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Biology

L'analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di doi: 10.3791/51058 Published: January 20, 2014

Summary

Metodi per isolare e preparare Drosophila testicoli campioni (vivere e fissa) per l'imaging dal contrasto di fase e microscopia a fluorescenza sono descritte qui.

Abstract

Drosophila melanogaster è un sistema potente modello che è stato ampiamente utilizzato per chiarire una varietà di processi biologici. Ad esempio, gli studi sia del femminile e linee germinali maschili di Drosophila hanno contribuito notevolmente alla comprensione corrente della meiosi e biologia delle cellule staminali. Protocolli eccellenti sono disponibili in letteratura per l'isolamento e l'imaging di Drosophila ovaie e testicoli 3-12. Qui, metodi per la dissezione e la preparazione dei testicoli Drosophila per l'analisi microscopica sono descritti con un video dimostrativo accompagnamento. Un protocollo per isolare testicoli dall'addome dei maschi adulti e preparare vetrini di tessuto reale per l'analisi al microscopio a contrasto di fase e un protocollo per il fissaggio e immunocolorazione testicoli per l'analisi al microscopio a fluorescenza sono rappresentati. Queste tecniche possono essere applicate nella caratterizzazione di mutanti di Drosophila che esibiscono defects nella spermatogenesi e nella visualizzazione delle localizzazioni subcellulari di proteine.

Introduction

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Testicoli Drosophila sono un sistema modello ideale per lo studio di molti processi biologici che comprendono la regolazione delle cellule staminali, meiosi e sviluppo dello sperma 13-18. Gli spermatociti ed i loro fusi meiotiche sono grandi e quindi conveniente per l'analisi citologica e rilassato checkpoint del ciclo cellulare durante la spermatogenesi facilitano lo studio delle mutazioni nei geni del ciclo cellulare. Diversi tipi di cellule possono essere osservati in progressione ordinata lungo la lunghezza dei testicoli, e qualsiasi problema nella spermatogenesi può portare a cambiamenti in questa disposizione complessiva. Queste caratteristiche combinate con strumenti genetici Drosophila hanno facilitato l'analisi mutazionale della spermatogenesi 21-23.

Le fasi di spermatogenesi Drosophila sono stati ben definiti. Cellule germinali che si sviluppano all'interno sincrono cisti progrediscono sequenzialmente attraverso le fasi della spermatogenesi lungo la lunghezza del testicolo. Durante both mitotico e divisioni meiotica delle cellule germinali maschili, citochinesi si verifica incompleto tale che le cellule figlie rimangono collegati da ponti citoplasmatici noti come canale chiamato (Figura 1). La punta apicale del testicolo contiene una popolazione di cellule staminali germinali che dà origine a spermatogoni, che subiscono quattro divisioni mitotiche con citochinesi incompleto per generare cisti 16 cellule di spermatociti primari. Dopo la fase di premeiotic S, spermatociti primari entrano G2, un periodo di crescita prolungato di ~ 90 ore durante il quale aumenta il volume cellulare ~ 25 volte. Progressione attraverso meiosi I e meiosi II porta alla formazione di cisti 32 cellulari di spermatociti secondari e cisti 64 cellulari di spermatidi aploidi, rispettivamente. I, spermatidi rotondi immaturi sottoposti a numerosi rimodellamento cellulare per formare spermatozoi maturi. Cellule post-meiotiche, in particolare i fasci di allungamento e spermatidi maturi, occupano gran parte del volume del testicolo.

Tegli trasporto successo di sperma funzionale alla linea femminile richiede un coordinamento tra le diverse parti del sistema riproduttivo maschile, che è composto da varie strutture accoppiati (i testicoli, vescicole seminali e ghiandole accessorie) e un unico condotto eiaculatorio (Figura 2). Spermatozoi sono prodotti nei testicoli e memorizzati all'interno delle vescicole seminali fino copulazione 24. Le ghiandole accessorie contengono cellule secretorie che producono liquido seminale. Lo sperma migrazione dalle vescicole seminali sono mescolati con liquido seminale all'interno del condotto eiaculatorio, che è collegato ad entrambe le vescicole seminali e ghiandole accessorie. Questa miscela di sperma e fluido seminale viene infine pompato fuori del maschio nella vagina della femmina volare attraverso il bulbo eiaculatorio situato all'estremità posteriore del maschio addome 25. Le proteine ​​all'interno del liquido seminale sono essenziali per la conservazione prolungata di spermatozoi all'interno degli organi specializzati noto come spermateche in reptratto roductive di Drosophila femmine 26.

Metodi eccellenti per l'isolamento dei testicoli Drosophila e visualizzazione delle cellule nelle varie fasi della spermatogenesi sono disponibili nella letteratura scientifica 3-12. Noi qui aggiungiamo a questo corpo di conoscenze con la presentazione di esempi di questi protocolli con un video dimostrativo di accompagnamento. Il protocollo per la preparazione dei testicoli vivi campioni per la microscopia a contrasto di fase si basa su un metodo precedentemente descritto 27. Il protocollo per formaldeide fissazione e immunocolorazione di testicoli si basa su un metodo descritto in precedenza 28. I metodi qui descritti sono stati utilizzati in molti studi di Drosophila spermatogenesi (ad esempio, per valutare i ruoli di dineina, un motore microtubuli Minus estremità rivolta, durante la spermatogenesi Drosophila).

Oltre ai protocolli di base, suggerimenti riportati varying la dissezione per arricchire di spermatogoni, spermatociti, o spermatozoi maturi. Diversi metodi di elaborazione dei testicoli tali che le cisti sia rimangono intatti o sono interrotti come necessario descritti. Un vantaggio nell'uso testicoli Drosophila come sistema modello è che, rispetto ai ovociti ed embrioni di Drosophila, anticorpi e coloranti possono facilmente penetrare nelle cellule dopo la loro dispersione dai testicoli, e sono necessarie meno fasi di lavaggio, quindi, protocolli possono essere effettuate in un tempo relativamente breve tempo.

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Protocol

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1. Testicoli Dissection

  1. Anestetizzare mosche in una bottiglia o flacone utilizzando un flusso di CO 2 e trasferire ad un pad mosca.
  2. In ordine mosche sotto un microscopio da dissezione utilizzando un pennello piccolo, e raccogliere un numero appropriato (seconda dell'esperimento) di maschi di Drosophila dei genotipi desiderati. I maschi giovani (0-2 giorni) sono l'ideale per l'esame delle cellule durante i primi stadi della spermatogenesi (ad esempio spermatogoni, spermatociti e spermatidi precoci post-meiotiche), mentre i maschi leggermente più anziani (2-5 giorni) sono l'ideale per l'esame di cellule nelle fasi finali della spermatogenesi (in particolare, maturo sperma).
  3. Usare pinze per rimuovere le ali di ogni volo (per evitare che le mosche dal galleggiante nel liquido durante la dissezione).
  4. Aggiungere ~ 500 ml di tampone fosfato salino (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4; PBS) in una goccia di un piatto dissezione siliconata suuno sfondo nero. Altre soluzioni acquose sono state usate con successo per testicoli dissezione 3.
  5. Punto pinza verso la parte anteriore della mosca, afferrarlo dal torace, ed immergerlo nella goccia PBS. Durante la visualizzazione attraverso il microscopio da dissezione, utilizzare un altro paio di pinze per afferrare e tirare la genitali esterni (struttura marrone scuro che si trova alla fine posteriore dell'addome ventrale) posteriormente fino a quando si stacca dall'addome. Nella maggior parte dei casi, i testicoli, vescicole seminali e ghiandole accessorie verranno rimossi dall'addome insieme ai genitali esterni, se necessario, introdurre una sola coppia di pinze in addome e giro fuori testicoli.
  6. Testicoli separati da ghiandole accessorie e genitali esterni con due coppie di pinze nei menu PBS (Figura 2). Wild-type testicoli sono facilmente distinguibili dai tessuti bianchi vicini per il loro colore giallo. Procedere immediatamente alla fase 2.
  7. Per isolare testicoli dai maschi pharate (i.. E racchiuso nel bozzolo), una fase aggiuntiva deve essere eseguita prima che comporta la rimozione della mosca dal bozzolo; questo passo è stato precedentemente descritto altrove 31. Procedere con dissezione come per i testicoli adulti che iniziano nella fase 1.2.
  8. Per isolare testicoli dai maschi larvali, eseguire una modifica di un protocollo per isolare ovaie larve di Drosophila 32. Brevemente, larve maschio può essere distinto da larve femmina dalla presenza di una coppia di grandi strutture chiare ovali (testicoli larvali) incorporati nel terzo posteriore del corpo grasso. Per isolare testicoli larvali, parzialmente scorticato aprire la larva maschio per isolare i testicoli e il corpo grasso circostante dall'addome come descritto per l'isolamento delle ovaie larvali. Procedere immediatamente alla fase 2 del protocollo qui descritto, i testicoli possono poi essere rimossi dal corpo grasso appena prima del montaggio (passi 2.3 o 3.14) come descritto per le ovaie 32.

  1. Utilizzare un paio di pinze per inserire delicatamente 2-3 paia di testicoli in una goccia di 4-5 ml di PBS in una piazza copertura in vetro antiscivolo. Si noti che il rapporto tra numero di testicoli di volume di PBS può essere necessario regolare: troppo liquido impedire alle cellule di diffondere correttamente quando schiacciato, mentre troppo poco liquido indurre le cellule a scoppiare quando schiacciato. Facoltativo: Utilizzare copertura siliconata scivola per ridurre al minimo l'aderenza del tessuto per coprire scivolare nella fase 3.2.
  2. Usare un paio di pinze per lacerare ogni testicolo in una posizione appropriata in modo da massimizzare la presenza dei tipi di cellule germinali desiderati nella preparazione (si noti che il contenuto del testicolo saranno principalmente uscita dalla regione lacerata sul vetrino durante lo schiacciamento passo.) Per arricchire di spermatogoni e spermatociti, strappare aprire il testicolo adiacente alla sua estremità apicale (livello 1, Figura 2B). Per arricchire di spermatociti e spermatidi, strappo aprire il testicolo in un position leggermente basale al livello 1 (livello 2, Figura 2B). Per arricchire le cellule germinali più mature, strappare aperto il testicolo più vicino a dove la curvatura inizia (livello 3, Figura 2B).
  3. Posizionare delicatamente un vetrino per microscopio sul vetrino di schiacciare i testicoli; non applicare pressione manualmente come il solo peso della copertura antiscivolo è sufficiente per ottenere un campione correttamente schiacciata. Cercate di evitare di intrappolare bolle d'aria. Facoltativo: Utilizzo poli-L-lisina rivestite vetrini da microscopio per promuovere l'adesione del tessuto a scorrere nel passaggio 3.2.
  4. Utilizzare preparazione immediatamente (idealmente entro 15 minuti dalla preparazione) per osservare cellule vive mediante microscopia a contrasto di fase, per le mosche transgeniche con l'espressione di proteine ​​con targhetta modo fluorescente nei testicoli, cellule vive possono essere esaminate al microscopio a fluorescenza in questa fase. In alternativa, procedere alla fissazione e colorazione anticorpo (Protocol 3).
  5. Stoppino delicatamente il liquido in eccesso da sotto il vetrino con una pulizia wipe consentire appiattimento della preparazione finché le cellule germinali sono chiaramente a fuoco.

3. Formaldeide fissazione e colorazione anticorpale

  1. Snap congelare ogni diapositiva contenente testicoli schiacciati (dal protocollo 2) usando un paio di pinze di metallo per immergere brevemente in azoto liquido (fino azoto liquido si ferma bubbling).
  2. Rimuovere immediatamente la polizza di copertura con una lama di rasoio.
  3. Utilizzare pinze di metallo per trasferire le diapositive in una prechilled portavetrini bicchiere pieno di ghiaccio-freddo etanolo al 95% (grado spettrofotometrica, privo di metanolo). Conservare a -20 ° C per 10 min.
  4. Utilizzare metallo molle a trasferire vetrini per un rack scorrevole in vetro riempita con formaldeide al 4% in PBS più 0,1% Triton X-100 (PBS-T). Conservare a temperatura ambiente per 7 min.
  5. Utilizzare pinze di metallo per trasferire le diapositive di un rack scorrevole in vetro riempita con PBS. Lavare i vetrini in PBS per 5 min a temperatura ambiente. Ripetere 1x. Eseguire tutti i lavaggi scartando la soluzione nel rack vetrino (
  6. Eliminare il PBS e immergere i vetrini in PBS-T per 30 min a temperatura ambiente per permeabilize membrane cellulari.
  7. Lavare i vetrini in PBS per 5 min a temperatura ambiente. Ripetere 2x.
  8. Blocco passo (opzionale): Immergere i vetrini in PBS più 1% BSA per 45 minuti a temperatura ambiente.
  9. Utilizzare una penna barriera idrofobica per disegnare un cerchio sul vetrino intorno tessuto schiacciato (facilmente visibile a occhio) al fine di limitare le soluzioni di anticorpi (aggiunte in fasi 3.9 e 3.11). Il tessuto deve essere tenuto umido in ogni momento durante l'esecuzione di immunoistochimica.
  10. Aggiungere 30-40 ml di anticorpo primario (diluito in PBS-T, 1:400 a 1:50, secondo anticorpo) al tessuto all'interno del cerchio. Se è stato eseguito il blocco, diluire l'anticorpo primario in PBS-T più 1% BSA. Anti-gamma-tubulina anticorpo (per la colorazione di cntrosome in Figura 4) è stato diluito 1:100. Incubare in un umido, camera oscura (scatola di plastica per es. Chiusocon asciugamani umidi di carta) per 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° C.
  11. Lavare i vetrini in PBS per 5 min a 3x camera di temperatura. Se è effettuata blocco, lavare due volte in PBS-T e una volta in PBS (5 min a temperatura ambiente ciascuna).
  12. Aggiungere 30-40 ml di anticorpo secondario coniugato con fluoroforo (diluito 1:400 in PBS) per il tessuto e incubare al buio per 1-2 ore a temperatura ambiente.
  13. Lavare i vetrini in PBS per 5 min a temperatura ambiente. Ripetere 2x.
  14. Aggiungere 30-40 ml di soluzione di DAPI (0,2 mg / ml in PBS) per il tessuto all'interno del cerchio.
  15. Posizionare delicatamente una scivolata copertura in vetro sopra il tessuto, avendo cura di evitare di intrappolare bolle d'aria. Se devono apparire bolle d'aria, muoversi con attenzione intorno la polizza di copertura senza distruggere la zucca fino a quando le bolle sfuggire ai lati del vetrino.
  16. Utilizzare una pulizia wipe per cancellare l'eccesso DAPI dai bordi della diapositiva.
  17. Sigillare la polizza di copertura al vetrino con smalto trasparente.
  18. Utilizzare questa preparazioneentro i prossimi 3-4 ore per vedere le cellule immunostained mediante microscopia a fluorescenza. Per la conservazione a lungo termine di diapositive (almeno fino a diverse settimane), utilizzare un supporto di montaggio dura a base di glicerolo-con DAPI, e conservare i vetrini a -20 ˚ C.
  19. In alternativa, i campioni fissare in metanolo al posto di formaldeide (secondo l'antigene). Dopo aver completato l'intero protocollo di passaggio 3.2, immergere i vetrini di testicoli schiacciati in metanolo per 10 minuti a -20 ° C e procedere con passo 3.5 in poi.

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Representative Results

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Un esempio di una coppia correttamente sezionato di organi riproduttivi maschili Drosophila è mostrato in Figura 2A. Testicoli rimossi dall'addome della mosca maschio adulto sono tipicamente collegati al condotto eiaculatorio (marrone, Figura 2A ') ed una coppia di ghiandole accessorie (verde, Figura 2A') tramite una coppia di vescicole seminali (blu, Figura 2A ') . Per separare i testicoli dalla maggior parte del tessuto somatica accompagnamento, il dotto eiaculatorio e ghiandole accessorie deve essere staccato e scartato tale che solo la coppia testicoli e le vescicole seminali restano (Figure 2B e 2B '). Le vescicole seminali possono anche essere rimossi, lasciando solo la coppia testicoli da elaborare ulteriormente.

L'età dei maschi adulti selezionati per testicoli dissezione è una considerazione importante. In giovani maschi (0-2 giorni dopo eclosion), le vescicole seminali sono piccolee quasi vuoto, e testicoli sono al loro diametro massimo (come in Figura 2). Utilizzando maschi più giovani assicura un numero relativamente elevato di cellule in divisione germinali (sia in fase di mitosi e meiosi) e nei primi spermatidi post-meiotico. Quando i maschi più anziani (3-5 giorni dopo eclosion) vengono utilizzati per la dissezione (immagine non mostrato), le vescicole seminali sono più importanti perché sono sporgenti con lo sperma, e i testicoli sono più stretti rispetto ai maschi più giovani. I maschi anziani sono preferibili se l'obiettivo è quello di visualizzare spermatozoi maturi.

A causa della progressione ordinata di eventi di sviluppo lungo la lunghezza dei testicoli di Drosophila, cellule germinali in fasi specifiche della spermatogenesi possono essere arricchiti in base alla posizione in cui dissezionati testicoli sono strappati prima schiacciamento. Ad esempio, lacrimazione aprire il testicolo vicino alla sua punta apicale (livello 1, Figura 2B ') produce una grande varietà di cellule nelle fasi iniziali della spermatogenesi. Figura 3Una mostra un'immagine a contrasto di fase di una popolazione rappresentativa di spermatogoni (freccia bianca), primi spermatociti primari (freccia gialla), e spermatociti primari tardivi (freccia rossa) così ottenuto. In alternativa, lacrimazione aprire il testicolo in una posizione leggermente più basale (livello 2, figura 2B ') produce principalmente spermatociti e spermatidi. Figura 3B mostra un'immagine a contrasto di fase di una popolazione di cellule rappresentante di spermatociti primari (freccia rossa), spermatidi rotondi ( freccia verde), allungamento spermatidi (freccia arancione), e fasci di spermatozoi maturi (freccia blu) ottenuti in questo modo.

Di imaging a contrasto di fase dei testicoli può essere utilizzato per caratterizzare difetti nella spermatogenesi Drosophila risultanti da mutazioni nei geni che sono critici per questo processo. Spermatidi rotondi hanno un aspetto molto stereotipo quando viene visto attraverso un microscopio a contrasto di fase. Ciascuno di questi spermatidi immaturi ha un unico, PHAe-light, nucleo rotondo e un singolo, di fase-scuro, aggregato mitocondriale giro di circa la stessa dimensione (contrassegnato da freccia viola e freccia, rispettivamente in Figura 3C). Variazione dei numeri relativi o le dimensioni di questi organelli può derivare da divisioni meiotiche aberranti (vedi la discussione). Un esempio di tale difetto è mostrato in Figura 3D. Spermatidi rotondi da maschi adulti con mutazione del separi (asun) gene contengono un unico grande aggregato mitocondriale e più piccoli nuclei a causa di difetti di citochinesi e segregazione cromosomica 29.

Microscopia a fluorescenza è un altro approccio potente per studiare Drosophila spermatogenesi. Un esempio di immagine fluorescente di cellule fissate da un campione testicoli schiacciati è mostrato in Figura 4. Testicoli sono stati ottenuti da mosche transgenici che esprimono GFP-beta1-tubulina (prodotto del bTub56D gene fuso al suo C-terterminale end di GFP e sotto il controllo della Ubi-p63E promotore del gene ubiquitina; dono da H. Oda e Y. Akiyama-Oda, JT Biohistory Research Hall, Osaka, Giappone), al fine di etichettare i microtubuli (verde nella figura 4D, in scala di grigi in Figura 4A). I testicoli transgeniche sono state immunoistochimica utilizzando un anticorpo topo contro il gamma-tubulina (anticorpo secondario: anti-topo Cy3) per contrassegnare centrosomi (rosso in figura 4D, in scala di grigi nella figura 4C) e DAPI macchiate per marcare il DNA (blu in figura 4D, in scala di grigi in Figura 4B). Le cellule a diversi stadi della spermatogenesi possono essere facilmente identificati esaminando la disposizione dei microtubuli, centrosomi, e cromosomi (vedi legenda).

Figura 1
Figu re 1. Schema di divisioni cellulari germinali nei maschi di Drosophila. Ogni divisione delle cellule staminali produce una cellula goniale che subisce quattro turni di divisioni mitotiche con citochinesi incompleto per produrre una cisti di 16 cellule di spermatociti primari. Ogni spermatocita primario subisce una fase di crescita prolungata prima di essere sottoposte le due divisioni meiotica, di nuovo con citochinesi incomplete, per formare una cisti 32 celle di spermatociti secondari interconnessi seguite da una ciste 64 celle di spermatidi rotondi interconnessi. Spermatidi rotondi sono caratterizzati dalla presenza di un nucleo fase luce e un aggregato mitocondriale fase-scuro (il Nebenkern) di dimensioni simili. Gli spermatidi rotondi subiscono allungamento e individualizzazione a formare gli spermatozoi maturi. Teste di spermatozoi maturi possono essere identificati dai loro nuclei aghiformi. I nuclei sono mostrati in blu; Nebenkerne (aggregati mitocondriali) in nero; citoplasma in tan./ 50981fig1highres.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 2
Figura 2. Organi riproduttivi di maschi di Drosophila. Giovani adulti maschi (0-2 giorni dopo eclosion) sono stati selezionati per la dissezione. Micrografie luce degli organi riproduttivi isolati sono mostrati in A e B con corrispondenti cartoni animati in A 'e B'. (A, A ') testicoli Drosophila (rosso) rimosso dall'addome di una mosca maschio adulto sono collegati al condotto eiaculatorio (marrone) attraverso le vescicole seminali (blu). Un paio di ghiandole accessorie (verde) è anche collegato al condotto eiaculatorio. (B, B ') I testicoli dovrebbero essere separati dalle ghiandole accessorie brima di far scorrere la preparazione. Prima di schiacciamento, strappare aprire i testicoli a livello 1 per arricchire le cellule nelle fasi iniziali della spermatogenesi, al livello 2 per ottenere una popolazione mista di meiosi e le cellule germinali post-meiosi e al livello 3 per arricchire di spermatozoi maturi. Barra della scala, a 250 mm. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 3
Immagini a contrasto di fase Figura 3. Dei testicoli di Drosophila. (A) L'abbondanza di cellule in fasi iniziali della spermatogenesi, tra cui spermatogoni (freccia bianca), i primi spermatociti primari (freccia gialla), e spermatociti primari fine (freccia rossa) sono tipicamente rilasciato quando il testicolo è strappata al livello 1 (vedi Fig.ure 2B '). Due o più interconnessi cellule (una conseguenza della citochinesi incompleto) spesso si fondono completamente, come un artefatto della procedura di schiacciamento (freccia gialla segna una fusione di due primi spermatociti). (B) Una combinazione di spermatociti (freccia rossa indica spermatocita primario tardi) e cellule post-meiotiche, tra cui spermatidi rotondi (freccia verde), spermatidi in allungamento (freccia arancione indica cisti parziale), e sperma maturo fasci (freccia blu), sono tipicamente rilasciata quando il testicolo è strappata a livello 2 (vedere la Figura 2B '). (C, D) di imaging a contrasto di fase dei testicoli schiacciati può essere utilizzato per identificare prontamente difetti nelle spermatidi rotondi abbondanti e stereotipati. Wild-type spermatidi hanno un nucleo (fase-luce, segnato da freccia viola) collegato a un unico aggregato mitocondriale (fase-scuro, indicata dalla freccia viola) di circa uguali dimensioni (C). Spermatidi da asunf02815testicoli contengono più piccoli nuclei e una grande aggregato mitocondriale come risultato della citochinesi fallito e errori di segregazione cromosomica (D). Barra della scala, da 10 mm. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Figura 4
.. Figura 4 immagine fluorescente dei testicoli Drosophila Preparazioni a base di testicoli schiacciati isolate dai maschi che esprimono GFP-tagged beta1-tubulina (verde in D, scala di grigi in A) sono state fissate e colorate per entrambi DNA (DAPI, blu in D, scala di grigi in B) e centrosomi (anticorpi gamma-tubulina, rosso in D, in scala di grigi in C). A spermatozoi dividendocyte (freccia bianca) può essere visto accanto a un grande campo di spermatidi rotondi (freccia bianca segna a cellule rappresentante) e un fascio di spermatozoi maturi (freccia gialla). Barra della scala, da 10 mm. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

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Discussion

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Anche se i testicoli di wild-type mosche possono essere facilmente identificati grazie al loro colore giallo (in contrasto con i tessuti bianchi vicini), i testicoli di mosche mutanti bianchi sono bianchi e quindi può occasionalmente essere confusi con l'intestino. Ceppi più transgenici, tipicamente in uno sfondo bianco, hanno anche testicoli bianchi perché il mini-bianco gene trovato P-elementi non promuove l'accumulo di pigmento nei testicoli. Quando testicoli Drosophila non possono essere distinti in base al colore, altre caratteristiche facilmente riconoscibili includono la spirale e la presenza a coppie 12. Si noti che alcuni lavoratori trovano più facile da usare aghi dissezione invece di pinze per isolare i testicoli 12.

Un punto critico di questo protocollo è la preparazione dei testicoli schiacciati. Un approccio utile è quello di librarsi la slitta di qualche millimetro sopra la polizza di copertura che contiene i testicoli tale che il TE superficiension della PBS sul vetrino alza la polizza di copertura contenente il tessuto verso la diapositiva. Questo metodo tende a distruggere le cisti e diffondere le cellule sul vetrino, che lo rende ideale per l'imaging singole celle. In alternativa, per mantenere cisti intere o parziali per l'imaging, il volume di PBS immesso sul vetrino può essere aumentata (da 4-5 mL di 7-8 ml).

Se un particolare mutante Drosophila di interesse non sopravvive fino all'età adulta, quindi testicoli larve o pupe alternativa può essere utilizzato per studiare la spermatogenesi. Nella sezione Protocollo, i riferimenti sono forniti per l'isolamento dei maschi e delle ovaie pharate larvali, una modificazione di quest'ultimo protocollo può essere utilizzata per isolare testicoli larvali. I passaggi per strappare, schiacciare, e la colorazione testicoli larve o pupe sono essenzialmente identici a quelli qui descritti ai testicoli adulti. Anche se la linea di volo da studiare può raggiungere l'età adulta, l'isolamento dei testicoli larve o pupe può essere preferibile se il gOAL è quello di ottenere cellule nelle prime fasi della spermatogenesi. Come descritto nella sezione dei risultati rappresentativi, cellule in fasi precoci o tardivi della spermatogenesi possono essere arricchiti come desiderato variando il livello a cui il testicolo è strappata prima schiacciamento.

Microscopio a contrasto di fase offre un approccio relativamente semplice per lo studio Drosophila spermatogenesi. Uno dei vantaggi della microscopia a contrasto di fase su immunoistochimica e microscopia a fluorescenza è che meno tempo è necessario per preparare i campioni. Tutti i principali fasi della spermatogenesi può essere facilmente identificato con questa tecnica 24. Infatti, diversi gruppi hanno utilizzato a contrasto di fase di analisi microscopica dei testicoli come schermo primario per caratterizzare i fenotipi di Drosophila maschio-sterile linee mutanti 21-23. Durante divisioni meiotiche, mitocondri e cromosomi sono ugualmente partizionati alle cellule figlie. Una caratteristica unica della spermatogenesi in Drosophiluna e altri insetti comporta la formazione di un aggregato mitocondriale (il Nebenkern) in spermatidi rotondi 24. Spermatidi rotondi contengono una Nebenkern fase buia e un nucleo fase-luce di circa uguale dimensione in un rapporto di 1:1 (Figura 3). Il diametro del nucleo riflette il contenuto di DNA delle spermatidi rotondi, così errori nella segregazione cromosomica durante la meiosi può portare alla variabilità dimensione nucleare 33. Turbativa di citochinesi meiotica seguenti risultati cromosoma segregazione in spermatidi rotondi multinucleati in cui il fusibile Nebenkerne in un unico aggregato 34. Quindi, una variazione nel rapporto 1:1 o nella dimensione o forma della Nebenkern e nucleo in spermatidi rotondi può essere facilmente rilevato al microscopio a contrasto di fase dei testicoli vivi ed è spesso diagnostica di difetti di meiosi. Fusione di due o più celle interconnesse all'interno di una ciste comune si verifica frequentemente come artefatto della procedura di schiacciamento (Figura 3A, Freccia gialla), il rapporto 1:1 di nuclei a Nebenkerne, tuttavia, è ancora mantenuto.

Immunocolorazione delle preparazioni fisse di testicoli di Drosophila può essere eseguita alla fase cellule in fase spermatogenesi e valutare modelli di espressione e localizzazione subcellulare delle proteine ​​di interesse. Un sistema raffinato per classificare le fasi di Drosophila spermatogenesi in base alla morfologia cellulare, organizzazione della cromatina, e le modalità microtubuli delle cellule testicoli immunostained per la tubulina e DNA macchiate è stato descritto 19. Drosophila spermatociti primari sono relativamente grandi cellule, e mandrini meiotiche può essere chiaramente osservato utilizzando questo approccio. Coimmunostaining per cntrosome (per esempio, utilizzando anticorpi contro gamma-tubulina) può essere eseguito per ottenere una visione più precisa della struttura fuso meiotico. La formaldeide è un fissatore idoneo quando immunoistochimica testicoli con una vasta gamma di antibodzioni (per esempio anti-lamin e catena pesante anti-dineina). La morfologia dei microtubuli e centrosomi, tuttavia, è meglio conservato con metanolo, di conseguenza, il metanolo viene tipicamente utilizzato come fissativo durante l'esecuzione immunoistochimica con anticorpi contro alfa-tubulina e gamma-tubulina.

Se gli anticorpi contro una proteina di interesse non sono disponibili, linee di Drosophila transgeniche esprimenti una versione fluorescente targhetta (ad es. MCherry o GFP) della proteina possono essere generati come approccio alternativo. La localizzazione subcellulare della proteina può essere determinata utilizzando un microscopio per visualizzare la fluorescenza GFP in preparazioni vivi o fissi di tessuto, in alternativa, anticorpi anti-GFP possono essere utilizzati per rilevare la proteina di fusione in campioni fissati. In Figura 4, microtubuli in un preparato testicoli fisso stati visualizzati tramite fluorescenza intrinseca di GFP-tagged beta1-tubulina (espresso da un transgene sotto il controllo di un globalleato espresso promotore ubiquitina). In alternativa, moscerini transgenici in cui l'espressione è sotto il controllo di un promotore tessuto-specifico, ad esempio, il promotore del gene beta2-tubulina sono stati utilizzati per specifiche testicoli-espressione 35. In alternativa, l'espressione di una proteina di interesse può essere limitato a specifiche cellule germinali maschili utilizzando il sistema UAS-GAL4 36. Nano-GAL4 può essere utilizzato per indurre l'espressione di una proteina sotto il controllo di un promotore UAS entro spermatogoni, mentre Bam-GAL4 può essere usato per indurre la sua espressione all'interno spermatociti 37. Knockdown di una proteina di interesse può anche essere indotta nei testicoli esprimendo un tornante costrutto RNAi sotto il controllo di un promotore UAS in combinazione con questi driver GAL4 37.

Lo sviluppo di metodi per l'analisi in tempo reale di immagini di cellule testicoli di Drosophila ha ampliato la gamma di questioni che possono essereaffrontato con questo sistema. Gli eventi di citochinesi meiotica possono essere visualizzati mediante microscopia a contrasto di fase di spermatociti coltivate in coaguli di fibrina all'interno di una camera di perfusione per prolungare la vita delle cellule 35. Time-lapse microscopia confocale di spermatociti di Drosophila che esprimono proteine ​​fluorescenti con tag 'stato anche un approccio potente (ad esempio, per studiare l'assemblaggio fuso meiotico) 38. L'utilizzo della microscopia confocale per l'imaging dal vivo di una fase precedente, le dividendo le cellule staminali germinali dei testicoli di Drosophila, ha portato ad una maggiore comprensione della regolazione delle cellule staminali. Oltre ai contrasto di fase e microscopia di immunofluorescenza approcci qui presentate, microscopia elettronica a trasmissione è stata anche ampiamente utilizzato per studiare Drosophila spermatogenesi 31.

Oltre alle immagini, testicoli Drosophila possono essere utilizzati come fonte di materiale per l'analisi dell biochimicas. Per gli esperimenti di immunoblotting, testicoli mosca sezionati possono essere omogeneizzati in tampone campione 6x (5 ml / testicoli coppia), bollito, e direttamente caricati su un gel SDS-PAGE (~ 4 testicoli accoppiamenti / corsia). Ad esempio, questo approccio è stato utilizzato per valutare i livelli di componenti dineina-dinactina nei testicoli di diversi mutanti di Drosophila. Testicoli estratti possono alternativamente essere preparati omogeneizzando il tessuto in tampone di lisi nondenaturing se è importante mantenere l'integrità proteina. Ad esempio, Drosophila testicoli estratti sono stati utilizzati in esperimenti coimmunoprecipitation per dimostrare la presenza di complessi proteici stabili in questo tessuto 41-43.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Michael Anderson per stabilire in laboratorio Lee questi metodi accettati per lo studio della spermatogenesi con la consulenza di esperti da Karen Hales. H. Oda e Y. Akiyama-Oda generosamente fornito la γ-tubulina-GFP volare stock. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione NIH R01 al LAL (GM074044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

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L&#39;analisi citologica della spermatogenesi: Preparati Live e fisse di<em&gt; Drosophila</em&gt; Testicoli
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Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

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