Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

शुक्राणुजनन की कोशिकीय विश्लेषण: की लाइव और फिक्स्ड तैयारी Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/51058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

अलग और चरण विपरीत और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा इमेजिंग के लिए ड्रोसोफिला वृषण नमूने (रहते हैं और फिक्स्ड) तैयार करने के लिए तरीके के साथ साथ वर्णित हैं.

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर व्यापक रूप से जैविक प्रक्रियाओं की एक किस्म को स्पष्ट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है. उदाहरण के लिए, महिला और ड्रोसोफिला के पुरुष रोगाणु लाइनों दोनों की पढ़ाई चालू अर्धसूत्रीविभाजन की समझ के साथ ही स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के लिए बहुत योगदान दिया है. बहुत बढ़िया प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला अंडाशय और वृषण 3-12 के अलगाव और इमेजिंग के लिए साहित्य में उपलब्ध हैं. इस के साथ साथ, सूक्ष्म विश्लेषण के लिए विच्छेदन और ड्रोसोफिला वृषण की तैयारी के लिए तरीके एक साथ वीडियो प्रदर्शन के साथ वर्णित हैं. वयस्क पुरुषों के पेट से वृषण अलग और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के साथ ही प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण के लिए वृषण फिक्सिंग और immunostaining के लिए एक प्रोटोकॉल के लिए जीना ऊतक की स्लाइड तैयार करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत कर रहे हैं. इन तकनीकों में डी प्रदर्शन है कि ड्रोसोफिला म्यूटेंट के लक्षण वर्णन में लागू किया जा सकता हैशुक्राणुजनन में साथ ही साथ प्रोटीन की subcellular localizations के दृश्य में efects.

Introduction

ड्रोसोफिला वृषण स्टेम कोशिकाओं का विनियमन, अर्धसूत्रीविभाजन, और शुक्राणु विकास 13-18 सहित कई जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल प्रणाली रहे हैं. spermatocytes और उनके meiotic spindles बड़े और कोशिकीय विश्लेषण के लिए इसलिए सुविधाजनक हैं, और शुक्राणुजनन के दौरान आराम से सेल चक्र चौकियों सेल चक्र जीन में उत्परिवर्तन के अध्ययन की सुविधा. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं वृषण की लंबाई के साथ आदेश दिया प्रगति में मनाया जा सकता है, और शुक्राणुजनन में कोई व्यवधान इस समग्र व्यवस्था में परिवर्तन हो सकता है. ड्रोसोफिला आनुवंशिक उपकरणों के साथ संयुक्त इन सुविधाओं शुक्राणुजनन 21-23 की उत्परिवर्तनीय विश्लेषण में मदद की है.

ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन के चरणों में अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है. अल्सर के भीतर synchronously कि विकास जर्मलाइन कोशिकाओं वृषण की लंबाई के साथ शुक्राणुजनन के चरणों के माध्यम से क्रमिक रूप से प्रगति. बो के दौरानmitotic और पुरुष रोगाणु कोशिकाओं की meiotic डिवीजनों वें, cytokinesis बेटी कोशिकाओं (चित्रा 1) अंगूठी नहरों के रूप में जाना cytoplasmic पुलों से जुड़े रहते हैं कि अधूरे ऐसी होती है. वृषण के शिखर टिप प्राथमिक spermatocytes के 16 सेल अल्सर उत्पन्न करने के लिए अधूरा cytokinesis साथ चार mitotic डिवीजनों से गुजरना जो spermatogonial कोशिकाओं, को जन्म देता है कि germline स्टेम कोशिकाओं की आबादी शामिल है. Premeiotic एस चरण के बाद, प्राथमिक spermatocytes G2, ~ 90 घंटा जो सेलुलर मात्रा बढ़ जाती है ~ 25 गुना के दौरान की एक लम्बी विकास की अवधि में प्रवेश. अर्धसूत्रीविभाजन मैं और क्रमशः माध्यमिक spermatocytes और अगुणित spermatids के 64 सेल अल्सर, के 32 सेल अल्सर के गठन में अर्धसूत्रीविभाजन II परिणामों के माध्यम से प्रगति. अपरिपक्व, गोल spermatids परिपक्व शुक्राणु के लिए फार्म का व्यापक सेलुलर remodeling गुजरना. पोस्ट meiotic कोशिकाओं, elongating के बंडलों और परिपक्व spermatids विशेष रूप से, वृषण की मात्रा का ज्यादा कब्जा करना था.

टीमादा मक्खियों के लिए कार्यात्मक शुक्राणु की वह सफल परिवहन कई बनती संरचनाओं (वृषण, लाभदायक vesicles, और सहायक ग्रंथियों) और एक भी उद्गार वाहिनी से बना है जो पुरुष प्रजनन प्रणाली, चित्रा (2) के विभिन्न भागों के बीच समन्वय की आवश्यकता है. शुक्राणु वृषण भीतर उत्पादन और शयन 24 तक लाभदायक vesicles के भीतर जमा हो जाती है. सहायक ग्रंथियों लाभदायक तरल पदार्थ का उत्पादन है कि स्रावी कोशिकाओं होते हैं. लाभदायक vesicles से पलायन शुक्राणु लाभदायक vesicles और सहायक ग्रंथियों दोनों से जुड़ा है जो उद्गार वाहिनी, भीतर लाभदायक तरल पदार्थ के साथ मिश्रित कर रहे हैं. शुक्राणु और लाभदायक तरल पदार्थ के मिश्रण यह अंततः महिला पुरुष के पेट से 25 के पीछे के अंत में स्थित उद्गार बल्ब के माध्यम से उड़ान भरने की योनि में पुरुष के बाहर पंप है. लाभदायक तरल पदार्थ के भीतर प्रोटीन प्रतिनिधि में spermathecae के रूप में जाना विशेष अंगों के भीतर शुक्राणु के लंबे समय तक भंडारण के लिए आवश्यक हैंड्रोसोफिला महिलाओं की 26 roductive पथ.

ड्रोसोफिला वृषण का अलगाव और शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं के दृश्य के लिए बहुत बढ़िया तरीकों वैज्ञानिक साहित्य 3-12 में उपलब्ध हैं. हम यहाँ एक साथ वीडियो प्रदर्शन के साथ इन प्रोटोकॉल का उदाहरण पेश करके ज्ञान के इस शरीर को जोड़ें. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी के लिए जीना वृषण नमूनों की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल एक पहले से वर्णित विधि 27 पर आधारित है. formaldehyde के निर्धारण और वृषण के immunostaining के लिए प्रोटोकॉल भी एक पहले से वर्णित विधि 28 पर आधारित है. यहाँ बताया दृष्टिकोण (उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन के दौरान, एक शून्य से अंत निर्देशित microtubule मोटर dynein की भूमिका का आकलन करने के लिए) ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन के कई अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है.

बुनियादी प्रोटोकॉल के अलावा, सुझाव varyin के लिए प्रदान की जाती हैंजी विच्छेदन spermatogonia, spermatocytes, या परिपक्व शुक्राणु के लिए समृद्ध करने के लिए इतनी के रूप में. इस तरह के अल्सर कि वृषण प्रसंस्करण के लिए विभिन्न तरीकों बरकरार रहेगा या वर्णित हैं जरूरत के रूप में बाधित कर रहे हैं. एक मॉडल प्रणाली के रूप में ड्रोसोफिला वृषण का उपयोग में एक फायदा ड्रोसोफिला oocytes और भ्रूण की तुलना में, एंटीबॉडी और रंजक आसानी वृषण से उनके प्रसार निम्नलिखित कोशिकाओं घुसना कर सकते हैं, और कम धोने कदम जरूरी हैं, वह है, इस प्रकार, प्रोटोकॉल एक अपेक्षाकृत में प्रदर्शन किया जा सकता है कम समय.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Testes विच्छेदन

  1. सीओ 2 की एक धारा का उपयोग कर एक बोतल या शीशी में मक्खियों anesthetize और एक मक्खी पैड को हस्तांतरण.
  2. क्रमबद्ध एक छोटे तूलिका का उपयोग कर एक विदारक खुर्दबीन के नीचे मक्खियों, और वांछित जीनोटाइप के ड्रोसोफिला पुरुषों की (प्रयोग पर निर्भर करता है) एक उचित संख्या में एकत्र. (2-5 दिन पुरानी) थोड़ा पुराने पुरुषों कोशिकाओं की जांच के लिए आदर्श होते हैं जबकि (0-2 दिन पुरानी) युवा पुरुषों, शुक्राणुजनन के पहले चरण (जैसे spermatogonia, spermatocytes, और जल्दी बाद meiotic spermatids) में कोशिकाओं की जांच के लिए आदर्श होते हैं शुक्राणुजनन के अंतिम चरण में (विशेष रूप से, शुक्राणु परिपक्व).
  3. (विच्छेदन के दौरान तरल में चल मक्खियों से रोकने के लिए) प्रत्येक उड़ान भरने से पंखों को निकालने संदंश का प्रयोग करें.
  4. पर एक सिलिकॉन लेपित विच्छेदन पकवान के लिए एक बूंद में, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस 130 मिमी NaCl, 7 मिमी ना 2 4 HPO, 3 मिमी नाह 2 पीओ 4) की ~ 500 मिलीलीटर जोड़ेंएक काले रंग की पृष्ठभूमि. अन्य जलीय समाधान सफलतापूर्वक वृषण विच्छेदन 3 के लिए इस्तेमाल किया गया है.
  5. प्वाइंट मक्खी की पूर्वकाल की ओर संदंश, छाती से यह समझ, और पीबीएस ड्रॉप में विसर्जित. विदारक माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखने के दौरान, यह पेट से detaches तक पीछे बाह्य जननांग (उदर पेट के पीछे के अंत में स्थित गहरे भूरे संरचना) समझ और खींचने के लिए संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करें. ज्यादातर मामलों में, वृषण, लाभदायक vesicles, और सहायक ग्रंथि बाह्य जननांग के साथ पेट के साथ से निकाल दिया जाएगा, यदि नहीं, तो पेट में संदंश की एक जोड़ी डालने और वृषण बाहर चिढ़ाओ.
  6. पीबीएस ड्रॉप में संदंश के दो जोड़े (चित्रा 2) का उपयोग गौण ग्रंथि और बाह्य जननांग से अलग वृषण. जंगली प्रकार वृषण आसानी से अपने पीले रंग से पड़ोसी सफेद ऊतकों से प्रतिष्ठित हैं. चरण 2 पर तुरंत आगे बढ़ें.
  7. Pharate पुरुषों (मैं से वृषण अलग करने के लिए.. ई पोटा संबंधी मामले के भीतर संलग्न), एक अतिरिक्त कदम पहले पोटा संबंधी मामले से मक्खी दूर करना शामिल है कि प्रदर्शन किया जाना चाहिए, यह कदम पहले से कहीं 31 में वर्णित किया गया है. 1.2 चरण में शुरुआत वयस्क वृषण के लिए के रूप में विच्छेदन के साथ आगे बढ़ें.
  8. लार्वा पुरुषों से वृषण अलग करने के लिए, ड्रोसोफिला लार्वा अंडाशय 32 अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का एक संशोधन प्रदर्शन करते हैं. संक्षेप में, पुरुष लार्वा वसा शरीर के पीछे तीसरे में एम्बेडेड बड़े, स्पष्ट, अंडाकार संरचनाओं (लार्वा वृषण) की एक जोड़ी की मौजूदगी से महिला लार्वा से प्रतिष्ठित किया जा सकता. लार्वा वृषण अलग करने के लिए, आंशिक रूप से लार्वा अंडाशय के अलगाव के लिए वर्णित के रूप में पेट से वृषण और आसपास वसा शरीर को अलग करने के लिए पुरुष लार्वा खोलने लूटना. यहाँ बताया प्रोटोकॉल के चरण 2 के लिए तुरंत आगे बढ़ना, वृषण बाद बस से पहले अंडाशय 32 के रूप में वर्णित (2.3 या 3.14 कदम) के बढ़ते करने के लिए वसा शरीर से हटाया जा सकता है.

  1. धीरे एक वर्ग गिलास को कवर पर्ची पर पीबीएस के 4-5 मिलीलीटर की एक बूंद में वृषण के 2-3 जोड़े स्थान के लिए संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें. बहुत कम तरल जब कुचल कोशिकाओं फट करने के लिए कारण होगा, जबकि बहुत अधिक तरल कुचल जब ठीक से फैलने से कोशिकाओं को रोकने जाएगा: पीबीएस मात्रा को वृषण संख्या के अनुपात को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है कि ध्यान दें. वैकल्पिक: उपयोग siliconized कवर 3.2 कदम में पर्ची कवर करने के लिए ऊतक का पालन कम करने के लिए निकल जाता है.
  2. (ध्यान दें तैयारी में वांछित germline प्रकार की कोशिकाओं की उपस्थिति को अधिकतम करने के लिए इतनी के रूप में एक उचित स्थान पर खुला प्रत्येक वृषण आंसू संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें कि squashing दौरान स्लाइड पर वृषण फटे क्षेत्र से होगा अधिकतर निकास की सामग्री कदम.) spermatogonia और spermatocytes के लिए समृद्ध है, इसके शिखर टिप (स्तर 1, चित्रा 2 बी) के लिए आसन्न वृषण खोलने के आंसू. Spermatocytes और spermatids के लिए समृद्ध है, आंसू एक स्थिति में वृषण खोलनेस्तर 1 (2 स्तर, चित्रा 2 बी) को थोड़ा बेसल ition. अधिक परिपक्व germline कोशिकाओं के लिए समृद्ध करीब वक्रता (स्तर 3, चित्रा 2B) शुरू होता है, जहां के लिए खुला वृषण आंसू.
  3. धीरे वृषण स्क्वैश कवर पर्ची पर एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड जगह, अकेले कवर पर्ची का वजन एक ठीक से कुचल नमूना प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है के रूप में मैन्युअल रूप से दबाव लागू नहीं है. हवाई बुलबुले को फँसाने बचने की कोशिश करें. वैकल्पिक: इस्तेमाल की पाली एल lysine लेपित माइक्रोस्कोप 3.2 कदम में स्लाइड करने के लिए ऊतक के पालन को बढ़ावा देने के लिए स्लाइड.
  4. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए (आदर्श तैयारी के 15 मिनट के भीतर) तुरंत तैयारी का प्रयोग करें, वृषण में fluorescently टैग प्रोटीन की अभिव्यक्ति के साथ ट्रांसजेनिक मक्खियों के लिए, जीवित कोशिकाओं के इस कदम पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जांच की जा सकती है. वैकल्पिक रूप से, निर्धारण और एंटीबॉडी धुंधला (प्रोटोकॉल 3) के साथ आगे बढ़ना.
  5. धीरे एक सफाई डब्ल्यू का उपयोग coverslip के नीचे से किसी भी अतिरिक्त तरल बातीजर्म कोशिकाओं ध्यान में स्पष्ट रूप से कर रहे हैं जब तक IPE तैयारी की सपाट अनुमति देने के लिए.

3. Formaldehyde फिक्सेशन और एंटीबॉडी धुंधला

  1. स्नैप (तरल नाइट्रोजन बुदबुदाती बंद हो जाता है जब तक) तरल नाइट्रोजन में इसे संक्षेप में विसर्जित करने के लिए धातु चिमटे की एक जोड़ी का उपयोग (प्रोटोकॉल 2) कुचल वृषण युक्त प्रत्येक स्लाइड फ्रीज.
  2. एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर तुरंत कवर पर्ची निकालें.
  3. ठंडा 95% इथेनॉल के साथ भरा एक prechilled गिलास स्लाइड रैक (spectrophotometric ग्रेड, मेथनॉल मुक्त) करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण करने के लिए धातु चिमटे का प्रयोग करें. 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  4. 4% पीबीएस में formaldehyde प्लस 0.1% ट्राइटन X-100 (पीबीएस-टी) के साथ भरा एक गिलास स्लाइड रैक करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण करने के लिए धातु चिमटे का प्रयोग करें. 7 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर.
  5. पीबीएस के साथ भरा एक गिलास स्लाइड रैक करने के लिए स्लाइड स्थानांतरण करने के लिए धातु चिमटे का प्रयोग करें. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड्स धो लें. 1x दोहराएँ. (कांच स्लाइड रैक में समाधान discarding की सभी washes प्रदर्शन करना
  6. पीबीएस त्यागें और कोशिका झिल्ली permeabilize करने के लिए कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पीबीएस आयकर में विसर्जित स्लाइड.
  7. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड्स धो लें. 2x दोहराएँ.
  8. कदम (वैकल्पिक) अवरुद्ध: कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड्स प्लस 1% बीएसए को विसर्जित कर दिया.
  9. (कदम 3.9 और 3.11 में जोड़ा) एंटीबॉडी समाधान सीमित करने के क्रम में (आंखों से आसानी से दिखाई) कुचल ऊतक के आसपास स्लाइड पर एक चक्र आकर्षित करने के लिए एक hydrophobic बाधा कलम का उपयोग करें. immunostaining प्रदर्शन करते हुए ऊतक हर समय नम रखा जाना चाहिए.
  10. सर्कल के भीतर ऊतकों को (एंटीबॉडी पर निर्भर 01:50 पीबीएस आयकर, 1:400 में पतला,) प्राथमिक एंटीबॉडी के 30-40 मिलीलीटर जोड़ें. अवरुद्ध किया जाता है तो पीबीएस टी प्लस 1% BSA में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला. (चित्रा 4 में centrosomes की धुंधला के लिए) एंटी गामा ट्यूबिलिन एंटीबॉडी 1:100 पतला था. एक नम, अंधेरे कक्ष (जैसे. बंद प्लास्टिक बॉक्स में सेतेनम कागज कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए तौलिए) या रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर साथ
  11. कमरे के तापमान 3x पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड्स धो लें. अवरुद्ध किया जाता है तो पीबीएस आयकर में दो बार धोने और एक बार पीबीएस में कमरे के तापमान (प्रत्येक पर 5 मिनट).
  12. ऊतक को fluorophore संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (पीबीएस में 1:400 पतला) के 30-40 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए अंधेरे में सेते हैं.
  13. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए पीबीएस में स्लाइड्स धो लें. 2x दोहराएँ.
  14. 30-40 सर्कल के भीतर ऊतकों को DAPI समाधान (पीबीएस में 0.2 मिलीग्राम / एमएल) की मिलीलीटर जोड़ें.
  15. धीरे हवा के बुलबुले फँसाने से बचने के लिए, देखभाल करने के ऊतक पर एक गिलास को कवर पर्ची जगह. हवाई बुलबुले प्रकट करना चाहिए, तो बुलबुले कवर पर्ची के पक्षों से भागने तक स्क्वैश नष्ट करने के बिना कवर पर्ची के आसपास सावधानी से ले जाते हैं.
  16. एक सफाई का प्रयोग करें स्लाइड के किनारों से अतिरिक्त DAPI दाग को मिटा.
  17. स्पष्ट नेल पॉलिश का उपयोग कर स्लाइड पर कवर पर्ची सील.
  18. इस तैयारी का प्रयोग करेंफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा immunostained कोशिकाओं देखने के लिए अगले 3-4 घंटे के भीतर. (कम से कम कई हफ्तों तक) स्लाइड्स की लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -20 ˚ सी में एक ग्लिसरॉल आधारित माउंट मुश्किल DAPI के साथ मीडिया, और दुकान स्लाइड्स का उपयोग
  19. वैकल्पिक रूप से, (प्रतिजन पर निर्भर करता है) मेथनॉल के बजाय formaldehyde में नमूनों को ठीक. 3.2 कदम के माध्यम से पूरे प्रोटोकॉल पूरा करने के बाद, -20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए मेथनॉल में कुचल वृषण की स्लाइड्स विसर्जित और आगे कदम 3.5 के साथ आगे बढ़ना.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ड्रोसोफिला पुरुष प्रजनन अंगों के एक ठीक से विच्छेदित जोड़ी का एक उदाहरण चित्रा 2A में दिखाया गया है. वयस्क पुरुष मक्खी के पेट से निकाल testes आम तौर पर लाभदायक vesicles की एक जोड़ी (नीला, चित्रा 2A ') के माध्यम से उद्गार वाहिनी (ब्राउन, चित्रा 2A') और सहायक ग्रंथियों की एक जोड़ी (हरा, चित्रा 2A ') से जुड़े होते हैं . साथ दैहिक ऊतक, उद्गार वाहिनी और सहायक ग्रंथियों की सबसे अधिक से वृषण अलग करने के लिए अलग और वृषण जोड़ी और लाभदायक vesicles ही ('आंकड़े 2 बी और 2 बी) रहते हैं कि इस तरह के त्याग किया जाना चाहिए. लाभदायक vesicles भी आगे की कार्रवाई की जा करने के लिए केवल वृषण जोड़ी छोड़ने, हटाया जा सकता है.

वृषण विच्छेदन के लिए चयनित वयस्क पुरुषों की उम्र एक महत्वपूर्ण विचार है. (0-2 दिनों eclosion के बाद) युवा पुरुषों में, लाभदायक vesicles छोटे हैंऔर लगभग खाली, और वृषण (चित्रा 2 के रूप में) अपने अधिक से अधिक व्यास में हैं. युवा पुरुषों का उपयोग करना (पिंजरे का बँटवारा या अर्धसूत्रीविभाजन या तो के दौर से गुजर) से विभाजित germline कोशिकाओं और जल्दी बाद meiotic spermatids की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या सुनिश्चित करता है. पुराने पुरुषों (3-5 दिन eclosion के बाद) विच्छेदन (छवि नहीं दिखाया गया है) के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, वे शुक्राणु के साथ उभड़ा हुआ है क्योंकि लाभदायक vesicles अधिक प्रमुख हैं, और वृषण युवा पुरुषों में से संकरा कर रहे हैं. लक्ष्य परिपक्व शुक्राणु कल्पना करने के लिए है, तो पुराने पुरुषों बेहतर कर रहे हैं.

ड्रोसोफिला वृषण की लंबाई के साथ विकास संबंधी घटनाओं का आदेश दिया प्रगति के कारण, शुक्राणुजनन की विशिष्ट चरणों में germline कोशिकाओं वृषण पूर्व squashing को फाड़ रहे हैं विच्छेदित जिस पर स्थिति के आधार पर समृद्ध किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, अपने शिखर टिप (स्तर 1, चित्रा 2 बी ') के पास वृषण खुला फाड़ शुक्राणुजनन के प्रारंभिक दौर में कोशिकाओं का एक बहुतायत पैदावार. चित्रा 3एक इस तरह से प्राप्त spermatogonia (सफेद तीर), जल्दी प्राथमिक spermatocytes (पीले तीर), और देर से प्राथमिक spermatocytes (लाल तीर) के एक प्रतिनिधि की आबादी का एक चरण विपरीत छवि को दर्शाता है. वैकल्पिक रूप से, एक से थोड़ा अधिक बेसल स्थिति (स्तर 2, चित्रा 2 बी ') में वृषण खुला फाड़ मुख्यतः spermatocytes और spermatids पैदावार. चित्रा 3B प्राथमिक spermatocytes (लाल तीर), गोल spermatids (के एक प्रतिनिधि सेल की आबादी का एक चरण विपरीत छवि से पता चलता है हरी तीर), इस तरह से प्राप्त spermatids (नारंगी तीर), और परिपक्व शुक्राणु बंडलों (नीले तीर) elongating.

वृषण की चरण विपरीत इमेजिंग इस प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं कि जीन में उत्परिवर्तन से उत्पन्न ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन में दोष चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखा है जब दौर spermatids एक बहुत टकसाली भूमिका है. इन अपरिपक्व spermatids में से प्रत्येक एक एकल, phas हैई प्रकाश, गोल नाभिक और (चित्रा -3 सी में, क्रमशः, बैंगनी Arrowhead और तीर से चिह्नित) लगभग एक ही आकार के एक एकल, चरण अंधेरा, गोल mitochondrial कुल. इन अंगों के सापेक्ष संख्या या आकार में भिन्नता न्यायपालिका meiotic डिवीजनों (चर्चा देखने के लिए) से परिणाम कर सकते हैं. इस तरह के एक दोष का एक उदाहरण चित्रा 3 डी में दिखाया गया है. अलग - अलग (Asun) जीन के उत्परिवर्तन के साथ वयस्क पुरुषों से गोल spermatids cytokinesis और गुणसूत्र अलगाव 29 में दोष का एक परिणाम के रूप में एक ही बड़ा mitochondrial समग्र और कई छोटे नाभिक होते हैं.

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन के अध्ययन के लिए एक और शक्तिशाली तरीका है. एक कुचल वृषण नमूना से तय कोशिकाओं के एक फ्लोरोसेंट छवि का एक उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है. Testes अपनी सी आतंकवाद पर जुड़े हुए bTub56D जीन का GFP-beta1 ट्यूबिलिन (उत्पाद व्यक्त ट्रांसजेनिक मक्खियों से प्राप्त किया गयामीनल GFP के लिए और यूबीआई-p63E ubiquitin जीन प्रमोटर के नियंत्रण में अंत; एच. ओडीए और वाई Akiyama-ओडीए, संयुक्त Biohistory रिसर्च हॉल, ओसाका, जापान) से उपहार सूक्ष्मनलिकाएं (चित्रा 4D, स्केल में ग्रीन लेबल के क्रम में चित्रा -4 ए में). ट्रांसजेनिक वृषण गामा ट्यूबिलिन के खिलाफ एक माउस एंटीबॉडी का उपयोग immunostained गया (माध्यमिक एंटीबॉडी: विरोधी माउस Cy3) और (चित्रा 4D, चित्रा 4C में स्केल में लाल) centrosomes चिह्नित करने के लिए चित्रा 4D में डीएनए (नीला, स्केल चिह्नित करने के लिए DAPI दाग चित्रा 4 बी में). शुक्राणुजनन के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं को आसानी से सूक्ष्मनलिकाएं, centrosomes, और गुणसूत्रों (कथा देखें) की व्यवस्था का परीक्षण करके पहचाना जा सकता है.

चित्रा 1
Figu 1. ड्रोसोफिला पुरुषों में germline कोशिका विभाजन के योजनाबद्ध पुनः. प्रत्येक स्टेम कोशिका विभाजन प्राथमिक spermatocytes की एक 16 सेल पुटी निर्माण करने के लिए अधूरा cytokinesis साथ mitotic डिवीजनों के चार दौर से होकर गुजरती है कि एक gonial सेल पैदा करता है. प्रत्येक प्राथमिक spermatocyte पूर्व परस्पर दौर spermatids के 64 सेल पुटी द्वारा पीछा परस्पर माध्यमिक spermatocytes की एक 32 सेल पुटी के लिए फार्म, अधूरा cytokinesis साथ फिर से, दो meiotic डिवीजनों के दौर से गुजर के लिए एक लंबे समय तक विकास के चरण से गुजरता है. गोल spermatids एक चरण प्रकाश नाभिक की उपस्थिति और समान आकार के एक चरण अंधेरे mitochondrial कुल (Nebenkern) की विशेषता है. दौर spermatids परिपक्व शुक्राणु के लिए फार्म का बढ़ाव और वैयक्तिकरण गुजरना. परिपक्व शुक्राणु सिर उनके सुई के आकार का नाभिक से पहचाना जा सकता है. नाभिक नीले में दिखाए जाते हैं, काले रंग में Nebenkerne (mitochondrial समुच्चय), तन में कोशिका द्रव्य./ 50981fig1highres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
ड्रोसोफिला पुरुषों की चित्रा 2. प्रजनन अंगों. युवा वयस्क पुरुषों (0-2 दिनों eclosion के बाद) विच्छेदन के लिए चयन किया गया था. पृथक प्रजनन अंगों की हल्की micrographs एक में कार्टून इसी 'और' बी 'के साथ ए और बी में दिखाया गया. (ए, ए ') एक वयस्क पुरुष मक्खी के पेट से निकाल ड्रोसोफिला वृषण (लाल) लाभदायक vesicles (नीला) के माध्यम से उद्गार वाहिनी (ब्राउन) से जुड़े हैं. सहायक ग्रंथियों (हरा) की एक जोड़ी भी उद्गार वाहिनी से जुड़ी है. (बी, बी ') वृषण सहायक ग्रंथियों बी से अलग किया जाना चाहिएefore तैयारी स्लाइड. स्तर 2 पर meiotic और बाद meiotic germline कोशिकाओं के एक मिश्रित आबादी प्राप्त करने के लिए; पिछले squashing के लिए, 1 स्तर पर वृषण शुक्राणुजनन के प्रारंभिक दौर में कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए खुला आंसू और 3 स्तर पर परिपक्व शुक्राणु के लिए समृद्ध है. स्केल बार, 250 मिमी. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
ड्रोसोफिला वृषण की चित्रा 3. चरण विपरीत छवियाँ. (ए) spermatogonia (सफेद तीर), जल्दी प्राथमिक spermatocytes (पीले तीर), और देर से प्राथमिक spermatocytes (लाल तीर) सहित शुक्राणुजनन के प्रारंभिक दौर, पर कोशिकाओं की एक बहुतायत आम तौर पर जारी कर रहे हैं वृषण 1 स्तर पर अलग कर दिया जाता है जब (चित्र देखेंure 2 बी '). दो या अधिक परस्पर कोशिकाओं (अधूरा cytokinesis का एक परिणाम) अक्सर squashing प्रक्रिया (पीले arrowhead दो जल्दी spermatocytes की एक संलयन के निशान) की एक विरूपण साक्ष्य के रूप में पूरी तरह से फ्यूज. (बी) के दौर spermatids (हरी तीर), elongating spermatids (नारंगी तीर आंशिक पुटी अंक), और परिपक्व शुक्राणु बंडलों (नीले तीर) सहित spermatocytes (लाल तीर देर प्राथमिक spermatocyte अंक) और बाद meiotic कोशिकाओं, का एक संयोजन, आम तौर पर कर रहे हैं वृषण स्तर 2 में फाड़ा है जब '(चित्रा 2B देखें) जारी किया. कुचल वृषण (सी, डी) चरण विपरीत इमेजिंग आसानी से प्रचुर मात्रा में और टकसाली दौर spermatids में दोष की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक एकल mitochondrial कुल (चरण अंधेरा, बैंगनी तीर से चिह्नित) से जुड़ी लगभग बराबर आकार की (सी), जंगली प्रकार spermatids एक नाभिक (बैंगनी Arrowhead द्वारा चिह्नित चरण प्रकाश) है. Asunf02815 से Spermatidsवृषण गुणसूत्र अलगाव (डी) में विफल रहा cytokinesis और त्रुटियों का एक परिणाम के रूप में कई छोटे नाभिक और एक बड़े mitochondrial कुल होते हैं. स्केल बार, 10 मिमी. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 4
.. ड्रोसोफिला वृषण की चित्रा 4 फ्लोरोसेंट छवि GFP टैग beta1 ट्यूबिलिन (डी में ग्रीन, एक में स्केल) व्यक्त पुरुषों से अलग कुचल वृषण की तैयारियां तय की और दाग दोनों डीएनए के लिए कर रहे थे (DAPI, डी में नीले, बी में स्केल) और centrosomes (गामा ट्यूबिलिन एंटीबॉडी, डी में लाल, सी में स्केल). एक विभाजन वीर्यएक प्रत्यय जिसका अर्थ कोशिका है (सफेद arrowhead) अगले दौर spermatids (सफेद तीर एक प्रतिनिधि कोशिकाओं अंक) और परिपक्व शुक्राणु (पीले तीर) का एक बंडल के एक बड़े क्षेत्र को देखा जा सकता है. स्केल बार, 10 मिमी. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

जंगली प्रकार मक्खियों के वृषण आसानी के कारण उनके पीले रंग (इसके विपरीत पड़ोसी सफेद ऊतकों) को पहचाना जा सकता है, सफेद उत्परिवर्ती मक्खियों के वृषण सफेद होते हैं और इस तरह कभी - कभी पेट के साथ भ्रमित किया जा सकता है. पी तत्वों में पाया मिनी सफेद जीन वृषण में वर्णक संचय को बढ़ावा नहीं करता है क्योंकि एक सफेद पृष्ठभूमि में आम तौर पर कर रहे हैं जो सबसे ज्यादा ट्रांसजेनिक उपभेदों,, भी सफेद वृषण है. ड्रोसोफिला वृषण रंग से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है, दूसरे को आसानी से पहचानने योग्य सुविधाओं जोड़े 12 में उनके सर्पिल पैटर्न और घटना में शामिल हैं. कुछ कार्यकर्ताओं के लिए यह आसान वृषण 12 अलग करने के लिए विच्छेदन सुइयों के बजाय संदंश का उपयोग करने के लिए लगता है कि ध्यान दें.

इस प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण कदम कुचल वृषण की तैयारी है. एक उपयोगी दृष्टिकोण कुछ मिलीमीटर है कि इस तरह वृषण युक्त कवर पर्ची पर स्लाइड उड़ना है सतह तेकवर पर्ची पर पीबीएस के nsion स्लाइड की ओर ऊतक युक्त कवर पर्ची लिफ्टों. इस विधि अल्सर को बाधित और व्यक्ति की कोशिकाओं इमेजिंग के लिए आदर्श बना, स्लाइड पर कोशिकाओं बाहर फैल जाता है. वैकल्पिक रूप से, इमेजिंग के लिए पूरे या आंशिक अल्सर बनाए रखने के लिए, पीबीएस की मात्रा कवर पर्ची पर रखा गया (4-5 मिलीलीटर से 7-8 मिलीलीटर) बढ़ाया जा सकता है.

ब्याज की एक विशेष ड्रोसोफिला उत्परिवर्ती वयस्कता के लिए जीवित नहीं है, तो लार्वा या पोटा संबंधी वृषण वैकल्पिक रूप से शुक्राणुजनन अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. प्रोटोकॉल अनुभाग में, संदर्भ pharate पुरुषों और लार्वा अंडाशय के अलगाव के लिए प्रदान की जाती हैं, बाद प्रोटोकॉल के एक संशोधन लार्वा वृषण अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. , फाड़ squashing, और लार्वा या पोटा संबंधी वृषण धुंधला करने के लिए कदम वयस्क वृषण के लिए यहाँ बताया कि अनिवार्य रूप से समान हैं. अध्ययन किया जा मक्खी लाइन वयस्कता तक पहुँच सकते हैं, भले ही लार्वा या पोटा संबंधी वृषण के अलगाव बेहतर हो सकता है अगर जीOAL शुक्राणुजनन के शुरुआती दौर में कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए है. प्रतिनिधि परिणाम खंड में वृषण पूर्व squashing को अलग कर दिया जाता है, जिस पर स्तर अलग से वांछित के रूप में, शुक्राणुजनन की जल्दी या देर चरणों में कोशिकाओं को समृद्ध बनाया जा सकता है.

चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन के अध्ययन के लिए एक अपेक्षाकृत सरल तरीका प्रदान करता है. Immunostaining और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी पर चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का एक फायदा कम समय के नमूने तैयार करने के लिए आवश्यक है. शुक्राणुजनन के प्रमुख चरणों के सभी आसानी से इस तकनीक को 24 का उपयोग कर पहचाना जा सकता है. दरअसल, कई समूहों ड्रोसोफिला पुरुष बाँझ उत्परिवर्ती लाइनों 21-23 के phenotypes निस्र्पक के लिए एक प्राथमिक स्क्रीन के रूप में वृषण के चरण विपरीत सूक्ष्म विश्लेषण का इस्तेमाल किया है. Meiotic डिवीजनों के दौरान, mitochondria और क्रोमोसोम समान रूप से बेटी की कोशिकाओं को विभाजित कर रहे हैं. Drosophil में शुक्राणुजनन की एक अनूठी विशेषताएक और अन्य कीड़ों दौर spermatids 24 में एक mitochondrial कुल (Nebenkern) का गठन शामिल है. गोल spermatids एक चरण अंधेरे Nebenkern और एक 1:1 के अनुपात में लगभग बराबर आकार का एक चरण प्रकाश नाभिक (चित्रा 3) के होते हैं. नाभिक का व्यास दौर spermatids का डीएनए सामग्री को दर्शाता है, ताकि अर्धसूत्रीविभाजन दौरान गुणसूत्र अलगाव में त्रुटियों परमाणु आकार 33 में परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. Multinucleated दौर spermatids में गुणसूत्र अलगाव परिणामों के बाद meiotic cytokinesis के विघटन जिसमें एक भी कुल 34 में Nebenkerne फ्यूज. इसलिए, 1:1 के अनुपात में या दौर spermatids में आकार या Nebenkern का आकार और नाभिक में किसी भी बदलाव को आसानी से लाइव वृषण के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया और अर्धसूत्रीविभाजन में दोष की अक्सर निदान किया जा सकता है. एक आम पुटी के भीतर दो या अधिक परस्पर कोशिकाओं के विलय अक्सर squashing प्रक्रिया का एक विरूपण साक्ष्य के रूप में होता है (चित्रा 3A, पीले arrowhead); Nebenkerne को नाभिक की 1:1 अनुपात, हालांकि, अभी भी बनाए रखा है.

ड्रोसोफिला वृषण की अचल तैयारी के immunostaining कोशिकाओं के दौर से गुजर शुक्राणुजनन करने के लिए मंच के रूप में अच्छी तरह से अभिव्यक्ति पैटर्न और ब्याज की प्रोटीन की subcellular localizations आकलन किया जा सकता है. सेलुलर आकारिकी, chromatin संगठन, और ट्यूबिलिन और डीएनए दाग के लिए immunostained वृषण कोशिकाओं के microtubule व्यवस्था पर आधारित ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन के चरणों को वर्गीकृत करने के लिए एक परिष्कृत योजना ड्रोसोफिला प्राथमिक spermatocytes अपेक्षाकृत बड़े कोशिकाओं रहे हैं. 19 में वर्णित किया गया है, और meiotic spindles कर सकते हैं स्पष्ट रूप से इस दृष्टिकोण का उपयोग कर देखा जा. (उदाहरण के लिए गामा ट्यूबिलिन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग) centrosomes के लिए Coimmunostaining meiotic धुरी संरचना का एक और अधिक सटीक दृश्य प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है. Antibod की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ वृषण immunostaining जब Formaldehyde एक उपयुक्त लगानेवाला हैएँ (उदाहरण के लिए, विरोधी lamin और विरोधी dynein भारी श्रृंखला). सूक्ष्मनलिकाएं और centrosomes की आकृति विज्ञान, तथापि, मेथनॉल के साथ संरक्षित बेहतर है, अल्फा ट्यूबिलिन और गामा ट्यूबिलिन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunostaining प्रदर्शन इसलिए, जब मेथनॉल आमतौर पर लगानेवाला के रूप में प्रयोग किया जाता है.

ब्याज की एक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी उपलब्ध नहीं हैं, तो प्रोटीन का एक fluorescently टैग किया है (उदाहरण. MCherry या GFP) संस्करण व्यक्त ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लाइनों एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में उत्पन्न किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, विरोधी GFP एंटीबॉडी तय नमूनों में संलयन प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रोटीन की subcellular स्थानीयकरण तो ऊतक का जीना या निर्धारित की तैयारी में GFP प्रतिदीप्ति देखने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है. चित्रा 4 में, एक निश्चित वृषण तैयारी में सूक्ष्मनलिकाएं एक ग्लोब के नियंत्रण में एक transgene से व्यक्त GFP टैग beta1 ट्यूबिलिन के आंतरिक प्रतिदीप्ति (के माध्यम से कल्पना थेसहयोगी) ubiquitin प्रमोटर व्यक्त किया. वैकल्पिक रूप से, ट्रांसजेनिक मक्खियों जो अभिव्यक्ति में एक ऊतक विशेष प्रमोटर के नियंत्रण में है, उदाहरण के लिए, Beta2 ट्यूबिलिन जीन के प्रमोटर वृषण विशिष्ट अभिव्यक्ति 35 के लिए इस्तेमाल किया गया है. वैकल्पिक रूप से, ब्याज की एक प्रोटीन की अभिव्यक्ति यूएएस Gal4 प्रणाली 36 का उपयोग करके विशिष्ट पुरुष germline कोशिकाओं के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है. Nanos-Gal4 spermatogonial कोशिकाओं के भीतर एक यूएएस प्रमोटर के नियंत्रण में एक प्रोटीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, बेम-Gal4 spermatocytes 37 के भीतर अपनी अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ब्याज की एक प्रोटीन की पछाड़ना भी इन Gal4 ड्राइवरों 37 के साथ संयोजन के रूप में एक यूएएस प्रमोटर के नियंत्रण में एक आरएनएआई बाल के लिये कांटा निर्माण व्यक्त वृषण में प्रेरित किया जा सकता है.

ड्रोसोफिला वृषण कोशिकाओं के रहने छवि विश्लेषण के लिए तरीकों का विकास हो सकता है कि सवालों की रेंज का विस्तार किया गया हैइस प्रणाली का उपयोग कर संबोधित किया. meiotic cytokinesis की घटनाओं कोशिकाओं 35 के जीवन को लम्बा करने के क्रम में एक छिड़काव चैम्बर के अंदर आतंच थक्के में सुसंस्कृत spermatocytes के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं. Fluorescently टैग प्रोटीन व्यक्त ड्रोसोफिला spermatocytes के समय चूक confocal माइक्रोस्कोपी भी 38 (meiotic धुरी विधानसभा अध्ययन करने के लिए, उदाहरण के लिए) एक शक्तिशाली दृष्टिकोण से किया गया है. पहले चरण का लाइव इमेजिंग के लिए confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग, ड्रोसोफिला वृषण की बांट germline स्टेम सेल, स्टेम सेल विनियमन की एक वृद्धि की समझ के लिए प्रेरित किया. इस के साथ साथ प्रस्तुत चरण विपरीत और immunofluorescence माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण के अलावा, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी भी ड्रोसोफिला शुक्राणुजनन 31 अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है.

इमेजिंग के अलावा, ड्रोसोफिला वृषण जैव रासायनिक विश्लेषण करने के लिए सामग्री का एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैएस. Immunoblotting प्रयोगों के लिए, विच्छेदित मक्खी वृषण, 6X नमूना बफर (5 एमएल / वृषण जोड़ी) में homogenized उबला हुआ, और सीधे एक एसडीएस पृष्ठ जेल (~ 4 वृषण जोड़े / लेन) पर लोड किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, इस दृष्टिकोण कई ड्रोसोफिला म्यूटेंट के वृषण में dynein-dynactin घटकों के स्तर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. Testes अर्क वैकल्पिक रूप से यह प्रोटीन अखंडता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है अगर nondenaturing lysis बफर में ऊतक homogenizing द्वारा तैयार किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, ड्रोसोफिला अर्क इस ऊतक 41-43 में स्थिर प्रोटीन परिसरों की उपस्थिति का प्रदर्शन coimmunoprecipitation प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया है testes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों ली प्रयोगशाला में करेन हेल्स से विशेषज्ञ सलाह के साथ शुक्राणुजनन के अध्ययन के लिए इन स्वीकार किए जाते हैं तरीकों की स्थापना के लिए माइकल एंडरसन को धन्यवाद देना चाहूंगा. एच. ओडीए और वाई Akiyama-ओडीए उदारता γ ट्यूबिलिन-GFP शेयर उड़ प्रदान की. इस काम के लाल (GM074044) के लिए एक एनआईएच R01 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).

Tags

बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 83, विच्छेदन वृषण शुक्राणुजनन अर्धसूत्रीविभाजन जर्म कोशिकाओं चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी immunofluorescence
शुक्राणुजनन की कोशिकीय विश्लेषण: की लाइव और फिक्स्ड तैयारी<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; Testes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee,… More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter