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Biology

Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/51058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Verfahren zur Isolierung und Herstellung von Drosophila Hoden Proben (leben und fest) für die Bildgebung durch Phasenkontrast-und Fluoreszenzmikroskopie sind hierin beschrieben.

Abstract

Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modellsystem, das in großem Umfang verwendet wurde, um eine Vielzahl von biologischen Prozessen aufzuklären. Beispielsweise haben Studien sowohl der männlichen und weiblichen Keimlinien Drosophila zur derzeitigen Verständnis der Meiose und Stammzellenbiologie beigetragen. Ausgezeichnete Protokolle sind in der Literatur für die Isolierung und Darstellung von Drosophila Ovarien und Hoden 3-12 erhältlich. Hierin sind Verfahren für die Präparation und Herstellung von Drosophila Hoden für die mikroskopische Analyse mit einem zugehörigen Video-Demonstration beschrieben. Ein Protokoll für die Isolierung Hoden aus dem Bauch von erwachsenen Männern und Herstellung von Folien lebendes Gewebe zur Analyse durch Phasenkontrastmikroskopie als auch ein Protokoll für die Befestigung und die Immunfärbung Hoden für die Analyse durch Fluoreszenzmikroskopie dargestellt. Diese Techniken können bei der Charakterisierung von Drosophila-Mutanten, d aufweisen angewendetefects der Spermatogenese sowie der Visualisierung der subzellulären Lokalisation von Proteinen.

Introduction

Drosophila Hoden sind eine ideale Modellsystem für die Untersuchung von vielen biologischen Prozessen, einschließlich der Regulation von Stammzellen, Meiose und Samenentwicklung 13-18. Die Spermatozyten und ihre Reife Spindeln sind groß und damit praktisch für die zytologische Analyse und entspannt Zellzyklus-Kontrollpunkte während der Spermatogenese erleichtern die Untersuchung von Mutationen in Zellzyklus-Genen. Verschiedene Zelltypen können in geordneten Ablauf entlang der Länge der Hoden beobachtet werden, und jede Störung der Spermatogenese zu Änderungen in dieser Gesamtanordnung führen. Diese Eigenschaften kombiniert mit Drosophila genetische Werkzeuge haben die Mutationsanalyse der Spermatogenese 21-23 erleichtert.

Die Stadien der Drosophila Spermatogenese haben gut definiert. Keimbahnzellen, die synchron in Zysten Fortschritte sequentiell durch die Stadien der Spermatogenese entlang der Länge des Hodens. Während boten der mitotischen und meiotischen Teilungen der männlichen Keimzellen, tritt Zytokinese unvollständig, so dass die Tochterzellen bleiben zytoplasmatische Brücken Ringkanäle bekannt sind (Abbildung 1). Die apikale Spitze des Hodens enthält eine Bevölkerung von Keimbahn-Stammzellen, die Anlass zu den Spermatogonien, die vier mitotische Teilungen mit unvollständiger Zytokinese unterziehen, um 16-Zellen-Zysten primären Spermatozyten generieren. Nach premeiotic S-Phase, primären Spermatozyten geben G2, eine längere Wachstumsperiode von ~ 90 Stunden, während der zellulären Volumensteigerungen ~ 25-fache. Progression durch Meiose I und Meiose II führt zur Bildung von 32-Zell-Zysten sekundären Spermatozyten und 64-Zellen-Zysten von haploiden Spermatiden sind. Die unreifen, runden Spermatiden in umfangreichen zellulären Umbau zu reifen Spermien bilden. Post-meiotischen Zellen, insbesondere die Bündel der Verlängerung und reife Spermatiden, besetzen viel von dem Volumen der Hoden.

Ter erfolgreich den Transport von Funktions Spermien weibliche Fliegen erfordert die Koordination zwischen den verschiedenen Teilen des männlichen Fortpflanzungssystem, das aus mehreren gekoppelten Strukturen (die Hoden, Samenblasen und akzessorischen Drüsen) und einem Einzel Ejakulationsleitung zusammengesetzt ist (Abbildung 2). Spermien werden in den Hoden produziert und innerhalb der Samenbläschen, bis Kopulation 24 gespeichert. Die Zubehör sekretorischen Drüsen enthalten Zellen, die Samenflüssigkeit zu produzieren. Die Spermien Migration aus den Samenbläschen mit Samenflüssigkeit innerhalb des Ejakulationsleitung, die sowohl für die Samenbläschen und die Anhangsdrüsen verbunden ist gemischt. Diese Mischung von Spermien und Samenflüssigkeit wird schließlich aus dem männlichen in die Vagina der weiblichen Fliegen durch die Ejakulation Lampe am hinteren Ende des männlichen Bauch 25 angeordnet gepumpt. Proteine ​​in der Samenflüssigkeit sind für eine längere Lagerung von Spermien in spezialisierten Organen wie Spermatheken in der rep bekanntroductive Trakt von Drosophila-Weibchen 26.

Ausgezeichnete Methoden zur Isolierung von Drosophila Hoden und Visualisierung von Zellen in verschiedenen Stadien der Spermatogenese sind in der wissenschaftlichen Literatur 3-12 erhältlich. Wir hier in diesem Körper von Wissen hinzufügen, indem Beispiele für diese Protokolle mit einem begleitenden Video-Demonstration. Das Protokoll für die Herstellung von Lebendproben Hoden zur Phasenkontrastmikroskopie auf einem zuvor beschriebenen Verfahren auf der Basis 27. Das Protokoll für die Formaldehyd-Fixierung und Immunfärbung von Hoden wird auch auf einem zuvor beschriebenen Verfahren auf der Basis 28. Die hier beschriebenen Ansätze wurden in vielen Studien von Drosophila Spermatogenese verwendet (zum Beispiel die Rollen von Dynein beurteilen, ein Minus-Ende gerichtet Mikrotubuli Motor während der Drosophila Spermatogenese).

Zusätzlich zu den grundlegenden Protokolle werden Vorschläge für varyin bereitgestelltg der Dissektion, um für Spermatogonien, Spermatozyten, oder reifen Spermien zu bereichern. Verschiedene Verfahren zum Verarbeiten der Hoden, so daß Zysten entweder erhalten bleiben oder zerstört werden, wie nötig sind, beschrieben. Ein Vorteil bei der Verwendung Hoden Drosophila als Modellsystem ist, dass, im Vergleich zu Drosophila Eizellen und Embryonen, Antikörper und Farbstoffe können leicht eindringen Zellen nach ihrer Streuung aus den Hoden und weniger Waschschritte erforderlich sind, so können Protokolle in einer relativ durchgeführt werden kurze Zeit.

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Protocol

1. Hoden Dissection

  1. Anesthetize Fliegen in einer Flasche oder einem Fläschchen mit einem Strom von CO 2 und übertragen, um eine Fliege Pad.
  2. Sortieren fliegt unter einem Binokular mit einem kleinen Pinsel, und sammeln eine entsprechende Anzahl (je nach Experiment) von Drosophila Männchen der gewünschten Genotypen. Junge Männer (0-2 Tage alt) sind ideal für die Prüfung Zellen in den früheren Stadien der Spermatogenese (zB Spermatogonien, Spermatozyten und frühen postmeiotischen Spermatiden), während etwas ältere Männer (2-5 Tage alt) sind ideal für die Prüfung der Zellen in den letzten Stadien der Spermatogenese (insbesondere reifen Spermien).
  3. Verwenden einer Pinzette, um die Flügel aus jeder fliegen zu entfernen (um die Fliegen aus variabel in Flüssigkeit während der Präparation zu verhindern).
  4. Hinzufügen ~ 500 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4, PBS) in einem Tropfen auf eine silikonbeschichtete Dissektion Schale aufein schwarzer Hintergrund. Andere wässrige Lösungen wurden erfolgreich Hoden Präparation 3 verwendet.
  5. Punkt in Richtung der vorderen Zange der Fliege, fassen Sie es durch den Brustkorb, und tauchen es in der PBS-Tropfen. Während Sie durch das Binokular, verwenden Sie eine andere Pinzette zu greifen und ziehen Sie den äußeren Genitalien (dunkelbraun Struktur am hinteren Ende des ventralen Bauch gelegen) hinten, bis es aus dem Bauch löst. In den meisten Fällen werden die Hoden, Samenblasen und Zubehör-Drüse aus dem Bauch zusammen mit der äußeren Genitalien entfernt werden, wenn nicht, kann eine einzelne Pinzette in den Bauch und necken sich die Hoden.
  6. Separate Hoden aus dem Zubehördrüse und äußeren Genitalien mit zwei Pinzetten in der PBS-Tropfen (Abbildung 2). Wildtyp-Hoden werden leicht von benachbarten weißen Gewebe durch ihre gelbe Farbe aus. Gehen Sie sofort zu Schritt 2 über.
  7. Um Hoden von Männern pharate (i isolieren.. E innerhalb der Puppenhülle eingeschlossen), ist ein weiterer Schritt zuerst durchgeführt, die das Entfernen der Fliege aus der Puppenhülle umfasst werden, dieser Schritt wurde bereits an anderer Stelle 31 beschrieben. Fahren Sie mit der Präparation wie bei den Erwachsenen Hoden ab Schritt 1.2.
  8. Um Hoden von männlichen Larven zu isolieren, führen Sie eine Modifikation eines Protokolls zur Isolierung von Drosophila-Larven 32 Eierstöcke. Kurz gesagt, können männliche Larven von weiblichen Larven durch die Anwesenheit von einem Paar große, klare, ovale Strukturen (Larven Hoden) im hinteren Drittel der Fettkörper eingebettet unterschieden werden. Um Larven Hoden isolieren, teilweise die Haut abziehen öffnen die männliche Larve, die Hoden und die umgebende Fettkörper aus dem Bauch zu isolieren, wie für die Isolierung der Larven Eierstöcke beschrieben. Gehen Sie sofort zu Schritt 2 von dem hier beschriebenen Protokoll, die Hoden können später von der fetten Körper nur vor der Montage (Schritte 2.3 oder 3.14) als für den Eierstöcken 32 beschrieben, entfernt werden.

  1. Verwenden Sie eine Pinzette vorsichtig platzieren 2-3 Paar Hoden in einem Tropfen 5.4 ml PBS auf einem quadratischen Deckglas. Beachten Sie, dass das Verhältnis der Hoden Nummer PBS Lautstärke kann angepasst werden müssen: zu viel Flüssigkeit aus Zellen richtig Ausbreitung zu verhindern, wenn gequetscht, während zu wenig Flüssigkeit führt zu Zellen platzen, wenn gequetscht. Optional: Verwenden silikonisierte Deckgläser, um die Einhaltung von Gewebe zu minimieren, um den Schlupf in Schritt 3.2 zu decken.
  2. Verwenden Sie eine Zange, um jeden Hoden offen an einer geeigneten Stelle zu reißen, um das Vorhandensein der gewünschten Keimbahn-Zelltypen in der Vorbereitung zu maximieren (beachten Sie, dass der Inhalt des Hodens wird meist Austritt aus dem zerrissenen Region auf den Objektträger während der Quetschung Schritt aus.) Um Spermatogonien und Spermatozyten zu bereichern, aufreißen die Hoden neben seinem apikalen Spitze (Ebene 1, 2B). Um Spermatozyten und Spermatiden bereichern, Tränen öffnen Sie die Hoden bei einer posITION leicht basalen auf Stufe 1 (Ebene 2, 2B). Um reifer Keimbahnzellen zu bereichern, reißen die Hoden näher an offen, wo die Krümmung beginnt (Stufe 3, Abbildung 2B).
  3. Sanft statt einen Glasobjektträger über das Deckglas, um die Hoden quetschen, nicht Druck manuell anwenden, wie das Gewicht des Deckglases allein ist ausreichend, um eine richtig gequetscht Probe zu erhalten. Versuchen Sie zu vermeiden Luftblasen. Optional: Verwenden Poly-L-Lysin beschichteten Objektträger, um die Einhaltung des Gewebes zu fördern, um in Schritt 3.2 gleiten.
  4. Verwenden Vorbereitung sofort (idealerweise innerhalb von 15 Minuten der Vorbereitung), um lebende Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie beobachten, für transgenen Fliegen mit der Expression von fluoreszenzmarkierten Proteine ​​in den Hoden, können lebende Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie in diesem Schritt untersucht werden. Alternativ fahren Sie mit der Fixierung und Antikörperfärbung (Protokoll 3).
  5. Docht vorsichtig überschüssige Flüssigkeit unter dem Deckglas mit einer Reinigungs wipe zu Abflachung der Vorbereitung zu ermöglichen, bis die Keimzellen sind deutlich im Fokus.

3. Formaldehyd-Fixierung und Antikörperfärbung

  1. Schnellfrost jede Folie mit Hoden gequetscht (von Protokoll Nr. 2) mit einem Paar Metallzange, um es kurz in flüssigen Stickstoff tauchen (bis flüssigem Stickstoff stoppt Blasenbildung).
  2. Entfernen Sie das Deckglas sofort mit einer Rasierklinge.
  3. Verwenden Metallzange, um Folien in eine vorgekühlte Glasobjektträger mit eiskaltem 95% Ethanol gefüllt (spektrophotometrische grade, Methanol-frei) zu übertragen. Lagerung bei -20 ° C für 10 min.
  4. Verwenden Metallzangen Dias auf einen Objektträger-Rack mit 4% Formaldehyd in PBS plus 0,1% Triton X-100 (PBS-T) gefüllt übertragen. Lagern bei Raumtemperatur für 7 min.
  5. Verwenden Metallzangen Dias auf einen Objektträger mit PBS gefüllten Rack übertragen. Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. Wiederholen 1x. Führen Sie alle Waschungen durch Verwerfen Lösung in der Glasobjektträgergestell (
  6. Verwerfen die PBS und tauchen Folien in PBS-T für 30 min bei Raumtemperatur, Zellmembranen durchlässig zu machen.
  7. Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. 2x wiederholen.
  8. Blockierungsschritt (optional): Tauchen Folien in PBS plus 1% BSA für 45 min bei Raumtemperatur.
  9. Verwenden Sie eine hydrophobe Barriere Stift einen Kreis auf der Folie herum gequetscht Gewebe (mit dem Auge gut sichtbar), um die Antikörperlösungen (in Schritten 3.9 und 3.11 hinzugefügt) beschränken zu ziehen. Das Gewebe sollte feucht zu allen Zeiten während der Durchführung Immunfärbung gehalten werden.
  10. Hinzufügen 30-40 ml primärem Antikörper (in PBS-T, 1:400 bis 1:50 verdünnt, je Antikörper), um Gewebe innerhalb des Kreises. Wenn Sperrung durchgeführt wurde, verdünnte primäre Antikörper in PBS-T plus 1% BSA. Anti-Gamma-Tubulin-Antikörper (für die Färbung von Zentrosomen in Fig. 4) wurde 1:100 verdünnt. Inkubation in einer feuchten, dunklen Kammer (z. B. geschlossene Kunststoff-Box.mit feuchten Papiertüchern) für 2 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
  11. Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur 3x. Wenn Sperrung durchgeführt wurde, zweimal waschen in PBS-T und einmal in PBS (5 min bei Raumtemperatur jeweils).
  12. Hinzufügen 30-40 ml Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper (verdünnt 1:400 in PBS) auf das Gewebe und Inkubieren im Dunkeln für 1-2 h bei Raumtemperatur.
  13. Waschen Folien in PBS für 5 min bei Raumtemperatur. 2x wiederholen.
  14. Hinzufügen 30-40 ml DAPI-Lösung (0,2 mg / ml in PBS) zu dem Gewebe innerhalb des Kreises.
  15. Sanft statt ein Deckglas über das Gewebe, kümmert sich um Luftblasen zu vermeiden. Wenn Luftblasen erscheinen soll, sorgfältig um das Deckglas zu bewegen, ohne die Squash bis die Blasen von den Seiten des Deckglases zu entkommen.
  16. Verwenden Sie ein Reinigungstuch, um überschüssige DAPI von den Rändern der Folie tupfen.
  17. Dichten Sie das Deckglas auf den Objektträger mit klarem Nagellack.
  18. Mit dieser Vorbereitunginnerhalb der nächsten 3-4 h auf immungefärbten Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie zu sehen. Für längerfristige Speicherung von Dias (bis mindestens mehrere Wochen), verwenden Sie eine Glycerin-basierte Festmontage Medien mit DAPI und speichern Objektträger bei -20 ˚ C
  19. Alternativ fixieren Proben in Methanol anstelle von Formaldehyd (je nach Antigen). Nach Abschluss der gesamten Protokoll über den Schritt 3.2, tauchen Dias von gequetschten Hoden in Methanol für 10 min bei -20 ° C und fahren Sie mit Schritt 3.5 weiter.

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Representative Results

Ein Beispiel eines gut präpariert Paar von Drosophila männlichen Geschlechtsorgane ist in 2A gezeigt. Hoden aus dem Abdomen der erwachsenen männlichen Fliege entfernt werden typischerweise zum Ejakulationsleitung (braun, 2A ') und einem Paar Anhangsdrüsen (grün, 2A') über ein Paar von Samenblasen (blau, 2A ') befestigt . Die Hoden von den meisten zugehörigen somatischen Gewebe, das Ejakulationsleitung und die Anhangsdrüsen trennen sollte abgenommen und verworfen, so daß nur das Paar Hoden und Samenblasen bleiben (Fig. 2B und 2B '). Samenblasen können entfernt werden, wobei nur die Hoden Paar weiterverarbeitet werden.

Das Alter der erwachsenen Männer für Hoden Dissektion ausgewählt ist eine wichtige Überlegung. Bei jungen Männern (0-2 Tage nach dem Schlüpfen) sind die Samenblasen kleinund nahezu leer ist, und die Hoden sind am maximalen Durchmesser (wie in Fig. 2). Mit jüngeren Männern sorgt für eine relativ große Anzahl der Teilungskeimbahnzellen (Mitose unterziehen entweder oder Meiose) und frühen post-meiotischen Spermatiden. Bei älteren Männchen (3-5 Tage nach dem Schlüpfen) sind für die Präparation (Bild nicht gezeigt) verwendet, sind die Samenblasen mehr im Vordergrund, weil sie mit Sperma prall, und die Hoden sind schmaler als bei jüngeren Männern. Ältere Männer sind bevorzugt, wenn das Ziel ist, reifen Spermien visualisieren.

Aufgrund der geordneten Progression der Entwicklungs Ereignisse entlang der Länge der Drosophila Hoden, können Keimzellen in spezifischen Stadien der Spermatogenese basierend auf der Position, an der eingeschnittenen Hoden vor dem Quetschen zerrissen angereichert werden. Zum Beispiel Aufreißen der Hoden in der Nähe ihrer apikalen Spitze (Ebene 1, 2B ') ergibt eine Fülle von Zellen in frühen Stadien der Spermatogenese. Fig. 3A zeigt ein Phasenkontrastbild einer repräsentativen Anzahl von Spermatogonien (weißer Pfeil), frühe primären Spermatozyten (gelber Pfeil), und am späten primären Spermatozyten (roter Pfeil) auf diese Weise erhalten. Alternativ Aufreißen der Hoden bei einer etwas mehr Grundposition (Ebene 2, 2B ') ergibt sich in erster Linie Spermatozyten und Spermatiden. 3B zeigt eine Phasenkontrastbild einer repräsentativen Zellpopulation von primären Spermatozyten (roter Pfeil), runden Spermatiden ( grüner Pfeil), verlängert Spermatiden (orange Pfeil) und reifen Spermien Bündel (blauer Pfeil) auf diese Weise erhalten.

Phasenkontrast-Abbildung des Testes verwendet werden, um Defekte in Drosophila Spermatogenese von Mutationen in Genen, die kritisch für dieses Verfahren erhaltene charakterisieren. Die runden Spermatiden haben eine sehr stereotype Aussehen, wenn durch ein Phasenkontrastmikroskop betrachtet. Jede dieser unreifen Spermatiden hat einen einzigen, phasE-Licht, runden Kern und eine einzige, phasen dunkel, rund mitochondrialen Aggregat von ungefähr der gleichen Größe (mit Pfeilspitze und lila Pfeil markiert jeweils in 3C). Variation in den relativen Zahlen oder Größen dieser Organellen aus abweichenden meiotischen Teilungen (siehe Diskussion) führen. Ein Beispiel eines solchen Mangels ist in Fig. 3D gezeigt. Runden Spermatiden von erwachsenen Männern mit Mutation des auseinander (asun)-Gen enthalten einen einzigen großen mitochondrialen Aggregat und mehrere kleine Kerne als Folge von Defekten in der Zytokinese und Chromosomensegregation 29.

Die Fluoreszenzmikroskopie ist ein weiteres leistungsfähiges Konzept für das Studium Drosophila Spermatogenese. Ein Beispiel für ein Fluoreszenzbild von festen Zellen aus einer gequetschten Hoden Probe wird in Fig. 4 gezeigt. Hoden von transgenen Fliegen GFP-beta1-Tubulin (ein Produkt von bTub56D Gen an seinem C-ter fusioniert exprimiert erhaltenTerminal an GFP und unter der Kontrolle des Ubi-p63E Ubiquitin-Gen-Promotor zu beenden; Geschenk von H. Oda und Y. Akiyama-Oda, JT Biohistory Forschung Hall, Osaka, Japan), um die Mikrotubuli (grün in 4D, Graustufen kennzeichnen in Fig. 4A). Die transgenen Hoden wurden immunhistochemisch mit einem Maus-Antikörper gegen Gamma-Tubulin (sekundärer Antikörper: anti-Maus-Cy3) an Zentrosomen (rot in 4D, Graustufen in 4C) und markieren DAPI-gefärbt, um DNA (blau in 4D, Graustufen markieren in Fig. 4B). Zellen in verschiedenen Stadien der Spermatogenese kann leicht durch Prüfung der Anordnung der Mikrotubuli Zentrosomen und Chromosomen (siehe Legende) identifiziert werden.

Figur 1
Figu re 1. Schematische Darstellung der Keimbahn Zellteilungen in Drosophila Männer. Jede Stammzell Division ein Kieferzelle, die vier Runden mitotische Teilungen durchläuft mit unvollständigen Zytokinese einen 16-Zellen-Zyste von primären Spermatozyten zu produzieren. Jede primäre Spermatozyten erfährt eine längere Wachstumsphase vor unterziehen die beiden meiotischen Teilungen, wieder mit unvollständigen Zytokinese, um einen 32-Zellen-Zyste von miteinander verbundenen sekundären Spermatozyten, gefolgt von einem 64-Zellen-Zyste von miteinander verbundenen runden Spermatiden zu bilden. Runden Spermatiden sind durch die Anwesenheit eines Phasenlicht Kern und einer Phasen dunklen mitochondrialen Aggregat (die Nebenkern) von ähnlicher Größe sind. Die runden Spermatiden unterziehen Dehnung und Individualisierung, die reifen Spermien bilden. Reifen Spermien Köpfe können durch die ihre nadelförmigen Kerne identifiziert werden. Die Zellkerne sind blau dargestellt; Nebenkerne (mitochondriale Aggregate) in schwarz; Zytoplasma in tan./ 50981fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
Abbildung 2. Fortpflanzungsorgane von Drosophila Männer. Junge erwachsene Männchen (0-2 Tage nach dem Schlüpfen) wurden für die Präparation ausgewählt. Lichtmikroskopische Aufnahmen von isolierten Fortpflanzungsorgane sind in A und B mit entsprechenden Karikaturen in A 'und B' gezeigt. (A, A ') Drosophila Hoden (rot) aus dem Bauchraum von einem erwachsenen Mann Fliegen entfernt werden, um die Ejakulationsleitung (braun) über den Samenblasen (blau) verbunden ist. Ein Paar von akzessorischen Drüsen (grün) wird auch der Ductus ejaculatorius angebracht. (B, B ') Die Hoden sollten von den akzessorischen Drüsen b getrennt werdenevor schieben Vorbereitung. Vor Quetschen, aufreißen, die Hoden auf der Ebene 1, um auf Zellen in frühen Stadien der Spermatogenese bereichern, auf Stufe 2, um eine Mischpopulation von Meiose und post-meiotischen Keimbahnzellen zu erhalten, und auf Stufe 3 bis zur reifen Spermien zu bereichern. Maßstabsbalken, 250 mm. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 3
Abbildung 3. Phasenkontrastbilder von Drosophila Hoden. (A) Eine Fülle von Zellen in frühen Stadien der Spermatogenese, einschließlich Spermatogonien (weißer Pfeil), frühe primären Spermatozyten (gelber Pfeil), und am späten primären Spermatozyten (roter Pfeil) werden in der Regel veröffentlicht wenn die Hoden auf der Ebene 1 abgerissen (siehe Abb.Abbildung 2B). Zwei oder mehr miteinander verbundenen Zellen (eine Folge der unvollständigen Zytokinese) verschmelzen oft völlig als ein Artefakt der Quetschung Verfahren (gelbe Pfeilspitze markiert eine Fusion von zwei frühen Spermatozyten). (B) Eine Kombination von Spermatozyten (roter Pfeil markiert späten primären Spermatozyten) und post-meiotischen Zellen, einschließlich der runden Spermatiden (grüner Pfeil), verlängert Spermatiden (orange Pfeil markiert Teil Zyste) und reifen Spermien Bündel (blauer Pfeil), sind in der Regel freigegeben, wenn die Hoden auf Ebene 2 gerissen (siehe Abbildung 2B). (C, D) Phasenkontrast-Bildgebung von gequetschten Hoden können Sie leicht erkennen Mängel in der reichlich vorhandenen und stereotype runden Spermatiden werden. Wildtyp-Spermatiden haben ein Kern (Phase-Licht, durch lila Pfeilspitze markiert) zu einem einzigen mitochondrialen Aggregat (Phase-dunkel, von lila Pfeil markiert) angebracht von ungefähr gleicher Größe (C). Spermatiden von asunf02815Hoden enthalten mehrere kleine Kerne und eine große mitochondrialen Aggregat aufgrund von fehl Zytokinese und Fehler in der Chromosomensegregation (D). Maßstabsbalken, 10 mm. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 4
.. Abbildung 4 Fluoreszenzbild von Drosophila Hoden gequetscht Zubereitungen der Hoden von Männern GFP-markierten beta1-Tubulin (grün in D-, Graustufen in A) Expression isoliert wurden fixiert und gefärbt sowohl für DNA (DAPI, blau in D-, Graustufen in B) und Zentrosomen (Gamma-Tubulin-Antikörper, rot in D-, Graustufen in C). Eine Aufteilung spermatocyte (weiße Pfeilspitze) können neben einem großen Bereich der runden Spermatiden (weißer Pfeil markiert ein Vertreter Zellen) und ein Bündel von reifen Spermien (gelber Pfeil) gesehen werden. Maßstabsbalken, 10 mm. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Discussion

Obwohl die Hoden von Wildtyp-Fliegen können ohne weiteres durch ihre gelbe Farbe (im Gegensatz die benachbarten weißen Gewebe) identifiziert werden kann, sind die Hoden von weißen mutierten Fliegen weiß und kann daher gelegentlich mit dem Darm zu verwechseln. Die meisten transgenen Linien, die typischerweise in einem weißen Hintergrund, haben auch weiße Hoden, weil die Mini-white-Gen in P-Elementen funktioniert Pigmentakkumulation in den Hoden nicht fördern. Bei Drosophila Hoden kann nicht durch Farbe unterschieden werden, andere leicht erkennbare Merkmale sind ihre Spiralmuster und das Auftreten in Paare 12. Beachten Sie, dass einige Arbeiter finden es einfacher, Dissektion Nadeln statt Zange verwenden, um die Hoden isolieren 12.

Ein kritischer Schritt dieses Protokolls ist die Herstellung der gequetschte Hoden. Ein sinnvoller Ansatz ist die Folie, ein paar Millimeter über dem Deckglas, das die Hoden, so dass die Oberfläche schweben tension des PBS auf dem Deckglas hebt das Deckglas des Gewebes auf die Folie mit. Dieses Verfahren neigt dazu, Zysten stören und verteilt Zellen auf dem Objektträger, wodurch es ideal für die Abbildung einzelner Zellen. Alternativ zur vollständigen oder teilweisen Zysten zur Bildgebung zu erhalten, das Volumen PBS auf dem Deckglas platziert erhöht werden (4-5 ml auf 7-8 ml).

Wenn eine bestimmte Drosophila-Mutante von Interesse nicht bis zum Erwachsenenalter überleben, dann Larven-oder Puppen Hoden können alternativ zur Spermatogenese zu untersuchen. In dem Protokollabschnitt werden Hinweise zur Isolierung von pharate Männchen und Larveneierstöcke vorgesehen, eine Änderung der letztgenannte Protokoll kann verwendet werden, um Larven Hoden isolieren. Die Schritte zum Reißen, Quetschen und Anfärben Larven-oder Puppen Hoden sind im Wesentlichen identisch zu der hier für den Hoden erwachsener beschrieben. Selbst wenn die Fliege Linie untersucht werden können das Erwachsenenalter erreichen, kann die Isolierung der Larven-oder Puppen Hoden bevorzugt sein, wenn die giel ist es, Zellen in den frühesten Stadien der Spermatogenese zu erhalten. Wie in der repräsentativen Ergebnissen Abschnitt beschrieben, können die Zellen in frühen oder späten Stadien der Spermatogenese, wie durch Variation der Ebene, auf der die Hoden vor dem Quetschen gerissen gewünschten angereichert werden.

Phasenkontrast-Mikroskopie bietet einen relativ einfachen Ansatz für das Studium Drosophila Spermatogenese. Ein Vorteil von Phasenkontrastmikroskopie überImmunFärbung und Fluoreszenz-Mikroskopie ist, dass weniger Zeit benötigt wird, um die Proben herzustellen. Alle wichtigen Stadien der Spermatogenese können leicht unter Verwendung dieser Technik 24 identifiziert werden. Tatsächlich haben mehrere Gruppen Phasenkontrast-mikroskopische Analyse der Hoden als primäre Bildschirm für die Charakterisierung der Phänotypen der Drosophila männlich sterilen Mutanten-Linien 21-23 verwendet. Während der meiotischen Teilungen sind Mitochondrien und Chromosomen gleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt. Ein einzigartiges Merkmal der Spermatogenese bei Drosophileine und andere Insekten beinhaltet die Bildung eines mitochondrialen Aggregat (die Nebenkern) in runden Spermatiden 24. Runden Spermatiden enthalten eine Phasen dunklen Nebenkern und eine Phase-Licht Kern ungefähr gleicher Größe in einem Verhältnis von 1:1 (Figur 3). Der Durchmesser des Kerns spiegelt den DNA-Gehalt der runden Spermatiden, so dass Fehler in der Chromosomensegregation während der Meiose können, um die Variabilität in der Kerngröße 33 führen. Störung der Zellteilung der Meiose Chromosomensegregation folgenden Ergebnisse in kernige runden Spermatiden, in dem die Nebenkerne Sicherung in einem einzigen Aggregat 34. Daher kann jede Änderung in der 1:1-Verhältnis oder in der Größe oder Form des Nebenkern und Kern in runden Spermatiden leicht durch Phasenkontrast-Mikroskopie lebender Hoden nachgewiesen werden, und ist oft von Diagnosefehlern in der Meiose. Fusion von zwei oder mehreren miteinander verbundenen Zellen in einer gemeinsamen Zyste tritt häufig als ein Artefakt des Verfahrens Quetschung (3A, Gelbe Pfeilspitze), die 1:1-Verhältnis von Kernen zu Nebenkerne jedoch noch aufrechterhalten.

Immunfärbung von festen Zubereitungen aus Drosophila Testes durchgeführt werden, um Zellen, die eine Stufe der Spermatogenese sowie Expressionsmuster und die subzelluläre Lokalisation von Proteinen von Interesse zu bewerten. Ein raffiniertes System zur Klassifizierung der Stadien der Drosophila Spermatogenese auf der Basis der Zellmorphologie, Chromatin-Organisation und Mikrotubuli-Arrangements von Hoden-Zellen für Tubulin und DNA-gefärbten immun beschrieben worden 19. Drosophila primären Spermatozyten sind relativ großen Zellen, und die Reife Spindeln können mit diesem Ansatz deutlich beobachtet werden. Coimmunostaining für Zentrosomen (beispielsweise unter Verwendung von Antikörpern gegen Gamma-Tubulin) durchgeführt werden, um eine genauere Ansicht des meiotischen Spindelstruktur zu erhalten. Formaldehyd ist ein geeignetes Fixiermittel, wenn Immunfärbung Hoden mit einer breiten Palette von Antikören (z. B. Anti-Lamin-und Anti-Dynein schwere Kette). Die Morphologie der Mikrotubuli und Zentrosomen ist jedoch besser erhalten mit Methanol, daher Methanol wird üblicherweise als Fixiermittel bei der Durchführung von Immunfärbung mit Antikörpern gegen Alpha-Tubulin-und Gamma-Tubulin verwendet.

Wenn Antikörper gegen ein Protein von Interesse verfügbar sind, können transgene Drosophila-Linien eines fluoreszenzmarkierten (z. B.. MCherry oder GFP) Version des Proteins exprimieren, als alternativer Ansatz erzeugt werden. Alternativ können anti-GFP-Antikörper verwendet, um das Fusionsprotein in festen Proben zu detektieren, die subzelluläre Lokalisierung des Proteins kann dann mit Hilfe eines Mikroskops, um die GFP-Fluoreszenz in lebenden oder fixierten Präparaten von Gewebe neu bestimmt werden. In Fig. 4 wurden die Mikrotubuli in einer festen Hoden Herstellung über die intrinsische Fluoreszenz von GFP-markierten beta1-Tubulin (aus einem Transgen unter der Kontrolle eines glob ausgedrückt visualisiertVerbündeter ausgedrückt Ubiquitin-Promotor). Alternativ transgenen Fliegen in der die Expression unter der Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, zum Beispiel haben der Promotor des beta2-Tubulin-Gen für Hoden-spezifische Expression 35 verwendet. Alternativ kann die Expression eines Proteins von Interesse spezifischen männlichen Keimbahn-Zellen unter Verwendung des Gal4-UAS-System 36 beschränkt werden. Nano Gal4 kann die Expression eines Proteins unter der Kontrolle eines Promotor-UAS in Spermatogonien zu induzieren, während bam-Gal4 verwendet werden, um seinen Ausdruck in Spermatozyten 37 zu induzieren. Zuschlags eines Proteins von Interesse auch in den Hoden von einer Haarnadel-RNAi-Konstrukt unter der Kontrolle eines UAS-Promotor in Verbindung mit diesen Gal4 Treiber 37 exprimieren, induziert werden.

Die Entwicklung von Methoden für die Live-Bildanalyse von Drosophila-Zellen der Hoden hat die Auswahl von Fragen, die sein können, erweitertadressiert mit diesem System. Die Ereignisse der meiotischen Zellteilung kann durch Phasenkontrastmikroskopie von Spermatozyten in Fibringerinnseln in einer Perfusionskammer, um die Lebensdauer der Zellen zu verlängern 35 kultiviert visualisiert werden. Zeitraffer-konfokale Mikroskopie von Drosophila Spermatozyten ausdrücken fluoreszenzmarkierten Proteine ​​wurde auch ein leistungsfähiges Konzept (beispielsweise meiotischen Spindelanordnung zu studieren) 38. Die Verwendung von konfokaler Mikroskopie für die Bildgebung von einer früheren Stufe, die Teilungskeimbahn-Stammzellen der Drosophila Hoden, hat zu einem besseren Verständnis der Stammzellregulation geführt. Zusätzlich zu den Phasenkontrast-und Immunfluoreszenzmikroskopie Ansätze hierin dargestellt, ist die Transmissionselektronenmikroskopie auch ausgiebig verwendet worden, um die Spermatogenese Drosophila 31 zu studieren.

Zusätzlich zur Bildgebung können Drosophila Hoden als eine Quelle von Material für biochemische analysi verwendet werdens. Für Immunoblotting Experimenten kann seziert fly Hoden bei 6x Probenpuffer (5 ml / Hoden Paar) homogenisiert werden, gekocht, und direkt auf einem SDS-PAGE-Gel (~ 4 Hoden Paare / Spur) geladen. Zum Beispiel hat dieser Ansatz verwendet worden, um die Pegel der Dynein-Dynactin Komponenten in den Hoden von mehreren Drosophila-Mutanten zu beurteilen. Hoden Extrakte können alternativ durch Homogenisieren des Gewebes in denaturierenden Lysepuffer wenn es wichtig ist, um die Proteinintegrität aufrechtzuerhalten, hergestellt werden. Zum Beispiel, Hoden Drosophila Extrakte in Coimmunpräzipitation Experimenten verwendet worden, um das Vorhandensein von stabilen Protein-Komplexen in diesem Gewebe 41-43 demonstrieren.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Michael Anderson für die Einrichtung in der Lee-Labor akzeptiert diese Methoden zur Untersuchung der Spermatogenese mit fachkundiger Beratung von Karen Hales danken. H. Oda und Y. Akiyama-Oda großzügig sofern die γ-Tubulin-GFP Fliegen Lager. Diese Arbeit wurde durch ein NIH R01 Zuschuss für LAL (GM074044) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

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Grundlegendes Protokoll , Dissektion Hoden Spermatogenese Meiose Keimzellen Phasenkontrastmikroskopie Immunfluoreszenz
Die zytologische Analyse der Spermatogenese: Live-und Fest Zubereitungen aus<em&gt; Drosophila</em&gt; Hoden
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Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

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