Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של doi: 10.3791/51058 Published: January 20, 2014

Summary

שיטות לבידוד והכנת דגימות דרוזופילה אשכים (לחיות וקבוע) להדמיה על ידי שלב בניגוד ומיקרוסקופ פלואורסצנטי מתוארים במסמך זה.

Abstract

תסיסנית היא מערכת מודל רבת עוצמה שכבר בשימוש נרחב על מנת להבהיר מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. לדוגמא, מחקרים של שתי נשים וקווים נבט זכר של דרוזופילה תרמו רב להבנה הנוכחית של מיוזה כמו גם ביולוגיה של תאי גזע. פרוטוקולים מצוינים זמינים בספרות לבידוד וההדמיה של השחלות ואשכים דרוזופילה 3-12. בזאת, שיטות לנתיחה והכנת האשכים דרוזופילה ניתוח מיקרוסקופי מתוארות בהפגנת וידאו נלווית. פרוטוקול לבידוד אשכים מהבטן של זכרים בוגרים והכנת שקופיות של רקמת חיה לניתוח על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד, כמו גם פרוטוקול לתיקון וimmunostaining אשכים לניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מוצגים. ניתן ליישם את הטכניקות הללו באפיון של מוטציות דרוזופילה כי תערוכת דefects בתאי זרע, כמו גם בהדמיה של מגויר subcellular של חלבונים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

האשכים דרוזופילה הם מערכת מודל אידיאלית לחקר תהליכים ביולוגיים רבים, כולל רגולציה של תאי גזע, מיוזה, ופיתוח זרע 13-18. Spermatocytes וצירי meiotic שלהם הם גדולים, ולכן נוחים לניתוח ציטולוגית, ומחסומי מחזור התא רגועים במהלך spermatogenesis להקל על המחקר של מוטציות בגנים מחזור התא. ניתן להבחין בסוגים שונים של תאים בהתקדמות הורה לאורכו של האשכים, ושיבוש כלשהו בתאי זרע יכול להוביל לשינויים בהסדר הכולל הזה. תכונות אלה בשילוב עם כלים גנטיים דרוזופילה הקלו ניתוח מוטאציות של תאי הזרע 21-23.

השלבים של spermatogenesis דרוזופילה כבר מוגדרים היטב. תאים בתאי מין שמתפתחים באופן סינכרוני בתוך ציסטות התקדמות רציפות בשלבים של תאי זרע לאורכו של האשך. במהלך בוה המיטוטי וחטיבות meiotic של תאי נבט הזכר, cytokinesis מתרחש באופן חלקי כך שתאי הבת להישאר מחוברים על ידי גשרי cytoplasmic המכונים תעלות טבעת (איור 1). קצה הקודקוד של האשך מכיל אוכלוסייה של תאי גזע בתאי מין שמעוררת תאי spermatogonial, אשר עוברים ארבע חטיבות המיטוטי עם cytokinesis שלם כדי לייצר ציסטות 16 תאים של spermatocytes העיקרי. לאחר שלב S premeiotic, spermatocytes העיקרי להיכנס G2, תקופת צמיחה ממושכת של ~ 90 שעות שבמהלכו עליות נפח סלולארי ~ פי 25. התקדמות דרכי מיוזה ומיוזה השנייה תוצאות בהיווצרות ציסטות 32 תא של spermatocytes המשני וציסטות 64 תא של spermatids הפלואידים, בהתאמה. Spermatids לא בשלה, העגול עובר שיפוץ נרחב סלולארי כדי ליצור זרע בוגרים. תאים שלאחר meiotic, בפרט הצרורות של מתארך וspermatids הבוגר, תופסים הרבה הנפח של האשך.

Tהוא הובלה מוצלחת של זרע פונקציונלי לזבובים נשיים דורשת תיאום בין החלקים השונים של מערכת הרבייה הגברית, שמורכבת מכמה מבני זיווג (האשכים, שלפוחית ​​זרע ובלוטות עזר) ותעלת שופכה אחד (איור 2). זרע מיוצר בתוך האשכים ומאוחסן בתוך שלפוחית ​​הזרע עד הזדווגות 24. בלוטות האבזר מכילות תאי הפרשה המייצרים את נוזל זרע. הזרע נודד משלפוחית ​​הזרע מעורבב עם נוזל זרע בתוך צינור השופכה, אשר מחובר לשתי שלפוחית ​​הזרע ובלוטות האבזר. תערובת זו של זרע ונוזל זרע נשאבת סופו של דבר מחוץ לזכר לתוך הנרתיק של הנקבה לעוף בנורת השפיכה ממוקמת בקצה האחורי של 25 בטן הגברית. חלבונים בתוך נוזל הזרע הם חיוניים לאחסון ממושך של זרע בתוך איברים מתמחים המכונים spermathecae בנציגמערכת roductive של נקבות דרוזופילה 26.

שיטות מצוינות לבידודה של אשכים דרוזופילה ויזואליזציה של תאים בשלבים שונים של תאי זרע זמינות בספרות המדעית 3-12. אנחנו בזאת להוסיף לגוף זה של ידע על ידי הצגת דוגמאות של פרוטוקולים אלה עם הפגנת וידאו נלווית. הפרוטוקול להכנת דגימות אשכים חיים למיקרוסקופ שלב בניגוד מבוסס על שיטה שתוארה לעיל 27. הפרוטוקול לקיבעון פורמלדהיד וimmunostaining של אשכים מבוססים גם על שיטה שתוארה לעיל 28. הגישות המתוארות כאן נעשו שימוש במחקרים רבים של תאי זרע דרוזופילה (לדוגמא, על מנת להעריך את התפקידים של dynein, מנוע microtubule מינוס מכוון סופו של דבר בתאי זרע דרוזופילה).

בנוסף לפרוטוקולים הבסיסיים, הצעות ניתנות לvaryinגרם לנתיחה על מנת להעשיר לspermatogonia, spermatocytes, או זרע בוגרים. שיטות שונות לעיבוד האשכים כך שציסטות או יישארו ללא שינוי או הם שיבשו במידת הצורך מתוארים. יתרון בשימוש באשכי דרוזופילה כמערכת מודל הוא כי בהשוואה לביציות דרוזופילה ועוברים, נוגדנים וצבעים יכולים בקלות לחדור לתאים הבאים פיזורם מהאשכים, ושלבי כביסה פחות נדרשים, ולכן ניתן לבצע פרוטוקולים באופן יחסי זמן קצר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Dissection אשכים

  1. הרדימי זבובים בבקבוק או בקבוקון באמצעות זרם של CO 2 ולהעביר למשטח לטוס.
  2. מיין זבובים תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מכחול קטן, ולאסוף מספר מתאים (תלוי בניסוי) של הזכרים דרוזופילה של גנוטיפים הרצויים. זכרים צעירים (בן 0-2 ימים) הם אידיאליים לבחינת תאים בשלבים המוקדמים של תאי זרע (למשל spermatogonia, spermatocytes, וspermatids פוסט meiotic המוקדם), ואילו גברים מעט מבוגרים (בן 2-5 ימים) הם אידיאליים לבחינת תאים בשלבים הסופיים של תאי זרע (בפרט, להבשיל זרע).
  3. שימוש במלקחיים כדי להסיר את הכנפיים מלטוס (כדי למנוע מהזבובים צפים בנוזל בזמן נתיחה).
  4. להוסיף ~ 500 מיליליטר של פוספט שנאגרו מלוח (130 mM NaCl, 7 מ"מ Na 2 HPO 4, 3 מ"מ לאא 2 PO 4; PBS) בירידה לצלחת לנתיחה מצופה סיליקון עלרקע שחור. תמיסות מימיות אחרות שימשו בהצלחה לאשכים לנתיחה 3.
  5. נקודת המלקחיים לכיוון הקדמי של הזבוב, לתפוס אותו על ידי בית החזה, ולטבול אותו בטיפת PBS. במהלך הצגה מבעד למיקרוסקופ לנתח, להשתמש בזוג נוסף של מלקחיים לתפוס ולמשוך את אברי המין החיצוניים (מבנה בצבע חום כהה הממוקם בקצה האחורי של בטן הגחון) בדיעבד עד שהוא מתנתק מהבטן. ברוב המקרים, האשכים, שלפוחית ​​זרע ובלוטת אבזר יוסרו מהבטן יחד עם אברי המין החיצוניים, אם לא, להכניס זוג אחד של מלקחיים לתוך הבטן ולהקניט את האשכים.
  6. אשכים נפרדים מבלוטת אבזר ואברי מין חיצוני באמצעות שני זוגות מלקחיים בירידת PBS (איור 2). אשכים wild-type בקלות להבחין בין רקמות שכנות הלבנות לפי צבעם הצהוב. פנה מייד לצעד 2.
  7. כדי לבודד אשכים מזכרי pharate (i .. הדואר הסגור בתוך המקרה גלמי), צריך קודם לבצע צעד נוסף שכרוך בהסרה לטוס מהמקרה גלמי; שלב זה כבר תואר בעבר במקום אחר ביום 31. להמשיך עם נתיחה כלאשכים למבוגרים מתחילים בצעד 1.2.
  8. כדי לבודד אשכים מזכרי זחל, לבצע שינוי של פרוטוקול לבידוד השחלות זחל דרוזופילה 32. בקצרה, זחלי זכר ניתן להבחין בין זחלים נשיים על ידי הנוכחות של זוג המבנים גדולים, ברורים, סגלגלים (אשכים זחל) משובצים בשליש האחורי של השומן בגוף. כדי לבודד אשכים זחל, באופן חלקי לפשוט את העור לפתוח את זחל הזכר לבודד את האשכים ושומן הגוף סביב מהבטן כפי שתואר עבור הבידוד של השחלות זחל. פנה מייד לשלב 2 של הפרוטוקול המתואר במסמך זה; האשכים יכולים להיות מאוחר יותר הוסרו מהגוף השומן רק לפני ההרכבה (שלבים 2.3 או 3.14) כפי שתואר לשחלות 32.

ss = "jove_title"> 2. לדוגמא הכנה והדמית חיה

  1. השתמש זוג מלקחיים למקום בעדינות 2-3 זוגות של אשכים בירידה של 4-5 מיליליטר של PBS על להחליק את מכסה זכוכית מרובע. שים לב שהיחס בין מספר אשכים לPBS עוצמת שמע עשוי צריך להיות מותאם: יותר מדי נוזלים ימנעו תאים מלהתפשט כראוי כאשר נמעכו, ואילו נוזל מעט מדי יגרום לתאים להתפוצץ כאשר מעוך. אופציונאלי: כיסוי siliconized שימוש מחליק כדי למזער את ההיצמדות של רקמות כדי לכסות להחליק בשלב 3.2.
  2. השתמש זוג המלקחיים לקרוע פתוח כל אשך בעמדה מתאימה כדי למקסם את נוכחותם של סוגי התאים הרצויים בתאי מין בהכנה (שים לב שהתוכן של האשך תהיה בעיקר יציאה מהאזור הקרוע לשקופית במעיכה צעד.) כדי להעשיר לspermatogonia וspermatocytes, לקרוע לפתוח את האשך סמוך לקצה הקודקוד שלה (ברמה 1, איור 2). כדי להעשיר לspermatocytes וspermatids, דמעה לפתוח את האשך בקופהition מעט בסיס לרמת 1 (רמה 2, איור 2). כדי להעשיר את תאים בתאי מין בוגרים יותר, קורע את האשך קרוב יותר למקום שבי העקמומיות מתחילה (רמה 3, תרשים 2B).
  3. מניח בעדינות שקופית מיקרוסקופ זכוכית על להחליק את המכסה למחוץ את האשכים; לא להפעיל לחץ באופן ידני כמו המשקל של להחליק את המכסה בלבד מספיק כדי להשיג מדגם מעוך כמו שצריך. נסה להימנע מלכידת בועות אוויר. אופציונאלי: מיקרוסקופ השתמש פולי-L-ליזין מצופה מחליק לקדם היצמדות של רקמות כדי להחליק בשלב 3.2.
  4. להשתמש בתכשיר באופן מיידי (באופן אידיאלי בתוך 15 דקות של הכנה) להתבונן תאי חיים על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד; לזבובים מהונדסים עם ביטוי של חלבונים מתויגים fluorescently באשכים, ניתן לבדוק תאי חיים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלב זה. לחלופין, להמשיך עם קיבעון ומכתים נוגדן (פרוטוקול 3).
  5. בעדינות פתיל את נוזלי עודפים מתחת coverslip באמצעות ניקוי wipe לאפשר השטחת ההכנה עד תאי הנבט הם בבירור בפוקוס.

3. פורמלדהיד קיבוע ונוגדן מכתים

  1. הצמד להקפיא כל שקופית המכילה אשכים מעוכים (מפרוטוקול 2) באמצעות מלקחי מתכת כדי לטבול אותו בקצרה בחנקן נוזלי (עד חנקן נוזלי מפסיק מבעבע).
  2. הסר את תלוש לכסות באופן מיידי באמצעות סכין גילוח.
  3. השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למדף זכוכית שקופית prechilled מלא באתנול 95% קרים כקרח (הכיתה spectrophotometric, נטול מתנול). חנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למתלת שקופיות זכוכית מלאות בפורמלין 4% ב-PBS בתוספת 0.1% טריטון X-100 (PBS-T). לאחסן בטמפרטורת חדר למשך 7 דקות.
  5. השתמש במלקחי מתכת כדי להעביר שקופיות למתלת שקופיות זכוכית מלאות PBS. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 1x. לבצע את כל שוטף על ידי השלכת פתרון במעמד שקופיות זכוכית (
  6. מחק את PBS ולטבול את השקופיות ב-PBS-T ל30 דקות בטמפרטורת חדר כדי permeabilize קרום תא.
  7. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 2x.
  8. חסימת צעד (לא חובה): לטבול את השקופיות ב PBS בתוספת BSA 1% ל45 דקות בטמפרטורת חדר.
  9. השתמש בעט מחסום הידרופובי לצייר עיגול בשקופית סביב רקמה מעוכה (נראית בקלות בעין) על מנת להגביל את פתרונות הנוגדנים (הוסיפו בצעדי 3.9 ו3.11). הרקמות צריכה להישמר לחה בכל העת בעת ביצוע immunostaining.
  10. הוספת 30-40 מיליליטר של נוגדן ראשוני (בדילול מלא PBS-T, 1:400 ל1:50, בהתאם לנוגדנים) לרקמה בתוך המעגל. אם החסימה בוצעה, לדלל נוגדן ראשוני ב-PBS-T בתוספת BSA 1%. נוגדן אנטי גמא טובולין (לצביעת centrosomes באיור 4) היה מדולל 1:100. דגירה בתא לח, כהה (קופסא פלסטיק סגורה לדוגמא.במגבות לחות נייר) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר או הלילה ב 4 ° C.
  11. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר 3x. אם החסימה בוצעה, לשטוף פעמים PBS-T ופעם אחת ב-PBS (5 דקות בטמפרטורת חדר כל אחד).
  12. הוספת 30-40 מיליליטר של נוגדן fluorophore מצומדות המשני (בדילול 1:400 ב-PBS) לרקמות דגירה בחושך במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר.
  13. לשטוף שקופיות PBS במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על 2x.
  14. הוספת 30-40 מיליליטר של תמיסת DAPI (0.2 מ"ג / מיליליטר PBS) לרקמה בתוך המעגל.
  15. מניח בעדינות להחליק את מכסה זכוכית על הרקמות, לטפל כדי למנוע לכידת בועות אוויר. אם בועות האוויר אמורות להופיע, לנוע בזהירות סביב להחליק את המכסה מבלי להרוס את הקישואים עד שהבועות לברוח מן הצדדים של להחליק את המכסה.
  16. השתמש ניקוי לנגב למחוק DAPI העודף מהקצוות של השקופיות.
  17. לאטום להחליק את המכסה לשקופית באמצעות לק ברור.
  18. להשתמש בתכשיר זהבתוך 3-4 שעות הבאות כדי להציג תאי immunostained על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עבור אחסון לטווח ארוך של שקופיות (עד לפחות כמה שבועות), יש להשתמש באמצעי תקשורת קשה הר מבוסס גליצרול עם DAPI, ושקופיות חנות ב -20 ˚ C.
  19. לחלופין, לתקן את הדגימות במתנול במקום פורמלדהיד (תלוי באנטיגן). לאחר שסיים את הפרוטוקול כולו דרך שלב 3.2, לטבול את השקופיות של אשכים מעוכים במתנול 10 דקות ב -20 מעלות צלזיוס ולהמשיך בשלב 3.5 ואילך.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

דוגמא של זוג גזור כהלכה של איברי הרבייה של גבר דרוזופילה מוצגת באיור 2 א. אשכים הוסרו מהבטן של זבוב זכר הבוגר מצורפים בדרך כלל לצינור השופכה (חום, איור 2 א ') וזוג בלוטות אבזר (הירוק, איור 2 א') באמצעות זוג שלפוחית ​​זרע (הכחול, איור 2 א ') . כדי להפריד את האשכים מרוב הרקמות הנלוות סומטיים, צינור השופכה ואת בלוטות האבזר צריך להיות מנותק וזנוח כזה שרק זוג האשכים ושלפוחיות הזרע יישארו (2B דמויות ו2B '). שלפוחית ​​הזרע ניתן גם להסיר, ומשאירה רק את זוג אשכים לעיבוד נוסף.

גיל הזכרים הבוגרים שנבחרו לנתיחה אשכים הוא שיקול חשוב. בגברים צעירים (0-2 ימים לאחר eclosion), שלפוחית ​​הזרע הם קטניםוכמעט ריק, והאשכים נמצאים בקוטר שלהם המקסימאלי (כמו באיור 2). שימוש בזכרים צעירים מבטיח מספר גדול יחסית של תאי חלוקת תאי מין (עוברים גם מיטוזה או מיוזה) וspermatids פוסט meiotic המוקדם. כאשר זכרים מבוגרים יותר (3-5 ימים לאחר eclosion) משמשים לנתיחה (תמונה לא מוצגת), שלפוחית ​​הזרע הן בולטות יותר, כי הם בולטים עם זרע, והאשכים הם צרים יותר מאשר אצל גברים צעירים יותר. גברים מבוגרים יותר עדיפים אם המטרה היא להמחיש זרע בוגרים.

בשל ההתקדמות המסודרת של אירועים התפתחותיים לאורך האשכים דרוזופילה, ניתן להעשיר את תאים בתאי מין בשלבים מסוימים של תאי זרע הבוסס על המיקום שבו ניתח אשכים קרועים לפני למעוך. לדוגמא, קורע פתוחים האשך ליד קצה הקודקוד שלה (ברמה 1, איור 2 ב ') מניב שפע של תאים בתאי זרע של שלבים מוקדמים. איור 3מציג תמונת שלב ניגודיות של אוכלוסיית נציג spermatogonia (חץ לבן), spermatocytes המוקדם הראשוני (חץ צהוב), וspermatocytes מאוחר הראשוני (חץ אדום) שהושג בדרך זו. לחלופין, קורע פתוח האשך בעמדה קצת יותר בסיסי (רמה 2, איור 2 ב ') מניב בעיקר spermatocytes וspermatids. איור 3 ב מציג תמונת שלב ניגודיות של אוכלוסיית תאי נציג spermatocytes הראשוני (חץ אדום), spermatids העגול ( חץ ירוק), מתארך spermatids (חץ כתום), וחבילות זרע בוגרים (חץ כחול) שהושג בדרך זו.

הדמיה שלב ניגודיות של אשכים יכול לשמש כדי לאפיין פגמים בתאי זרע דרוזופילה כתוצאה ממוטציות בגנים שהם קריטיים לתהליך הזה. יש לי spermatids סיבוב מראה מאוד סטריאוטיפי כאשר נצפה מבעד למיקרוסקופ שלב ניגודיות. כל אחד מאלה יש spermatids בשלה יחיד, phasדואר אור, גרעין עגול ו, צבירה יחידה, שלב כהה עגולה המיטוכונדריה של בערך באותו הגודל (מסומן על ידי ראש חץ וחץ סגולים, בהתאמה, באיור 3 ג). וריאציה במספרים או גדלים יחסי של אברונים אלה יכול לנבוע מחטיבות meiotic חריגות (ראה דיון). דוגמא לפגם מסוג הנ"ל שמוצגת באיור 3D. spermatids העגול מזכרים בוגרים עם מוטציה של הגן לגזרים (asun) מכיל המצרפי אחת גדולה של המיטוכונדריה וגרעינים קטנים מרובים כתוצאה מפגמים בcytokinesis והפרדת כרומוזום 29.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא עוד גישה רבת עוצמה ללימוד spermatogenesis דרוזופילה. דוגמא של תמונת ניאון של תאים קבועים ממדגם אשכים מעוכים מוצגת באיור 4. אשכים התקבלו מזבובים מהונדסים להביע GFP-beta1-טובולין (תוצר של גני bTub56D התמזגו ב-C-terminal בסופו לGFP ותחת שליטה של אמרגן גן היוביקוויטין Ubi-p63E; מתנת H. עוד וי 'אקיאמה-אודה, JT Biohistory המחקר הול, אוסקה, יפן) כדי לתייג את microtubules (ירוק באיור 4D, בגווני אפור באיור 4 א). האשכים מהונדסים היו immunostained באמצעות נוגדני עכבר נגד גמא טובולין (שני נוגדנים: אנטי עכבר Cy3) כדי לסמן centrosomes (אדום באיור 4D, בגווני אפור באיור 4C) וDAPI מוכתם לסמן DNA (כחול באיור 4D, בגווני אפור באיור 4 ב). תאים בשלבים שונים של תאי זרע יכולים להיות מזוהים בקלות על ידי בחינת ההסדר של microtubules, centrosomes, והכרומוזומים (ראה אגדה).

איור 1
Figu מחדש 1. סכמטי של חלוקות תא בתאי מין אצל זכרים דרוזופילה. כל חטיבת תאי גזע מייצרת תא gonial שעובר ארבעה סיבובים של חטיבות המיטוטי עם cytokinesis שלם כדי לייצר ציסטה 16 תאים של spermatocytes העיקרי. כל spermatocyte העיקרי עובר שלב צמיחה ממושך לפני שעבר שתי חטיבות meiotic, שוב עם cytokinesis שלם, כדי ליצור ציסטה 32 תא של spermatocytes המשני ביניהם ואחרי ציסטה 64 תא של spermatids סבב ביניהם. spermatids העגול מאופיינים על ידי הנוכחות של גרעין שלב אור וצבירת שלב כהה המיטוכונדריה (Nebenkern) בגדלים דומים. Spermatids העגול עובר התארכות וindividualization כדי ליצור זרע הבוגרים. ניתן לזהות ראשי זרע בשלים ידי הגרעינים בצורת המחט שלהם. גרעינים מוצגים בכחול; Nebenkerne (מצרפים של המיטוכונדריה) בשחור; ציטופלסמה בשיזוף./ "= היעד" _blank 50981fig1highres.jpg "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איברי איור 2. רבייה של זכרים דרוזופילה. זכרים בוגרים צעירים (0-2 ימים לאחר eclosion) נבחרו לנתיחה. micrographs אור של איברי רבייה מבודדים מוצג בA ו-B עם מקביל קריקטורות ב'ו-B '. (, ') האשכים דרוזופילה (אדום) הוסרו מהבטן של זבוב זכר בוגר מחוברים לצינור השופכה (חום) באמצעות שלפוחית ​​הזרע (הכחולה). זוג בלוטות אבזר (ירוק) הוא גם מחובר לצינור השופכה. (ב ', ב') צריכים להיות מופרדים האשכים מבלוטות האבזר בefore להחליק הכנה. לפני למעוך, קורע את האשכים ברמה 1 להעשרת תאים בשלבים המוקדמים של תאי זרע; ברמה 2 כדי להשיג את אוכלוסייה מעורבת של meiotic ותאים בתאי מין שלאחר meiotic; וברמת 3 להעשרה לזרע בוגרים. סרגל קנה מידה, 250 מ"מ. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. תמונות שלב ניגודיות של אשכים דרוזופילה. () שפע של תאים בשלבים מוקדמים של תאי זרע, ובכלל זה spermatogonia (חץ לבן), spermatocytes המוקדם הראשוני (חץ צהוב), וspermatocytes מאוחר ראשוני (חץ אדום) הם שוחררו בדרך כלל כאשר האשך נקרע ברמת 1 (ראה איור2B יור '). שניים או מחוברים יותר תאים (כתוצאה מcytokinesis שלם) לעתים קרובות למזג לחלוטין כתוצר של הליך המעיכה (ראש חץ צהוב מסמן שילוב של שתי spermatocytes המוקדם). (ב) שילוב של spermatocytes (חץ אדום מסמן spermatocyte העיקרי מאוחר) ותאים שלאחר meiotic, כולל spermatids העגול (חץ ירוק), spermatids מתארך (חץ כתום מסמן ציסטה החלקית), וחבילות זרע בוגרים (חץ כחול), הוא בדרך כלל שוחרר כאשר האשך נקרע ברמה 2 (ראה איור 2 ב '). (C, D) הדמיה שלב ניגודיות של אשכים מעוכים יכולה לשמש כדי לזהות בקלות פגמים בspermatids העגולה בשפע והסטריאוטיפי. יש לי spermatids פראי מסוג גרעין אחד (שלב האור; סומן על ידי ראש חץ סגול) מצורף לצבירה יחידה של המיטוכונדריה (שלב כהה; המסומנות בחץ סגול) בגודל שווה פחות או יותר (C). Spermatids מasunf02815אשכים מכילים גרעינים קטנים מרובים וצבירת המיטוכונדריה אחד גדולה כתוצאה מcytokinesis נכשל ושגיאות בהפרדת כרומוזום (ד '). סרגל קנה מידה, 10 מ"מ. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4
.. תמונת איור 4 פלורסנט של אשכים דרוזופילה ההכנות של אשכים מעוכים מבודדות מזכרים להביע GFP-tagged beta1-טובולין (ירוק בD, בגווני אפור ב) קובעו ונצבעה עבור שניהם ה-DNA (DAPI; כחולה בD, בגווני אפור בבוקר) וcentrosomes (נוגדני גמא טובולין; אדום בD, בגווני אפור ב-C). Spermato חלוקתcyte (חץ לבן) ניתן לראות בסמוך לשדה גדול של spermatids העגול (חץ לבן מסמן תאי נציג) וחבילה של זרע בוגרים (חץ צהוב). סרגל קנה מידה, 10 מ"מ. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

למרות שהאשכים של זבובים פראי מסוג ניתן לזהות בקלות בשל צבעם הצהוב (בניגוד לרקמות שכנות הלבנות), האשכים של זבובים שעברו מוטציה לבנים הם לבנים ולכן לעתים ניתן להתבלבל עם הבטן. זנים מהונדסים ביותר, אשר בדרך כלל ברקע לבן, יש גם אשכים לבנים בגלל גן המיני לבן שנמצא בP-אלמנטים אינו מקדם הצטברות הפיגמנט באשכים. כאשר לא ניתן להבחין אשכים דרוזופילה לפי צבע, תכונות קלות לזיהוי אחרים כוללות דפוס שלהם הספירלה והתרחשות בזוגות 12. שים לב שחלק מהעובדים מוצאים את זה קל יותר לשימוש במחטים לנתיחה במקום מלקחיים כדי לבודד את האשכים 12.

שלב קריטי של פרוטוקול זה הוא ההכנה של האשכים מעוכים. גישה שימושית אחת היא לרחף שקופיות כמה מילימטרים מעל להחליק את המכסה המכיל את האשכים כך שte פני השטחnsion של PBS על להחליק את המכסה מרים להחליק את המכסה המכיל הרקמה לכיוון השקופיות. שיטה זו נוטה לשבש ציסטות ופרושים תאים בשקופית, מה שהופך אותו אידיאלי עבור הדמיה תאים בודדים. לחלופין, כדי לשמור על ציסטות שלמות או חלקיות עבור הדמיה, בהיקף של PBS יוצב על להחליק את המכסה יכול להיות מוגבר (4-5 מיליליטר ל 7-8 מיליליטר).

אם מוטציה דרוזופילה מסוימת של עניין לא מצליחה לשרוד עד לבגרות, ואז אשכים זחל או גלמים יכולים לחלופין לשמש כדי לחקור תאי זרע. בקטע הפרוטוקול, הפניות ניתנות לבידוד של זכרים pharate והשחלות זחל; שינוי של הפרוטוקול האחרון יכול לשמש כדי לבודד אשכים זחל. הצעדים לקריעה, למעוך, ומכתימים את האשכים זחל או גלמים הם בעצם זהים לזה שתואר במסמך זה לאשכים למבוגרים. גם אם קו הזבוב להיחקר יכול להגיע לבגרות, בידוד של אשכים זחל או גלמים עשוי להיות עדיף אם goal הוא להשיג תאים בשלבים המוקדמים של תאי זרע. כפי שתואר בסעיף תוצאות הנציג, יכול להיות מועשרים בתאים של תאי זרע מוקדם או מאוחר שלבים לפי צורך על ידי שינוי הרמה שבה האשך נקרע לפני למעוך.

מיקרוסקופ שלב בניגוד מציע גישה פשוטה יחסית ללימוד spermatogenesis דרוזופילה. אחד יתרונות של מיקרוסקופ שלב בניגוד מעל immunostaining ומיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא שנדרש פחות זמן להכין את הדגימות. כל השלבים העיקריים של תאי זרע ניתן לזהות בקלות באמצעות טכניקה זו 24. ואכן, מספר קבוצות השתמשו בניתוח מיקרוסקופי שלב בניגוד לאשכים כמסך עיקרי לאפיון פנוטיפים של קווי זכר סטרילי דרוזופילה מוטציה 21-23. במהלך חטיבות meiotic, מיטוכונדריה והכרומוזומים מחולקים באופן שווה לתאי בת. תכונה ייחודית של תאי זרע בDrosophilוחרקים אחרים כרוך בהיווצרות כוללת של המיטוכונדריה (Nebenkern) בspermatids העגול 24. spermatids העגול מכיל Nebenkern שלב כהה וגרעין שלב האור בגודל שווה פחות או יותר ביחס 1:1 (איור 3). הקוטר של הגרעין משקף את תוכן ה-DNA של spermatids העגול, ולכן טעויות בהפרדת כרומוזום במהלך המיוזה יכולות להוביל לשונות בגודל גרעיני 33. שיבוש של cytokinesis meiotic בעקבות תוצאות הפרדה כרומוזום בspermatids העגולה multinucleated בי פתיל Nebenkerne ל34 כולל אחד. לפיכך, כל שינוי ביחס 1:1 או בגודל או צורה של Nebenkern וגרעין בspermatids העגול יכול להיות מזוהה בקלות על ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד לאשכים חיים ולעתים קרובות אבחון של מומים במיוזה. שילוב של שתיים או תאים מחוברים יותר בתוך הציסטה נפוצה לעתים קרובות מתרחש כתוצר של הליך המעיכה (איור 3A, ראש החץ צהוב); ביחס של 1:1 של גרעינים לNebenkerne, לעומת זאת, עדיין נשמר.

Immunostaining של הכנות קבועות של האשכים דרוזופילה ניתן לבצע לביים תאי זרע עוברים תאים, כמו גם להעריך את דפוסי ביטוי ומגוירים subcellular של חלבונים של עניין. ערכה מעודנת לסיווג השלבים של spermatogenesis דרוזופילה המבוססים על המורפולוגיה התאית, ארגון הכרומטין, והסדרי microtubule של אשכים תאי immunostained לטובולין ומוכתם DNA תוארה 19. Spermatocytes העיקרי דרוזופילה הם תאים גדולים יחסית, וצירי meiotic יכולים בבירור שנצפה באמצעות גישה זו. Coimmunostaining לcentrosomes (לדוגמא, שימוש בנוגדנים כנגד גמא טובולין) יכול להיות מבוצע כדי להשיג מבט מדויק יותר של מבנה ציר meiotic. פורמלדהיד הוא מקבע מתאים כאשר immunostaining אשכים עם מגוון רחב של antibodies (לדוגמא, אנטי lamin ושרשרת כבדה נגד dynein). המורפולוגיה של microtubules וcentrosomes, לעומת זאת, היא טובה יותר לגובה עם מתנול, ולכן, מתנול משמש בדרך כלל כמקבע בעת ביצוע immunostaining עם נוגדנים כנגד אלפא טובולין וגמא טובולין.

אם נוגדנים נגד חלבון של עניין אינם זמינים, יכולים להיות שנוצרו קווים מהונדסים דרוזופילה להביע גרסה (לדוגמא. MCherry או GFP) מתויגת fluorescently של החלבון כגישה חלופית. לוקליזציה subcellular של החלבון אז יכולה להיות נקבעה על ידי שימוש במיקרוסקופ כדי לראות את הקרינה ה-GFP בהכנות חיות או קבועות של רקמות; לחלופין, ניתן להשתמש בנוגדנים אנטי-GFP כדי לזהות את חלבון ההיתוך בדגימות קבועות. באיור 4, microtubules בהכנת אשכים קבוע היו דמיינו באמצעות הקרינה הפנימית של beta1-טובולין-GFP-tagged (הביעה מtransgene תחת שליטה של גושברית הביעה אמרגן היוביקוויטין). לחלופין, זבובים מהונדסים שבו ביטוי הוא תחת השליטה של אמרגן רקמות ספציפיות, למשל, האמרגן של הגן beta2-טובולין שימש במשך אשכים ספציפיים ביטוי 35. לחלופין, את הביטוי של חלבון של עניין יכול להיות מוגבל לתאים בתאי מין גבריים ספציפיים על ידי שימוש במערכת כטב"מ-Gal4 36. Nanos-Gal4 ניתן להשתמש כדי לגרום לביטוי של חלבון תחת השליטה של אמרגן כטב"מ בתוך תאי spermatogonial, בעוד בום-Gal4 ניתן להשתמש כדי לגרום לביטוי שלה בתוך spermatocytes 37. מציאה של חלבון של עניין גם יכולה להיגרם באשכים בהבעת מבנה סיכת ראש RNAi תחת השליטה של אמרגן כטב"מ בשיתוף עם נהגי Gal4 אלה 37.

פיתוח השיטות לניתוח חי תמונה של תאי אשכים דרוזופילה הרחיב את מגוון שאלות שיכולים להיותהתייחס באמצעות מערכת זו. האירועים של cytokinesis meiotic ניתן דמיינו ידי מיקרוסקופ שלב בניגוד לspermatocytes מתורבת בקרישי הפיברין בתוך תא זלוף על מנת להאריך את חיי התאים 35. גם מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות של spermatocytes דרוזופילה לבטא חלבונים מתויגים fluorescently כבר גישה רבת עוצמה (לדוגמא, כדי ללמוד הרכבה ציר meiotic) 38. השימוש במיקרוסקופ confocal הדמיה חיה של שלב מוקדם יותר, תאי גזע בתאי מין החלוקה של האשכים דרוזופילה, הובילו להבנה מוגברת של רגולציה בתאי גזע. בנוסף לגישות מיקרוסקופית שלב בניגוד וimmunofluorescence המוצגות כאן, מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים יש גם שימוש נרחב ללמוד spermatogenesis דרוזופילה ביום 31.

בנוסף להדמיה, ניתן להשתמש בם האשכים דרוזופילה כמקור של חומר לניתוח ביוכימיs. עבור ניסויי immunoblotting, יכולים להיות הומוגני אשכים זבוב גזורים בחיץ מדגם 6x (5 מיליליטר / אשכים זוג), מבושל, ונטענים ישירות על ג'ל SDS-PAGE (~ זוגות 4 אשכים / נתיב). לדוגמא, גישה זו נעשתה שימוש כדי להעריך את הרמות של מרכיבי dynein-dynactin באשכים של כמה מוטציות דרוזופילה. לחלופין ניתן להכין תמציות אשכים ידי שמאחד את הרקמה במאגר תמוגה nondenaturing אם זה חשוב כדי לשמור על שלמות חלבון. לדוגמא, דרוזופילה אשכי תמציות היו בשימוש בניסויי coimmunoprecipitation להפגין הנוכחות של קומפלקסי חלבונים יציבים ברקמה זו 41-43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות למייקל אנדרסון להקמה במעבדה לי שיטות המקובלות אלה לחקר תאי זרע עם ייעוץ מקצועי מקארן חאלס. ה 'עוד וי' אקיאמה-Oda סיפקו בנדיבות γ-טובולין-GFP לטוס מניות. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01 לLAL (GM074044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).
ניתוח ציטולוגית של תאי זרע: הכנות בשידור חי והקבועות של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אשכים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter