Abstract
Insecten passen hun reacties op door prikkels ervaring associëren die stimuli met gebeurtenissen belangrijk voor de overleving (bijvoorbeeld voedsel, partners, bedreigingen). Er zijn verschillende gedrags-mechanismen waardoor een insect leert saillante verenigingen en ze aan bij deze gebeurtenissen. Het is belangrijk om deze gedragsproblemen plasticiteit voor programma's die gericht zijn naar het bijstaan van insecten die nuttig zijn voor de landbouw zijn te begrijpen. Dit inzicht kan ook oplossingen ontdekken biomedische landbouwmachines problemen die insecten die fungeren als ziekte vectoren en plagen. De Proboscis Extension Response (PER) conditionering protocol is ontwikkeld voor honingbijen (Apis mellifera) meer dan 50 jaar geleden om te bestuderen hoe zij zien en te leren over bloemen geuren, die de nectar en stuifmeel middelen een kolonie nodig om te overleven signaleren. De PER procedure biedt een robuuste en eenvoudig te dienst kader voor het bestuderen van verschillende ecologisch relevante mechanismen van gedrags-plasticiteit. Het is eenvoudig aan te passen voor gebruik met verschillende andere soorten insecten en andere gedrags-reflexen. Deze protocollen kunnen gemakkelijk worden gebruikt in combinatie met verschillende middelen voor het toezicht neurale activiteit in het centrale zenuwstelsel via elektrofysiologie of Bio-imaging of voor het manipuleren gerichte neuromodulatory pathways. Het is een robuuste test voor het snel opsporen van sub-letale effecten op het gedrag veroorzaakt door milieu-invloeden, toxines of pesticiden.
We zien hoe de per protocol is eenvoudig te implementeren met behulp van twee procedures. Een geschikt als laboratorium oefening voor studenten of snel testen van het effect van een experimentele behandeling. De andere biedt grondiger controle variabelen, die in studies van gedragsconditionering. We tonen hoe verschillende maatregelen voor de gedragsreactie variërend van binaire ja / nee meer continue variabele zoals latentie en duur van zuigorganen verlenging kan worden gebruikt om hypotheses te testens. En bespreken we een aantal valkuilen die onderzoekers vaak tegenkomen als ze gebruik maken van de procedure voor de eerste keer.
Introduction
Veel insecten leren over ecologisch relevante stimuli, en ze dan veranderen hun gedragsreacties op die prikkels om aan te passen aan nieuwe voorspellende relaties in hun omgeving. Verschillende mechanismen kan deze gedrags plasticiteit ten grondslag liggen (bijvoorbeeld nonassociative, associatief / Pavlov, en operante / instrumentaal 1). Deze soorten plasticiteit verschillen hoe de stimuli of gedrag geassocieerd met belangrijke gebeurtenissen, zoals het optreden van voedsel, een partner, of gevaar. Inzicht in deze vormen van plasticiteit is erg belangrijk voor fundamenteel onderzoek naar hoe het zenuwstelsel verandert om nieuwe herinneringen 2 coderen. Het is ook belangrijk voor het begrijpen van het adaptief gedrag van insecten die belangrijke dragers van de ziekte (bijvoorbeeld tseetseevlieg en muggen) en insecten die de landbouw belangrijk zijn, zijn, hetzij in de productie van gewassen (honingbijen) of als ongedierte.
Studeren gedragsmatige plasticiteit in een animal vereist een mate van experimentele controle over een aantal variabelen die niet haalbaar in het gebied 1. Het vereist de ontwikkeling van een robuust conditionering protocol dat kan worden ingezet onder meer gecontroleerde omstandigheden, maar die nog steeds het gedrag onder natuurlijke omstandigheden relevant. De honingbij (Apis mellifera) is een uitstekend model voor het maken van een protocol te ontwikkelen voor het uitvoeren van gecontroleerde onderzoek naar gedragsveranderingen plasticiteit 3,4. De Proboscis Extension Response (PER) in honing bijen is een natuurlijke gedrags reflex waarin de honingbij breidt zijn slurf in reactie op antennal stimulatie met een suikeroplossing. Tijdens normaal foerageergedrag, PER treedt op wanneer de honingbij vindt nectar in een bloem. Gelukkig zal bijen gemakkelijk vertonen deze eenvoudige en gemakkelijk kwantificeerbare gedrag in het laboratorium. Dit maakt het mogelijk om te bestuderen, in een gecontroleerde omgeving, de mechanismen die deze ecologisch relevante gedrag 5 beïnvloeden. PER can ook binnen een conditionering protocol gebruiken om stimulus perceptie en leren en geheugen onder verschillende behandelingsomstandigheden, die zijn ontworpen om de gedrags-en neurale mechanismen die ten grondslag liggen aan de plasticiteit 6 onthullen onderzoeken.
Sinds de eerste studies van Kuwabara 7, is PER conditioning op grote schaal gebruikt om nonassociative, associatieve en operante mechanismen die ten grondslag liggen aan gedrags plasticiteit in honingbijen 8 onthullen. Deze mechanismen zijn identiek aan die geopenbaard in studies van vrij vliegen honingbijen 9. In tegenstelling tot de studies van vrij vliegende bijen, kunnen PER conditioning protocollen worden gekoppeld met de elektrofysiologie 10,11 of levende cellen fluorescentie beeldvorming 12-14 van de hersenen. Bovendien PER protocollen zorgen voor experimentele manipulatie van zenuwbanen via farmacologische en moleculair genetische behandelingen om hypotheses over de rol van specifieke onderdelen van het netwerk, zoals neur testenomodulators 15,16. PER protocollen hebben ook een belangrijke manier om de subletale effecten van milieu-omstandigheden, alsmede toxines op de gezondheid en foerageergebied efficiëntie van honingbijen 17 te evalueren.
Deze procedure beschrijft twee geur levering methoden in parallel. Methode 1 is een versie van de geur en ongeconditioneerde stimulus (sucrose) levering die een goedkope en technisch eenvoudige werkwijze voor het presenteren van de geur en sucrose beloning verschaft. Deze methode is goed voor de basisopleiding en wanneer de automatisering niet mogelijk is. Het is een uitstekende manier om deze techniek om een klaslokaal of onderwijs laboratorium te introduceren. Tijdens het conditioneren experimenten met meer moeilijke taken en gekoppelde fysiologische conditie van geurwaarneming, leren of geheugen, is het zeer belangrijk om nauwkeurig en precies regelen de aanvang, duur levering timing van stimuli. Voor de meest betrouwbare stimulans levering, gebruik dan een middel van het automatiseren van de geur levering eennd een nauwkeurige methode van beloning levering. Methode 2 wendt geautomatiseerde geur levering en nauwkeuriger sucrose levering. Het is technisch geavanceerder en vereist meer voor de initiële setup dan methode 1, maar het verhoogt de consistentie van de timing en de hoeveelheid stimuli gebruikt voor het conditioneren en mogelijk moet worden gebruikt wanneer.
Protocol
1 Geur (geconditioneerde stimulus) Cartridge Setup
- Aan het begin van het experiment opstart meerdere geur cartridges voor alle verschillende geuren nodig om conditionering proeven.
- Gebruik een zuurkast voor geur verdunning en geur cartridge voorbereiding. Open nooit flessen geuren buiten die zuurkast, omdat de geur snel zal verspreid over het lab en in potentie de honingbijen om de geur te ontmaskeren voordat conditionering. Ook draag handschoenen tijdens het instellen van de geur cartridges en grondig wassen daarna om te voorkomen dat het blootstellen van de honingbijen aan geuren, terwijl ze te hanteren.
- Zorg ervoor dat elke geur cartridge is duidelijk gemarkeerd met een kleurcode van de geur die het eerst gebruikt. Gebruik nooit een geur cartridge (injectiespuit of plunjer) voor meer dan een geur, aangezien residuele geur op de patroon.
- Voorbereiding Geuren en Geur mengsels
- Verdunnen geuren in beide hexaan of minerale olie om de desired concentratie.
LET OP: Het veranderen van de concentratie van de geur of het presenteren van mengsels van twee of meer geurstoffen kunnen zorgen voor een onderzoek van bijkomende aspecten van de manier waarop bijen voelen geuren en leren de geconditioneerde vereniging. Geur mengsels kan zo simpel zijn als een 50:50 binair mengsel of zo complex als een aantal geuren die natuurlijke olfactorische stimuli na te bootsen. Het verminderen van de concentratie van de geur verhoogt ook de moeilijkheid van de taak.- Geuren verarmd met hergebruik van de patroon (figuur 2) worden. Om te voorkomen dat problemen van uitputting te maken genoeg patronen om te kunnen schakelen naar een nieuwe cartridge elke 10-12 gebruikt.
- Verdunnen geuren in beide hexaan of minerale olie om de desired concentratie.
- Voorbereiding Geur Cartridges
- Methode 1
- Voor deze werkwijze gebruikt 20 ml plastic spuiten met een 15 mm diameter cirkel filtreerpapier vastgemaakt aan het einde van de rubber zuiger geur cartridges.
- Verwijder de zuiger uit de spuit en gebruik een punaise voor het stuk filte hechtenr papier aan het einde van de plunjer.
- Gebruik een micropipet tot 10 ul van de geur te plaatsen op het filter papier, en plaats de zuiger in de spuit vat. Duw de zuiger om de 15 ml-markering op de spuit.
- Methode 2
- Voor deze werkwijze gebruikt 1 cc tuberculine glas of kunststof spuiten (of aangepaste pipetten soortgelijke omvang en vorm) met een strook filtreerpapier binnen en een rubber of silicone gasstroom volledig einde van de spuit vat voor de geur cartridges.
- Verwijder de zuiger uit een 1 cc tuberculine spuit vat. De spuit zal het lichaam van de geur cartridge.
- Verwijder de zwarte rubberen tip van de zuiger en knip het gesloten uiteinde van de rubber tip.
OPMERKING: Deze rubberen ring zal fungeren als een restrictor om zuigkracht te verminderen van de luchtstroom in de arena, die voortijdig zal trekken geur uit de cassette en over de terughoudende honingbij. Afwisselend, siliconen buis (4,8 mm outer diameter) gesneden in 5 mm secties werken als restrictor.
- Spoel de binnenzijde van de spuit en de rubber / silicone restrictor met 70% ethanol (veel van de restgeur van eerder gebruik verwijderen) en laat ze drogen.
- Plaats een 0,2 x 4 cm strook filtreerpapier in de brede opening van het vat, zodat het papier reikt 1-2 cm verder dan de opening.
- Met een micropipet 3-10 gl van de geur op het filtreerpapier plaatsen zonder dat de geur aanraken het einde van de injectiespuit. De pipet tip kan worden hergebruikt voor hetzelfde de geur, maar zorg ervoor dat u een nieuwe tip te gebruiken voor het opzetten van de volgende geur.
- Draai de brede opening van de spuit naar boven zodat het filter papier valt snel in de buis. Steek de restrictor in de brede opening van de spuit.
- Zorg ervoor dat elke geur cartridge is duidelijk gemarkeerd met een kleurcode label van de geur wordt het eerst gebruikt. Gebruik nooit een geur cartridge (spuitcilinder of engeIctor) voor meerdere geur, daar mogelijk restgeur erop.
- Bal het einde van een niet-pluizende tissue, laten weken met 70% ethanol, en gebruik deze om grondig te vegen het buitenste oppervlak van de cartridge om eventuele geur aan de buitenkant van de cartridge te verwijderen.
- Methode 1
2 Verzamelen, Tegenhouden, en Feeding the Bees
- Voorbereiding Bee Tegenhouden Gordels
- Maak eenvoudig straatverbod gordels voor honingbijen uit plastic soda rietjes, harde plastic buis, of bewerkte metalen buis (al zijn ongeveer 0,9 cm binnendiameter en hebben 1-2 mm wanddikte). Gebruik steviger gordels voor de procedures met betrekking tot de operatie.
- Snij 3 cm gedeelten van de buis. Dan, gedeeltelijk weggesneden ongeveer de helft van de bovenste 1 cm van de gordel om het gemakkelijker maken om de bij plaats te houden terwijl de bevestiging van de gordel.
- Snijd een 0,2 x 6 cm strook van duct tape en sluit het ene uiteinde aan de ene kant van de bijen harnas, leaVing de andere kant vrij.
- Verzamelen Bijen van de arbeider
- Verzamel werknemers van de ingang van de kolonie als ze pauzeren voor het vertrek uit de kolonie of als ze terugkomen van het foerageren.
OPMERKING: Het plaatsen van een stuk gaas, met gaten net groot genoeg voor de werkbijen om doorheen te kruipen, boven de ingang vertraagt de terugkerende werknemers naar beneden en maakt het makkelijker om ze te vangen voordat ze in de kolonie. - Plaats een scintillatieflesje over de bijen tot hij vliegt omhoog in het. Houd de flacon met de opening horizontaal of naar beneden, terwijl het deksel is bevestigd, zodat de bijen niet vliegen op uit de flacon. Plaats slechts een bee in elk flesje. Zorg ervoor dat de deksel heeft een gat erin te zorgen voor een adequate gasuitwisseling.
- Verzamel de bijen snel naar de tijd die ze besteden in de injectieflacons te minimaliseren. De injectieflacons met bijen in hen in een klein doosje in de schaduw.
- Breng de doos met de flesjes en de bijen naar het lab, en plaats de flesjes in een ijs-water slUrry totdat de bijen stoppen met bewegen. Zodra een bij immobiel is, verwijdert u de flacon van het ijs onmiddellijk te lange blootstelling aan kou vermijden, en plaats de bijen in een straatverbod harnas.
OPMERKING: We raden niet aan het plaatsen van de bijen in de koelkast of vriezer, omdat het moeilijk te controleren wanneer de bijen worden immobiel, wat resulteert in een overmatige blootstelling aan de koude. Bij benutting van meer dan 10 bijen, alleen overdragen enkele bijen om het ijs-water suspensie tegelijk.
- Verzamel werknemers van de ingang van de kolonie als ze pauzeren voor het vertrek uit de kolonie of als ze terugkomen van het foerageren.
- Beteugeling van de Bijen
- Plaats de bijen in het harnas met dorsale thorax tegenover het weggesneden deel van de buis en het vlak boven de top van de buis. Druk zachtjes op de bijen dicht bij de slang, zodat haar monddelen buiten de rand van de buis. Schuif de strook tape tussen de kop en de thorax aan de rugzijde van de bij en goed vast het vrije einde aan de zijkant van de kabelboom.
- Zorg ervoor dat de tape op het harnas is glad en strak. Er mag geen kennisgeving wordenceable openingen tussen de voorkant van de bij harnas en de tape en de tape moet plat op de bovenkant van het harnas. Als er lacunes zijn de bijen niet in staat om zijn slurf naar behoren uit te breiden of het kan ontsnappen. Zorg er ook voor de benen van de bijen zijn niet uitsteken tussen de voorkant van het harnas en de duct tape.
- Plaats de bijen in het harnas met dorsale thorax tegenover het weggesneden deel van de buis en het vlak boven de top van de buis. Druk zachtjes op de bijen dicht bij de slang, zodat haar monddelen buiten de rand van de buis. Schuif de strook tape tussen de kop en de thorax aan de rugzijde van de bij en goed vast het vrije einde aan de zijkant van de kabelboom.
- Het voeden van de bijen en de Feeding om Conditioning Interval
- Ongeveer 30 min na winning - nadat de bijen hebben hersteld van de eerste installatie - voeden de bijen 3-4 ul 0,5 M sucrose (in het water). Dit bedrag is voldoende voor een voeding-aan-conditioning interval van 3-4 uur zijn.
- In het algemeen u 1 pi 0,5 M sucrose ongeveer ieder uur wachttijd tussen voeding en conditionering zorgen de bijen overleven maar de interval honger genoeg begin conditionering gemotiveerd aan het geconditioneerde vereniging leren. In een laboratorium bewaard bij een warme temperatuur of wanneer uzingen een andere concentratie van sacharose, past u de gevoed bedrag of het tijdsinterval dienovereenkomstig.
OPMERKING: Met een voeding te conditioneren interval van 24 uur, zorg ervoor dat alle bijen worden gevoed om verzadiging met 0,5 of 1 M sucrose ten minste 24 uur voordat conditionering zal beginnen. Bij kamertemperatuur, bijen nodig hebben ongeveer 24 uur voordat ze voldoende gemotiveerd zijn om goed te reageren op een conditionering protocol.
OPMERKING: Gebruik een lagere concentratie sucrose oplossing voor het voeden van de bijen dan de gebruikte concentratie als beloning tijdens het conditioneren te voorkomen dat de bijen steeds minder gevoelig voor de concentratie van sucrose tijdens conditioneren, waarbij leerprestaties 18 verlagen. - Voed de bijen in een gebied ver weg van de opleiding gebied. Blootstelling aan de ongeconditioneerde stimulus (sacharose) in de conditionering context vóór conditionering wellicht volgend conditionering invloed op de geur.
- In het algemeen u 1 pi 0,5 M sucrose ongeveer ieder uur wachttijd tussen voeding en conditionering zorgen de bijen overleven maar de interval honger genoeg begin conditionering gemotiveerd aan het geconditioneerde vereniging leren. In een laboratorium bewaard bij een warme temperatuur of wanneer uzingen een andere concentratie van sacharose, past u de gevoed bedrag of het tijdsinterval dienovereenkomstig.
- Tijdens het interval tussen voeding en conditioning plaatsen de bijen op het aanrecht in een rustig gedeelte van het lab om onnodige verstoring te voorkomen. Indien het laboratorium lage luchtvochtigheid, plaatst bijen in een plastic container met natte papieren handdoeken tijdens het tijdsinterval. Dit voorkomt uitdroging, omdat de bijen kunnen sterven wanneer ze worden blootgesteld aan lage vochtigheid gedurende langere tijdsperioden.
OPMERKING: de winning en het voeden protocol niet binnen een experiment te veranderen! Gebruik slechts een bepaalde tijd tussen het opzetten en voeren van de bijen en het begin van conditionering voor elk experiment, zodat de bijen allemaal precies op dezelfde manier behandeld.
- Ongeveer 30 min na winning - nadat de bijen hebben hersteld van de eerste installatie - voeden de bijen 3-4 ul 0,5 M sucrose (in het water). Dit bedrag is voldoende voor een voeding-aan-conditioning interval van 3-4 uur zijn.
3 Conditioning
- Testen op Sucrose Gevoeligheid
- Een paar minuten voor het begin van conditionering, test de motivatie van de bijen te voeden door het aanraken van de antennes met een kleine druppel van 0,5 M sucrose-oplossing (dezelfde concentratie gebruikt tijdens het voeden). Laat ze niet te voeden tijdens deze test. Als zij reageren door het extending hun snuit, zij waarschijnlijk niet gemotiveerd leren en kan worden gebruikt voor het protocol.
- Experiment Ontwerp
OPMERKING: Dit protocol kan worden aangepast aan een breed scala van leren protocollen passen met het oog op de vele aspecten van het leren en het geheugen capaciteiten honingbijen 'te onderzoeken. Onder de vele parameters die kunnen worden aangepast zijn: Inter-trial interval, het aantal bijen getraind op een gegeven moment, inter-stimulus interval, het type en de concentratie en het aantal geuren, het type en de concentratie van de ongeconditioneerde stimulus, het aantal en de volgorde van studies (figuur 1; tabel 1) 19-21. Bij het ontwerpen van het exacte protocol voor elke conditionering proces, is het zeer belangrijk om de inter-trial interval consistent individuen houden. Een inter proef interval dat is te kort, te lang of inconsistent zal de prestaties van de bijen aantasten. Zie de discussie voor een volledige behandeling van dit onderwerp.
OPMERKING: Bijs zal de taak sneller als ze in een warme omgeving te leren. Houd daarom de temperatuur van de opleiding milieu consistente en warm (29-30 ° C indien mogelijk). - Het leveren van de Geur (geconditioneerde stimulus)
- Methode 1
- Het opzetten van de Geur Delivery System
- Monteer de plastic 20 ml injectiespuit geladen met de geur-behandelde filter papier dus het is stabiel en het smalle uiteinde wordt geconfronteerd direct bij antennes van de bij. Zet de zuiger op de 15 ml-markering en de positie van de spuit, zodat de zuiger is gemakkelijk bereikbaar.
- De presentatie van de Geur Stimulus
- Aan het begin van elke proef, plaatst u de bijen in het harnas aan de kapstok in de conditionering arena met zijn antennes wees direct naar de geur cartridge. Laat de bijen acclimatiseren aan de arena voor 15-25 seconden voor het begin van de geur stimulans om verstoring veroorzaakt door de abrupte verandering in de visuele omgeving tijdens de geur stimulus te verminderen.
- Indien de bij begint te reageren op de geur cartridge direct nadat deze zich in de conditionering arena kan er geur op tip van de cartridge zijn. Verwijder de vervuilende geur door het wassen van de cartridge af met een pluisvrij doekje gedrenkt in 70% ethanol. Als dat het probleem niet oplost, vervangt u de cartridge.
- Druk op de zuiger van de spuit in een gestaag tempo, zodat de zuiger helemaal is ingedrukt binnen 4 sec. Monitor de reactie van de bijen aan de reuk voor de presentatie van de ongeconditioneerde stimulus.
- Na elke proef, zodat de bijen te rusten in de conditionering arena voor een ander 15-25 sec. Het verplaatsen van de bijen te snel na het proces zal de effectiviteit van elke conditionering proces aanzienlijk verminderen.
- Aan het begin van elke proef, plaatst u de bijen in het harnas aan de kapstok in de conditionering arena met zijn antennes wees direct naar de geur cartridge. Laat de bijen acclimatiseren aan de arena voor 15-25 seconden voor het begin van de geur stimulans om verstoring veroorzaakt door de abrupte verandering in de visuele omgeving tijdens de geur stimulus te verminderen.
- Het opzetten van de Geur Delivery System
- Methode 2
- Het opzetten van de Geur Delivery System
- Luchtstroom Bron en Flow Rate
- Als de bron luchtstroom voor geur leveringgebruik een aquarium beluchter pomp of een laboratoriumtafel perslucht, als het laboratorium is uitgerust met het.
OPMERKING: Een typische aquarium beluchter pomp zal een luchtstroom in de buurt van 400 ml / min (7 ml / sec) hebben; via 4 sec geur stimulus wordt 28 ml van lucht door een 1 ml patroon stromen. - Gebruik een flowmeter in overeenstemming met de slang van de luchtaanvoer inrichting voor het debiet van de luchttoevoer regelen. Stel de flowmeter totdat de stroomsnelheid 400 ml / min. Controleer het debiet bij de opening van de geur cartridge met een aparte flowmeter.
- Sluit de luchtstroom naar de geur cartridge via een systeem van kunststof buizen en kleppen.
OPMERKING: De timing apparaat hieronder besproken opent de kleppen op het juiste moment in het proces. Plastic connectoren hechten de luchtstroom systeem om de geur cartridge door een Luer soort gehechtheid aan spuitcilinder van de cartridge. - Ongeacht de luchtstroom bron, controleer het debiet periodiek te make ervoor dat de lijn intact is en het debiet wordt gehandhaafd op de gewenste snelheid.
- Als de bron luchtstroom voor geur leveringgebruik een aquarium beluchter pomp of een laboratoriumtafel perslucht, als het laboratorium is uitgerust met het.
- Luchtstroom Bron en Flow Rate
- Geautomatiseerde Geur Delivery
- Gebruik een Programmable Logic Controller (PLC) voor de levering van de geur te automatiseren.
OPMERKING: De PLC wordt geprogrammeerd om de kleppen om de geur levering luchtstroom 6 sec opent na het starten van het programma (geïnitieerd door het indrukken van een knop), blijven de kleppen geopend voor 4 sec, en een geluidssignaal te voeden signaal, via een kleine luidspreker, 3 sec na geur stimulusaanvang De experimentator moet sucrose leveren signaleren. - Gebruik een kleine LED aan de timing van de geur stimulans geven tijdens elke proef. Indien mogelijk gebruik van een rode LED, omdat fotoreceptoren bijen weg te zijn verschoven van langer [rood] golflengten en in de richting van kortere [uv] golflengten, zodat ze het niet goed kunnen zien. Plaats de LED achter en onder de bijen, buiten hun gezichtsveld, zodat het licht een onbedoelde geconditioneerde stimulus niet zal worden.
OPMERKING: De LIGht helpt ook verifiëren dat de PLC correct werkt en is nuttig bij het analyseren van video-opnamen van de antwoorden van de bijen tijdens de test trials.
- Gebruik een Programmable Logic Controller (PLC) voor de levering van de geur te automatiseren.
- Het uitlaatsysteem
- Het opzetten van een uitlaatsysteem achter de bijen te helpen trekken de lucht langs de bijen en de geur beladen lucht te evacueren uit de conditionering arena om een discrete tijdsbestek voor elke voorstelling van de geur te behouden.
OPMERKING: Als er een vacuüm-systeem in het laboratorium, wijzigen de vacuüm-poort en sluit een leiding van droger slang aan op de luchtstroom die nodig is om de conditionering arena evacueren bieden. Als er geen vacuümsysteem, een kleine elektrische ventilator ondergebracht overeenkomstig de droger buis tot een afzuigkap of via een venster volstaan.
- Het opzetten van een uitlaatsysteem achter de bijen te helpen trekken de lucht langs de bijen en de geur beladen lucht te evacueren uit de conditionering arena om een discrete tijdsbestek voor elke voorstelling van de geur te behouden.
- Aan het begin van elke dag, het elektrisch en lucht aansluitingen van de geur levering systeem en het uitlaatsysteem. Druk op de startknop van de geur levering systeem en bijhouden van de tijd tussen het indrukken van deknop en wanneer de kleppen open (een rustige klik en het LED-lampje gaat branden) en wanneer de cue om de ongeconditioneerde stimulus presenteren (een geluidssignaal) klinkt. Controleer de luchttoevoer door een vochtige vingertop voor de connector die wordt aangesloten op de geur cartridge. Er moet een sterke luchtstroom wanneer de kleppen open zijn. Controleer het uitlaatsysteem door met een niet-pluizende weefsel tot aan de opening van het uitlaatsysteem om te zorgen dat de luchtstroom sterk genoeg is om goed te evacueren van de lucht uit de airconditioning arena.
- Het opzetten van de Geur Delivery System
- Montage van de Geur Cartridge
- Plaats wat boetseerklei, hetzij op het aanrecht of op een klein plexiglas staan om de bijen en de geur cartridge direct positioneren tegenover het uitlaatsysteem. Plaats het glas geur spuit in de klei en stel het zo de opening in het brede uiteinde is gericht op het hoofd van de bij. Het einde van de injectiespuit moet 1-2 cm van de honingbij. Kies een afstand binnen dit bereik en constant zijn.
- Veilig plaats de fitting aansluiten van de patroon naar de luchtslang en klepsysteem via smalle ingeslepen einde van de injectiespuit.
- De presentatie van de Geur Stimulus
- Aan het begin van elke proef, plaats de spande bijen aan de kapstok in de conditionering arena met zijn antennes wees direct naar de geur cartridge. Laat de bijen rust in de arena voor 15-25 seconden voor het begin van de geur stimulans om te wennen aan zijn nieuwe omgeving geworden.
OPMERKING: Als de bijen begint te reageren op de geur cartridge direct nadat in de conditionering arena wordt geplaatst, kan er geur op het puntje van de cartridge zijn. Verwijder de vervuilende geur door het wassen van de cartridge af met een pluisvrij doekje gedrenkt in 70% ethanol. Als dat het probleem niet oplost, vervangt u de cartridge. - Druk op de startknop om de timing mechanisme voor geur levering starten. Monitor de reactie van de bijen om de geur na stimulusbegin en vóór de indiening van de ongeconditioneerde stimulus.
- Na elke proef, zodat de bijen te rusten in de conditionering arena voor een ander 15-25 sec om voor de initiële vorming van het geheugen. Het verplaatsen van de bijen te snel na het proces zal de effectiviteit van elke conditionering proces aanzienlijk verminderen.
- Aan het begin van elke proef, plaats de spande bijen aan de kapstok in de conditionering arena met zijn antennes wees direct naar de geur cartridge. Laat de bijen rust in de arena voor 15-25 seconden voor het begin van de geur stimulans om te wennen aan zijn nieuwe omgeving geworden.
- Methode 1
- Het leveren van de Sucrose (ongeconditioneerde stimulus)
- Methode 1
- Voor deze werkwijze gebruikt een tandenstoker de sucrose leveren.
LET OP: Het beste is om een plastic tandenstoker gebruiken omdat de houten tandenstokers een geur die de reacties van de bijen aan de geconditioneerde stimulus invloed zal kunnen hebben. - Dompel het uiteinde van de tandenstoker in het sucrose-oplossing, en, wanneer het tijd is om de ongeconditioneerde stimulus te presenteren, houdt de tandenstoker in de voorkant van de bijen en laat de bijen aan de sucrose uit de tandenstoker likken voor ongeveer 1 sec.
- Vervang de tandenstoker regelmatig om ophoping van su voorkomenCrose.
- Voor deze werkwijze gebruikt een tandenstoker de sucrose leveren.
- Methode 2
- Sucrose Delivery System
OPMERKING: Een meer accurate manier om de ongeconditioneerde stimulus te leveren is door middel van het gebruik van de micrometer spuiten, die nauwkeurig kleine hoeveelheden (tienden van een microliter) van de sucrose beloning kan leveren.- Wikkel de micrometer van de spuit zo ver mogelijk. Laad de micrometer spuit vat met de sucrose-oplossing. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in het glas gedeelte en monteer de spuit. Vul de hub van de naald met de sucrose-oplossing alvorens het op het smalle uiteinde van de spuit. Om ervoor te zorgen dat de vloeistof in de naald daadwerkelijk sucrose en geen water uit het wassen van de naald, de wind micrometer uit 1-2 gl voor het begin van het experiment.
- Sucrose Delivery System
- Sucrose Voorstelling
- Houd de punt van de naald van ongeveer 2 cm van de honingbij terwijl de geur wordt gepresenteerd. Gebruik de rand van de training arena te voorkomenhet schudden van de spuit als de beweging kan de bijen af te leiden. Raak de naald niet te dicht in afwachting van de voeding signaal niet krijgen, want dat zal ook voortijdig verschuift de aandacht van de bijen van de geur van de sucrose.
- Zodra de voeding signaal klinkt, licht op de antennes, totdat de bijen breidt haar slurf, dan voeden de bijen. Dit zou slechts een zeer lichte aanraking of twee om de antennes vereisen.
- Gebruik een beloning bedrag tussen 0,2 en 0,8 pl. De bijen moeten gemakkelijk de hele druppel binnen de periode toegewezen voor de ongeconditioneerde stimulus (~ 1-2 sec) verbruikt. Gebruik geen "ad libitum" voeden uit een grote druppel, die de bijen voedt zich gedurende enkele seconden, maar kan niet volledig verbruikt.
- Kijk voor sucrose bouwen op de antenne, die de reactie van de bijen die voor alle latere presentaties van de beloning zal verminderen. Wijzig de voeding procedure als dit gebeurt.
- Om een nauwkeurige koppeling van de geur zorgencue en de sucrose beloning, zorg ervoor dat de druppel van sucrose-oplossing zo snel mogelijk te presenteren aan de bijen na de toon.
OPMERKING: Timing tussen het begin van de CS (geur) en BE (sucrose) is kritisch. Idealiter zou de geur presentatie en sucrose presentatie kort overlappen. Als er meer dan een paar seconden verstrijken tussen het einde van het CS en de levering van de Verenigde Staten, zal conditionering werking verstoren.
- Methode 1
4 Testen
- Na conditionering gebruik ongewapend-test proeven om te beoordelen hoe goed de bijen geleerd en / of onthoud de geconditioneerde vereniging.
OPMERKING: Zie de discussie voor een uitgebreide uitleg van het belang van het analyseren van 'reacties op ongewapende testen proeven in aanvulling op de bijen' de bijen prestaties in de conditionering proeven en een uitleg van het doel van het aantal testen proeven en testen geuren. - Consolidatie Time
- Volgendeconditionering, ofwel het beheer van een onmiddellijke proefproces of laat de bijen om te rusten door middel van een periode van consolidatie.
OPMERKING: De lengte van de consolidatieperiode, het tijdsinterval tussen conditionering en testen, afhankelijk van het doel van het experiment. Als het doel is om te leren van verschillen of korte-termijn geheugen te onderzoeken, kan de prestaties van de bijen 'op proef proeven worden geëvalueerd onmiddellijk na of enkele uren na conditionering. Als het experiment betreft onderzoeken op lange termijn geheugen, moet de test trials worden gegeven ten minste 24 uur na het einde van conditionering. - Als de test trials zijn meer dan 24 uur na conditioning, voeden de bijen om verzadiging met 0,5 M sucrose na conditionering en ten minste eenmaal per dag daarna tot 12-24 uur voor de test trials.
- Om ervoor te zorgen dat de bijen hebben verzadiging bereikt, dan moet elk van hen verschillende keren totdat ze niet langer hun slurf uit te breiden in antwoord op hun antenne te rakene met sucrose. Ze kunnen zo veel als 40 pi consumeren om verzadiging te bereiken.
- Houd de bijen in een vochtige container om hun uitdrogende en sterven tijdens de consolidatie periode te voorkomen.
- Volgendeconditionering, ofwel het beheer van een onmiddellijke proefproces of laat de bijen om te rusten door middel van een periode van consolidatie.
- Test Trials
- Gebruik alleen vers bereide geur cartridges voor het testen.
OPMERKING: De cartridges gebruikt voor acquisitie kan verschillend worden uitgeput, zodat de test stimulus niet consistent proeven, geuren, en de individuele bijen zullen zijn en daarom kan significante invloed op de consistentie en de robuustheid van de resultaten. - Tijdens het testen handhaven hetzelfde inter-trial interval en andere parameters zoals gebruikt in de conditioneringsfase van het experiment.
- Mis ongeconditioneerde stimulus vertonen bij testproeven, aangezien de aanwezigheid van een beloning reactie van de bijen aan de geconditioneerde stimulus zal veranderen, mogelijk maskerende subtiele effecten van de conditionering protocol of behandeling.
- Video's opnemen van alle of de testproeven kunnen meerdere aspecten antwoorden van de bijen later meten met de geur (s).
- Gebruik alleen vers bereide geur cartridges voor het testen.
5 Opnemen Reacties the Bees '
- Binary (Aanwezigheid / Afwezigheid) Scoren van PER
- Gebruik een binair scoresysteem van PER tijdens het conditioneren studies en tijdens het testen proeven. Score reacties als positief of negatief; Dit is voldoende voor vele soorten analyses met een steekproefomvang van 20-40 bijen per behandelingsgroep. De precieze topologie van de reacties kan 22 complex zijn. Het is belangrijk een gemakkelijk te zien en scoren criterium voor een positieve reactie vastgesteld.
- Score reactie een bee's als positief (+), wanneer de bijen breidt haar slurf voorbij de lijn die door het verbinden van de uiteinden van de geopende kaken. Alleen scoren een positieve reactie wanneer de bijen breidt haar slurf na geur ontstaan, maar voordat de geur te compenseren.
- Score reactie een bee's als negatief (-) als er geen eXTension van de slurf tijdens het onderzoek of indien de slurf wordt verlengd na de verschuiving van de geurstof.
- Vermijd het proberen om een gedeeltelijke respons scoren. Om fijner onderscheid te maken in het gedrag van de bijen ', gebruik maken van de video-analyse techniek hieronder beschreven.
- Gebruik een binair scoresysteem van PER tijdens het conditioneren studies en tijdens het testen proeven. Score reacties als positief of negatief; Dit is voldoende voor vele soorten analyses met een steekproefomvang van 20-40 bijen per behandelingsgroep. De precieze topologie van de reacties kan 22 complex zijn. Het is belangrijk een gemakkelijk te zien en scoren criterium voor een positieve reactie vastgesteld.
- Video Analyse van Extra PER Afmetingen (Film 1)
- Verzamel aanvullende informatie van gedragstesten door het analyseren van video's van de reacties een bij om een geur.
Opmerking: Deze metingen kunnen ook een hogere temporele resolutie voor onderzoek van de antwoorden van de bijen de geuren, vooral wanneer er geen verschil in de aanwezigheid / afwezigheid scoring van PER tussen behandelingsgroepen. - Het opnemen van de video's
- Gebruik altijd onversterkt test of het uitsterven proeven voor video-opnamen. De aanwezigheid van de beloning wordt de reactie van de bijen aan de geur wijzigen wijziging van de duur van proboscis extensie.
- Stel een videocamera op een statief boven de training arena en de focus van de camera op de voorkant van het hoofd van de bij, zodat de antennes en proboscis scherp zijn.
- Plaats de kleine LED licht, wat aangeeft geur stimulus, in een gebied achter de bij die zichtbaar is in de video om het te gebruiken om geur onset en offset tijdens analyse.
- Begin met het opnemen 20 seconden voordat geur ontstaan en blijven opnemen voor minstens 20 seconden na de geur te compenseren voor het verstoren van de bijen.
- Video Analyse
- Het uploaden van de video's in video-editing software, zoals iMovie of Final Cut Pro, met de mogelijkheid van het meten van tijdsintervallen tussen specifieke frames in de video.
- Analyseer respons van de bijen de geur voor een discrete tijdsperiode vanaf het begin van de geur stimulus (bijvoorbeeld 10 of 20 seconden).
- Gebruik de volgende gemeenschappelijke metingen voor het evalueren PER:
- Meet deduur van zuigorganen verlenging, die de totale tijd dat de slurf voorbij de onderkaak naar onderkaak lijn (hierboven beschreven).
OPMERKING: Een bij kan verlengen en intrekken haar slurf meerdere keren tijdens de 10-20 sec tijdvenster. Meet elke slurf uitbreiding afzonderlijk, en bereken de totale duur. Het analyseren van het aantal en de duur van elke individuele proboscis extensie kan ook waardevolle informatie. - Meet de latency van proboscis extensie, dat is de tijd tussen de geur ontstaan, wanneer de LED gaat branden, en de eerste proboscis extensie.
- Tel en tijd Glossal uitbreidingen ten opzichte van het begin van geurstof, de eerste uitbreiding of andere timing parameters.
- Volg Antennaal bewegingen 23, wat ook blijkt karakteristieke geur-gerichte veranderingen.
OPMERKING: In Film 1, de antennaal bewegingen werden bijgehouden met video-tracking-software om de verandering in antennal bewegingen illustreren in reactie op een geur stimulus.
- Meet deduur van zuigorganen verlenging, die de totale tijd dat de slurf voorbij de onderkaak naar onderkaak lijn (hierboven beschreven).
- Verzamel aanvullende informatie van gedragstesten door het analyseren van video's van de reacties een bij om een geur.
Representative Results
We presenteren twee voorbeelden van het gebruik van de protocollen PER hierboven beschreven. Het eerste voorbeeld gebruik gemaakt van methode 2 te onderzoeken hoe honingbijen zien verschillende geuren als functie van de moleculaire gelijkenis met geur als de CS 5,24,25. De tweede is een voorbeeld van het gebruik van methode 1 en enkele voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen bij het begin PER conditioneringsexperimenten gebruikt in het onderzoekslaboratorium.
Studies zoals deze zijn gebruikt om de olfactorische 'perceptuele ruimte' van bijen en motten beschrijven in combinatie met Bio-imaging 13 of elektrofysiologische analyse 26. Honingbijen (n = 20) werden geconditioneerd om de geurstof decanal met sucrose versterking associëren meer dan 12 forward koppelen conditioning trials (Figuur 3A). Ongeveer 10% van de bijen reageerden 'spontaan' op de eerste proef, die is normaal. Daarna het percentage responded te verhogen in de komende beproevingen tot 100% van de honingbijen gereageerd op de vijfde proef en elke volgende proef. Verschillende studies hebben aangetoond dat deze toegenomen respons specifiek voor de voorwaartse koppeling toestand (figuur 1) ten opzichte van verscheidene belangrijke controleprocedures 3. Na de acquisitie fase werd elke honingbij onderworpen aan een reeks versterkte testproeven (figuur 3B), die betrokken blootstelling aan de geur CS en verscheidene andere geurstoffen die systematisch verschilde van de CS moleculaire structuren. Honingbijen reageerden het sterkst op de CS. De reacties op de andere geurstoffen af als functie van de systematische veranderingen in structuur met de laagste reacties op de geurstoffen minst op het CS.
In figuur 4 worden de resultaten van een recente workshop waarin studenten geleerd voor het eerst, hoe conditioneren honingbijen volgens methode 1 geïllustreerd. Studenten sparren t geconditioneerd honingbijen door voorwaartse koppeling methycyclohexanone (MCH) of octanol (LGO) met sucrose wapening (Figuur 4A). Procent reacties waren lager op de eerste proef en verhoogde op de daaropvolgende proeven, wat aangeeft dat de bijen leerde de geur-sucrose vereniging. Er waren verschillen in de mate dat de bijen leerde de geconditioneerde associatie tussen de verschillende groepen studenten. In onze ervaring, kunnen deze soorten verschil als gevolg van de geur die werd gebruikt als CS, de onnauwkeurige elementen methode (methode 1) of het trainingsniveau van de onderzoekers. In het derde geval, de prestaties wordt al snel meer in overeenstemming met de toegenomen ervaring van de onderzoekers '. Na conditionering werd elke honingbij twee keer getest met elke geur. In groepen van bijen die waren geconditioneerd met voorwaartse koppeling van oktober of MCH, het antwoord was, zoals verwacht, de sterkste op de geconditioneerde geur (Figuur 4B).
ent "> De tweede groep van de bijen die ervaren forward pairing LGO werd geconditioneerd in parallel aan een andere groep waarin de geur oktober achteruit was gepaard met sucrose. Backward pairing is een van de verschillende soorten van de controleprocedures aan te tonen dat de stijging van de respons is specifiek voor koppeling toekomen en niet aan een andere werkwijze, zoals niet-specifieke arousal van sensibilisatie. terugwaartse koppeling, de sucrose VS en geur CS worden in omgekeerde volgorde welke is getoond in figuur 1. Verwerving data van achterwaartse koppeling zijn niet getoond omdat de CR niet gescoord kan worden gegeven van de presentatie van de geur CS na de presentatie van sucrose. Zoals voorspeld zou worden voor associatieve conditionering, de respons niveaus LGO waren hoger in de voorwaartse gekoppelde groep ten opzichte van de achtergebleven groep (Figuur 4C).7fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 1 Schema van experimenteel ontwerp voor het conditioneren van het gebruik van voorwaartse koppeling. Zie tabel 1 voor de definities van de termen die in deze figuur. (A) De CS (geur) gaat vooraf aan en overlapt met de VS (sucrose / water-oplossing). De relatie tussen de CS en de US aangetoond is optimaal voor het conditioneren van de bijen en de motten. Maar de optimale ISI kan afhangen van de conditionering protocol en diersoorten 1. (B) Verdeling en relatieve timing van CS, CR, US, en UR. De CR dat hetzij vóór de VS presentatie of tijdens ongewapend 'test' trials is de afhankelijke maat voor experimentele protocollen.
Figuur 2 Geur uitputting met hergebruik van cartridges. Voor deze gegevens, geur cartridges warenopstelling met hexanol zoals beschreven in de tekst. Hexanol wordt vaak gebruikt als KS PER studies; echter, de werkelijke snelheid van uitputting afhangen van de geur en oplosmiddel. Cartridges werden vervolgens ooit gebruikt voor 4 sec elke minuut meer dan 8 trials (uitgaande 5 honingbijen / proces in een standaard experiment dat zou gelijk zijn 40 toepassingen). De verdunningen in de aangegeven oplosmiddel dat relatief standaard PER experimenten waren 2,0 M (A) en 0,2 M (B). (A, B) De geur werd bemonsterd na de eerste en de achtste proeven door adsorptie op een vaste fase micro-extractie (SPME) vezel die vervolgens werd gedesorbeerd op een gaschromatograaf. De relatieve gebieden onder de pieken waren hoger na de eerste proef opzichte van de achtste zowel oplosmiddelen en beide concentraties (Wilcoxon matched pairs signed rank test p <0,05 [*] of hoger), waaruit blijkt dat minder geur uit de cartridge werd geleverd nadat de patroon was gebruikt een aantal malen. (C, D) Dezelfde gegevens toont alleen de achtste tr IAL met de y-as uitgebreid. Het toont dat de vermindering was iets groter voor hexaan opzichte van minerale olie, maar alleen bij de lagere concentratie.
Figuur 3 Verwerving en test met decanal als de CS en methode 2 te conditioneren. (A) Trial-by-trial respons (CR) op 12 forward pairing trials (figuur 1). De gegevens zijn afkomstig n = 20 honingbijen airconditioning in vier groepen van 5 honingbijen elk. De ISI is 3 sec en het ITI was 6 min. (B) Onversterkte tests met geuren die verschillen van decanal door koolstofketen en / of positie van de carbonyl koolstof. De geuren werden in een gerandomiseerd serie over vier groepen werden afgewisseld met versterkte onderzoeken met decanal (elke twee tot drie trials) teneinde uitsterven van de CR voorkomen.
Figuur 4 Gegevens uit een workshop waarin studenten werden getraind om de conditie van de bijen met behulp van PER methode 1 (A) Overname van gegevens uit drie groepen van honingbijen geconditioneerd om octanol (n = 23 en 15 voor Gps 1 en 2, respectievelijk) en methylcyclohexanon (n = 10) (B) CR in onversterkte proeven met beide geuren.; vier studies gepresenteerd in willekeurige serie over groepen. (C) Onversterkte testen met beide geuren in twee groepen van bijen, een forward gekoppeld (Gp 1, n = 23) en een achterwaartse gepaarde (n = 25).
| Term (afkorting) | Definitie | Relevante Voorbeeld |
| Geconditioneerde stimulus (CS) | Eenstimulus die weinig of geen respons opwekt in eerste en signalen US | GEUR |
| Geconditioneerde respons (CR) een | De respons op de CS na associatie met de VS | Proboscis UITBREIDING |
| Ongeconditioneerde stimulus (US) | Een biologisch belangrijke prikkel die een reactie uitlokt | SUCROSE / wateroplossing |
| Ongeconditioneerde respons (UR) een | De respons op de US | Proboscis UITBREIDING |
| Inter-Stimulus Interval (ISI) | De tijd tussen het begin van het CS en het begin van de US | GEUR te SUCROSE interval |
| Inter-Trial Interval (ITI) | De tijd tussen opeenvolgende CS-US paringen voor een enkel dier | GEUR (proef n) om de geur (proef n + 1)-interval |
Tabel 1 Imlangrijke Terminologie. Zie Figuur 1 voor een illustratie van deze voorwaarden. a Voor PER conditionering de CR en UR zijn hetzelfde, maar voor andere soorten verenigingen en reflexen van de CR en UR kunnen verschillen.
Film 1. Een video van een honingbij uitvoeren PER nadat was geconditioneerd om te reageren op een geur. Let op de PER respons van de bij ongeveer 1,5 sec na aanvang geur. Tracking software in kaart gebracht de antennaal bewegingen in reactie op de presentatie van de geur. De lijnen uitgezet in de rechterbovenhoek van de video weergave van de daadwerkelijke antennal bewegingen. De twee grafieken onder aan het scherm show antennaal bewegingen op x (links) en Y (rechts) coördinaten. De verticale lijnen in de grafiek getoond in de video aan te geven, van links naar rechts, licht aan, PER, licht uit en slurf intrekken.
Discussion
Dit protocol presenteerde twee betrouwbare methoden voor het conditioneren van het gebruik van de PER procedure. Dit zijn twee verschillende methoden die met succes zijn toegepast 27, 21. Wij gebruiken Methode 2 voor alle experimentele studies waarbij PER zoals het is altijd betrouwbaar, zelfs over verschillende onderzoekers.
Dezelfde fundamentele procedure is aangepast aan veel verschillende soorten studies met honingbijen, waaronder het gebruik van de verschillende conditionering stimuli en andere gedrags-reflexen. Ook is gekoppeld aan onderzoek naar de genetische basis van verschillen in het leren 28,29, de fysiologische correlaten van olfactorische perceptie en geheugen in de hersenen 13,14,30, en de modulerende en moleculair genetische basis van gedrag 15,16,31 . Vanwege de geavanceerde kennis van de ecologische relevantie van olfactorische leren honingbijen, die meer dan 100 jaar geleden begon met de eerste studies van Karl von Frisch
De basisprocedure is krachtig omdat het kan worden toegepast om problemen in andere soorten, en onderzoeken. Twee soorten nachtvlinders, Manduca sexta en Spodoptera littoralis, zijn gebruikt in PER studies naar de neurale basis van identificatie en geur olfactorische leervermogen 32,33 per soort 'onderzoeken. PER experimenten met fruitvliegjes hebben veel inzichten in de moleculaire signaaltransductie cascades betrokken bij chemosensation en leren 34. En PER is onlangs gebruikt om gewenning bij de vlooien (Rhodnius prolixus) 35, een belangrijke ziekteoverbrenger bestuderen.
In het algemeen is de procedure bestand tegen veranderingen in de; het gebruik van different methoden zullen waarschijnlijk tot dezelfde relatieve verschil tussen de behandelingsgroepen. Ondanks de relatief eenvoudige procedure kan meerdere problemen soms voorkomen dat de bijen uit het leren van de geur-sucrose vereniging. De volgende onderwerpen zijn mogelijk aanpassingen aan het protocol en een aantal van de meest voorkomende problemen die zich tijdens PER conditionering kunnen voordoen.
Overwegingen op aantal en type van Trials in de Conditioning Protocol
Elke leren protocol zal de blootstelling van de bijen nodig hebben om een aantal proeven in de acquisitie fase. Dit aantal hangt grotendeels af van de moeilijkheid van de taak. Honingbijen kan een eenvoudige taak na een eenmalige proef te leren, maar ze moeten op zijn minst een drie proeven op lange termijn geheugen induceren. Zoals verwacht, zal de honingbijen vereisen aanzienlijk meer proeven om een moeilijke taak adequaat te leren. Meestal is er een maximum aantal proeven waarna de bijen niet meer aanzienlijke verbetering van deir prestaties. Dit maximum is afhankelijk van de specifieke taak, de geur types en concentraties en de concentratie sucrose.
Bij gebruik van meer dan een type van de proef met verschillende geuren, geven de verschillende proces in een pseudo-willekeurige sequentie van de bijen te houden van het onthouden van een eenvoudige reeks geur presentaties plaats van het leren van de verschillen tussen de geuren 36. In deze pseudo-willekeurige reeksen, moet er een gelijk aantal pogingen voor elk van de geur types. Ook de waarschijnlijkheid van een proef van een geur soort wordt voorafgegaan en gevolgd door dezelfde geur, of een van de andere geuren, moeten gelijk zijn voor alle geuren zijn. Voor twee geuren - A en B - gebruik de volgende volgorde: ABBABAAB. Meer dan acht proeven elke geur wordt vier keer gepresenteerd. Aaneenschakelen identieke sequenties om het gewenste aantal proeven voor elke geur te bereiken.
Ongeacht proefopzet, zijn er een aantal parameters die moeten blijvenconstant om leren te optimaliseren. De overlap tussen de CS en de VS is van cruciaal belang voor een effectieve conditionering. De inter-trial interval (Figuur 1, Tabel 1) moet constant zijn en worden geoptimaliseerd omdat onregelmatigheid of een te korte of te lange inter-trial interval significant de effectiviteit van de conditionering protocol 1 kan beïnvloeden.
Overwegingen over het belang en Ontwerp van Behavioral Testen Trials
Reacties opgenomen tijdens de 'acquisitie fase' van een experiment, wanneer de CS en de VS samen worden aangeboden, kan nuttig zijn. Echter, pas op dat de geur presentatie voorwaarden kunnen verschillen van het ene type van de proef naar de andere. Tijdens versterkte studies wordt de geur gevolgd door sucrose gepresenteerd in combinatie met een visuele stimulus (beweging van de inrichting voor het leveren van de sucrose druppel) dat de bij reactie kan beïnvloeden. En de bijen hebben slechts drie secondens om een reactie (Figuur 1 vier seconden van geur stimulatie minus de ene sec overlap met sucrose presentatie) tonen. Als het experiment betreft de bijen leren om twee geuren te onderscheiden (bijvoorbeeld, gewapend en ongewapend), de ongewapende geur gepresenteerd op alternatieve proeven gebeurt zonder de visuele prikkel van de beloning presentatie en de bijen hebben de volle vier seconden om te reageren. Daarom, de antwoorden op de twee geuren zijn niet volledig vergelijkbaar tijdens de overname. Met de conditionering protocol, niet alleen vertrouwen op overname bochten 1. Om beter te vernemen welke bijen geleerd, voeren een reeks versterkte testproeven, waarbij noch geur versterkt, die ervoor zorgt dat het testen van alle stimuli plaatsvindt onder identieke omstandigheden.
Afhankelijk van het specifieke doel van het experiment, kan testen bestaan uit enkele testproeven van de geconditioneerde geur of een reeks onderzoeken met de geconditioneerde odof of een combinatie van de geconditioneerde en nieuwe geuren. Een enkele test proces van de geconditioneerde geur zorgt voor een eenvoudige analyse van de vraag of de bijen 'Onthoud de geconditioneerde geur. Kan echter voor de eerste proef proef motivatieniveau de bijen en hun gevoeligheid van de geconditioneerde geur geven. Een serie proeven, ofwel een serie proeven uitsterven van de geconditioneerde geur of een reeks afzonderlijke onderzoeken van de geconditioneerde en een of meer nieuwe geuren, kunnen ook worden gebruikt om geheugen te beoordelen. De serie van uitsterven proeven kunnen beoordelen hoe sterk de bijen 'Onthoud de geconditioneerde vereniging. Hoe sterker de recall het groter aantal studies die nodig zijn om de geconditioneerde respons te blussen. Een reeks van enkele testen van geconditioneerde en nieuwe geuren kunnen ook de specificiteit geheugen van de geconditioneerde geur van de bijen te evalueren.
Het is ook noodzakelijk te conditioneren en test zowel controle en behandelde groepen tegelijkertijd punten. Comparing van de prestaties van de bijen snel na conditionering voor bijen gehouden voor langere tijd is problematisch, omdat de blootstelling aan de sucrose VS door het voeren van de bijen tot verzadiging. Bijvoorbeeld, kan een afname van de prestaties na lange intervallen omdat het geheugen verval of het kan te wijten zijn aan veranderingen in motiverende toestand en / of leren geïnduceerd door versterkte blootstelling aan de VS, waardoor de resultaten ambigu. Derhalve prestaties van een behandelingsgroep altijd worden beoordeeld ten opzichte van een controlegroep geconditioneerd en getest op dezelfde tijdstippen.
Geur Concentratie en Integriteit
Er zijn verschillende manieren waarop de concentratie en integriteit van de geur (CS) kunnen worden aangetast. Het meest voorkomende probleem met geur levering de uitputting van geur cartridges overmatig (figuur 2). Vervang de cartridges 10-12 gebruik (om de 2 of 3 studies met groepen van 5 honingbijen) om deze valkuil te vermijden. Het is ook kritisch te gebruikenverse cartridges voor test-trials, omdat de gebruikte cartridges differentieel kan worden uitgeput en dus aanwezig ongelijke geur stimuli. Een ander bekend probleem geur cartridge vervuiling door met de cartridge voor meerdere geur zonder volledig reinigen. Een vuile of vervuilde luchtstroom kan ook onbedoeld introduceren extra olfactorische stimulus (actieve kool filters kan achtergrond besmetting te voorkomen). Dit is vooral problematisch wanneer het koppelen PER conditionering met metingen van de fysiologische reacties op de geur. Leaky geur cartridges een probleem vormen, omdat de bijen worden blootgesteld voordat het proces begint, waarin de saillantie van de geur prikkel vermindert om de geur. Loszittende op de luchttoevoer voor de geur levering kan leiden tot weinig of geen geur levering wanneer de klep wordt geopend, kunstmatig respons van de bijen aan het beoogde geur verminderen.
Sucrose-oplossing en ongeconditioneerde stimulus (Beloning)
De eenmount, concentratie, en de integriteit van de sucrose-oplossing gebruikt als de VS zijn van vitaal belang voor het succes van het experiment. Conditioning is een functie van de hoeveelheid en concentratie van sucrose-oplossing in water als de Amerikaanse 37. De micrometer spuiten van methode 2 toestaan voor zeer nauwkeurige (tot 0,2 pl) zeggenschap over Amerikaanse levering, en wij raden ze met behulp van beide methoden beschreven. Gebruik van de tandenstokers (Methode 1) voldoende voor omstandigheden waarin de dure spuiten niet kan worden gebruikt, zoals in de opleiding van grote groepen studenten, werk in het veld, of met lagere budgetten. Zorgvuldige implementatie van methode 1 is prima, zolang de timing wordt onderhouden met regelmatige vervanging van tandenstokers om afzettingen van sucrose (en de concentratie geleverd) te vermijden. Het gebruik van tandenstokers is het moeilijker nauwkeurig te regelen en schat de hoeveelheid en grootte van de Amerikaanse geleverde, wat belangrijk is voor het conditioneren studies 1. De concentratie sucrose nodigeen voldoende beloning voor de bijen gemotiveerd aan het geconditioneerde vereniging kom kan afhangen van de moeilijkheid van de taak en interne toestand van de bijen of jaargetijde houden. De moeilijkere taken vereisen een hogere sucrose-oplossing voor de bijen 'om de taak met succes te leren. Schimmel kan opbouw in sacharose-oplossingen, zelfs bij 5 ° C, waarbij de integriteit van de oplossing in het gedrang brengt, die de gezondheid en de perceptie van de beloning van de bijen tijdens het experiment. Het beste is om de oplossing te vervangen om de paar dagen.
Precisie, timing, en de consistentie van CS en de US, de levertijd
Het meest kritieke punt over de juiste uitvoering van een PER procedure, of wat dat betreft elke conditionering procedure, houdt precisie, timing en consistentie van de CS en de US levering (figuur 1). Onderzoekers die nieuw zijn op de procedure vaak onnauwkeurig over de levering van een of beide stimuli. ISI'sdie niet om voor overlap CS en Amerikaanse resulteren in slechte prestaties conditionering. De PLC automatiseert een akoestisch signaal voor de experimentator sucrose 3 sec leveren na het begin van geur levering. Onderzoekers moeten de sucrose / water druppel dicht bij de bijen voor een snelle levering na het signaal vast te houden. Deze procedures helpen meevoeren een consistente ISI. Het plaatsen van een stopwatch door de conditionering arena zorgt voor een gemakkelijke tijd plaatsing van de proef, alsmede de controle op de tijd van de bijen in de arena, zowel voor als na levering van stimuli. Zo ITI kan betrekkelijk consistent zijn en de gehele procedure kan met een geregelde snelheid worden uitgevoerd. ITI dat te kort zijn, bijvoorbeeld minder dan 1 min, of te lang kan leiden tot slechte conditionering rendement 1.
Seizoensgebonden, milieu-, en contextuele effecten op Honey Bee Prestatie
Prestaties van honingbijen 'kan aanzienlijk worden beïnvloed door zijn omgevingzowel voor als tijdens het conditioneren. Vaak zal de schommelingen in de temperatuur en de beschikbaarheid van voedsel die met de veranderende seizoenen motivatie van de bijen om te leren veranderen. Wanneer de bloemen in bloei staan, de motivatie van de bijen om te leren de geconditioneerde vereniging in het lab af 38. Wanneer de kolonie wordt benadrukt - van extreme temperaturen, voedseltekorten, of-ziekte stress - de bijen 'zal een vermindering van hun leerprestaties binnenkant laten zien. Honingbijen bewaard in een vlucht kamer kan goed leren voor een tijdje, maar er ook de stress van de ziekte en veroudering degraderen hun leerprestaties in de tijd. De context tijdens het conditioneren kunnen ook de prestaties van de bijen 'te verlagen. Vreemde geuren, beweging, en andere stimuli kunnen de bijen af te leiden uit de experimentele stimuli. Om dit probleem te voorkomen, handhaven van een redelijk consistent, vereenvoudigde visuele context.
Genotype en ervaring beïnvloedt per voorstelling
<p class = "jove_content"> Honey bee werknemers kunnen aanzienlijk verschillen in prestaties op de conditionering procedure wegens taakspecialisatie, genotype, of andere omgevingsfactoren 20. Daarom is het belangrijk te standaardiseren, zoveel mogelijk, de soorten dieren gebruikt in een experiment om inter-individuele variatie te verminderen. In een kolonie geleid door een open-paarde koningin, wat betekent dat ze gepaard met veel verschillende drones, zullen de werknemers verschillen in vaderlijke genotype. Genetische achtergrond kan leiden tot dramatische verschillen in sensorische respons 39 en leerprestaties 29. Met behulp van kolonies geleid door koninginnen instrumentaal geïnsemineerd met sperma van enkele drones 28 vermindert dit inter-individuele variatie.De hierboven beschreven protocollen, inclusief een methode voor het verzamelen van honing bij werknemers uit het nest ingang. Echter, deze bijen verschillen van elkaar wat betreft leeftijd of gedragstaak. Ze is nog jong (inexperienCED) of ouder (meer ervaren) verzamelaars. Het kan gaan om jonge bijen die hun eerste oriëntatie vluchten. Of ze ook mogen zijn bewaker bijen. Om de variabiliteit te verminderen, markeer de bijen met een sneldrogende lakverf of markeerlabels hetzij als ze zich voordoen als volwassenen (om te controleren voor de leeftijd) en / of als ze beginnen foerageren (om te controleren voor de ervaring). Dan, een paar dagen later, het verzamelen van de gemarkeerde bijen voor het conditioneren. Werknemers die betrokken zijn bij de verpleging gedrag kan worden afgehaald bij de frames binnen de korf. Verpleegkundigen kunnen positief worden geïdentificeerd als ze voegen hun hoofd in een broedcel te voeden en de zorg voor de larve binnen.
Met behulp van Virgin Queens of Drones voor PER Conditioning
Naast werknemer honingbijen, kan maagd honingbij koninginnen en darren gemakkelijk worden geconditioneerd in een PER procedure voor studies die gericht zijn op het ontwikkelen van genetische lijnen van honingbijen die verschillen in leerprestaties 28. Maagdelijke koninginnen moet binnenkort worden afgehaald na they komen uit verpopping en direct in straatverbod harnassen geplaatst zonder verdoving. Jonge, onvolwassen drones verzameld uit het broed kam in de kolonie zijn over het algemeen niet gemotiveerd om te leren. Nadat ze zijn begonnen paring vluchten, drones gemakkelijk leren PER taken 28. Ze moeten worden verzameld als ze 's nachts terug te keren van een paring vlucht en in een kleine kooi in een kolonie wordt gebruikt voor het opfokken van koninginnen. Probeer niet om ze te benutten de dag voor conditionering; ze niet goed overleven in harnassen overnachten. Een paar uur voor het conditioneren van de drones kunnen worden afgehaald bij de kooien en geplaatst in het straatverbod harnassen zonder verdoving.
Conclusies
Deze PER procedure, zoals methoden bedraagt uitgangspunt voor het ontwerpen PER experimenten. De meeste PER protocollen vereisen dat de procedure van een gewijzigd worden om de specifieke doelen van het experiment en accomm implementerene verschillende behandelingsgroepen. Het is eenvoudig te implementeren. Echter, een goede uitvoering vereist aandacht voor detail en de praktijk. Eenmaal onder de knie kan een krachtige procedure om toe te voegen als een research tool voor meerdere fundamenteel en toegepast onderzoek programma's met verschillende soorten insecten zijn.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door de financiering van NIH NCRR (R01 RR014166 aan BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS co-PI), het Amerikaanse ministerie van Landbouw (J trumble PI; BH Smith co-PI) en Arizona State University. De financiering voor de workshop aan studenten (data in figuur 4) te trainen werd verstrekt door de Stichting van de Wetenschap van Chili.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Odorant Compounds (for example) | |||
| 1-hexanol | Sigma-Aldrich | 471402-100ML | For additional examples |
| 2-octanone | Sigma-Aldrich | W280208-800G-K | of odorants, see any of |
| heptanol | Sigma-Aldrich | 51778-5ML | the papers on olfactory |
| gerianol | Sigma-Aldrich | 163333-25G | processing from the |
| nonanal | Sigma-Aldrich | 131210-100ML | Smith lab. |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-1L | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | Make sure it’s odorless. |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Scintillation vials | Sigma-Aldrich | Z190535-1PAK | Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials. |
| Bee harness | Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing. | ||
| Duct tape | |||
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956-1PAK | |
| Wash bottles | Sigma-Aldrich | Z560847-3EA | For the 70% ethanol. |
| Dryer tubing | |||
| FOR METHOD 1 ONLY | |||
| 20 ml disposable plastic syringes | Cole-Parmer | WU-07945-18 | |
| 15 mm filter paper circles | Sigma-Aldrich | Z274844-1PAK | |
| Pushpins | |||
| Toothpicks | |||
| FOR METHOD 2 ONLY | |||
| Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml | Cole-Parmer | EW-07840-00 | |
| Gilmont micrometer syringe tip | Cole-Parmer | EW-07841-00 | |
| 26 G 3/8” Leur hub hypodermic needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
| 1 cc tuberculin syringes (plastic/glass) | Sigma-Aldrich | Z181641-1EA OR Z192090-200EA | Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses. |
| Small rubber/silicone restrictors | Cole-Parmer | EW-95702-02 | Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| 75 x 100 mm filter paper | Sigma-Aldrich | Z695106-500EA | |
| Direct Logic 05 Programmable Logic Controller |  Koyo Electronics Industries Co, Ltd |
||
| 1 mm, 4 mm, & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing. |
| Polypropylene connectors & leur fittings | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes. |
| 65 mm Correlated Flowmeter | Cole-Parmer | EW-03216-08 | Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve. |
| OR | |||
| Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump | Aquacave |
AE-TETRA-300 | |
| LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E" | The Lee Company |
LFAA1200118H | Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW |
| PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer | RadioShack |
273-074 | |
References
- Rescorla, R. A. Behavioral studies of Pavlovian conditioning. Annu Rev Neurosci. 11, 329-352 (1988).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). Journal of Comparative Psychology. 97, 107-119 (1983).
- Giurfa, M., Sandoz, J. C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn Mem. 19, 54-66 (2012).
- Smith, B. H., Wright, G. A., Daly, K. S. The Biology of Floral Scents. Dudareva, N., Pichersky, E. , CRC Press. 263-295 (2006).
- Menzel, R., Giurfa, M. Dimensions of cognition in an insect, the honeybee. Behav Cogn Neurosci Rev. 5, 24-40 (2006).
- Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene, Apis mellifera. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Zoology. 13, 458-464 (1957).
- Menzel, R. The honeybee as a model for understanding the basis of cognition. Nat Rev Neurosci. 13, 758-768 (2012).
- Menzel, R. Neurobiology of comparative cognition. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum. 237-292 (1990).
- Hammer, M., Menzel, R. Learning and memory in the honeybee. Journal of Neuroscience. 15, 1617-1630 (1995).
- Strube-Bloss, M. F., Nawrot, M. P., Menzel, R. Mushroom body output neurons encode odor-reward associations. J Neurosci. 31, 3129-3140 (2011).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body. Front Syst Neurosci. 2, (2008).
- Fernandez, P. C., Locatelli, F. F., Person-Rennell, N., Deleo, G., Smith, B. H. Associative conditioning tunes transient dynamics of early olfactory processing. J Neurosci. 29, 10191-10202 (2009).
- Locatelli, F. F., et al. Nonassociative plasticity alters competitive interactions among mixture components in early olfactory processing. Eur J Neurosci. 37, 63-79 (2013).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23, 5370-5380 (2003).
- Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
- Hladun, K. R., Smith, B. H., Mustard, J. A., Morton, R. R., Trumble, J. T. Selenium toxicity to honey bee (Apis mellifera L.) pollinators: effects on behaviors and survival. PLoS One. 7, e34137 (2012).
- Wiegmann, D. D., Smith, B. H. International Journal of Comparative Psychology. 22, 141-152 (2009).
- Drezner-Levy, T., Shafir, S. Parameters of variable reward distributions that affect risk sensitivity of honey bees. J Exp Biol. 210, 269-277 (2007).
- Drezner-Levy, T., Smith, B. H., Shafir, S. The effect of foraging specialization on various learning tasks in the honey bee (Apis mellifera). Behavioral Ecology & Sociobiology. 64, 135-148 (2009).
- Shafir, S., Menda, G., Smith, B. H. Caste-specific differences in risk sensitivity in honeybees, Apis mellifera. Animal Behaviour. 69, 859-868 (2005).
- Smith, B. H., Menzel, R. An analysis of variability in the feeding motor program of the honey bee; the role of learning in releasing a modal action pattern. Ethology. 82, 68-81 (1989).
- Erber, J., Pribbenow, B., Kisch, J., Faensen, D. Operant conditioning of antennal muscle activity in the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Comparative Physiology A-Sensory Neural & Behavioral Physiology. 186, 557-565 (2000).
- Smith, B. H., Menzel, R. The use of electromyogram recordings to quantify odorant discrimination in the honey bee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 35, 369-375 (1989).
- Stopfer, M., Bhagavan, S., Smith, B. H., Laurent, G. Impaired odour discrimination on desynchronization of odour-encoding neural assemblies. Nature. 390, 70-74 (1997).
- Daly, K. C., Christensen, T. A., Lei, H., Smith, B. H., Hildebrand, J. G. Learning modulates the ensemble representations for odors in primary olfactory networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10476-10481 (2004).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J Neurosci Methods. 211, 159-167 (2012).
- Chandra, S. B., Hosler, J. S., Smith, B. H. Heritable variation for latent inhibition and its correlation with reversal learning in honeybees (Apis mellifera). Journal of Comparative Psychology. 114, 86-97 (2000).
- Chandra, S. B., Hunt, G. J., Cobey, S., Smith, B. H. Quantitative trait loci associated with reversal learning and latent inhibition in honeybees (Apis mellifera). Behavior Genetics. 31, 275-285 (2001).
- Hammer, M. The neural basis of associative reward learning in honeybees. Trends in Neurosciences. 20, 245-252 (1997).
- Frisch, K. The Dance Language and Orientation of Bees. , Harvard University Press. (1965).
- Daly, K. C., Smith, B. H. Associative olfactory learning in the moth Manduca sexta. J Exp Biol. 203, 2025-2038 (2000).
- Fan, R. J., Anderson, P., Hansson, B. Behavioural analysis of olfactory conditioning in the moth spodoptera littoralis (Boisd.) (Lepidoptera: noctuidae). J Exp Biol. 200. 23 (Pt 23), 2969-2976 (1997).
- Paranjpe, P., Rodrigues, V., VijayRaghavan, K., Ramaswami, M. Gustatory habituation in Drosophila relies on rutabaga (adenylate cyclase)-dependent plasticity of GABAergic inhibitory neurons. Learn Mem. 19, 627-635 (2012).
- Vinauger, C., Lallement, H., Lazzari, C. R. Learning and memory in Rhodnius prolixus: habituation and aversive operant conditioning of the proboscis extension response. J Exp Biol. 216, 892-900 (2013).
- Smith, B. H., Abramson, C. I., Tobin, T. R. Conditional withholding of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera) during discriminative punishment. Journal of Comparative Psychology. 105, 345-356 (1991).
- Smith, B. H. An analysis of blocking in odorant mixtures: an increase but not a decrease in intensity of reinforcement produces unblocking. Behav Neurosci. 111, 57-69 (1997).
- Gerber, B., et al. Honey bees transfer olfactory memories established during flower visits to a proboscis extension paradigm in the laboratory. Animal Behaviour. 52, 1079-1085 (1996).
- Rueppell, O., et al. The genetic architecture of sucrose responsiveness in the honeybee (Apis mellifera L). Genetics. 172, 243-251 (2006).
