behavior Genetics. 31, 275-285 (2001).
- Hammer, M. The neural basis of associative reward learning in honeybees. Trends in Neurosciences. 20, 245-252 (1997).
- Frisch, K. The Dance Language and Orientation of Bees. , Harvard University Press. (1965).
- Daly, K. C., Smith, B. H. Associative olfactory learning in the moth Manduca sexta. J Exp Biol. 203, 2025-2038 (2000).
- Fan, R. J., Anderson, P., Hansson, B. Behavioural analysis of olfactory conditioning in the moth spodoptera littoralis (Boisd.) (Lepidoptera: noctuidae). J Exp Biol. 200. 23 (Pt 23), 2969-2976 (1997).
- Paranjpe, P., Rodrigues, V., VijayRaghavan, K., Ramaswami, M. Gustatory habituation in Drosophila relies on rutabaga (adenylate cyclase)-dependent plasticity of GABAergic inhibitory neurons. Learn Mem. 19, 627-635 (2012).
- Vinauger, C., Lallement, H., Lazzari, C. R. Learning and memory in Rhodnius prolixus: habituation and aversive operant conditioning of the proboscis extension response. J Exp Biol. 216, 892-900 (2013).
- Smith, B. H., Abramson, C. I., Tobin, T. R. Conditional withholding of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera) during discriminative punishment. Journal of Comparative Psychology. 105, 345-356 (1991).
- Smith, B. H. An analysis of blocking in odorant mixtures: an increase but not a decrease in intensity of reinforcement produces unblocking. Behav Neurosci. 111, 57-69 (1997).
- Gerber, B., et al. Honey bees transfer olfactory memories established during flower visits to a proboscis extension paradigm in the laboratory. Animal Behaviour. 52, 1079-1085 (1996).
- Rueppell, O., et al. The genetic architecture of sucrose responsiveness in the honeybee (Apis mellifera L). Genetics. 172, 243-251 (2006).
