Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/51058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Werkwijzen voor het isoleren en het voorbereiden van Drosophila testes monsters (wonen en vast) voor beeldvorming door fase-contrast en fluorescentie microscopie worden hierin beschreven.

Abstract

Drosophila melanogaster is een krachtig modelsysteem dat wijd gebruikt om een verscheidenheid van biologische processen helderen. Zo hebben studies van zowel de vrouwelijke als mannelijke kiemlijnen van Drosophila mate bijgedragen tot de huidige kennis van meiose en stamcel biologie. Uitstekend protocollen zijn in de literatuur voor de isolatie en beeldvorming van Drosophila eierstokken en testes 3-12. Hierin, methoden voor de dissectie en voorbereiding van Drosophila testes voor microscopische analyse worden beschreven met een begeleidende video demonstratie. Een protocol voor het isoleren testes uit de buik van volwassen mannetjes en voorbereiden slides van levend weefsel voor analyse door fase-contrast microscopie en een protocol voor het bevestigen en immunokleuring testes voor analyse door fluorescentiemicroscopie worden gepresenteerd. Deze technieken kunnen in de karakterisering van Drosophila mutanten die d vertonen worden toegepastefects in spermatogenese en in de visualisatie van subcellulaire lokalisatie van eiwitten.

Introduction

Drosophila testes zijn een ideaal model voor de studie van vele biologische processen, waaronder de regulering van stamcellen, meiose en spermaontwikkeling 13-18. De spermatocyten en hun meiotische spindels zijn groot en dus handig voor cytologische analyse en ontspannen celcyclus checkpoints tijdens spermatogenese vergemakkelijken de studie van mutaties in genen van de celcyclus. Verschillende celtypen kunnen in geordende progressie worden genomen over de lengte van de testes en eventuele verstoring van spermatogenese kan leiden tot veranderingen in de algemene regeling. Deze eigenschappen, gecombineerd met Drosophila genetische hulpmiddelen hebben de mutatie-analyse van de spermatogenese 21-23 vergemakkelijkt.

De stadia van Drosophila spermatogenese goed zijn afgebakend. Germlinecellen dat synchroon ontwikkelen binnen cysten vooruitgang achtereenvolgens door de stadia van spermatogenese langs de lengte van de testis. Tijdens both de mitotische en meiotische delingen van de mannelijke geslachtscellen, cytokinesis optreedt onvolledig, zodat de dochtercellen blijven verbonden door cytoplasmatische bruggen bekend als grachten (figuur 1). De apicale uiteinde van de testis bevat een bevolking van kiembaan stamcellen die aanleiding geeft tot spermatogonial cellen, die vier mitotische delingen ondergaan met onvolledige cytokinesis tot 16-cel cysten van primaire spermatocyten genereren. Na premeiotic S-fase, primaire spermatocyten voer G2, een langere groeiperiode van ~ 90 uur gedurende welke cellulaire volume toeneemt ~ 25-voudig. Progressie door meiose I en meiose II resulteert in de vorming van 32-cellen cysten secundaire spermatocyten en 64-cellen cysten haploïde spermatiden respectievelijk. De onvolwassen, ronde spermatiden ondergaan uitgebreide cellulaire verbouwing tot rijpe zaadcellen vormen. Post-meiotische cellen, in het bijzonder de bundels van het verlengen en volwassen spermatiden, bezetten een groot deel van het volume van de testis.

Thij succesvol transport van functionele zaadcellen aan vrouwelijke vliegen vereist coördinatie tussen de verschillende delen van het mannelijke voortplantingssysteem, die is samengesteld uit verschillende afgestemde structuren (de testes, zaadblaasjes, en accessoire klieren) en een enkele ejaculatie kanaal (figuur 2). Zaadcellen worden geproduceerd in de testes en opgeslagen in de zaadblaasjes tot copulatie 24. Het accessoire klieren bevatten secretoire cellen die zaadvocht produceren. Het sperma migreren van de zaadblaasjes gemengd met zaadvloeistof binnen de ejaculatie kanaal, die is aangesloten op de zaadblaasjes en de accessoire klieren. Dit mengsel van sperma en zaadvloeistof uiteindelijk uit de mannelijke gepompt in de vagina van het vrouwelijke vliegen door de ejaculatie lamp bij het ​​achterste uiteinde van de mannelijke buik 25. Eiwitten in het zaadvocht zijn essentieel voor de langdurige opslag van sperma binnen gespecialiseerde organen bekend als spermathecae in de reproductive darmkanaal van Drosophila vrouwen 26.

Uitstekende werkwijzen voor de isolatie van Drosophila testes en visualiseren van cellen in verschillende stadia van spermatogenese zijn in de wetenschappelijke literatuur 3-12. We hierin toe te voegen aan dit lichaam van kennis door de presentatie van voorbeelden van deze protocollen met een begeleidende video demonstratie. Het protocol voor bereiding van levende testes monsters voor fase-contrast microscopie is gebaseerd op een eerder beschreven werkwijze 27. Het protocol voor formaldehyde fixatie en immunokleuring van testes is ook gebaseerd op een eerder beschreven werkwijze 28. De hierin beschreven methoden zijn gebruikt in vele studies van Drosophila spermatogenese (bijvoorbeeld de rollen van dynein beoordelen, een min-end gerichte microtubuli motor tijdens Drosophila spermatogenese).

In aanvulling op de basis protocollen worden suggesties voorzien varying de dissectie om zo te verrijken voor spermatogonia, spermatocyten of rijpe zaadcellen. Verschillende methoden voor het verwerken van de testes zodat cysten ofwel intact blijven of worden verstoord behoefte beschreven. Een voordeel in het gebruik van Drosophila testes als modelsysteem is dat vergeleken met Drosophila eicellen en embryo's, antilichamen en kleurstoffen kunnen gemakkelijk cellen binnendringen na de verspreiding van de testes en minder wasstappen vereist, dus kan protocollen relatief uitgevoerd korte tijd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Testikels Dissection

  1. Verdoven vliegen in een fles of flacon met een stroom van CO 2 en over te dragen aan een vlieg pad.
  2. Sorteer vliegt onder een dissectie microscoop met een kleine penseel, en laat een passend aantal (afhankelijk van het experiment) van Drosophila mannetjes van de gewenste genotypen. Jonge mannen (0-2 dagen oud) zijn ideaal voor de behandeling van cellen in de vroegere stadia van de spermatogenese (bijv. spermatogonia, spermatocyten en vroege post-meiotische spermatiden), terwijl iets oudere mannen (2-5 dagen oud) zijn ideaal voor de behandeling van cellen in de laatste fase van de spermatogenese (met name volwassen sperma).
  3. Gebruik een tang om de vleugels van elkaar vliegen te verwijderen (om te voorkomen dat de vliegen van zweven in vloeistof tijdens dissectie).
  4. Voeg -500 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2PO 4, PBS) in een druppel op een gesiliconiseerd dissectie schoteleen zwarte achtergrond. Andere waterige oplossingen zijn met succes gebruikt voor de testes dissectie 3.
  5. Punt tang naar de voorste van de vlieg, pakt u het door de thorax, en dompel het in de PBS druppel. Tijdens het bekijken door de microscoop ontleden, gebruik een tang om achteren grijpen en trek de externe genitaliën (donkerbruin structuur bij het achterste uiteinde van de ventrale abdomen) totdat deze loskomt uit de buik. In de meeste gevallen zal de testes, zaadblaasjes en accessoire klier uit de buik, samen met de uitwendige geslachtsorganen worden verwijderd, zo niet, plaatst u een enkel paar tang in de buik en plagen uit de testes.
  6. Aparte testes van accessoire klier en uitwendige geslachtsorganen gebruik van twee paar tang in de PBS daling (figuur 2). Wild-type testes zijn gemakkelijk te onderscheiden van naburige witte weefsels door hun gele kleur. Ga onmiddellijk naar stap 2.
  7. Om testes isoleren uit pharate mannen (i.. E ingesloten in het popstadium geval), moet een extra stap eerst worden uitgevoerd, dat omvat het verwijderen van de vlieg van het popstadium, deze stap is eerder elders 31 beschreven. Ga verder met dissectie als voor de volwassen testes beginnen bij stap 1.2.
  8. Om testes isoleren van larvale mannetjes, het uitvoeren van een wijziging van een protocol voor het isoleren van Drosophila larven eierstokken 32. In het kort kunnen mannetje larven worden onderscheiden van vrouwelijke larven door de aanwezigheid van een paar grote, duidelijke, ovaal structuren (larven testes) ingebed in het onderste derde van het vet lichaam. Om larvale testes isoleren gedeeltelijk villen opent de mannelijke larve de testes en het omliggende vet lichaam isoleren van de buik beschreven voor het isoleren van larvale eierstokken. Onmiddellijk over tot stap 2 van de hierin beschreven protocol, de testes kan later worden verwijderd uit het vet lichaam vlak voor bevestiging (stap 2.3 of 3,14) zoals beschreven voor de eierstokken 32.

  1. Gebruik een pincet om voorzichtig te plaatsen 2-3 paar testikels in een daling van 4-5 ml PBS op een vierkante glazen dekglas. Merk op dat de verhouding van de testes nummer PBS volume moet mogelijk worden aangepast: te veel vloeistof wordt voorkomen dat cellen niet meer goed verspreidt wanneer geplet, terwijl er te weinig vloeistof zal veroorzaken cellen te barsten wanneer geplet. Optioneel: Gebruik gesiliconiseerde dekglaasjes om de naleving van het weefsel te minimaliseren slip in stap 3.2 dekken.
  2. Gebruik een pincet open elke testis scheuren op een geschikte positie om de aanwezigheid van de gewenste kiemlijn celtypes in het preparaat maximaliseren (Opmerking: de inhoud van de testis zal meestal uitgang uit de verscheurde gebied op de dia tijdens de kneuzingen stap.) te verrijken voor spermatogonia en spermatocyten, scheur open de testis naast haar apicale tip (niveau 1, Figuur 2B). Te verrijken voor spermatocyten en spermatiden, scheur open de testis op een posnu bovendien iets basaal naar niveau 1 (niveau 2, Figuur 2B). Te verrijken voor rijpere germlinecellen, openscheuren de testis dichter bij waar de kromming begint (niveau 3, Figuur 2B).
  3. Plaats voorzichtig een glazen objectglaasje over de dekglas aan de testikels te pletten, geen druk handmatig toepassen als het gewicht van het deksel slip alleen voldoende is om een ​​goed geplet monster te verkrijgen. Probeer te voorkomen dat luchtbellen. Optioneel: Gebruik poly-L-lysine beklede objectglaasjes om hechting van weefsel bevorderen schuiven in stap 3.2.
  4. Gebruik voorbereiding onmiddellijk (idealiter binnen 15 minuten na de bereiding) om levende cellen te observeren door fase-contrast microscopie, voor transgene vliegen met expressie van fluorescent gelabelde eiwitten in de testes, kunnen levende cellen met behulp van fluorescentie microscopie onderzocht worden in deze stap. Als alternatief gaan met fixatie en antilichaamkleuring (Protocol nr. 3).
  5. Zachtjes lont overtollige vloeistof uit onder het dekglaasje met behulp van een schoonmaak wipe tot afvlakking van de bereiding toe, totdat de kiemcellen zijn duidelijk in beeld.

3. Formaldehyde Fixatie en antilichaamkleuring

  1. Snap bevriezen elke dia met geplet testes (van Protocol nr. 2) met behulp van een paar metalen tang om het even onder te dompelen in vloeibare stikstof (tot vloeibare stikstof stopt borrelen).
  2. Verwijder het deksel slip onmiddellijk met een scheermesje.
  3. Gebruik metalen tang om dia's over te dragen aan een voorgekoeld glasplaatje rek gevuld met ijskoude 95% ethanol (spectrofotometrische rang,-methanol gratis). Bewaar bij -20 ° C gedurende 10 minuten.
  4. Gebruik metalen tang om dia dragen aan een glasplaatje rek gevuld met 4% formaldehyde in PBS plus 0,1% Triton X-100 (PBS-T). Bewaren bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten.
  5. Gebruik metalen tang om dia's over te dragen aan een glasplaatje rek gevuld met PBS. Was objectglaasjes in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. 1x herhalen. Voer alle wasbeurten door afdanking oplossing in het glaasje rack (
  6. Gooi de PBS en dompel glaasjes in PBS-T gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur celmembranen doorlaatbaar.
  7. Was objectglaasjes in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Herhaal 2x.
  8. Blokkeringsstap (optioneel): Dompel dia's in PBS plus 1% BSA gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
  9. Gebruik een hydrofobe barrière pen om een ​​cirkel op de dia rond geplette weefsel (goed zichtbaar op het oog) om het antilichaam oplossingen (toegevoegd in stappen 3.9 en 3.11) beperken trekken. Het weefsel moet vochtig gehouden worden ten alle tijden tijdens het uitvoeren immunostaining.
  10. Voeg 30-40 ml primair antilichaam (verdund in PBS-T, 1:400 tot 1:50, afhankelijk antilichaam) om weefsel binnen de cirkel. Als het blokkeren werd uitgevoerd, verdunnen primaire antilichaam in PBS-T plus 1% BSA. Anti-gamma-tubuline antilichaam (voor kleuring van centrosomes in figuur 4) werd verdund 1:100. Incubeer in een vochtige, donkere kamer (bijv.. Gesloten plastic doosmet vochtige papieren handdoeken) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
  11. Was objectglaasjes in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur 3x. Als blokkeren werd uitgevoerd, twee keer wassen in PBS-T en eenmaal in PBS (5 min bij kamertemperatuur elk).
  12. Voeg 30-40 ml fluorofoor geconjugeerd secundair antilichaam (1:400 verdund in PBS) aan het weefsel en incubeer in het donker gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  13. Was objectglaasjes in PBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Herhaal 2x.
  14. Voeg 30-40 ml DAPI oplossing (0,2 mg / ml in PBS) om het weefsel binnen de cirkel.
  15. Plaats voorzichtig een dekglaasje over het weefsel, de zorg om te voorkomen dat luchtbellen. Als er luchtbellen moeten verschijnen, voorzichtig bewegen het dekglas zonder het vernietigen van de squash totdat de bellen ontsnappen uit de zijkanten van het dekglas.
  16. Gebruik een schoonmaakdoekje te wissen overtollige DAPI van de randen van de glijbaan.
  17. Dicht de dekglas naar de dia met behulp van duidelijke nagellak.
  18. Gebruik deze voorbereidingbinnen de komende 3-4 uur om immuun-cellen bekijken door fluorescentie microscopie. Voor langere-termijn opslag van dia's (tot ten minste enkele weken), gebruik maken van een glycerol gebaseerde harde mount media met DAPI, en op te slaan dia's bij -20 ˚ C.
  19. Alternatief fix monsters in methanol in plaats van formaldehyde (afhankelijk van het antigeen). Na het voltooien van het hele protocol tot en met stap 3.2, dompel slides van geplette testes in methanol gedurende 10 minuten bij -20 ° C en ga verder met stap 3.5 verder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Een voorbeeld van een zorgvuldig ontleed paar Drosophila mannelijke voortplantingsorganen wordt getoond in figuur 2A. Testes verwijderd uit de buik van de volwassen mannelijke vliegen zijn meestal verbonden aan de ejaculatie kanaal (bruine figuur 2A) en een paar accessoire klieren (groen figuur 2A) via een paar zaadblaasjes (blauw, Figuur 2A) . De testes scheiden van de meeste van de bijgaande somatische weefsel, de ejaculatie kanaal en het accessoire klieren worden losgemaakt en verwijderd, zodat alleen de testes paar en de zaadblaasjes blijven (Figuren 2B en 2B). De zaadblaasjes kan worden verwijderd, waardoor alleen de testes pair verder verwerkt.

De leeftijd van de volwassen mannen geselecteerd voor testes dissectie is een belangrijke overweging. Bij jonge mannen (0-2 dagen na eclosion), de zaadblaasjes zijn kleinen bijna leeg en de testes op hun maximale grootte (figuur 2). Met behulp van jongere mannen zorgt voor een relatief groot aantal delende germlinecellen (ondergaan ofwel mitose of meiose) en vroege post-meiotische spermatiden. Bij oudere mannen (3-5 dagen na verpopping) worden gebruikt voor dissectie (afbeelding niet getoond), de zaadblaasjes zijn meer op de voorgrond, omdat ze puilen met sperma, en de testikels zijn smaller dan bij jongere mannen. Oudere mannetjes zijn voorkeur als het doel is om rijpe zaadcellen te visualiseren.

Door de bestelde progressie van ontwikkelingsgebeurtenissen langs de lengte van de Drosophila testes, kunnen kiemlijn cellen in specifieke fasen van spermatogenese verrijkt gebaseerd op de stand waarin ontleed testes vóór pletten gescheurd. Bijvoorbeeld, het openscheuren van de testis in de buurt van de apicale uiteinde (niveau 1, Figuur 2B ') levert een overvloed aan cellen in de vroege stadia van de spermatogenese. Figuur 3A toont een fase-contrast beeld van een representatieve populatie van spermatogonia (witte pijl), vroege primaire spermatocyten (gele pijl), en laat de primaire spermatocyten (rode pijl) op deze wijze verkregen. Als alternatief, het openscheuren van de testis op een iets meer basale positie (niveau 2, Figuur 2B ') levert voornamelijk spermatocyten en spermatiden. Een fase-contrast beeld van een vertegenwoordiger celpopulatie primaire spermatocyten (rode pijl), ronde spermatiden (Figuur 3B toont groene pijl), verlengen spermatiden (oranje pijl), en volwassen sperma bundels (blauwe pijl) op deze wijze verkregen.

Fase-contrast beeldvorming van testes kan worden gebruikt om defecten te karakteriseren in Drosophila spermatogenese gevolg van mutaties in genen die essentieel zijn voor dit proces. De ronde spermatiden een zeer stereotype verschijning wanneer bekeken door een fase-contrast microscoop. Elk van deze onvolwassen spermatiden heeft een enkele, PHAe-licht, ronde kern en een enkele, fase-donkere, ronde mitochondriale totaal van ongeveer dezelfde grootte (gekenmerkt door paars pijlpunt pijl en, respectievelijk, in figuur 3C). Variatie in de relatieve aantallen of maten van deze organellen kan het gevolg zijn van afwijkende meiotische delingen (zie bespreking). Een voorbeeld van een dergelijke storing is getoond in figuur 3D. Ronde spermatiden van volwassen mannen met mutatie van de asunder (asun) gen bevatten een enkele grote mitochondriale aggregaat en meerdere kleine kernen als gevolg van gebreken in cytokinesis en chromosoomscheiding 29.

Fluorescentie microscopie is een andere krachtige aanpak voor het bestuderen van Drosophila spermatogenese. Een voorbeeld van een fluorescerende beeld van gefixeerde cellen van een geplette testes monster is getoond in figuur 4. Testes werden verkregen uit transgene vliegen die GFP-beta1-tubuline (product van bTub56D gen gefuseerd aan zijn C-terterminal einde aan GFP en onder controle van de Ubi-p63E ubiquitine-gen promoter; geschenk van H. Oda en Y. Akiyama-Oda, JT Biohistory Research Hall, Osaka, Japan) om de microtubuli (groen in figuur 4D, grijstinten label figuur 4A). De transgene testes werden immunostained gebruik van een muis antilichaam tegen gamma-tubuline (secundair antilichaam: anti-muis Cy3) naar centrosomes (rood in figuur 4D, grijstinten in figuur 4C) en markeer DAPI gebeitst om DNA (blauw in figuur 4D, grijstinten markeren figuur 4B). Cellen in verschillende stadia van de spermatogenese kan gemakkelijk worden geïdentificeerd door de opstelling van de microtubuli, centrosomes en chromosomen (zie legenda).

Figuur 1
Figu re 1. Schema van kiembaan celdelingen in Drosophila mannen. Elke divisie stamcellen produceert een gonial cel die vier ronden van mitotische delingen ondergaat met onvolledige cytokinesis een 16-cel cyste van primaire spermatocyten produceren. Elke primaire spermatocyt ondergaat een langdurige groeifase voorafgaand aan het ondergaan van de twee meiotische delingen, opnieuw met onvolledige cytokinesis, een 32-cel cyste van onderling verbonden secundaire spermatocyten gevolgd door een 64-cel cyste van onderling verbonden ronde spermatiden vormen. Ronde spermatiden worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een fase-licht kern en een fase-dark mitochondriale aggregaat (de Nebenkern) van vergelijkbare grootte. De ronde spermatiden ondergaan rek en individualisering aan de rijpe zaadcellen vormen. Oudere sperma koppen kunnen worden geïdentificeerd door hun naaldvormige kernen. Kernen zijn weergegeven in blauw; Nebenkerne (mitochondriale aggregaten) in zwart; cytoplasma in tan./ 50981fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2
Figuur 2. Voortplantingsorganen van Drosophila mannen. Jonge volwassen mannetjes (0-2 dagen na verpopping) werden geselecteerd voor dissectie. Licht microfoto van geïsoleerde voortplantingsorganen zijn in A en B met overeenkomstige cartoons in A 'en B'. (A, A ') Drosophila testes (rood) verwijderd uit de buik van een volwassen mannelijke vliegen zijn aangesloten op de ejaculatie kanaal (bruin) via de zaadblaasjes (blauw). Een paar accessoire klieren (groen) is ook verbonden met de ejaculatie kanaal. (B, B ') De testes moeten worden gescheiden van de accessoire klieren boordat schuiven voorbereiding. Voorafgaand aan het pletten, openscheuren de testes op niveau 1 te verrijken voor cellen in een vroeg stadium van de spermatogenese, op niveau 2 om een ​​gemengde populatie van de meiose en post-meiotische germlinecellen verkrijgen, en op niveau 3 te verrijken voor volwassen sperma. Schaal bar, 250 mm. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 3
Figuur 3. Fase-contrast beelden van Drosophila testes. (A) Een overvloed van cellen in een vroeg stadium van de spermatogenese, waaronder spermatogonia (witte pijl), vroege primaire spermatocyten (gele pijl), en laat de primaire spermatocyten (rode pijl) worden meestal vrijgelaten wanneer de testis wordt gescheurd op niveau 1 (zie fig.Ure 2B). Twee of meer onderling verbonden cellen (een gevolg van onvolledige cytokinesis) zekering vaak volledig als een artefact van de kneuzingen procedure (gele pijl markeert een fusie van twee vroege spermatocyten). (B) Een combinatie van spermatocyten (rode pijl markeert laat primaire spermatocyt) en post-meiotische cellen, met inbegrip van rond spermatiden (groene pijl), verlengen spermatiden (oranje pijl markeert gedeeltelijke cyste), en volwassen sperma bundels (blauwe pijl), zijn typisch vrijgegeven wanneer de testis wordt gescheurd op niveau 2 (zie figuur 2B). (C, D) Fase-contrast beeldvorming van geplette testes kan worden gemakkelijk defecten in de overvloedige en stereotype rond spermatiden identificeren. Wild-type spermatiden hebben een kern (fase-licht; gekenmerkt door paars pijlpunt) aangesloten op een enkele mitochondriale aggregaat (fase-dark; gemarkeerd met paarse pijl) van ongeveer gelijke grootte (C). Spermatiden van asunf02815testes bevatten meerdere kleine kernen en een grote mitochondriale aggregeren als gevolg van mislukte cytokinese en fouten in chromosoom segregatie (D). Schaal bar, 10 mm. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 4
.. Figuur 4 TL-beeld van Drosophila testes Bereidingen van geplette testikels geïsoleerd van de mannetjes die GFP-gelabelde beta1-tubuline (groen in D, grijstinten in A) werden gefixeerd en gekleurd voor beide DNA (DAPI; blauw in D, grijstinten in B) en centrosomes (gamma-tubuline antilichaam; rood in D, grijstinten in C). Een verdelen spermatocyte (witte pijlpunt) is te zien naast een groot gebied van de ronde spermatiden (witte pijl markeert een representatieve cellen) en een bundel van rijpe zaadcellen (gele pijl). Schaal bar, 10 mm. Klik hier voor grotere afbeelding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel de testes van wildtype vliegen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd door hun gele kleur (in tegenstelling tot de naburige witte weefsels), de testes witte mutantvliegen zijn wit en daardoor kan soms worden verward met de darm. De meeste transgene stammen, die typisch op een witte achtergrond, ook witte testikels omdat de mini-witte gen in P-elementen niet bevordert pigment accumulatie in de testes. Wanneer Drosophila testes niet kan worden onderscheiden door de kleur, andere herkenbare kenmerken zijn hun spiraalvormig patroon en het optreden in paren 12. Merk op dat sommige werknemers vinden het gemakkelijker om dissectie naalden in plaats van een tang gebruiken om de testikels te isoleren 12.

Een kritische stap van dit protocol is de voorbereiding van de geplette testes. Een nuttige aanpak is om de dia zweven een paar millimeter boven het deksel op waarin de testes, zodanig dat de oppervlakte tension van het PBS op de cover slip tilt de deksel op waarin het weefsel naar de dia. Deze methode heeft de neiging om cysten te verstoren en verspreid cellen op de dia, waardoor het ideaal is voor de beeldvorming van individuele cellen. Alternatief om hele of gedeeltelijke cysten voor beeldvorming handhaven het volume PBS op de dekglaasje geplaatst kan worden verhoogd (4-5 ml tot 7-8 ml).

Als een bepaalde Drosophila mutant van belang niet overleeft naar volwassenheid, dan larven of popstadium testes kan als alternatief worden gebruikt om spermatogenese te bestuderen. In het gedeelte protocol worden verwijzingen voorzien voor de isolatie van pharate mannen en larvale eierstokken, een wijziging van laatstgenoemde protocol kan worden gebruikt voor larvale testes isoleren. De stappen voor het scheuren, pletten, en vlekken larvale of popstadium testes zijn in wezen identiek aan die hierin beschreven voor de volwassen testes. Zelfs als de vlieg lijn te bestuderen kunnen de volwassen leeftijd bereiken, kan isolatie van larven of popstadium testes beter zijn als de gLOA is om cellen te verkrijgen in de vroegste stadia van spermatogenese. Zoals in de resultaten representatief deel kunnen cellen in de vroege of late stadia van spermatogenese worden verrijkt zoals gewenst door het variëren van het niveau waarop de testis vóór pletten wordt gescheurd.

Fase-contrast microscopie biedt een relatief eenvoudige benadering voor het bestuderen van Drosophila spermatogenese. Een voordeel van fase-contrast microscopie op immunokleuring en fluorescentiemicroscopie is dat er minder tijd nodig om de monsters te bereiden. Alle belangrijke stappen van de spermatogenese kan gemakkelijk worden geïdentificeerd met deze techniek 24. Inderdaad hebben verscheidene groepen fase-contrast microscopische analyse van testes als primaire screening voor het karakteriseren van de fenotypen van Drosophila mannelijk-steriele mutant lijnen 21-23. Tijdens meiotische delingen, zijn mitochondriën en chromosomen gelijkelijk verdeeld aan dochtercellen. Een uniek kenmerk van de spermatogenese in Drosophileen en andere insecten betreft de vorming van een mitochondriale aggregaat (de Nebenkern) in ronde spermatiden 24. Ronde spermatiden bevatten een fase-dark Nebenkern en een fase-licht kern van ongeveer gelijke grootte in een 1:1 verhouding (Figuur 3). De diameter van de kern geeft de DNA-gehalte van de ronde spermatiden, zodat fouten in chromosoomscheiding tijdens meiose kan leiden tot variabiliteit in kerngrootte 33. Verstoring van de meiose cytokinesis volgende chromosoom segregatie leidt tot meerkernige ronde spermatiden waarin de Nebenkerne zekering in een aggregaat 34. Daarom kan elke wijziging in de verhouding 1:1 of de grootte of vorm van de Nebenkern en kern in ronde spermatiden gemakkelijk worden gedetecteerd door fase-contrast microscopie van levende testes en is vaak diagnostisch defecten in meiose. Fusie van twee of meer onderling verbonden cellen in een gemeenschappelijke cyste vaak optreedt als een artefact van de kneuzingen procedure (figuur 3A, Geel pijlpunt), de 1:1 verhouding van kernen te Nebenkerne echter nog gehandhaafd.

Immunokleuring van vaste bereidingen van Drosophila testes kan worden uitgevoerd op cellen die spermatogenese stadium evenals expressiepatronen en subcellulaire lokalisatie van eiwitten van belang te evalueren. Een verfijnde regeling voor het classificeren van de stadia van de Drosophila spermatogenese op basis van de cellulaire morfologie, chromatine organisatie, en microtubuli arrangementen van testes cellen immunostained voor tubuline en DNA gekleurd is beschreven 19. Drosophila primaire spermatocyten zijn relatief grote cellen, en de meiose spindels kan duidelijk waargenomen met behulp van deze benadering. Coimmunostaining voor centrosomes (bijvoorbeeld met antilichamen tegen gamma-tubuline) worden uitgevoerd om een ​​nauwkeuriger beeld van de meiotische spindel structuur te verkrijgen. Formaldehyde is een geschikt fixatief wanneer immunokleuren testes met een breed scala van antistoffenven (bijvoorbeeld anti-lamine en anti-dynein zware keten). De morfologie van microtubuli en centrosomes echter beter geconserveerd met methanol, dus wordt methanol meestal gebruikt als fixeermiddel bij het uitvoeren van immunokleuring met antilichamen tegen alfa-tubuline en gamma-tubuline.

Als antilichamen tegen een eiwit van belang niet beschikbaar zijn, kunnen transgene Drosophila lijnen expressie een fluorescent gelabeld (bijv.. MCherry of GFP) versie van het eiwit worden gegenereerd als een alternatieve benadering. De subcellulaire lokalisatie van het eiwit kan vervolgens worden bepaald met behulp van een microscoop om de GFP fluorescentie te bekijken in levende of vaste preparaten weefsel alternatief kunnen anti-GFP antilichamen worden gebruikt voor het fusie-eiwit te detecteren in gefixeerde monsters. In figuur 4 zijn microtubuli in vaste testes preparaat gevisualiseerd via de intrinsieke fluorescentie van GFP-gelabeld beta1-tubuline (expressie van een transgen onder controle van een klodderbondgenoot uitgedrukt ubiquitinepromotor). Ook transgene vliegen waarbij expressie onder de controle van een weefselspecifieke promotor, bijvoorbeeld, de promoter van de beta2-tubuline-gen werd gebruikt voor testes-specifieke expressie 35. Als alternatief kan de expressie van een eiwit van interesse worden beperkt tot specifieke mannelijke kiemlijn cellen met de UAS-Gal4 systeem 36. Nanos-Gal4 kan worden gebruikt om de expressie van een eiwit onder de controle van een promoter in UAS spermatogonia induceren terwijl bam-Gal4 kan worden gebruikt om de expressie in spermatocyten 37 induceren. Knockdown van een eiwit van belang eveneens in de testes worden geïnduceerd door expressie van een haarspeld RNAi construct onder controle van een UAS promotor in combinatie met deze Gal4 drivers 37.

De ontwikkeling van methoden voor live beeldanalyse van Drosophila testes cellen is het bereik van de vragen die kunnen worden uitgebreidgericht gebruik van dit systeem. De gebeurtenissen van meiotische cytokinese kan worden gevisualiseerd door fase-contrast microscopie van spermatocyten gekweekt in fibrinestolsels in een perfusie kamer om de levensduur van de cellen 35 te verlengen. Time-lapse confocale microscopie van Drosophila spermatocyten uiten fluorescent gelabelde eiwitten is ook een krachtige aanpak (bijvoorbeeld om meiotische spilstelsel bestuderen) 38. Het gebruik van confocale microscopie voor beeldvorming van levende eerder, de delende kiembaan stamcellen van de Drosophila testes, heeft geleid tot een beter begrip van stamcellen regelgeving. Naast de fase-contrast en immunofluorescentie microscopie benaderingen die hierin, transmissie-elektronenmicroscopie is ook uitgebreid gebruikt om Drosophila spermatogenese 31 bestuderen.

Naast beeldvorming, kan Drosophila testes worden gebruikt als een bron van materiaal voor biochemische analysis. Voor immunoblotting experimenten, kan ontleed fly testes worden gehomogeniseerd in 6x sample buffer (5 ml / testes paar), gekookt, en direct op een SDS-PAGE gel (~ 4 testes paren / baan) geladen. Zo heeft deze benadering gebruikt om de niveaus van dynein-dynactin componenten in de testes van verschillende Drosophila mutanten beoordelen. Testes extracten kunnen ook bereid door homogeniseren van het weefsel in denaturerende lysisbuffer als het belangrijk om eiwitten integriteit. Bijvoorbeeld, Drosophila testes extracten zijn gebruikt in co-immunoprecipitatie experimenten om de aanwezigheid van stabiele eiwitcomplexen in dit weefsel 41-43 tonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

De auteurs willen graag Michael Anderson bedanken voor het vaststellen van de Lee lab deze geaccepteerde methoden voor het bestuderen van spermatogenese met deskundig advies van Karen Hales. H. Oda en Y. Akiyama-Oda royaal de γ-tubuline-GFP vliegen stock. Dit werk werd ondersteund door een NIH R01 subsidie ​​aan LAL (GM074044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).

Tags

Basis Protocol , Dissectie testes spermatogenese meiose kiemcellen fase-contrast microscopie immunofluorescentie
Cytologische analyse van Spermatogenese: Live and Vaste Bereidingen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Testes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee,… More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter