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Biology

정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비 doi: 10.3791/51058 Published: January 20, 2014

Summary

분리 및 위상 콘트라스트와 형광 현미경으로 이미징 초파리 고환 샘플 (생활하고 고정)을 제조하는 방법이 설명된다.

Abstract

초파리 melanogaster의 널리 생물학적 과정의 다양성을 설명하기 위해 사용 된 강력한 모델 시스템이다. 예를 들어, 여성과 초파리의 수컷 생식 라인 모두의 연구는 현재의 감수 분열에 대한 이해뿐만 아니라 줄기 세포 생물학에 크게 기여했다. 우수한 프로토콜은 초파리의 난소와 고환 3-12의 분리 및 이미징에 대한 문헌에서 사용할 수 있습니다. 여기서, 현미경 분석에 대한 해부와 초파리 고환의 제조 방법은 첨부 된 비디오 데모와 ​​함께 설명되어 있습니다. 성인 남성의 복부에서 고환을 분리하고 위상차 현미경에 의한 분석뿐만 아니라 형광 현미경에 의한 분석을 위해 고환을 고정하고 면역 염색을위한 프로토콜에 대한 살아있는 조직 슬라이드를 제조하는 프로토콜이 제공됩니다. 이러한 기술 개발을 나타내는 초파리 돌연변이의 특성에 적용 할 수있다정자뿐만 아니라 단백질의 세포 내 현지화의 시각화 EFECTS.

Introduction

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초파리의 고환은 줄기 세포의 조절, 세포의 감수 분열, 그리고 정자 개발 13-18 등 많은 생물 학적 과정의 연구를위한 이상적인 모델 시스템이다. 정모 세포와 그들의 감수 스핀들 대형 및 세포 학적 분석에 따라서 편리하고 편안한 정자 동안에 세포주기 체크 포인트는 세포주기 유전자 변이의 연구를 용이하게한다. 상이한 세포 유형은 고환의 길이를 따라 정렬 된 진행성에서 관찰 될 수 있고, 정자 형성에 어떠한 중단이 전반적인 배열의 변화로 이어질 수있다. 초파리의 유전 도구와 결합 된 이러한 기능은 정자 21-23의 돌연변이 분석을 용이하게했다.

초파리의 정자의 단계가 잘 정의되어 있습니다. 낭종 내에 동기 개발 생식선 세포는 고환의 길이를 따라 정자의 단계를 통해 순차적으로 진행. 보 중유사 분열과 남성 생식 세포의 감수 분열 번째, 세포질 분열은 딸 세포 (그림 1) 링 운하로 알려진 세포질 다리로 연결되어있는 것을 불완전 같은 발생합니다. 고환의 꼭대기 끝은 차 정모 세포의 16 셀 낭종을 생성하는 불완전한 세포질 분열 네 개의 유사 분열 분열을 거쳐 정원 세포에 상승을 제공 생식 줄기 세포의 인구가 포함되어 있습니다. premeiotic S 단계 후, 차 정모 세포는 G2 ~ 90 시간하는 세포 부피가 증가 ~ 25 배 동안의 장기 성장 기간을 입력합니다. 감수 분열의 I 각각 차 정모 세포와 반수체 정자의 64 세포 낭종, 32 셀 낭종의 형성 세포의 감수 분열 II 결과를 통해 진행 상황. 미숙 한, 둥근 정자 성숙 정자를 형성하기 위해 광범위한 세포 리모델링을 받고있다. 사후 감수 세포는 연신의 번들 및 성숙 정자 특히, 고환의 볼륨을 중시 점유한다.

티여성 파리에 기능 정자의 그는 성공적으로 전송 여러 쌍 구조 (고환, 정낭 및 액세서리 땀샘)과 하나의 사정관으로 구성되어 남성의 생식 시스템 (그림 2)의 다른 부분 간의 조정이 필요합니다. 정자는 고환에서 생산 교미 24까지 정낭에 저장됩니다. 액세서리 샘은 정액을 생산하는 분비 세포가 포함되어 있습니다. 정낭에서 이주 정자가 정낭 및 액세서리 분비 모두 연결된 사정관, 내 정액과 혼합된다. 정자와 정액의이 혼합물은 궁극적으로 여성의 남성의 복부 (25)의 후방 단부에 위치 사정 전구를 통해 비행의 질에 남성의 펌핑된다. 정액 내 단백질은 담당자에 spermathecae로 알려진 전문 기관 내에서 정자의 장기간 보관에 필수적인초파리 암컷 26 roductive 기관.

초파리 고환의 분리 및 정자의 여러 단계에서 세포의 시각화를위한 훌륭한 방법은 과학 문헌 3-12에서 사용할 수 있습니다. 우리는 여기에 첨부 된 비디오 데모와 함께 이러한 프로토콜의 예를 제시하여 지식이 몸에 추가합니다. 위상차 현미경 라이브 고환 샘플의 준비를위한 프로토콜은 앞에서 설명한 방법 (27)에 기초한다. 포름 알데히드 고정 및 고환의 면역 염색을위한 프로토콜은 이전에 설명한 방법 28을 기반으로합니다. 본원에 기재된 방법 (예를 들어, 초파리 정자 동안, 마이너스 엔드 - 지향의 미세 소관 모터 dynein의 역할을 평가하기 위해) 초파리 정자의 많은 연구에 사용되었다.

기본 프로토콜 이외에, 제안은 varyin 제공된다G 해부 정조 세포, 정모 세포, 또는 성숙한 정자 풍부하게하기 위해. 이러한 낭종이 고환을 처리하기위한 다른 방법은 그대로 유지 또는 설명되어 필요에 따라 중단됩니다 하나. 모델 시스템으로 초파리 고환 사용에 장점은 초파리 난자 및 배아에 비해 항체 및 염료 쉽게 고환에서 그들의 분산 다음 세포에 침투 할 수 있으며, 적은 세척 단계가 요구되는 점이다, 따라서, 프로토콜은 상대적으로 수행 될 수있다 짧은 시간.

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Protocol

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1. 고환의 해부

  1. CO 2의 스트림을 사용하여 병 또는 유리 병에 파리를 마취 및 비행 패드에 전송합니다.
  2. 정렬 작은 붓을 사용하여 해부 현미경으로 파리, 원하는 유전자형의 초파리 수컷의 (실험)에 따라 해당 번호를 수집합니다. (2-5 일) 이전 약간 나이가 남성은 세포 검사에 이상적입니다 반면 (0-2일 세) 젊은 남성은 정자의 초기 단계 (예를 들어 정조 세포, 정모 세포, 초기 포스트 감수 정자)를 통해 세포를 검사에 이상적입니다 정자의 마지막 단계에서 (특히, 정자를 성숙).
  3. (해부하는 동안 액체에 떠에서 파리를 방지하기 위해) 각 비행에서 날개를 제거하는 집게를 사용합니다.
  4. 에 실리콘 코팅 해부 접시에 드롭, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS 130 mM의 NaCl을, 7 개 mm 나 2 HPO 4, 3 밀리미터의 NaH 2 PO 4)의 ~ 500 ML을 추가합니다검은 배경. 다른 수용액을 성공적으로 고환 절제술 3에 사용되었다.
  5. 포인트는 파리의 전방을 향해 핀셋, 가슴으로 이해하고, PBS의 드롭에 젖어. 해부 현미경을 통해 볼 수 있지만, 복부에서 분리 될 때까지 후방 외부 생식기 (복부 복부의 뒤쪽 끝 부분에 진한 갈색 구조)를 잡아 당겨 포셉의 다른 쌍을 사용합니다. 대부분의 경우, 고환, 정낭, 및 부속 선은 외부 성기와 복부에 따라 제거 할 것,하지 않을 경우, 복부에 포셉 한 쌍을 삽입하고 고환을 애타게.
  6. PBS의 드롭 집게 이쌍 (그림 2)를 사용하여 부속 선 및 외부 생식기에서 별도의 고환. 야생 형 고환은 쉽게 노란색으로 이웃 흰색 조직과 구별된다. 2 단계로 바로 진행합니다.
  7. pharate의 남성 (전에서 고환을 분리하려면.. 전자 번데기 케이스 내에 포함), 추가 단계는 먼저 번데기 케이스에서 비행을 제거 포함하는 수행해야합니다,이 단계는 이전에 다른 31에 설명되어 있습니다. 단계 1.2에서 시작하는 성인의 고환을 위해 같은 해부를 진행합니다.
  8. 애벌레 남성에서 고환을 분리, 초파리 애벌레 난소 32을 분리하는 프로토콜의 변형을 수행합니다. 간략하게, 수컷 유충 지방 본체의 후방 제에 포함 된 대형, 분명, 타원형 구조 (유생 정소) 쌍의 존재에 의해 암컷 유충으로부터 구별 될 수있다. 유생 고환을 분리 부분적 유생 난소의 분리 기술 한 바와 같이 복부에서 고환 및 주변 체지방을 분리 수컷 유충을 열 채찍. 본원에 기술 된 프로토콜의 2 단계로 바로 진행; 정소하기 직전 난소 (32)에서 기술 한 바와 같이 (2.3 또는 3.14 단)에 장착 지방 본체로부터 제거 될 수있다.

  1. 부드럽게 사각 유리 커버 슬립에 PBS의 4-5 ML의 드롭 고환 2 ~ 3 쌍을 배치 포셉 한 쌍을 사용합니다. 너무 작은 액체 때 숙청 세포는 파열의 원인이됩니다 반면, 너무 많은 액체를 숙청 할 때 제대로 확산 세포를 방지 할 수 있습니다 : PBS의 볼륨에 고환의 수의 비율을 조정해야 할 수도 있습니다. 선택 사항 : 사용 실리콘 처리 된 커버 단계 3.2 슬립을 충당하기 위해 조직의 부착을 최소화하기 위해 전표.
  2. (참고 준비에 필요한 생식 세포 유형의 존재를 극대화 할 수 있도록 적절한 위치에 열려있는 각각의 고환을 찢어 포셉 한 켤레를 사용하는 부수 동안 슬라이드에 고환 찢어진 지역에서 의지 주로 출구의 내용 단계를 포함한다.) 정조 세포와 정모 세포에 풍부하게, 그 정점 팁 (레벨 1, 그림 2B)에 인접한 고환을 열고 눈물. 정모 세포와 정자 세포에 풍부하게, 눈물은 pos의 고환을 열레벨 1 (레벨 2, 그림 2B)에 약간 기초 ition. , 더 성숙한 생식 세포에 풍부 가까이 곡률 (레벨 3, 그림 2B)를 시작하는 위치에 개방 고환을 찢어.
  3. 부드럽게 고환 스쿼시 커버 슬립 위에 유리 현미경 슬라이드를 배치, 혼자 커버 슬립의 무게가 제대로 숙청 샘플을 얻기에 충분하다로 수동으로 압력을 적용하지 않는다. 공기 방울이 않도록하십시오. 선택 사항 : 사용 폴리-L-라이신 코팅 현미경 단계 3.2에서 슬라이드에 조직의 준수를 촉진하기 위해 슬라이드.
  4. 위상차 현미경으로 살아있는 세포를 관찰하기 (이상적으로 준비 15 분 이내) 즉시 준비를 사용하여, 고환에서 찬란 태그 단백질의 발현과 유전자 변형 파리에, 살아있는 세포는이 단계에서 형광 현미경으로 검사 할 수 있습니다. 또한, 고정 및 항체 염색 (프로토콜 3)를 진행합니다.
  5. 부드럽게 청소 W를 사용하여 커버 슬립 아래에서 초과 액체를 심지생식 세포에 초점이 명확하게 될 때까지 IPE는 자료의 평탄화를 허용합니다.

3. 포름 알데히드 고정 및 항체 염색법

  1. 스냅 (액체 질소 버블 링을 멈출 때까지) 액체 질소에 짧게 젖어 금속 집게의 쌍을 사용 (프로토콜 2) 숙청 고환이있는 각 슬라이드를 동결.
  2. 면도날을 사용하여 즉시 커버 슬립을 제거합니다.
  3. 얼음처럼 차가운 95 % 에탄올로 가득 prechilled 유리 슬라이드 랙 (분광 등급, 메탄올 - 무료)에 슬라이드를 전송하는 금속 집게를 사용합니다. 10 분 -20 ° C에 보관하십시오.
  4. 4 % PBS에 포름 알데히드 플러스 0.1 % 트리톤 X-100 (PBS-T)로 채워진 유리 슬라이드 랙에 슬라이드를 전송하는 금속 집게를 사용합니다. 7 분 동안 실온에서 보관하십시오.
  5. PBS로 가득 유리 슬라이드 랙에 슬라이드를 전송하는 금속 집게를 사용합니다. 실온에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 1X를 반복합니다. (유리 슬라이드 랙에 솔루션을 삭제하여 모든 세척을 수행
  6. PBS를 폐기하고 세포막을 투과하는, 실온에서 30 분 동안 PBS-T에서 슬라이드 젖어.
  7. 실온에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 배를 반복합니다.
  8. 단계 (옵션) 차단 : 실온에서 45 분 동안 PBS에서 슬라이드 플러스 1 % BSA를 담근다.
  9. (단계 3.9 및 3.11에 추가) 항체 솔루션을 제한하기 위해 (눈으로 쉽게 볼) 숙청 조직 주변의 슬라이드에 원을 그리려면 소수성 장벽 펜을 사용합니다. 면역 염색을 수행하는 동안 조직을 항상 습한 유지되어야한다.
  10. 원 내에서 조직에 (항체에 따라 1:50 PBS-T, 1:400으로 희석) 일차 항체의 30 ~ 40 ML을 추가합니다. 블로킹이 수행 된 경우, PBS-T 플러스 1 % BSA에 일차 항체를 희석. (그림 4의 중심체의 염색에 대한) 안티-γ-tubulin에 항체는 1:100 희석시켰다. 습기, 어두운 챔버 (예. 폐 플라스틱 상자에 품다젖은 종이 실온에서 2 시간 동안 수건) 또는 4 박 ° C에서와
  11. 실내 온도 3 배에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 차단을 수행 한 경우, PBS-T에 두 번 세척 한 번 PBS에서 (실내 온도 각에서 5 분).
  12. 조직에 형광 - 복합 이차 항체 (PBS에서 1:400 희석)의 30 ~ 40 mL를 넣고 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 어둠 속에서 부화.
  13. 실온에서 5 분 동안 PBS에서 슬라이드를 씻으십시오. 배를 반복합니다.
  14. 30 ~ 40 원 내에서 조직에 DAPI 용액 (PBS 0.2 ㎎ / ㎖)의 ML을 추가합니다.
  15. 부드럽게 공기 방울이 않도록주의하면서, 조직 위에 유리 커버 슬립을 배치합니다. 기포가 발생한 경우, 거품이 커버 슬립의 측면에서 탈출 할 때까지 스쿼시를 파괴하지 않고 커버 슬립 주위를 조심스럽게 이동합니다.
  16. 청소를 사용하여 슬라이드의 가장자리에서 초과 DAPI를 지워 버리 닦아냅니다.
  17. 명확한 매니큐어를 사용하여 슬라이드에 커버 슬립을 봉인.
  18. 이 혼합물을 사용하여형광 현미경으로 세포 면역 염색을 볼 수있는 다음 3 ~ 4 시간 이내. (적어도 몇 주까지) 슬라이드의 장기 저장을 위해, -20 ˚ C에서 글리세롤 기반 하드 마운트 DAPI와 매체 및 저장 슬라이드를 사용
  19. 또한, (항원)에 따라 메탄올 대신 포름 알데히드에 샘플을 고정합니다. 단계 3.2을 통해 전체 프로토콜을 완료 한 후, -20 ° C에서 10 분 동안 메탄올 숙청 고환의 슬라이드를 담가 이후 단계 5를 진행합니다.

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Representative Results

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초파리의 남성 생식 기관의 제대로 해부 쌍의 예를 그림 2A에 표시됩니다. 성인 남성 파리의 복부에서 제거 고환은 일반적으로 정낭의 쌍 (파란색, 그림 2A ')를 통해 절규하는듯한 덕트 (브라운, 그림 2A') 및 액세서리 땀샘의 한 쌍 (녹색, 그림 2A ')에 연결되어 . 첨부 된 체세포 조직, 절규하는듯한 덕트 및 부속 샘의 대부분에서 고환을 분리하려면 분리 및 고환 쌍과 정낭 만이 ( '도 2b2B)을 유지하도록 폐기해야합니다. 정낭 또한 더욱 처리 될 만 고환 쌍을 남겨 제거 될 수있다.

고환 절제술 선택 성인 남성의 나이는 중요한 고려 사항이다. (0~2일 우화 후) 젊은 남성에서, 정낭 작은거의 빈, 고환 (그림 2에서와 같이) 자신의 최대 직경에 있습니다. 젊은 남성을 사용하면 (유사 분열 또는 감수 분열 중 하나를 겪고있는) 분할 생식 세포와 초기 포스트 감수 정자의 상대적으로 많은 수를 보장합니다. 세 남자가 (3-5 일 우화 후) 해부 (이미지가 표시되지 않음)에 사용하는 경우, 그들은 정자와 돌출되어 있기 때문에 정낭보다 눈에 띄는이며, 고환은 젊은 남성에 비해 좁은. 목표는 성숙한 정자를 시각화하는 경우 구형 수컷이 바람직하다.

초파리 고환의 길이를 따라 발달 사건의 주문 진행으로 인해, 정자의 특정 단계에서 생식 세포는 고환이 이전 퇴치에 찢어진 해부하는 위치에 따라 농축 될 수있다. 예를 들어, 그 정점 팁 (레벨 1, 그림 2B ') 근처에 고환을 열고 찢어은 정자의 초기 단계에서 세포의 풍요 로움을 얻을 수 있습니다. 그림 3이 방법으로 얻은 정조 세포 (흰색 화살표), 초기 차 정모 세포 (노란색 화살표), 늦은 차 정모 세포 (빨간색 화살표)의 대표적인 인구의 위상 콘트라스트 이미지를 보여줍니다. 또한, 좀 더 기초 위치 (레벨 2, 그림 2B ')에서 고환을 열고 찢어은 주로 정모 세포와 정자를 얻을 수 있습니다. 그림 3b는 차 정모 세포 (빨간색 화살표), 원형 정자 (대표 세포 인구의 위상 콘트라스트 이미지를 보여줍니다 녹색 화살표),이 방법으로 얻은 정자 (주황색 화살표), 성숙 정자 번들 (파란색 화살표)을 길게.

고환의 위상차 촬상이 과정에 중요한 유전자의 돌연변이로 인한 초파리 정자 결함을 특징 짓는 데에 이용 될 수있다. 위상차 현미경을 통해 볼 때 원형 정자는 매우 진부한 외관이있다. 이러한 미성숙 정자 각각 단일의 PHA가 여기E 빛, 둥근 핵 (그림 3C에 각각 보라색 화살촉 및 화살표로 표시) 거의 같은 크기의 단일 위상 어두운 둥근 미토콘드리아 집계. 이러한 세포 소기관의 상대적 숫자 나 크기의 변화는 탈선 감수 분열 (설명 참조)에서 발생할 수 있습니다. 이러한 결함의 예는도 3D에 도시된다. 산산이 (ASUN) 유전자의 돌연변이를 가진 성인 남성의 원형 정자는 세포질 분열과 염색체 분리 (29)의 결함의 결과로 하나의 큰 미토콘드리아 집계 및 다수의 소규모 핵을 포함하고 있습니다.

형광 현미경은 초파리의 정자 공부를위한 또 다른 강력한 방법입니다. 찌그러 고환 샘플에서 고정 된 세포의 형광 이미지의 예는도 4에 도시된다. 고환은 그 C-터에서 융합 bTub56D 유전자의 GFP-β1-튜 블린 (제품을 발현하는 형질 전환 초파리에서 얻어진한 단자는 GFP와 유비 - p63E 유비퀴틴 유전자 프로모터의 제어하에 종료, H.오다와 Y 아키야마 -오다, JT Biohistory 연구 홀, 오사카, 일본)에서 선물 미세 소관 (그림 4D, 그레이 스케일로 그린 레이블을하기 위해 도 4a에서). 형질 전환 고환은 γ-tubulin에 대해 마우스 항체를 이용한 면역 염색 하였다 (이차 항체 : 항 - 마우스를 Cy3)는 (그림 4D,도 4c에 그레이 스케일 빨강) 중심체를 표시하는 그림 4D의 DNA (블루, 그레이 스케일을 표시 DAPI 염색 그림 (b)에서). 정자 형성의 여러 단계에서 세포는 쉽게 미세 소관, 중심체와 염색체 (범례 참조)의 구성을 조사함으로써 식별 될 수있다.

그림 1
Figu 1. 초파리 수컷의 생식 세포 분열의 도식 다시. 각각의 줄기 세포 부문은 차 정모 세포의 16 셀 낭종을 생산하는 불완전한 세포질 분열과 유사 분열 분열의 네 라운드를 거쳐 gonial 셀을 생산하고 있습니다. 각 기본 spermatocyte 전에 상호 원형 정자의 64 셀 낭종 이어 상호 이차 정모 세포의 32 셀 낭종을 형성하기 위해, 불완전 세포질 분열 다시,이 감수 분열을 겪고에 장시간 성장 단계를 거친다. 원형 정자는 위상 빛 핵의 존재와 비슷한 크기의 위상 어두운 미토콘드리아 집계 (Nebenkern)을 특징으로한다. 원형 정자 세포는 성숙한 정자를 형성하는 신장과 개별화를 받고있다. 성숙한 정자 헤드는 자신의 침상 핵에 의해 식별 될 수있다. 핵은 파란색으로 표시됩니다 블랙 Nebenkerne (미토콘드리아 집계) 황갈색의 세포질./ 50981fig1highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
초파리 남성의 그림 2. 생식 기관. 젊은 성인 남성은 (0-2일 우화 후) 해부에 선정되었다. 고립 된 생식 기관의 빛 현미경은있는 만화 해당 '와 B'와 A와 B에 표시됩니다. (A, A ') 성인 남성 파리의 복부에서 제거 초파리의 정소 (빨간색)은 정낭 (파란색)를 통해 절규하는듯한 덕트 (갈색)에 연결되어있다. 액세서리 샘 (녹색)의 쌍은 절규하는듯한 덕트에 연결되어 있습니다. (B, B ') 고환은 액세서리 분비 B로부터 분리되어야한다efore 준비를 밀어 넣습니다. 레벨 2에서 감수 및 사후 감수 생식 세포의 혼합 인구를 제조하는 단계;, 이전 퇴치에, 레벨 1의 고환은 정자의 초기 단계에서 세포에 풍부하게 열려 찢어 레벨 3에 성숙한 정자 풍부하게. 스케일 바, 250mm는. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
초파리 고환의 그림 3. 위상 콘트라스트 이미지. (A) 정조 세포 (흰색 화살표), 초기 차 정모 세포 (노란색 화살표), 늦은 차 정모 세포 (빨간색 화살표)을 포함하여 정자의 초기 단계에서 세포의 풍요 로움은 일반적으로 출시되는 고환이 레벨 1에서 찢어진 경우 (그림 참조우레의 2B '). 두 개 이상의 상호 연결된 세포 (불완전한 세포질 분열의 결과는) 종종 부수 절차 (노란색 화살표 머리가 두 개의 초기 정모 세포의 융합을 표시)의 유물과 완전히 융합. (B) 원형 정자 (녹색 화살표), 길게 정자 (주황색 화살표 부분 낭종을 표시), 성숙 정자 번들 (파란색 화살표)를 포함 정모 세포 (빨간색 화살표가 늦게 차 spermatocyte를 표시) 및 사후 감수 세포의 조합은, 전형적으로 고환이 레벨 2에 찢어진 경우 ( '그림 2B 참조) 발표했다. 찌그러 고환의 (C, D) 위상 대비 이미징 용이 풍부한 베타 원형 정자의 결함을 식별하는데 사용될 수있다. 하나의 미토콘드리아 집계 (상 어두운, 보라색 화살표로 표시)에 부착 대략 같은 크기의 (C), 야생 형 정자 한 핵 (보라색 화살표 모양으로 표시 위상 등)가있다. asunf02815에서 정자고환은 염색체 분리 (D)에 실패 세포질 분열과 오류의 결과로 다수의 소규모 핵 및 하나의 큰 미토콘드리아 집계가 포함되어 있습니다. 스케일 바, 10mm는. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
.. 초파리 고환의 그림 4 형광 이미지 GFP - 태그 베타 1-튜 블린 (D 그린, 그레이 스케일)을 표현하는 남성으로부터 격리 숙청 고환의 준비가 고정 및 스테인드 모두 DNA에 대한 한 (DAPI, D 블루, B에 그레이 스케일) 와 중심체 (감마 - 튜 불린 항체, D 빨간색, C의 그레이 스케일). 분할 spermatocyte (흰색 화살촉)는 ​​다음 라운드의 정자 (흰색 화살표가 대표적인 세포를 표시) 및 성숙한 정자 (노란색 화살표)의 번들의 큰 필드에 볼 수 있습니다. 스케일 바, 10mm는. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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야생형 파리의 고환은 쉽게 인해 노란색 (대조적으로 이웃 흰색 조직)을 식별 할 수 있지만, 흰색 돌연변이 체의 고환은 흰색이며, 따라서 가끔 용기와 혼동 할 수 있습니다. P 요소에있는 미니 흰색 유전자가 고환에있는 색소의 축적을 촉진하지 않기 때문에 흰색 배경에 전형적으로 대부분의 형질 전환 균주는 또한 흰색 고환이 있습니다. 초파리의 고환은 색깔로 구분 할 수없는 경우, 다른 쉽게 인식 기능은 쌍 (12)에서의 나선형 패턴과 발생 (가) 있습니다. 일부 근로자가 쉽게 고환 (12)을 분리하는 절개 바늘 대신 집게를 사용하여 찾을 수 있습니다.

이 프로토콜의 중요한 단계는 숙청 고환의 준비입니다. 한 가지 유용한 방법은 몇 밀리되도록 고환을 함유 커버 슬립 위에 슬라이드를 올려하는 표면 TE커버 슬립에 PBS의 nsion 슬라이드 향해 조직을 함유하는 커버 슬립을 리프트. 이 방법은 낭종을 중단하고 개별 셀 이미징에 이상적 슬라이드에 세포를 확산하는 경향이있다. 대안 적으로, 이미징에 대한 전체 또는 부분 낭종을 유지하기 위해, PBS의 부피는 커버 슬립에 배치는 (4-5부터 7-8 밀리리터 ml로) 증가 될 수있다.

관심의 특정 초파리 돌연변이 체는 성인에 생존하지 않는 경우, 애벌레 나 번데기 고환은 정자 대안을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 프로토콜 섹션에서 참조는 pharate 수컷 및 유생 난소의 분리를 위해 제공되며, 후자 프로토콜의 변형 유생 고환을 분리하는데 사용될 수있다. , 찢어 눌리 및 유충 또는 번데기 고환을 염색하는 단계는 성인 고환 위해 본원에 기술 된 것과 본질적으로 동일하다. 공부하는 플라이 라인은 성인에 도달 할 수있다하더라도, 애벌레 나 번데기 고환의 분리가 바람직 할 수있다 경우 gOAL은 정자의 초기 단계에서 세포를 획득하는 것입니다. 대표적인 결과 섹션에서 설명한 바와 같이 고환이 이전 퇴치에 찢어진되는 레벨을 변경하여 원하는대로, 정자의 초기 또는 후기 단계에있는 세포에 충실 할 수 있습니다.

위상차 현미경은 초파리의 정자를 연구하는 비교적 간단한 방법을 제공합니다. 면역 염색과 형광 현미경 이상의 위상차 현미경의 장점 중 하나는 더 적은 시간이 샘플을 준비하기 위해 요구된다는 것이다. 정자의 주요 단계 중 모든 좀처럼이 기술 (24)을 사용하여 식별 될 수있다. 실제로, 몇몇 그룹은 초파리 남성 불임 돌연변이 라인 21-23의 표현형의 특성에 대한 기본 화면으로 고환의 위상차 현미경 분석을 사용했다. 감수 분열시 미토콘드리아와 염색체는 똑같이 딸 세포로 분할된다. Drosophil에있는 정자의 고유 한 기능다른 곤충 라운드 정자 (24)의 미토콘드리아 집계 (Nebenkern)의 형성을 포함한다. 원형 정자는 위상 어두운 Nebenkern 해 1:1의 비율로 대략 같은 크기의 위상 등 핵 (그림 3)이 포함되어 있습니다. 핵의 직경은 원형 정자 세포의 DNA 함량을 반영하는, 그래서 세포의 감수 분열시 염색체 분리에 오류가 핵의 크기 (33)에 변동을 초래할 수 있습니다. 다핵 라운드 정자의 염색체 분리의 결과 다음과 같은 감수 세포질 분열의 중단하는 하나의 집계 (34)에 Nebenkerne 퓨즈. 따라서, 1:1 비율 또는 원형 정자의 크기 또는 Nebenkern의 모양과 핵에 어떤 변화가 쉽게 라이브 고환의 위상차 현미경으로 감지 세포의 감수 분열에 결함이 자주 진단이다 할 수있다. 일반적인 낭종 내의 두 개 이상의 상호 연결된 세포의 융합 자주 눌리 절차의 이슈로 발생 (도 3a노란색 화살표 머리) Nebenkerne에 핵의 1:1 비율은, 그러나, 여전히 유지된다.

초파리 고환의 고정 제제의 면역 염색은 세포받은 정자를 무대뿐만 아니라 발현 패턴과 관심의 단백질의 세포 내 현지화을 평가하기 위해 수행 할 수 있습니다. 세포 형태, 염색질 조직 및 튜 불린과 DNA 염색에 대한 면역 염색 고환 세포의 미세 소관 배열에 따라 초파리의 정자 형성의 단계를 분류하기위한 세련된 방식은 초파리 차 정모 세포가 상대적으로 큰 세포입니다. 19을 설명하고 있으며, 감수 스핀들 수 분명하게이 방법을 사용하여 관찰 될 수있다. (예를 들어, γ-튜 불린에 대한 항체를 사용)에 대한 중심체 Coimmunostaining은 감수 스핀들 구조의보다 정확한 뷰를 얻기 위해 수행 될 수있다. antibod의 다양한 고환을 면역 염색 때 포름 적합하다 정착액IES (예를 들어, 안티 라민 및 안티 dynein 중쇄). 미세 소관과 중심체의 형태는, 그러나, 메탄올로 잘 보존이며 α-튜 불린 및 γ-튜 불린에 대한 항체로 면역 염색을 수행 할 때, 따라서, 메탄올은 전형적 정착액으로서 사용된다.

관심의 단백질에 대한 항체를 사용할 수없는 경우에, 단백질의 형광 태그 (예. mCherry 또는 GFP)을 발현하는 형질 전환 버전 초파리 라인은 다른 방법으로 생성 될 수있다. 대안 적으로, 항-GFP 항체는 고정 된 샘플에서 융합 단백질을 검출하는데 사용될 수 있으며, 단백질의 세포 내 지역화 후 조직의 라이브 또는 고정 제제에서 GFP 형광을 보려면 현미경 사용에 의해 결정될 수있다. 그림 4에서 고정 고환 준비의 미세 소관은 글로브의 통제하에 유전자로부터 발현 GFP - 태그 베타 1-튜 불린의 고유 형광 (를 통해 시각화했다동맹) 유비퀴틴 프로모터를 표명했다. 대안 적으로, 트랜스 제닉 파리는 어떤 식으로 조직 특이 적 프로모터의 제어하에, 예를 들어, 베타 - 튜 불린 유전자의 프로모터는 고환 특정 식 (35)를 위해 사용되어왔다. 대안 적으로, 관심 단백질의 발현이 UAS-인 Gal4 시스템 (36)을 사용하여 특정 남성 생식 세포로 제한 될 수있다. 나노 - 인 Gal4가 정원 세포 내의 UAS 프로모터의 제어하에 단백질의 발현을 유도하는 데 사용할 수있는, BAM-37 인 Gal4는 정모 세포 내에서 발현을 유도하는 데 사용될 수있다. 관심의 단백질의 최저 또한 이러한 인 Gal4 드라이버 (37)와 함께 UAS 프로모터의 제어하에 RNAi의 헤어핀 구조를 표현하여 고환에서 유도 할 수있다.

초파리의 정소 세포의 라이브 영상 분석 방법의 개발이 될 수 질문의 범위를 확장했다이 시스템을 사용하여 참조. 감수 세포질 분열의 이벤트는 셀 (35)의 수명을 연장하기 위해 관류 챔버 내부 피브린 응괴에서 배양 정모 세포의 위상 콘트라스트 현미경으로 시각화 될 수있다. 찬란 태그 단백질을 발현하는 초파리 정모 세포의 시간 경과 공 초점 현미경도 38 (감수 스핀들 어셈블리를 연구하기 위해, 예를 들어) 강력한 접근 방식이다. 이전 스테이지의 라이브 영상을위한 공 초점 현미경의 사용은 초파리 고환의 분할 생식선 줄기 세포는 줄기 세포의 조절 증가 이해되었다. 본 명세서 위상차 및 면역 형광 현미경 방식 이외에, 투과 전자 현미경은 초파리 정자 (31)을 연구하기 위해 광범위하게 사용되고있다.

촬상 이외에, 초파리 정소 생화학 analysi위한 물질의 공급원으로 사용될 수있다의. 면역 블롯 실험의 경우, 해부 비행 고환, 6 배 샘플 버퍼 (5 ㎖ / 고환 쌍)에서 균질화 삶은, 직접 SDS-PAGE 젤 (~ 4 고환 쌍 / 레인)에로드 할 수 있습니다. 예를 들어,이 방법은 여러 초파리 돌연변이 고환 dynein-dynactin 성분의 수준을 평가하기 위해 사용되었다. 정소 추출물 대안이 단백질의 무결성을 유지하기 위해 중요한 경우 변성 용해 완충액에서 조직을 균질화함으로써 제조 될 수있다. 예를 들어 초파리 추출물이 티슈 41-43 안정한 단백질 복합체의 존재를 입증하는 coimmunoprecipitation 실험에 사용 된 정소.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgments

저자는 이명박 실험실에서 카렌 헤일 즈에서 전문가의 조언과 정자를 연구하는이 허용 방법을 설정하기위한 마이클 앤더슨에게 감사의 말씀을 전합니다. H.오다와 Y 아키야마 -오다 아낌없이 γ-튜 불린-GFP 재고 비행 제공. 이 작품은 LAL (GM074044)에 NIH R01 교부금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

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정자의 세포 학적 분석 : 라이브와 고정 준비<em&gt; 초파리</em&gt; 고환
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Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

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