Abstract
Insekter endre sine svar på stimuli gjennom erfaring med å knytte disse stimuli med hendelser som er viktige for overlevelse (f.eks mat, styrmenn, trusler). Det er flere atferdsmekanismer gjennom som et insekt lærer fremtredende foreninger og relaterer dem til disse hendelsene. Det er viktig å forstå dette atferds plastisitet for programmer rettet mot å bistå insekter som er gunstig for landbruket. Denne forståelsen kan også brukes for å oppdage løsninger på biomedisinske og landbruks problemene skapt av insekter som opptrer som sykdom vektorer og skadedyr. Snabel Extension Response (PER) condition-protokollen ble utviklet for honningbier (Apis mellifera) over 50 år siden for å studere hvordan de oppfatter og lære om floral lukt, som signalet nektar og pollen ressurser en koloni behov for å overleve. Den PER prosedyren gir en robust og enkel å ansette rammeverk for å studere flere forskjellige økologisk relevant mechanismer av atferds plastisitet. Det er lett å tilpasse for bruk med flere andre insektarter og andre adferds reflekser. Disse protokoller kan lett anvendes i forbindelse med forskjellige anordninger for å overvåke nevral aktivitet i CNS via elektro eller Bioimaging, eller for å manipulere målrettede neuromodulatory trasé. Det er en robust assay for hurtig påvisning av sub-letale effekter på oppførsel skyldes miljømessige stressfaktorer, toksiner eller plantevernmidler.
Vi viser hvordan PER protokollen er grei å gjennomføre ved hjelp av to prosedyrer. En er egnet som et laboratorium øvelse for elevene eller for raske analyser av effekten av en eksperimentell behandling. Det andre gir mer grundig kontroll av variabler, som er viktig for studier av adferdskondisjonering. Vi viser hvordan flere tiltak for atferdsrespons som strekker seg fra binære ja / nei til mer kontinuerlig variabel som ventetid og varigheten av snabel forlengelse kan brukes til å teste hypotheses. Og vi diskutere noen fallgruver at forskere ofte støter på når de bruker prosedyren for første gang.
Introduction
Mange insekter lære om økologisk relevante stimuli, og de deretter endre sine atferdsmessige reaksjoner på disse stimuli for å tilpasse seg nye prediktive relasjoner i deres miljø. Flere ulike mekanismer kan ligge til grunn for denne atferds plastisitet (f.eks nonassociative, assosiativ / Pavlovian, og operant / instrumental 1). Disse typer plastisitet varierer i hvordan de stimuli eller atferd er forbundet med viktige hendelser, for eksempel forekomsten av mat, en kompis, eller fare. Forstå disse formene for plastisitet er svært viktig for grunnleggende forskning på hvordan nervesystemet endrer å kode nye minner to. Det er også viktig for å forstå de adaptive atferd av insekter som er viktige vektorer for sykdom (f.eks tsetse og mygg) og insekter som er landbruksmessig viktig, enten i planteproduksjon (honningbier) eller som skadedyr.
Studerer atferds plastisitet i noen animal krever et nivå på eksperimentell kontroll over en rekke variabler som ikke er oppnåelig i felt 1.. Det krever utviklingen av en robust kondisjone protokoll som kan benyttes under mer kontrollerte betingelser, men som fremdeles er relevant for problemet under naturlige betingelser. Honey Bee (Apis mellifera) er en utmerket modell for hvordan man kan utvikle en protokoll for å utføre kontrollerte analyser av atferds plastisitet 3,4. Snabel Extension Response (PER) på honningbier er en naturlig atferds refleks hvori honningbie utvider proboscis som reaksjon på antennal stimulering med en sukkeroppløsning. Under normal foraging atferd, oppstår PER når honningbie finner nektar i en blomst. Heldigvis vil honningbier lett oppviser denne enkle og lett å kvantifisere oppførsel i laboratoriet. Dette gjør det mulig å studere, i en kontrollert setting, hvilke mekanismer som påvirker dette økologisk relevant atferd fem. PER can også brukes innen en condition-protokollen for å undersøke stimulans persepsjon og læring og hukommelse under ulike behandlingsforhold, som er designet for å avsløre de atferdsmessige og nevrale mekanismer som ligger til grunn for plastisitet seks.
Siden de første studiene av Kuwabara 7, har PER conditioning vært mye brukt for å avsløre nonassociative, assosiativ og operante mekanismer som ligger til grunn for atferds plastisitet i honningbier åtte. Disse mekanismene er identiske med de avslørt i studier av fritt flyr honningbier ni. I motsetning til studier av fritt flyr honningbier, kan PER condition protokoller være kombinert med elektrofysiologi 10,11 eller live-cell fluorescens bildebehandling 12-14 av hjernen. Videre PER protokollene tillater for eksperimentell manipulering av nervebaner via farmakologiske eller molekylærgenetiske behandlinger for å teste hypoteser om rollene til bestemte komponenter i nettverket, for eksempel NEURomodulators 15,16. PER protokoller har også gitt en viktig måte å evaluere sublethal effektene av miljømessige forhold samt giftstoffer på helse og beite effektiviteten av honningbier 17.
Denne prosedyren beskriver to lukt leveringsmetoder i parallell. Metode 1 er en versjon av lukt og ubetinget stimulus (sukrose) leveranse som gir en rimelig og teknisk enkel metode for å presentere lukt og sukrose belønning. Denne metoden er bra for grunnleggende opplæring og når automatisering er ikke mulig. Det er en utmerket måte å introdusere denne teknikken til et klasserom eller undervisning laboratorium. Under condition for forsøk med vanskeligere oppgaver og kombinert fysiologiske vurderinger av lukt persepsjon, læring, eller minne, er det svært viktig å nøyaktig og presist regulere utbruddet, varighet levering timing av stimuli. For de mest pålitelige stimulans levering, bruke et middel for å automatisere lukt levering ennd en nøyaktig metode for belønning levering. Metode 2 benytter automatisert lukt levering og mer presis sukrose levering. Det er teknisk mer avansert og krever mer for det første oppsettet enn metode 1, men det øker konsistensen av timing og mengde stimuli som brukes for condition og bør brukes når det er mulig.
Protocol
1. Lukt (betinget stimulus) Cartridge Setup
- I begynnelsen av forsøket, setup flere lukt patroner for alle de forskjellige lukter som trengs for condition prøvelser.
- Bruk en avtrekkshette for lukt fortynning og luktpatron forberedelse. Aldri åpne flasker med lukt utenfor at avtrekkshette, siden lukt vil spre seg raskt gjennom hele lab og potensielt utsette honning bier til lukt før kondisjonering. Også, bruk hansker når du setter opp luktpatroner og vask grundig etterpå for å unngå å utsette de honningbier for lukt mens du håndterer dem.
- Sørg for at hver lukt patron er tydelig merket med en fargekodet etikett av lukt som første gang det brukes. Bruk aldri en lukt patron (sprøytesylinderen eller stempelet) for mer enn ett lukt, siden det kan være gjenværende lukt på kassetten.
- Forbereder lukt og lukt blandinger
- Fortynn lukt i enten heksan eller mineral-olje til desired konsentrasjon.
MERK: Endring av konsentrasjonen av lukt eller presentere blandinger av to eller flere dufter kan gi rom for undersøkelse av flere aspekter av hvordan bier fornemme lukt og lære den betingede foreningen. Lukt blandinger kan være så enkelt som en 50:50 binær blanding eller så komplisert som flere lukt som etterligner naturlige olfactory stimuli. Redusering av konsentrasjonen til lukt øker også vanskeligheten av oppgaven.- Lukt vil bli utarmet med gjenbruk av patronen (figur 2). For å unngå problemer fra utarming gjør nok patroner til å være i stand til å bytte til en ny patron hver 10-12 bruker.
- Fortynn lukt i enten heksan eller mineral-olje til desired konsentrasjon.
- Forbereder Lukt Patroner
- Metode 1
- For denne fremgangsmåten ved å bruke 20 ml plastsprøyter med en 15 mm diameter sirkelfilterpapir festet til gummi enden av stempelet for lukt patroner.
- Fjern stempelet fra sprøyten og bruk en stift til å feste stykke filter papir til enden av stempelet.
- Bruk en mikropipette å plassere 10 mL av lukt på filterpapiret, og sett stempelet inn i sprøytesylinderen. Skyv stempelet til 15 ml på sprøyten.
- Metode 2
- For denne fremgangsmåten ved å bruke en cc glass eller plastsprøyter tuberkulin (eller modifiserte pipetter av tilsvarende volum og form) med en strimmel av filterpapir og en inne i gummi eller silikon struping i den brede ende av sprøytesylinderen for de lukt patroner.
- Fjern stempelet fra en 1 cc tuberkulin sprøyten. Den sprøytesylinderen blir legemet av lukt patronen.
- Fjern den sorte gummispissen fra sprøytestemplet og avskåret den lukkede ende av gummispissen.
MERK: Denne gummiring vil fungere som en restriksjon for å redusere suge fra luftstrømmen i arenaen, som vil tidlig trekke lukt ut av kassetten og over behersket honningbie. Alternativt, silikonslanger (4,8 mm outer diameter) kuttet i 5 mm seksjoner fungere som stoppere.
- Skyll innsiden av sprøytesylinderen og gummi / silikon struping med 70% etanol (for å fjerne mye av den gjenværende lukt fra tidligere bruk) og la dem lufttørke.
- Plasser en 0,2 x 4 cm strimmel av filterpapir i den vide åpning av sylinderen slik at papiret strekker seg 1-2 cm utover åpningen.
- Bruk en mikropipette for å plassere 3-10 pl av lukt på filterpapir uten å la den lukt berører enden av sprøytesylinderen. Pipettespissen kan gjenbrukes for samme lukt, men sørg for å bruke et friskt tips å sette opp neste lukt.
- Drei bred åpning av sprøytesylinderen oppad slik at filterpapiret glir raskt inn i røret. Sett struperen i den vide åpning av sprøytesylinderen.
- Sørg for at hver lukt patron er tydelig merket med en fargekodet etikett av lukt første gang det brukes for. Bruk aldri en lukt patron (sprøyten eller restrictor) for mer enn ett lukt, siden det kan være gjenværende lukt på den.
- Ball opp i enden av en lofri vev, suge det med 70% etanol, og bruke den til å tørke grundig den ytre overflate av patronen for å fjerne eventuell gjenværende lukt på utsiden av patronen.
- Metode 1
2. Innsamling, besøksforbud, og Feeding the Bees
- Forbereder Bee tilbakehold Seler
- Lage enkle tilbakehold seletøy for honningbier ut av plast brus sugerør, hard plast rør, eller maskinert metallrør (alle er ca 0,9 cm indre diameter og har 1-2 mm veggtykkelse). Bruke kraftigere seletøy for prosedyrer som involverer kirurgi.
- Kutt 3 cm seksjoner av slangen. Deretter delvis trimme bort omtrent halvparten av de øverste 1 cm av selen for å gjøre det enklere å holde biene på plass mens du fester selen.
- Skjær en 0,2 x 6 cm stripe av duct tape og fest den ene enden til den ene siden av bee sele, leatreråvare den andre enden gratis.
- Samle Worker Bees
- Samle arbeidere fra inngangen til kolonien som de pause før avgang fra kolonien eller som de kommer tilbake fra beite.
MERK: Plassere et stykke netting, med hull akkurat stort nok for arbeideren bier å krype gjennom, over inngangen bremser de hjemvendte arbeidere ned og gjør det lettere å fange dem før de kommer inn i kolonien. - Plasser en scintillasjonskyvette over bee før den flyr opp i det. Hold hetteglasset med åpningen sin horisontalt eller vendt nedover mens lokket er festet slik at biene ikke fly opp av hetteglasset. Plasser bare en bie i hvert hetteglass. Pass på at lokket har et hull i den for å tillate tilstrekkelig gassutveksling.
- Samle biene raskt for å minimere den tiden de tilbringer i hetteglassene. Oppbevar hetteglassene med bier i dem i en liten boks i skyggen.
- Overfør boksen med hetteglass og bier til laboratoriet, og plasser hetteglass i en is-vann slUrry til biene slutter å bevege seg. Når en bie er immobile, fjerne flasken fra isen umiddelbart for å unngå overeksponering for kulde, og plasser bee inn en begrensende sele.
MERK: Vi anbefaler ikke å plassere biene i kjøleskapet eller fryseren siden det er vanskelig å overvåke når biene blir immobile, noe som resulterer i overdreven eksponering for kulde. Ved å utnytte mer enn 10 bier, overfører bare et par bier til is-vann-oppslemming på en gang.
- Samle arbeidere fra inngangen til kolonien som de pause før avgang fra kolonien eller som de kommer tilbake fra beite.
- Restraining the Bees
- Plasser bie i selen med sin dorsal thorax vender bortskårede parti av slangen og dens hode like over toppen av produksjonsrøret. Trykk forsiktig bee nær slangen slik sine munndeler går ut over kanten av slangen. Skyv stripe av tape inn mellom hodet og brystkassen på den dorsale side av bie og godt feste den frie ende til siden av selen.
- Pass på at tapen på selen er glatt og stram. Det bør ikke være noticeable gapene mellom fronten av bie sele og båndet, og båndet skal ligge flatt på toppen av selen. Hvis det er hull bee kan ikke være i stand til å utvide sin snabel riktig måte, ellers kan unnslippe. Sørg også for at det Bie forbena er ikke fremtredende mellom forsiden av sele og duct tape.
- Plasser bie i selen med sin dorsal thorax vender bortskårede parti av slangen og dens hode like over toppen av produksjonsrøret. Trykk forsiktig bee nær slangen slik sine munndeler går ut over kanten av slangen. Skyv stripe av tape inn mellom hodet og brystkassen på den dorsale side av bie og godt feste den frie ende til siden av selen.
- Fôring av bier og fôring Conditioning Intervall
- Ca 30 min etter utnyttelse - etter biene har gjenopprettet fra første installasjon - mate biene 3-4 mL 0,5 M sukrose (i vann). Denne mengde vil være tilstrekkelig for en mate-for-kondisjone intervall på 3-4 timer.
- Generelt, mate en ul 0,5 M sukrose for omtrent hver time ventetid mellom fôring og condition for å sikre at biene overlever intervallet ennå er sulten nok på begynnelsen av condition for å bli motivert til å lære den betingede foreningen. I et laboratorie-holdt på en varm temperatur, eller hvis usynge en annen konsentrasjon av sukrose, justere mengden matet eller tidsintervallet tilsvarende.
MERK: Med en fôring til conditioning intervall på 24 timer, sørge for at alle biene fôres til metning med 0,5 eller 1 M sukrose i minst 24 timer før condition vil begynne. Ved romtemperatur, bier krever omtrent 24 timer før de blir motivert nok til å svare godt i et kondisjoneringsprotokoll.
MERK: Bruk en lavere konsentrasjon av sukrose-løsning for mating av biene enn den konsentrasjon som brukes som en belønning under kondisjonering for å hindre at biene i å bli mindre følsom for konsentrasjonen av sukrose som brukes under kondisjonering, noe som kan redusere læreytelse 18.. - Mate biene i et område godt unna treningsområde. Eksponering for det ubetingede stimulus (sukrose) i condition sammenheng før condition kan påvirke påfølgende condition til lukt.
- Generelt, mate en ul 0,5 M sukrose for omtrent hver time ventetid mellom fôring og condition for å sikre at biene overlever intervallet ennå er sulten nok på begynnelsen av condition for å bli motivert til å lære den betingede foreningen. I et laboratorie-holdt på en varm temperatur, eller hvis usynge en annen konsentrasjon av sukrose, justere mengden matet eller tidsintervallet tilsvarende.
- Under intervallet mellom foring og conditioning plassere biene på benken i et rolig område av lab for å unngå unødig forstyrrelse. Hvis laboratoriet har lav luftfuktighet, plasserer bier i en plastbeholder med fuktige papirhåndklær i løpet av tidsintervallet. Dette forhindrer uttørking, siden biene kan dø hvis de blir utsatt for lav fuktighet i lengre tidsperioder.
MERK: Ikke endre utnyttelse og fôring protokollen innen et eksperiment! Bruk bare ett bestemt tidsintervall mellom å sette opp og fôring bier og begynner condition for hvert forsøk så biene blir alle behandlet på nøyaktig samme måte.
- Ca 30 min etter utnyttelse - etter biene har gjenopprettet fra første installasjon - mate biene 3-4 mL 0,5 M sukrose (i vann). Denne mengde vil være tilstrekkelig for en mate-for-kondisjone intervall på 3-4 timer.
3. Conditioning
- Testing for Sukrose Følsomhet
- Et par minutter før du begynner condition, teste bienes motivasjon til å mate ved å berøre antennene sine med en liten dråpe med 0,5 M sukrose løsning (samme konsentrasjon som brukes under fôring). Ikke tillate dem å mate under denne testen. Hvis de virker etter extending sin snabel, er de sannsynligvis tilstrekkelig motivert til å lære og kan brukes for protokollen.
- Eksperiment Design
MERK: Denne protokollen kan bli endret for å passe et bredt spekter av lærings protokoller for å undersøke mange aspekter av honningbier læring og minne evner. Blant de mange parametere som kan justeres er den: Inter-rettssaken intervall, antall bier trente på et gitt tidspunkt, inter-stimulus intervall, type og konsentrasjon og antall lukt, type og konsentrasjon av ubetinget stimulus, antall og rekkefølge av forsøkene (figur 1, tabell 1) 19-21. Ved utforming nøyaktig protokoll for hvert condition rettssaken, er det svært viktig å holde inter-rettssaken intervall konsekvent på tvers av individer. En inter prøveintervallet som er for kort, for lang eller inkonsekvent vil svekke biene prestasjoner. Se diskusjonen for en full behandling av dette temaet.
MERK: Bees vil lære oppgaven raskere hvis de er i et varmt miljø. Derfor holde temperaturen av opplæringen miljø konsistent og varm (29-30 ° C hvis mulig). - Leverer Lukt (betinget stimulus)
- Metode 1
- Sette opp Lukt Delivery System
- Monter plast 20 ml sprøyte lastet med lukt-behandlet filterpapir så det er stabil og den lille enden vender direkte på bee antenner. Sett stempelet på 15 ml mark og plasser sprøyten så stempelet er lett tilgjengelig.
- Presenterer lukt Stimulus
- I begynnelsen av hvert forsøk, plasser bie i selen på pinne i condition arena med sine antenner rettet direkte mot lukt kassetten. La bee akklimatisere seg til arenaen for 15-25 sek før du starter lukt stimulans for å redusere avbrudd forårsaket av brå endring i sine visuelle omgivelser i løpet av lukt stimulans.
- Hvis biene begynner å svare på lukt patronen umiddelbart etter at den er plassert i condition arena, kan det være lukt på kassetten tips. Fjern forurensende lukt ved å vaske ut patronen med en lofri vev dyppet i 70% etanol. Hvis det ikke løser problemet, bytter du ut patronen.
- Trykk stempelet på sprøyten i en jevn takt så stempelet er helt deprimert innen 4 sek. Overvåk bee svar på lukt før presentere den ubetingede stimulus.
- Etter hvert forsøk, la bee å hvile i condition arena for en annen 15-25 sek. Flytte bee for tidlig å følge rettssaken vil redusere effektiviteten til hver condition rettssaken.
- I begynnelsen av hvert forsøk, plasser bie i selen på pinne i condition arena med sine antenner rettet direkte mot lukt kassetten. La bee akklimatisere seg til arenaen for 15-25 sek før du starter lukt stimulans for å redusere avbrudd forårsaket av brå endring i sine visuelle omgivelser i løpet av lukt stimulans.
- Sette opp Lukt Delivery System
- Metode 2
- Sette opp Lukt Delivery System
- Airflow Source og Flow Rate
- Som kilde luftstrøm for lukt leveringbruke et akvarium aerator pumpe eller en laboratoriebenk trykklufttilførselen, hvis laboratoriet er utstyrt med den.
MERK: En typisk akvarium aerator pumpen vil ha en luftstrøm hastighet nær 400 ml / min (7 ml / sek); over 4 sek lukt stimulus, blir 28 ml av luft strømme gjennom en 1 ml patron. - Bruk en strømningsmåler i samsvar med slangen for lufttilførselsapparat for å regulere strømningshastigheten for lufttilførselen. Juster strømningsmåleren til strømningshastigheten er 400 ml / min. Kontroller strømningshastigheten ved åpningen av lukt patron med en separat strømningsmåler.
- Koble luftstrømmen til lukt patron gjennom et system av plastrør og ventiler.
MERK: Tidspunktet enhet omtalt nedenfor åpner ventilene på riktig tidspunkt i rettssaken. Plast kontakter feste luftstrømmen systemet til lukt patron gjennom en Luer typen vedlegg til kassettens sprøyten. - Uavhengig av luftstrømmen kilden, kontrollere strømningshastigheten periodisk til make at linjen er intakt, og strømningshastigheten ble holdt på den ønskede hastighet.
- Som kilde luftstrøm for lukt leveringbruke et akvarium aerator pumpe eller en laboratoriebenk trykklufttilførselen, hvis laboratoriet er utstyrt med den.
- Airflow Source og Flow Rate
- Automatisert Lukt Levering
- Bruk en programmerbar logisk styring (PLS) til å automatisere levering av lukt.
MERK: PLC er programmert til å åpne ventilene til lukt levering luftstrøm 6 sek etter oppstart av programmet (initiert ved å trykke på en knapp), holde ventilene åpne for 4 sek, og avgir en hørbar fôring signal, via en liten høyttaler, 3 sek etter lukt stimulans utbruddet å signal eksperimentator å levere sukrose. - Bruk en liten LED for å indikere timingen av lukt stimulans under hvert forsøk. Hvis det er mulig å bruke en rød LED, fordi bienes fotoreseptorer er flyttet bort fra lengre [Red] bølgelengder og mot kortere [uv] bølgelengder, slik at de ikke kan se det godt. Plasser LED bak og under bee, utenfor deres synsfelt, slik at lyset ikke vil bli en utilsiktet betinget stimulus.
MERK: LIGht hjelper også kontrollere at PLC fungerer ordentlig, og er nyttig i å analysere videoopptak av bier svar under testing prøvelser.
- Bruk en programmerbar logisk styring (PLS) til å automatisere levering av lukt.
- Eksossystemet
- Sett opp et eksosanlegg bak bee å hjelpe trekke luften forbi bie og å evakuere lukt-laden luft fra condition arena for å opprettholde en diskret tidsramme for hver presentasjon av lukt.
MERK: Hvis det er et vakuum system i laboratoriet, endre vakuum port og legge ved en kanal for tørketrommel slangen for å gi luftstrømmen som kreves for å evakuere condition arena. Hvis det ikke er et vakuum system, en liten elektrisk vifte plassert i tråd med tørketrommelen slangen ført til et avtrekksskap eller gjennom et vindu vil være nok.
- Sett opp et eksosanlegg bak bee å hjelpe trekke luften forbi bie og å evakuere lukt-laden luft fra condition arena for å opprettholde en diskret tidsramme for hver presentasjon av lukt.
- I begynnelsen av hver dag, sjekk de elektriske og lufttilkoblinger av lukt leveringssystemet og eksosanlegget. Trykke på startknappen på lukt levering system og spore tiden mellom å trykke påknappen og når ventilene åpne (en rolig klikk og LED-lyset kommer på), og når køen for å presentere den ubetingede stimulus (en hørbar tone). Kontroller luftlevering ved å plassere en fingertupp fuktig foran kontakten som vil bli festet til lukt patronen. Det bør være en sterk luftstrøm bare når ventilene er åpne. Sjekk eksossystemet ved å holde en lofri vev opp til åpningen av eksosanlegget for å sørge for at luftstrømmen er sterk nok til å skikkelig evakuere luft fra condition arena.
- Sette opp Lukt Delivery System
- Montere Lukt Cartridge
- Plassere noen modelleire enten på benken eller på en liten pleksiglass stå å plassere bie og lukt patron rett foran eksosanlegget. Sett glasset lukt sprøyten i leire og justere den slik at åpningen i den brede enden er rettet mot bee hode. Den enden av sprøyten bør være 1-2 cm fra bee. Plukk en avstand innenfor dette området og være konstant.
- Sikkert plassere beslaget forbinder patronen til luftslangen og ventilsystem over smale slipt glass enden av sprøyten.
- Presenterer lukt Stimulus
- I begynnelsen av hver studie plasser utnyttet bee på pinne i condition arena med sine antenner rettet direkte mot lukt kassetten. La bee resten i arenaen for 15-25 sek før du starter lukt stimulans for å tillate det å bli vant til sine nye omgivelser.
MERK: Hvis biene begynner å svare på lukt kassetten umiddelbart etter å ha blitt plassert i condition arena, kan det være lukt på kassetten tips. Fjern forurensende lukt ved å vaske ut patronen med en lofri vev dyppet i 70% etanol. Hvis det ikke løser problemet, bytter du ut patronen. - Trykk på startknappen for å starte timing mekanismen for lukt levering. Overvåk bee svar på lukt etter stimulusutbruddet og før presentasjon av ubetinget stimulus.
- Etter hvert forsøk, la bee å hvile i condition arena for en annen 15-25 sek for å tillate første minne formasjon. Flytte bee for tidlig å følge rettssaken vil redusere effektiviteten til hver condition rettssaken.
- I begynnelsen av hver studie plasser utnyttet bee på pinne i condition arena med sine antenner rettet direkte mot lukt kassetten. La bee resten i arenaen for 15-25 sek før du starter lukt stimulans for å tillate det å bli vant til sine nye omgivelser.
- Metode 1
- Leverer Sukrose (ubetingede stimulus)
- Metode 1
- For denne fremgangsmåten ved å bruke en tannpirker for å levere sukrose.
MERK: Det er best å bruke en plast tannpirker siden tre tannpirkere kan ha en lukt som vil påvirke bienes svar til betinget stimulus. - Dyppe av tannpirker inn i sukrose-løsning, og, når det er tid for å presentere den ubetingede stimulus, holder tannpirkeren foran bie og tillate bie å slikke sukrose fra tannpirker i omtrent 1 sek.
- Sett på tannpirker regelmessig for å unngå opphoping av suCrose.
- For denne fremgangsmåten ved å bruke en tannpirker for å levere sukrose.
- Metode 2
- Sukrose Delivery System
MERK: En mer nøyaktig måte for å levere den ubetingede stimulus er gjennom bruk av mikrometer sprøyter, som nøyaktig kan levere små mengder (tideler av en mikroliter) av sukrose belønning.- Vikle mikrometer av sprøyten tilbake så langt som mulig. Laste mikrometer sprøyten med sukroseløsning. Pass på at det ikke er noen bobler i glasset del og montere sprøyten. Fyll hub av nålen med sukroseløsning før du legger den på den smale enden av sprøyta. For å sikre at væske i nålen er faktisk sukrose og ikke vann fra vask nålen, vikle mikrometer frem 1-2 mL før du starter eksperimentet.
- Sukrose Delivery System
- Sukrose Presentasjon
- Hold tuppen av nålen omtrent 2 cm fra det bie mens lukt er presentert. Bruk kanten av treningsarena for å hindreristing sprøyten som bevegelsen kan distrahere bee. Ikke få nålen for nær i påvente av fôring signal, siden det vil også tidlig skifte bee oppmerksomhet fra lukt til sukrose.
- Så snart høres fôring signal, så vidt berører antennene til bee utvider sin snabel, deretter mate bee. Dette bør kreve bare en veldig lett berøring eller to til antennene.
- Bruk en belønning beløp mellom 0,2 og 0,8 mL. Bee bør lett konsumere hele dråpe innenfor tidsperioden tildelt for ubetinget stimulus (~ 1-2 sek). Ikke bruk "ad libitum" mating fra en stor dråpe, som biene strømmer på i flere sekunder, men kan ikke helt forbruker.
- Se for sukrose bygge opp på antennen, noe som vil redusere bee respons til senere presentasjoner av belønning. Endre fôring prosedyren hvis dette skjer.
- For å sikre nøyaktig sammenkobling av luktcue og sukrose belønning, sørg for å presentere dråpe sukroseløsning til bee så snart som mulig etter pipetonen.
MERK: Timing mellom utbruddet av CS (lukt) og USA (sukrose) er kritisk. Ideelt sett bør lukt presentasjon og sukrose presentasjon kort overlapper hverandre. Hvis mer enn noen få sekunder er gått mellom enden av CS og levering av USA, vil kondisjone ytelse avtar.
- Metode 1
4. Testing
- Etter condition bruk uarmerte test forsøk for å vurdere hvor godt biene lærte og / eller huske den betingede foreningen.
MERK: Se diskusjonen for en detaljert forklaring om viktigheten av å analysere bienes svar til uarmerte testforsøk i tillegg til biene prestasjoner i de condition prøvelser og en forklaring av hensikten med antall testforsøk og test lukt. - Konsolidering Tid
- Ettercondition, enten administrere en umiddelbar test rettssak eller la biene å hvile gjennom en konsolideringsperiode.
MERK: Lengden på perioden som er konsolidert, tidsintervallet mellom kondisjonering og testing, vil avhenge av Målet med eksperimentet. Hvis formålet er å undersøke læringsforskjeller eller korttidshukommelsen, kan biene prestasjoner på testforsøk vurderes umiddelbart etter eller flere timer etter condition. Hvis forsøket innebærer å undersøke langtidshukommelsen, bør testforsøk gis minst 24 timer etter avsluttet condition. - Hvis test studier er mer enn 24 timer etter condition, mate biene til metning med 0,5 M sukrose følgende condition og minst en gang per dag etterpå inntil 12-24 timer før testforsøk.
- Å sørge for at biene har nådd metning, mate hver av dem flere forskjellige tider inntil de ikke lenger utvide sine snabel i respons til å berøre deres antenneE med sukrose. De kan forbruke så mye som 40 pl for å nå metning.
- Hold biene i en fuktet beholder for å hindre deres uttørkende og dø i løpet av konsolideringsperioden.
- Ettercondition, enten administrere en umiddelbar test rettssak eller la biene å hvile gjennom en konsolideringsperiode.
- Test Trials
- Bruk bare nypreparerte lukt patroner for testing.
MERK: De patronene som brukes for erverv forskjellig vis kan bli oppbrukt, så testen stimulus ikke vil være konsistente på tvers prøvelser, lukt, og individuelle bier, og derfor kan ha betydelig innvirkning på konsistens og robusthet av resultatene. - Under testing opprettholde den samme inter-prøveintervall og andre parametere som benyttes i kondisjoneringsfasen av forsøket.
- Ikke presentere den ubetingede stimulus i løpet av testforsøk, siden tilstedeværelse av en belønning vil forandre humle reaksjon på det kondisjonerte stimulus, potensielt maske mer subtil virkning av kondisjoneringsprotokoll eller en behandling.
- Rekord videoer av alle of testforsøk for å være i stand til senere å måle flere aspekter bier responser til lukt (e).
- Bruk bare nypreparerte lukt patroner for testing.
5. Opptak Bees 'Responses
- Binary (Presence / fravær) Scoring av PER
- Bruk en binær scoring system av PER under condition forsøk og etter testing prøvelser. Resultat svar som enten positiv eller negativ; dette er tilfredsstillende for mange typer analyser med en utvalgsstørrelse på 20-40 bier per behandlingsgruppe. Den nøyaktige topologi av svarene kan være komplisert 22. Det er viktig å etablere en enkel å se og score kriterium for en positiv respons.
- Resultat en bie svar som positive (+) når bee utvider sin snabel utover linjen gjort ved å koble tips av de åpnede underkjever. Bare score en positiv respons når bee utvider sin snabel etter lukt utbruddet men før lukt offset.
- Resultat en bie svar som negativ (-) når det ikke er eXtension av snabel under rettssaken eller hvis snabel er utvidet etter at forskyvningen av odorant.
- Unngå å prøve å score partielle responser. For å gjøre finere distinksjoner i bienes adferd, bruke videoanalyse teknikken beskrevet nedenfor.
- Bruk en binær scoring system av PER under condition forsøk og etter testing prøvelser. Resultat svar som enten positiv eller negativ; dette er tilfredsstillende for mange typer analyser med en utvalgsstørrelse på 20-40 bier per behandlingsgruppe. Den nøyaktige topologi av svarene kan være komplisert 22. Det er viktig å etablere en enkel å se og score kriterium for en positiv respons.
- Videoanalyse av ekstra per Measurements (Movie 1)
- Innhente ytterligere opplysninger fra atferdstester ved å analysere videoer av en bie reaksjoner til en lukt.
MERK: Disse målingene kan også gi en høyere tidsoppløsning for undersøkelse av bienes svar på lukt, spesielt når det ikke er en forskjell i nærvær / fravær scoring av PER mellom behandlingsgruppene. - Spille inn videoer
- Bruk alltid uarmerte test eller utryddelse prøvelser for videoopptak. Tilstedeværelsen av belønningen vil forandre biene respons på lukt, kan endring av varigheten av proboscis forlengelse.
- Still et videokamera på et stativ over treningsarena og fokusere kameraet på forsiden av bee hode, så antennene og snabel er i skarp fokus.
- Plasser den lille LED-lys, noe som indikerer lukt stimulus presentasjon, i et område bak bee som er synlig i videoen for å bruke den til å identifisere lukt utbruddet og offset under analysen.
- Begynne innspillingen 20 sek før lukt utbruddet og fortsette innspillingen i minst 20 sek etter lukt utlignet før forstyrre bee.
- Video Analysis
- Last opp videoer i videoredigeringsprogramvare, for eksempel iMovie eller Final Cut Pro, med evnen til å måle tidsintervaller mellom spesifikke rammer i videoen.
- Analyser biene respons på lukt for en diskret tidsperiode som begynner ved begynnelsen av lukt stimulus (for eksempel 10 eller 20 sek).
- Bruk følgende vanlige målinger for å vurdere PER:
- MålVarigheten av proboscis forlengelse, som er den totale tid som snabel strekker seg utover kjeven til kjeven linje (beskrevet ovenfor).
MERK: En bie kan utvide og trekke tilbake sine snabel flere ganger i løpet av 10-20 sek tidsvinduet. Måle hver snabel forlengelse individuelt, og beregne den totale varigheten. Analysere antall og varighet av hver enkelt snabel forlengelse kan også gi verdifull informasjon. - Måle latency av snabel forlengelse, som er tiden mellom lukt utbruddet, når LED-lampen lyser, og den første snabel forlengelse.
- Grev og tid Glossal utvidelser i forhold til angrep av odorant, den første forlengelse, eller på andre tidsparametrene.
- Spor antennal bevegelser 23, som også viser karakteristiske lukt-orientert endringer.
MERK: I Movie 1, antennal bevegelsene har blitt sporet med video sporing programvare for å illustrere endringen i antennal bevegelser in som reaksjon på en stimulus lukt.
- MålVarigheten av proboscis forlengelse, som er den totale tid som snabel strekker seg utover kjeven til kjeven linje (beskrevet ovenfor).
- Innhente ytterligere opplysninger fra atferdstester ved å analysere videoer av en bie reaksjoner til en lukt.
Representative Results
Vi presenterer to eksempler på bruk av PER-protokoller som er beskrevet ovenfor. Det første eksemplet gjort bruk av Metode 2 for å studere hvordan honningbier oppfatter forskjellige lukter som en funksjon av den molekylære likheten til lukt brukes som CS 5,24,25. Det andre er et eksempel på bruk av metode 1, og noen av de forholdsregler som må tas når det begynner å bruke PER kondisjoneringseksperimenter i forskningslaboratoriet.
Studier som dette har blitt brukt for å beskrive lukte 'perseptuelle space' av honning bier og møll i forbindelse med Bioimaging 13 eller elektrofysiologisk analyse 26. Honningbier (n = 20) ble kondisjonert til å knytte odorant dekanal med sukrose forsterkning over 12 termin sammenkobling condition studier (figur 3A). Omtrent 10% av honningbier svarte 'spontant' på den første rettssaken, noe som er normalt. Etter at andelen som responded øke over de neste par forsøk til 100% av honningbier reagerte på den femte rettssaken og hver påfølgende rettssaken. Flere studier har vist at denne økningen i respons er spesifikk for fremover sammenkobling tilstand (figur 1) i forhold til flere viktige kontrollrutiner tre. Etter kjøpet fasen, ble hvert honningbie utsatt for en serie av uarmerte testforsøk (figur 3B), som er involvert eksponering for lukt CS og flere andre dufter som systematisk avvek fra CS i molekylstrukturer. Honningbier reagerte sterkest til CS. Deres svar på de andre odorants redusert som en funksjon av de systematiske endringer i struktur, med de laveste svarene på odorants minst som CS.
I Figur 4 viser resultatene fra en nylig workshop der elevene lærte, for første gang, hvordan tilstanden honningbier bruker Metode 1 er illustrert. Studenter firs t kondisjonerte honningbier ved termin sammenkobling methycyclohexanone (MCH) eller oktanol (OCT) med sukrose forsterkning (Figur 4A). Prosent svar var lavere på den første rettssaken og økt på etterfølgende studier indikerer at biene lærte lukt-sukrose foreningen. Det var forskjeller i graden at biene lærte betinget forening på tvers av ulike grupper av studenter. Etter vår erfaring, kan slike forskjeller skyldes den lukt som ble brukt som CS, til den upresise elementer i metode (Metode 1), eller til treningsnivå av forskere. I det tredje tilfellet, blir ytelsen raskt mer i samsvar med de forskere 'økt opplevelse. Etter kondisjonering, ble hver honningbie testet to ganger med hver lukt. I grupper av honningbier som hadde vært betinget med fremover sammenkobling av OCT eller MCH, svaret var, som forventet, den sterkeste til den betingede lukt (Figur 4B).
ent "> Den andre gruppen av honningbier som opplevde frem sammenkobling til oktober var betinget i parallell til en annen gruppe der lukt oktober ble bakover sammen med sukrose. Bakover sammenkobling er en av flere typer kontrollprosedyrer for å demonstrere at økningen i respons er bestemt til å videresende sammenkobling og ikke på grunn av en annen prosess, slik som ikke-spesifikk aktivering fra sensibilisering. For bakover sammenkobling, sukrose US lukt og CS er presentert i omvendt rekkefølge til det som er vist i figur 1. Datainnsamlingen fra bakoverkoblingen finnes ikke vist fordi CR ikke kan gjøres det gitt presentasjonen av lukt CS etter presentasjon av sukrose. som ville bli forutsagt for assosierende kondisjoneresponsnivåene til oktober var høyere i den fremre sammenkoblet gruppe i forhold til den bakre gruppe (figur 4C).7fig1highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 1. Diagrams av eksperimentell design for condition med skrå sammenkobling. Se tabell 1 for definisjoner av begrepene som brukes i dette tallet. (A) CS (lukt) forut og overlapper med USA (sukrose / vann-løsning). Forholdet mellom CS og USA vist er optimal for condition honning bier og møll. Men den optimale ISI kan stole på condition protokollen og dyrearter en. (B) Assistanse og relativ timing av CS, CR, US, og UR. CR som skjer enten før US presentasjon eller under uarmerte "test" prøvelser er den avhengige tiltak for eksperimentelle protokoller.
Figur 2. Lukt uttømming med gjenbruk av patroner. For disse dataene, lukt patroner varset-up med heksanol som beskrevet i teksten. Hexanol er ofte brukt som en CS i PER studier; imidlertid vil den faktiske frekvensen av uttømming avhenge av lukt og løsningsmiddel. Kassetter ble deretter brukt en gang for 4 sek hvert minutt over åtte studier (forutsatt 5 honningbier / rettssak i en standard eksperiment som ville tilsvare 40 bruksområder). Fortynningene i det angitte oppløsningsmiddel, som var relativt standard for PER eksperimenter, var 2,0 M (A) og 0,2 M (B). (A, B) Lukt ble prøvetatt etter den første og den åttende forsøk ved adsorpsjon på en fast fase Microextraction (SPME) fiber som deretter ble desorbert inn på en gasskromatograf. De relative områder under toppene var høyere etter den første rettssaken i forhold til det åttende for både løsemidler og for begge konsentrasjoner (Wilcoxon matchet par signert rank test p <0,05 [*] eller høyere), som viser at mindre lukt ble levert fra kassetten etter at patronen har blitt brukt et antall ganger. (C, D) de samme data som viser bare den åttende tr IAL med y-aksen utvidet. Den viser at uttømming var noe større enn for heksan i forhold til mineral-olje, men bare ved lavere konsentrasjon.
Figur 3. Erverv og test med dekanal som CS og metode 2 til condition. (A) Trial-by-rettssaken respons (CR) over 12 termin sammenkobling studier (figur 1). Dataene er hentet fra n = 20 honningbier klimaanlegg i fire grupper på 5 honningbier hver. Den ISI var 3 sek og ITI var 6 min. (B) uarmert tester ved hjelp av lukt som er forskjellig fra dekanal av karbonkjedelengde og / eller posisjonen av karbonylkarbonet. Lukt ble presentert i en randomisert serie på tvers av de fire grupper, og ble ispedd forsterkede forsøk med dekanal (hver to til tre studier) for å unngå utryddelse av CR.
Figur 4. Data fra en workshop der hovedfagsstudenter ble opplært til tilstanden honningbier bruker PER metode 1. (a) Kjøp data fra tre grupper av honningbier, tilpasset den oktanol (n = 23 og 15 for Gps 1 og 2, henholdsvis) og methylcyclohexanone (n = 10) (B) CRene under uarmerte tester med både lukt.; Fire studier presentert i tilfeldig serie på tvers av grupper. (C) uarmerte tester med både lukt i to grupper av honningbier, en forward paret (Gp 1, n = 23) og en bakover paret (n = 25).
| Term (forkortelse) | Definisjon | Relevant Eksempel |
| Betinget stimulus (CS) | Astimulus som utløser liten eller ingen respons på første og signaliserer US | LUKT |
| Betinget respons (CR) en | Responsen på CS etter assosiering med US | Snabel FORLENGELSE |
| Ubetinget stimulus (US) | En biologisk betydningsfull stimulus som utløser en respons | Sukrose / vannløsning |
| Ubetingede Response (UR) en | Responsen til det amerikanske | Snabel FORLENGELSE |
| Inter-Stimulus intervall (ISI) | Tiden mellom utbruddet av CS og utbruddet av den amerikanske | LUKT sukrose intervall |
| Inter-Trial intervall (ITI) | Tiden mellom suksessive CS-amerikanske sammenkoblinger for et enkelt dyr | LUKT (prøve n) til LUKT (prøve n + 1) intervall |
Tabell 1. Imtig terminologi. Se Figur 1 for en illustrasjon av disse vilkårene. en For PER condition CR og UR er de samme, men for andre typer foreninger og reflekser CR og UR kan variere.
Movie 1. en video av en honningbie utfører PER etter at det hadde blitt kondisjonert til å svare på en lukt. Legg merke til PER respons av bee ca 1,5 sek etter lukt utbruddet. Sporing programvare kartlagt antennal bevegelser i respons til presentasjon av lukt. Linjene plottet i øvre høyre hjørne av video bilde av den faktiske antennal bevegelser. De to grafene nederst på skjermen viser antennal bevegelser på X (til venstre) og Y (høyre) koordinerer. De vertikale linjene i grafen vist i videoen viser, fra venstre til høyre, lys på, PER, lampen og snabel dementi.
Discussion
Denne protokollen presenterte to pålitelige metoder for condition bruker PER prosedyre. Dette er to av flere metoder som har blitt ansatt 27, 21. Vi ansetter Metode 2 for alle eksperimentelle studier med PER som det er konsekvent pålitelig, også på tvers av ulike forskere.
Den samme grunnleggende prosedyren er tilpasset mange ulike typer studier med honningbier, inkludert bruk av ulike condition stimuli og ulike atferds reflekser. Det har også vært knyttet til undersøkelser av genetisk grunnlag av forskjeller i lærings 28,29, de fysiologiske korrelater olfactory persepsjon og hukommelse i hjernen 13,14,30, og de regulerende og molekylærgenetiske baser for atferd 15,16,31 . På grunn av avansert kunnskap om den økologiske betydningen av lukte læring til honningbier, som startet med de første studiene av Karl von Frisch over 100 år siden
Den grunnleggende prosedyren er kraftig ved at den kan anvendes for å undersøke problemer i andre arter også. To møll arter, Manduca Sexta og Spodoptera littoralis, har blitt brukt i PER studier for å undersøke nevrale grunnlaget for lukt identifikasjon og hver art 'luktelærings evner 32,33. PER eksperimenter med fruktfluer har gitt mange innsikt i de molekylære signal kaskader involvert i chemosensation og læring 34. Og PER har nylig blitt brukt til å studere tilvenning i loppe (Rhodnius prolixus) 35, en viktig sykdom vektor.
Generelt er fremgangsmåten robust for endringer i metoden; bruken av different metoder vil sannsynligvis produsere den samme relative forskjellen mellom behandlingsgruppene. Til tross for den relativt enkle prosedyren, kan flere problemer til tider forhindrer honningbier lære lukt-sukrose krets. Følgende tema er mulige endringer i protokollen, og noen av de vanligste problemene som kan oppstå under PER condition.
Vurderinger knyttet til antall og type Trials i Conditioning Protocol
Enhver lærings protokollen krever eksponering av biene i et antall forsøk i anskaffelse fase. Dette antallet avhenger i stor grad på vanskeligheten av oppgaven. Honningbier kan lære en enkel oppgave etter en enkelt studie, men de trenger minst en tre forsøk for å indusere langtidshukommelsen formasjon. Som forventet, vil de honningbier krever betydelig flere forsøk å tilstrekkelig lære en vanskelig oppgave. Vanligvis er det et maksimalt antall forsøk utover som biene ikke lenger er signifikant bedreir ytelse. Dette maksimum avhenger av den spesifikke oppgave, hvilke lukt og konsentrasjoner, og sukrose-konsentrasjon.
Når du bruker mer enn én type forsøk med forskjellige lukter, presentere de ulike typer prøve i en pseudo sekvens for å holde bier fra memorere en enkel sekvens av lukt presentasjoner i stedet for å lære forskjellene mellom lukt 36. I disse pseudo sekvenser, må det finnes et likt antall prøver for hver av de lukt typer. Dessuten er sannsynligheten for et forsøk med en lukttypen som innledes med og etterfølges av den samme lukt, eller en hvilken som helst av de andre lukt, må være lik for alle lukt. For to lukt - A og B - bruk følgende rekkefølge: ABBABAAB. Over åtte forsøk hver lukt presenteres fire ganger. Sette sammen identiske sekvenser for å nå ønsket antall forsøk for hver lukt.
Uavhengig av eksperimentell design, er det noen parametere som må værekonstant for å optimalisere læring. Overlappingen mellom CS og USA er avgjørende for effektiv condition. Den inter-rettssaken intervall (Figur 1, Tabell 1) må være konstant og optimaliseres fordi uregelmessighet eller en for kort eller for lang inter-rettssaken intervall i betydelig grad kan påvirke effektiviteten av condition protokoll 1.
Betraktninger om viktigheten av og Design av Behavioral Testing Trials
Responses innspilt i løpet av 'kjøp fase "av et eksperiment, da CS og USA presenteres sammen, kan være nyttig. Men, pass på at de lukt presentasjonsforhold kan variere fra én type prøveversjon til en annen. Under forsterkede studier er lukt etterfulgt av sukrose presentert i forbindelse med en visuell stimulus (bevegelse av anordningen for avgivelse av den dråpe sukrose) som kan påvirke bie respons. Og biene har bare tre andres for å vise en reaksjon (fire sekunder med lukt stimulering minus den ene sek overlapping med sukrose presentasjon, figur 1). Hvis forsøket innebærer biene lære å skille to lukt (f.eks armert og uarmert), den uarmert lukt presentert på alternative studier skjer uten den visuelle stimulus av belønning presentasjon og biene har hele fire sekunder til å svare. Derfor svarene på de to lukt er ikke helt sammenlign under oppkjøpet. Med noen condition-protokollen, ikke stole utelukkende på oppkjøps kurver en. For bedre å kunne fastslå hvilke bier har lært, innføre en serie av uarmerte testforsøk, hvor verken lukt er forsterket, noe som sikrer at testing av alle stimuli foregår under identiske betingelser.
Avhengig av den spesifikke formålet med forsøket, kan testing består av enkeltstående prøvings utprøving av den betingede lukt eller en serie rettssaker med den betingede odeller eller en kombinasjon av de betingede og nye lukter. En enkelt test prøveversjon av den betingede lukt gir en enkel analyse av om bienes huske den betingede lukt. Imidlertid kan responsen på den første testen rettssaken reflektere biene motivasjon nivå samt deres tilbakekalling av den betingede lukt. En serie av test-forsøk, enten en serie av forsøk utryddelse av det kondisjonerte lukt eller en serie av enkle tester av kondisjonert og en eller flere nye lukt, kan også brukes til å vurdere minne. Rekken av utryddelse prøvelser kan vurdere hvor sterkt de bienes huske den betingede foreningen. Jo sterkere tilbakekall større antall forsøk for å slukke betinget reaksjon. En rekke enkle tester av betingede og nye lukter kan også vurdere spesifisiteten biene 'minne om den betingede lukt.
Det er også viktig å pleie og teste både kontroll og behandlede gruppene på de samme tidspunkter. Comparing ytelsen bier snart etter condition til bier holdt for lengre tidsperioder er problematisk på grunn av eksponering for sukrose USA ved å mate biene til metning. For eksempel kan en reduksjon i ytelse etter lange intervaller skyldes minneråte eller det kan være på grunn av endringer i motiverende tilstand og / eller læring indusert av uarmert eksponering for US, slik at resultatene tvetydig. Derfor bør utførelse av en behandlingsgruppe alltid bli bedømt i forhold til en kontrollgruppe avkjølte og testet ved de samme tidspunkter.
Lukt Konsentrasjon og integritet
Det er flere måter som konsentrasjonen og integriteten av lukt (CS) kan bli kompromittert. Den mest utbredte problemet med lukt levering er uttømming av lukt kassetter fra overforbruk (figur 2). Bytte ut patronene 10-12 bruker (hver 2 eller 3-studier med grupper på 5 honningbier) for å unngå denne fallgruven. Det er også viktig å brukeferske kassetter for testforsøk, siden brukte kassetter forskjellig vis kan bli utarmet og dermed presentere ulike luktstimuli. Et annet vanlig problem er lukt patron forurensning som skyldes bruk av kassett for mer enn én lukt uten helt å rense den. En skitten eller forurenset luft flyt kan også utilsiktet innføre ekstra lukte stimulus (aktive kullfiltre kan hindre bakgrunn forurensning). Dette er spesielt problematisk når man kobler til PER condition med målinger av fysiologiske reaksjoner på lukt. Lekk lukt patroner presentere et problem siden de honningbier er utsatt for lukt før rettssaken begynner, noe som reduserer salience av lukt stimulans. Løstsittende på lufttilførselen for lukt levering kan resultere i liten eller ingen lukt levering når ventilen åpnes, kunstig redusere biene respons på den tiltenkte lukt.
Sukroseløsning og ubetinget stimulus (Belønning)
Amount, konsentrasjon og integriteten til sukroseløsning brukt som USA er avgjørende for å lykkes i forsøket. Kondisjonering er en funksjon av mengden og konsentrasjonen av sakkarose-vann-løsning som brukes som den amerikanske 37. Mikrometer sprøyter som brukes i Metode 2 gir mulighet for svært presis (ned til 0,2 mikroliter) kontroll av US levering, og vi anbefaler å bruke dem for begge metodene beskrevet. Bruk av tannpirkere (metode 1) er tilstrekkelig for omstendighetene som de dyre sprøyter ikke kan brukes, for eksempel, i trening store grupper av studenter, arbeid i felten, eller med lavere budsjetter. Forsiktig gjennomføring av metode 1 er bra så lenge timing opprettholdes med regelmessig utskifting av tannpirkere for å unngå opphoping av sukrose (og konsentrasjonen levert). Imidlertid, ved bruk av tannpirkere er det mer vanskelig å nøyaktig kontrollere og beregne mengden og størrelsen av den leverte US, noe som er viktig for kondisjoneringsstudier 1. Konsentrasjonen av sukrose for ågi en tilstrekkelig belønning for å holde biene motivert for å lære den betingede foreningen kan stole på vanskeligheten av oppgaven og biene 'indre tilstand eller tiden av året. De mer vanskelige oppgaver krever en høyere sukroseløsning for bier 'å kunne lære oppgaven. Mold kan oppbygning i sukrose-løsninger selv ved 5 ° C, noe som vil kompromittere integriteten av løsningen, som påvirker biene helse og oppfatning av belønning under eksperimentet. Det er best å erstatte løsningen med få dagers mellomrom.
Presisjon, timing, og konsekvens av CS og oss Levering
Den mest kritiske spørsmålet om riktig gjennomføring av et PER prosedyre, eller for den saks skyld noen condition prosedyren innebærer presisjon, timing og konsistensen av CS og US levering (figur 1). Etterforskerne som er nye til prosedyren ofte er upresise om levering av en eller begge stimuli. ISI ersom ikke klarer å tillate overlapping av CS og US resultere i dårlig kondisjone ytelse. PLS automatiserer et akustisk signal for eksperimentator å levere sukrose 3 sek etter utbruddet av lukt levering. Undersøkere skal holde sukrose / vanndråpen nær bie for rask levering etter at signalet. Disse prosedyrene hjelpe entrain en konsekvent ISI. Plassere en stoppeklokke ved condition arena for praktisk tid plassering av rettssaken samt overvåke bienes tid i arenaen både før og etter levering av stimuli. På den måten ITI s kan være forholdsvis jevn og hele prosedyren kan kjøres ved en kontrollert hastighet. ITI 's som er for korte, for eksempel mindre enn 1 min, eller for lang kan føre til dårlig kondisjone ytelse 1.
Seasonal, miljømessige og kontekstuelle Effekter på Honey Bee Ytelse
Honningbier prestasjoner kan bli betydelig påvirket av sine omgivelserbåde før og under condition. Ofte vil svingningene i temperatur og næringstilgang som kommer med de skiftende årstidene endre biene motivasjon til å lære. Når blomstene står i blomst, til biene motivasjon lære den betingede foreningen i laboratoriet synker 38. Når kolonien er stresset - fra ekstreme temperaturer, matmangel eller sykdomsrelatert stress - biene 'vil vise en reduksjon i deres læring ytelse inne. Honningbier holdes i et fly rom kan lære bra en stund, men det altfor stresset av sykdom og aldring degradere deres læring ytelse over tid. Konteksten under condition kan også redusere biene prestasjoner. Noen overflødige lukt, bevegelse og andre stimuli kan distrahere bee fra de eksperimentelle stimuli. For å unngå dette problemet, opprettholde en rimelig konsistent, forenklet visuell sammenheng.
Genotype og erfaring Påvirker PER Ytelse
<p class = "jove_content"> Honey bee arbeidstakere kan variere betydelig i ytelse på noen conditioning prosedyre på grunn av oppgaven spesialisering, genotype, eller andre miljøfaktorer 20. Derfor er det viktig å standardisere, så mye som mulig, hvilke typer dyr som ble brukt i et eksperiment for å redusere inter-individuell variasjon. I en koloni ledet av en åpen parret dronning, som betyr at hun parret med mange forskjellige droner, vil arbeiderne forskjellig i faderlig genotype. Genetisk bakgrunn kan føre til dramatiske forskjeller i sensorisk respons 39 og læring ytelse 29. Bruke kolonier ledet av queens instrumentelt inseminert med sæd fra én droner 28 reduserer dette interindividuell variasjon.De protokoller som er beskrevet ovenfor, innbefatter en fremgangsmåte for innsamling av honningbie arbeidere fra reiret inngang. Men disse honningbier skiller seg fra hverandre med hensyn til alder og atferdsmessige oppgave. De kan være små (inexperienced) eller eldre (flere erfarne) nitter. De kan være små honningbier gjør sitt første orienterings flyreiser. Eller de kan være vakt bier. For å redusere variabiliteten, markere biene med en hurtigtørkende emalje maling eller merkeskilt enten som de dukker opp som voksne (for å kontrollere for alder) og / eller når de begynner beite (for å kontrollere for erfaring). Så, noen dager senere, samle de merkede bier for condition. Arbeidere som er engasjert i sykepleie adferd kan hentes fra rammene innenfor strukturen. Sykepleiere kan bli positivt identifisert når de setter sine hoder inn i en flokk celle å mate og ta vare på larven inni.
Ved hjelp av Virgin Queens eller Drones for PER Conditioning
I tillegg til arbeideren honningbier, kan jomfrue honey bee dronninger og droner lett betinget i en PER prosedyre for studier som tar sikte på å utvikle genetiske linjer av honningbier som varierer i læring ytelse 28. Virgin dronninger skal samles snart etter they dukke opp fra pupation og plasseres direkte i tilbakehold seletøy uten bedøvelsen. Unge, umodne droner som samles inn fra stamfisk kam inne i kolonien er generelt ikke motivert for å lære. Etter at de har begynt parring fly, droner lett lære PER oppgaver 28. De skal samles som de kommer tilbake fra en paring fly og vedlikeholdes over natten i et lite bur i en koloni som brukes for oppdrett dronninger. Ikke forsøk å utnytte dem dagen før conditioning; de ikke overleve godt i seletøy over natten. Et par timer før condition dronene kan hentes fra merdene og plassert inn i begrensende seletøy uten bedøvelsen.
Konklusjoner
Dette PER prosedyre, i form av metoder, utgjør et utgangspunkt for å lage PER eksperimenter. De fleste PER protokoller vil kreve at prosedyren skissert endres på noen måte å gjennomføre de konkrete målene for forsøket og overnatte flere behandlingsgruppene. Det er lett å implementere. Men riktig implementering krever oppmerksomhet på detaljer og praksis. Når mestret det kan være en kraftig prosedyre for å legge til som et analyseverktøy for flere grunnleggende og anvendt forskning programmer med ulike insektarter.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av midler fra NIH NCRR (R01 RR014166 til BHS), NIH NIDCD (R01 DC011422 BHS co-PI), US Department of Agriculture (J Trumble PI; BH Smith co-PI) og Arizona State University. Midler til verkstedet for å trene studenter (data i figur 4) ble gitt av Science Foundation of Chile.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Odorant Compounds (for example) | |||
| 1-hexanol | Sigma-Aldrich | 471402-100ML | For additional examples |
| 2-octanone | Sigma-Aldrich | W280208-800G-K | of odorants, see any of |
| heptanol | Sigma-Aldrich | 51778-5ML | the papers on olfactory |
| gerianol | Sigma-Aldrich | 163333-25G | processing from the |
| nonanal | Sigma-Aldrich | 131210-100ML | Smith lab. |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-1L | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | Make sure it’s odorless. |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Scintillation vials | Sigma-Aldrich | Z190535-1PAK | Use a small drill bit to bore a small hole in the cap of the vials. |
| Bee harness | Custom-made from 0.9 cm diameter plastic soda straws or hard plastic/metal tubing. | ||
| Duct tape | |||
| Kimwipes | Sigma-Aldrich | Z188956-1PAK | |
| Wash bottles | Sigma-Aldrich | Z560847-3EA | For the 70% ethanol. |
| Dryer tubing | |||
| FOR METHOD 1 ONLY | |||
| 20 ml disposable plastic syringes | Cole-Parmer | WU-07945-18 | |
| 15 mm filter paper circles | Sigma-Aldrich | Z274844-1PAK | |
| Pushpins | |||
| Toothpicks | |||
| FOR METHOD 2 ONLY | |||
| Gilmont Micrometer syringe, 0.2 ml | Cole-Parmer | EW-07840-00 | |
| Gilmont micrometer syringe tip | Cole-Parmer | EW-07841-00 | |
| 26 G 3/8” Leur hub hypodermic needles | Fisher Scientific | 14-826-10 | |
| 1 cc tuberculin syringes (plastic/glass) | Sigma-Aldrich | Z181641-1EA OR Z192090-200EA | Glass tuberculin syringes are available, but plastic syringes are much less expensive and will work well for a limited number of uses. |
| Small rubber/silicone restrictors | Cole-Parmer | EW-95702-02 | Made from 4.8 mm outer diameter silicone tubing or the rubber tips of the 1 cc syringe plungers. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| 75 x 100 mm filter paper | Sigma-Aldrich | Z695106-500EA | |
| Direct Logic 05 Programmable Logic Controller |  Koyo Electronics Industries Co, Ltd |
||
| 1 mm, 4 mm, & 6 mm inner diameter PVC or silicone tubing | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of suitable tubing. |
| Polypropylene connectors & leur fittings | Cole-Parmer | Various | Cole-Parmer has a wide selection of connectors and fittings for many tube sizes. |
| 65 mm Correlated Flowmeter | Cole-Parmer | EW-03216-08 | Aluminum with glass float; for liquids and gases, with valve. |
| OR | |||
| Tetra Whisper 300 (Tetratek DW96-2) Aquarium Air Pump | Aquacave |
AE-TETRA-300 | |
| LIF series Solenoid Valves for .042 " ID Tubing, Configuration "E" | The Lee Company |
LFAA1200118H | Neoprene, 430 SS, 302 SS, 280 mW |
| PC-Board 12VDC 70dB Piezo Buzzer | RadioShack |
273-074 | |
References
- Rescorla, R. A. Behavioral studies of Pavlovian conditioning. Annu Rev Neurosci. 11, 329-352 (1988).
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera). Journal of Comparative Psychology. 97, 107-119 (1983).
- Giurfa, M., Sandoz, J. C. Invertebrate learning and memory: Fifty years of olfactory conditioning of the proboscis extension response in honeybees. Learn Mem. 19, 54-66 (2012).
- Smith, B. H., Wright, G. A., Daly, K. S. The Biology of Floral Scents. Dudareva, N., Pichersky, E. , CRC Press. 263-295 (2006).
- Menzel, R., Giurfa, M. Dimensions of cognition in an insect, the honeybee. Behav Cogn Neurosci Rev. 5, 24-40 (2006).
- Kuwabara, M. Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene, Apis mellifera. Journal of the Faculty of Science, Hokkaido University, Zoology. 13, 458-464 (1957).
- Menzel, R. The honeybee as a model for understanding the basis of cognition. Nat Rev Neurosci. 13, 758-768 (2012).
- Menzel, R. Neurobiology of comparative cognition. Kesner, R. P., Olton, D. S. , Lawrence Erlbaum. 237-292 (1990).
- Hammer, M., Menzel, R. Learning and memory in the honeybee. Journal of Neuroscience. 15, 1617-1630 (1995).
- Strube-Bloss, M. F., Nawrot, M. P., Menzel, R. Mushroom body output neurons encode odor-reward associations. J Neurosci. 31, 3129-3140 (2011).
- Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in kenyon cells of the honeybee mushroom body. Front Syst Neurosci. 2, (2008).
- Fernandez, P. C., Locatelli, F. F., Person-Rennell, N., Deleo, G., Smith, B. H. Associative conditioning tunes transient dynamics of early olfactory processing. J Neurosci. 29, 10191-10202 (2009).
- Locatelli, F. F., et al. Nonassociative plasticity alters competitive interactions among mixture components in early olfactory processing. Eur J Neurosci. 37, 63-79 (2013).
- Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. Journal of Neuroscience. 23, 5370-5380 (2003).
- Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
- Hladun, K. R., Smith, B. H., Mustard, J. A., Morton, R. R., Trumble, J. T. Selenium toxicity to honey bee (Apis mellifera L.) pollinators: effects on behaviors and survival. PLoS One. 7, e34137 (2012).
- Wiegmann, D. D., Smith, B. H. International Journal of Comparative Psychology. 22, 141-152 (2009).
- Drezner-Levy, T., Shafir, S. Parameters of variable reward distributions that affect risk sensitivity of honey bees. J Exp Biol. 210, 269-277 (2007).
- Drezner-Levy, T., Smith, B. H., Shafir, S. The effect of foraging specialization on various learning tasks in the honey bee (Apis mellifera). Behavioral Ecology & Sociobiology. 64, 135-148 (2009).
- Shafir, S., Menda, G., Smith, B. H. Caste-specific differences in risk sensitivity in honeybees, Apis mellifera. Animal Behaviour. 69, 859-868 (2005).
- Smith, B. H., Menzel, R. An analysis of variability in the feeding motor program of the honey bee; the role of learning in releasing a modal action pattern. Ethology. 82, 68-81 (1989).
- Erber, J., Pribbenow, B., Kisch, J., Faensen, D. Operant conditioning of antennal muscle activity in the honey bee (Apis mellifera L). Journal of Comparative Physiology A-Sensory Neural & Behavioral Physiology. 186, 557-565 (2000).
- Smith, B. H., Menzel, R. The use of electromyogram recordings to quantify odorant discrimination in the honey bee, Apis mellifera. Journal of Insect Physiology. 35, 369-375 (1989).
- Stopfer, M., Bhagavan, S., Smith, B. H., Laurent, G. Impaired odour discrimination on desynchronization of odour-encoding neural assemblies. Nature. 390, 70-74 (1997).
- Daly, K. C., Christensen, T. A., Lei, H., Smith, B. H., Hildebrand, J. G. Learning modulates the ensemble representations for odors in primary olfactory networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10476-10481 (2004).
- Matsumoto, Y., Menzel, R., Sandoz, J. C., Giurfa, M. Revisiting olfactory classical conditioning of the proboscis extension response in honey bees: a step toward standardized procedures. J Neurosci Methods. 211, 159-167 (2012).
- Chandra, S. B., Hosler, J. S., Smith, B. H. Heritable variation for latent inhibition and its correlation with reversal learning in honeybees (Apis mellifera). Journal of Comparative Psychology. 114, 86-97 (2000).
- Chandra, S. B., Hunt, G. J., Cobey, S., Smith, B. H. Quantitative trait loci associated with reversal learning and latent inhibition in honeybees (Apis mellifera). Behavior Genetics. 31, 275-285 (2001).
- Hammer, M. The neural basis of associative reward learning in honeybees. Trends in Neurosciences. 20, 245-252 (1997).
- Frisch, K. The Dance Language and Orientation of Bees. , Harvard University Press. (1965).
- Daly, K. C., Smith, B. H. Associative olfactory learning in the moth Manduca sexta. J Exp Biol. 203, 2025-2038 (2000).
- Fan, R. J., Anderson, P., Hansson, B. Behavioural analysis of olfactory conditioning in the moth spodoptera littoralis (Boisd.) (Lepidoptera: noctuidae). J Exp Biol. 200. 23 (Pt 23), 2969-2976 (1997).
- Paranjpe, P., Rodrigues, V., VijayRaghavan, K., Ramaswami, M. Gustatory habituation in Drosophila relies on rutabaga (adenylate cyclase)-dependent plasticity of GABAergic inhibitory neurons. Learn Mem. 19, 627-635 (2012).
- Vinauger, C., Lallement, H., Lazzari, C. R. Learning and memory in Rhodnius prolixus: habituation and aversive operant conditioning of the proboscis extension response. J Exp Biol. 216, 892-900 (2013).
- Smith, B. H., Abramson, C. I., Tobin, T. R. Conditional withholding of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera) during discriminative punishment. Journal of Comparative Psychology. 105, 345-356 (1991).
- Smith, B. H. An analysis of blocking in odorant mixtures: an increase but not a decrease in intensity of reinforcement produces unblocking. Behav Neurosci. 111, 57-69 (1997).
- Gerber, B., et al. Honey bees transfer olfactory memories established during flower visits to a proboscis extension paradigm in the laboratory. Animal Behaviour. 52, 1079-1085 (1996).
- Rueppell, O., et al. The genetic architecture of sucrose responsiveness in the honeybee (Apis mellifera L). Genetics. 172, 243-251 (2006).
