Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/51058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Способы выделения и подготовки дрозофилы яичек образцов (жить и фиксированной) для работы с изображениями на фазе контраста и флуоресцентной микроскопии описаны здесь.

Abstract

Дрозофилы является мощным модель системы, которая широко используется для выяснения различных биологических процессов. Например, исследования обоих женского и мужских половых линий дрозофилы внесли большой вклад в современное понимание мейоза, а также биологии стволовых клеток. Отлично протоколы доступны в литературе для выделения и визуализации Drosophila яичников и яичек 3-12. При этом методы вскрытия и подготовки дрозофилы яичек для микроскопического анализа описаны с сопровождающим видео демонстрации. Протокол для выделения семенников из брюшной полости взрослых мужчин и подготовки слайды живой ткани для анализа с помощью фазово-контрастной микроскопии, а в качестве протокола для фиксации и иммунного окрашивания яички для анализа с помощью флуоресцентной микроскопии представлены. Эти методы могут быть применены в характеристике Drosophila мутантов, которые обладают Dвидеоэффекты в сперматогенеза, а также в визуализации внутриклеточных локализаций белков.

Introduction

Drosophila яички являются идеальным модельной системой для изучения многих биологических процессов, включая регуляцию стволовых клеток, мейоза и развития сперматозоидов 13-18. В сперматоциты и их мейотические шпиндели большие и, следовательно, удобным для цитологического анализа и расслабленной контрольно-пропускные пункты клеточного цикла во время сперматогенеза облегчить изучение мутаций в генов клеточного цикла. Различные типы клеток можно наблюдать в упорядоченной прогрессии по длине яичек, и любое нарушение сперматогенеза может привести к изменениям в этой общей договоренности. Эти характеристики в сочетании с Drosophila генетических инструментов способствовали мутационный анализ сперматогенеза 21-23.

Этапы Drosophila сперматогенеза были четко определены. Клетках зародышевой линии, которые развиваются синхронно в кисты прогрессировать последовательно через стадии сперматогенеза по длине яичка. Во время бого митотического и мейотических подразделений мужских половых клеток, цитокинез происходит не полностью, так что дочерние клетки остаются соединены цитоплазматическими мостиками, известных как кольцевых каналов (рис. 1). Верхушечный верхушка яичка содержит население зародышевой линии стволовых клеток, который дает начало сперматогониальных клеток, которые подвергаются четыре митотических делений с неполной цитокинезе генерировать 16-клеточные кисты первичных сперматоцитах. После премейотической S фазе, сперматоциты введите G2, длительный период роста ~ 90 час, в течение которого увеличивается сотовой объем ~ 25 раз. Прогрессирование через мейоза I и мейоз II приводит к образованию 32-клеточных кист средних сперматоцитах и ​​64-клеточных кист гаплоидных сперматидах, соответственно. Незрелые, круглые сперматиды проходят обширные сотовой ремоделирования сформировать зрелые сперматозоиды. После мейоза клетки, в частности пучки удлинения и зрелые сперматиды, занимают большую часть объема яичка.

Тон успешно транспорт функциональной спермы в женских мух требует координации между различными частями мужской репродуктивной системы, которая состоит из нескольких парных структур (яичек, семенных пузырьков, и придаточных желез) и одной эякуляции протока (рис. 2). Сперматозоиды производятся в яичках и хранятся в семенных пузырьков, пока совокупления 24. Акцессорные железы содержат секреторные клетки, которые производят семенной жидкости. Сперма миграции из семенных пузырьков смешиваются с семенной жидкости внутри эякуляции канал, который соединен с обеих семенных пузырьков и придаточных желез. Эта смесь спермы и семенной жидкости, в конечном счете откачивают из самца во влагалище самки летать через эякуляции лампы, расположенной на заднем конце охватываемой части живота 25. Белки в пределах семенной жидкости имеют важное значение для длительного хранения спермы в специализированных органов, известных как сперматеки в респroductive тракт Drosophila женщин 26.

Отличные методы изоляции дрозофилы яичек и визуализации клеток на разных стадиях сперматогенеза доступны в научной литературе 3-12. Здесь мы добавить к этому совокупность знаний, представляя примеры этих протоколов с сопровождающим видео демонстрации. Протокол для подготовки проб живые яичек для фазово-контрастной микроскопии основан на описанным ранее методом 27. Протокол формальдегида фиксации и иммунным окрашиванием семенников также основано на ранее описанного метода 28. Подходы, описанные здесь, были использованы во многих исследованиях Drosophila сперматогенеза (например, для оценки роли динеина, микротрубочек двигатель минус-конец-направленный, в течение Drosophila сперматогенеза).

В дополнение к основным протоколов, предложения предусмотрены для varyinг рассечение с целью обогащения для сперматогониев, сперматоцитах или зрелой спермы. Различные методы обработки яички такие, что кисты либо остаются нетронутыми или нарушается по мере необходимости описаны. Преимущество использования Drosophila яички в качестве модельной системы является то, что, по сравнению с Drosophila ооцитов и эмбрионов, антитела и красители могут легко проникают в клетки после их разгона от семенников, и незначительное промывание требуется, таким образом, протоколы могут быть выполнены в относительно короткое время.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Семенники Рассечение

  1. Обезболить мух в бутылку или флакон с помощью потока СО 2 и трансфер в лету площадку.
  2. Сортировать летает под микроскопом рассекает используя маленькую кисть, и собрать соответствующее количество (в зависимости от эксперимента) от дрозофилы самцов желаемых генотипов. Молодые самцы (0-2 дней) идеально подходят для изучения клеток по всему ранних стадиях сперматогенеза (например сперматогенов, сперматоциты, и в начале пост-мейотические сперматид), в то время как немного старшего мужчины (2-5 дней) идеально подходят для изучения клеток в завершающей стадии сперматогенеза (в частности, созревают сперматозоиды).
  3. С помощью щипцов для удаления крыльев друг от летать (чтобы предотвратить мух от плавающих в жидкости при вскрытии).
  4. Добавить ~ 500 мл фосфатно-солевом буфере (130 мМ NaCl, 7 мМ Na 2 HPO 4, 3 мМ NaH 2 PO 4; PBS) в капле к силиконовым покрытием рассечение блюдо начерный фон. Другие водные растворы были успешно использованы для яичек вскрытия 3.
  5. Точка щипцы к передней части лету, понять его грудной клетки, и погрузите его в капле PBS. При просмотре через вскрытии микроскопом, использовать другую пару щипцов для тяните наружных половых органов (темно-коричневый, расположенный на заднем конце вентральной брюшной полости) кзади, пока она не отделяется от живота. В большинстве случаев, яички, семенные пузырьки и аксессуары железы будет удалена из брюшной полости вместе с наружных половых органов, а если нет, вставить одну пару щипцов в брюшную полость и дразнить яички.
  6. Отдельные яички из аксессуаров железы и наружных половых органов с помощью двух пар щипцов в капле PBS (рис. 2). Семенники дикого типа легко отличить от соседних белых тканей их желтого цвета. Немедленно приступить к шагу 2.
  7. Для выделения яички от pharate мужчин (I.. Э заключен в куколки случае), дополнительный шаг первым должен быть выполнен, что включает в себя удаление муху из куколки случае; этот шаг был описан ранее в другом месте 31. Продолжайте вскрытия, как и для взрослых семенников, начиная с шага 1.2.
  8. Для выделения яички от личинок самцов, выполнить модификацию протокола для изоляции дрозофилы личинок яичников 32. Вкратце, мужской личинки можно отличить от женского личинок наличием пары крупными, овальными структур (личинки яичек), встроенных в задней трети жира тела. Для выделения личинок яички, частично содрать открыть мужской личинку, чтобы изолировать семенники и окружающий жира тела из брюшной полости, как описано для выделения личинок яичников. Немедленно перейти к шагу 2 протокола, описанного здесь, яички позже могут быть удалены из жирового тела непосредственно перед монтажом (шаги 2,3 или 3,14), как описано в яичниках 32.

  1. Используйте пару щипцов осторожно положите 2-3 пары семенников в капле 4-5 мл PBS на квадратной покровным стеклом. Отметим, что отношение числа яичек в объеме PBS может нуждаться в корректировке: слишком много жидкости будет предотвратить клетки от распространения должным образом, когда сжато, в то время как слишком мало жидкости вызовет клетки лопнуть, когда раздавленный. Дополнительно: Использование силиконизированный крышка скользит минимизировать приверженность ткани для покрытия скольжение в п. 3.2.
  2. Используйте пару щипцов, чтобы разорвать каждого яичка в соответствующем положении так, чтобы максимизировать присутствие желательных типов зародышевой линии клеток в подготовке (обратите внимание, что содержимое яичка будет в основном выход из разорванной области на слайде во время деформируя шаг.) Для обогащения для сперматогониев и сперматоцитах, рвать открыть яичка, прилегающей к вершинной наконечником (уровень 1, рис. 2В). Для обогащения для сперматоцитах и ​​сперматид, слезоточивый открыть яичка в позition слегка базальная до уровня 1 (уровень 2, рис. 2В). Для обогащения для более зрелых половых клетках, оторвать открытый яичко ближе туда, где кривизна начинается (уровень 3, рис. 2б).
  3. Аккуратно поместите предметное стекло микроскопа над покровным раздавить яички; не оказывать давление вручную, так как вес одной только покровным достаточно для получения правильно сжатую образец. Старайтесь избегать образования пузырьков. Дополнительно: Использование поли-L-лизин покрытием предметные стекла способствовать присоединению ткани скользить в шаге 3.2.
  4. Немедленно Используйте подготовку (в идеале в течение 15 мин подготовки), чтобы наблюдать живые клетки на фазово-контрастной микроскопии; для трансгенных мух с выражением флуоресцентно меченых белков в яичках, живые клетки могут быть рассмотрены с помощью флуоресцентной микроскопии на этом шаге. С другой стороны, продолжить фиксации и окрашивания антител (протокол 3).
  5. Аккуратно фитиль лишнюю жидкость из-под покровного стекла с использованием очистки жIPE чтобы уплощение подготовки до зародышевые клетки не будут ясно в фокусе.

3. Формальдегид Фиксация и антител Окрашивание

  1. Привязать заморозить каждый слайд, содержащий раздавленные яички (от протокола 2) с помощью пары металлических щипцов, чтобы погрузить его кратко в жидком азоте (до жидкого азота не остановится пузырьков).
  2. Снимите покровное немедленно используя лезвие бритвы.
  3. Использование металлических щипцов для передачи слайды в prechilled стекло стойки, заполненной ледяной 95% этанола (спектрофотометрический класса, свободный от метанола). Хранить при -20 ° С в течение 10 мин.
  4. Использование металлических щипцов для передачи слайды предметное стекло стойки, заполненной 4% формальдегидом в PBS плюс 0,1% Тритон Х-100 (PBS-T). Хранить при комнатной температуре в течение 7 мин.
  5. Используйте металлические щипцы, чтобы передать слайды предметное стекло стойки, заполненной PBS. Промыть слайдов в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите 1x. Выполните все моет путем отбрасывания решение в стекло стойки (
  6. Отменить PBS и погружают слайдов в PBS-T в течение 30 мин при комнатной температуре к проницаемыми клеточные мембраны.
  7. Промыть слайдов в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите 2 раза.
  8. Шаг (не обязательно) Блокировка: Погрузитесь слайдов в PBS плюс 1% BSA в течение 45 мин при комнатной температуре.
  9. Используйте гидрофобный барьер перо, чтобы нарисовать круг на слайде вокруг раздавленной ткани (легко видимой на глаз), чтобы ограничить решения антител (добавлены с шагом 3,9 и 3,11). Ткань должна быть влажной все время при выполнении иммуноокрашивания.
  10. Добавить 30-40 мл первичного антитела (разбавленный в PBS-T, 1:400 до 1:50 в зависимости от антитела) в ткани внутри круга. Если блокирования проводили, развести первичного антитела в PBS-T плюс 1% BSA. Анти-гамма-тубулина антитела (для окрашивания центросомах на рисунке 4) разбавляли 1:100. Выдержите во влажной, темной камере (закрытый пластиковой коробке например.с влажных бумажных полотенец) в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С.
  11. Промыть слайдов в PBS в течение 5 мин при 3x комнатной температуры. Если блокирование была выполнена, мыть дважды в PBS-T и один раз в PBS (5 мин при комнатной температуре каждого).
  12. Добавить 30-40 мл флуорофора, конъюгированным вторичным антителом (разбавленного 1:400 в PBS) в ткани и инкубируют в темноте в течение 1-2 часов при комнатной температуре.
  13. Промыть слайдов в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите 2 раза.
  14. Добавить 30-40 мл раствора DAPI (0,2 мг / мл в PBS) в ткани в окружности.
  15. Аккуратно поместите покровным стеклом над ткани, избегая образования пузырьков. Если пузырьки воздуха должны появиться, тщательно передвигаться по покровным не разрушая сквош пока пузырьки вырваться из сторон покровным.
  16. Используйте протирайте чтобы уничтожить излишки DAPI от краев слайда.
  17. Закройте крышку скольжения на слайд с использованием четких лак для ногтей.
  18. Используйте этот препаратв течение следующих 3-4 часов, чтобы просмотреть, иммуноокрашиванию клетки флуоресцентной микроскопии. Для более длительного хранения слайдов (до, по крайней мере нескольких недель), используйте на основе глицерина трудно смонтировать носитель с DAPI и хранить слайды при -20 ˚ C.
  19. С другой стороны, закрепить образцы в метаноле вместо формальдегида (в зависимости от антигена). После завершения всего протокол через шаг 3.2, погрузиться слайды раздавленных яичек в метаноле в течение 10 мин при -20 ° С и перейдите к шагу 3.5 и далее.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Пример правильно расчлененного пары дрозофилы мужских половых органов показано на рисунке 2А. Семенники удалены из брюшной полости взрослого мужского лету, как правило, прилагается к эякуляции протока (коричневый, рис. 2А ") и парой придаточных желез (зеленый, рис. 2А ') через пару семенных пузырьков (синий, рисунок 2А") . Чтобы отделить яички от большинства сопроводительном соматических тканей, в эякуляции протока и придаточных желез следует снять и отбрасываются, так что только пара яичек и семенные пузырьки остаются (рис. 2Б и 2В "). В семенные пузырьки также могут быть удалены, оставив только пару яичек для дальнейшей обработки.

Возраст взрослых мужчин, отобранных для яичек вскрытия является важным фактором. У молодых мужчин (0-2 дней после вылупления), семенные пузырьки малыи почти пустой, и яички находятся в их максимального диаметра (как на рисунке 2). Использование молодых мужчин обеспечивает относительно большое количество разделительных половых клетках (проходящих либо митоза или мейоза) и в начале пост-мейотических сперматид. Когда пожилые мужчины (через 3-5 дней после вылупления) используются для вскрытия (изображение не показан), семенные пузырьки более заметны, потому что они выпуклые спермой, и яички уже, чем у более молодых мужчин. Пожилых мужчин, предпочтительно, если цель состоит в том, чтобы визуализировать зрелые сперматозоиды.

В связи с упорядоченной прогрессии событий развития по длине семенников Drosophila, зародышевой линии клеток на определенных этапах сперматогенеза может быть обогащен на основе позиции, в которой расчлененным яички рвутся до раздавливания. Например, разрывающий яичко вблизи ее апикальной наконечником (уровень 1, рис. 2В ") дает обилие клеток, в ранних стадиях сперматогенеза. Рисунок 3Показывает фазоконтрастной образ представительного населения сперматогониев (белая стрелка), ранние первичных сперматоцитах (желтая стрелка), и поздно первичных сперматоцитах (красная стрелка), полученной таким образом. Кроме того, разрывающий яичко на несколько более базальной позиции (уровень 2, рис. 2В ") дает в первую очередь сперматоциты и сперматиды. 3В показывает фазоконтрастной образ репрезентативной популяции клеток первичных сперматоцитах (красная стрелка), круглых сперматид ( зеленая стрелка), удлиняя сперматиды (оранжевая стрелка), и зрелые сперматозоиды пучки (синяя стрелка), полученные таким образом.

Фазового контраста изображения яичек может быть использован для характеристики дефектов в Drosophila сперматогенеза в результате мутаций в генах, которые имеют решающее значение для этого процесса. Круглые сперматиды имеют очень стереотипное появление, если смотреть через фазового контрастного микроскопа. Каждый из этих незрелых сперматид имеет один ПГАE-Light, круглые ядра и один, фаза-темно, вокруг митохондрий совокупность примерно того же размера (отмечен фиолетовым стрелки и стрелки, соответственно, на фиг.3С). Изменение относительных чисел или размеров этих органелл может быть результатом аномальным делений мейоза (см. обсуждение). Примером такого дефекта показано на рисунке 3D. Круглые сперматиды от взрослых мужчин с мутацией в клочья (Asun) гена содержат один большой митохондриальную агрегат и несколько небольших ядер в результате дефектов в цитокинезе и сегрегации хромосом 29.

Флуоресцентная микроскопия является еще одним мощным подход для изучения Drosophila сперматогенез. Пример флуоресцентное изображение фиксированных клеток из образца раздавленный семенников показан на рисунке 4. Семенники были получены от трансгенных мух, выражающих GFP-бета1-тубулина (продукт гена bTub56D слитый на его С-терминала конец к GFP и под контролем генов убиквитина промоутер Ubi-p63E; подарок от H. Ода и Ю. Акияма-Ода, JT Biohistory исследовательского Hall, Осака, Япония) для того, чтобы маркировать микротрубочки (зеленые на фиг.4D, оттенки серого на фиг.4А). Трансгенные яички, связывающие с использованием антитела мыши против гамма-тубулина (вторичным антителом: антимышиным Су3), чтобы отметить центросомы (красные на фиг.4D, оттенки серого на рисунке 4С) и DAPI-окрашенных по случаю ДНК (синий на рисунке 4D, оттенки серого на фиг.4В). Клетки на разных стадиях сперматогенеза можно легко определить по расположение микротрубочек, центросомах и хромосом (см. легенду).

Рисунок 1
FIGU повторно 1. Схема зародышевой линии клеточных делений в дрозофилы мужчин. Каждое подразделение стволовых клеток производит гониальных ячейку, подвергается четыре раунда митотических делений с неполной цитокинезе для получения 16-клеток кисты первичных сперматоцитах. Каждый первичный сперматоцит проходит длительное фазы роста до проходить два мейотических делени, снова с неполной цитокинеза, чтобы сформировать 32-клеток кисты взаимосвязанных вторичных сперматоцитах с последующим 64-клеточной кисты взаимосвязанных круглых сперматидах. Круглые сперматиды характеризуются наличием фазы легкого ядра и фазово-темно митохондриальной совокупности (Nebenkern) аналогичных размеров. Круглые сперматиды пройти удлинение и индивидуализацию, чтобы сформировать зрелые сперматозоиды. Зрелые головки сперматозоидов могут быть идентифицированы по их игольчатых ядер. Ядра показаны синим цветом; Nebenkerne (митохондриальные агрегаты) в черном; цитоплазма в загар./ 50981fig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2
Были выбраны рисунке 2. Репродуктивные органы дрозофилы мужчин. Молодых мужчин (0-2 дней после вылупления) для вскрытия. Легкие микрофотографии изолированных репродуктивных органов приведены в А и В с соответствующими карикатуры в А 'и В'. (А, А ') Drosophila яички (красный) удалены из брюшной полости взрослого мужского лету подключены к эякуляции протока (коричневый) с помощью семенных пузырьков (синий). Пара придаточных желез (зеленый) также прилагается к эякуляции протока. (В, В ') Яички должны быть отделены от придаточных желез бEfore скользить подготовку. До давя, разорвать яички на уровне 1 для обогащения клеток на ранних стадиях сперматогенеза; на уровне 2 для получения смешанную популяцию мейоза и пост-мейотических половых клетках, и на уровне 3 для обогащения для зрелой спермы. Шкала бар, 250 мм. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3
Рисунок 3. Фаза-контрастные изображения Drosophila яичек. (A) Обилие клеток на ранних стадиях сперматогенеза, в том числе сперматогониев (белая стрелка), ранние первичных сперматоцитах (желтая стрелка), и поздно первичных сперматоцитах (красная стрелка), как правило, освобождены когда яичко разрывается на уровне 1 (см. рисЮр 2B "). Два или несколько взаимосвязанных клетки (следствие неполного цитокинезе) часто сливаются полностью как артефакт процедуры выжимании (желтый стрелка знаменует собой слияние двух ранних сперматоцитах). (В) Сочетание сперматоцитах (красная стрелка отмечает поздно первичный сперматоцит) и пост-мейотических клеток, в том числе круглые сперматид (зеленая стрелка), удлиняя сперматид (оранжевая стрелка отмечает частичное киста), и зрелые сперматозоиды расслоений (синяя стрелка), как правило, освобождены, когда яичко разрывается на уровне 2 (см. рис 2B '). (С, D) фазового контраста изображения раздавленных яичек могут быть использованы для легко определить дефекты в изобилии и стереотипных круглых сперматид. Сперматиды дикого типа имеют одно ядро (фаза-света; отмеченный фиолетовым стрелки), прикрепленный к одной митохондриальной совокупности (фаза-темно, отмеченный фиолетовым стрелкой) из примерно одинакового размера (C). Сперматид от asunf02815яички содержать несколько небольших ядер и один большой митохондриальную агрегат в результате неудачной цитокинезе и ошибок в сегрегации хромосом (D). Шкала бар, 10 мм. Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 4
.. Рисунок 4 Люминесцентная образ Drosophila яичек Препараты раздавленных яичек, выделенные из мужчин, выражающих GFP с метками beta1-тубулина (зеленый в D, в градациях серого в А) фиксировали и окрашивали как для ДНК (DAPI, синий в D, оттенки серого в B) и центросомы (гамма-тубулина антител; красные в D, в градациях серого в C). Деления spermatoцит (белый стрелка) можно увидеть рядом с большим области круглых сперматид (белая стрелка отмечает представительные клетки) и пачкой зрелой спермы (желтая стрелка). Шкала бар, 10 мм. Щелкните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Хотя яички мух дикого типа могут быть легко идентифицированы за счет их желтого цвета (в отличие соседних белых тканей), яички белых мутантных мух белые и таким образом может иногда путать с кишечнике. Большинство трансгенных линий, которые обычно в белом фоне, также есть белые яички, потому что мини-белый ген найден в P-элементов не способствуют накоплению пигмента в яичках. Когда Drosophila яички нельзя отличить по цвету, другие легко узнаваемые черты включают их спиральный узор и вхождение в пар 12. Обратите внимание, что некоторые работники легче использовать рассечение иглы вместо щипцов, чтобы изолировать яичек 12.

Важным шагом этого протокола является подготовка раздавленных яичек. Одним из полезных подход заключается в наведении слайд несколько миллиметров над покровным содержащей яички так, чтобы поверхность теnsion из PBS на покровным поднимает крышку скольжения, содержащий ткань в сторону слайд. Этот метод, как правило, нарушить кисты и распространено клетки на слайде, что делает его идеальным для работы с изображениями отдельных клеток. С другой стороны, поддерживать весь или частичные кисты для обработки изображений, объем PBS размещены на покровным стеклом может быть увеличена (4-5 мл до 7-8 мл).

Если конкретный дрозофилы мутант интерес не доживают до взрослого возраста, то личинки или куколки яички могут альтернативно быть использованы для изучения сперматогенез. В разделе протокола, ссылки приведены для выделения pharate мужчин и личинок яичников; модификацией последнем протоколе могут быть использованы для выделения личинок яички. Этапы слезотечение, выжимании, и окрашивание личинок или куколки семенники, по существу, идентична описанной в настоящем документе для взрослых семенников. Даже если муха линии должны быть изучены может достичь зрелого возраста, изоляция личинок и куколок яичек может быть предпочтительнее, если гOAL является получение клеток на самых ранних стадиях сперматогенеза. Как описано в разделе результатов репрезентативного, клетки в ранних или поздних стадиях сперматогенеза может быть обогащен по желанию, изменяя уровень, на котором яичко растерзанного до давя.

Фазово-контрастной микроскопии предлагает относительно простой подход к изучению Drosophila сперматогенез. Одно из преимуществ фазово-контрастной микроскопии над иммуноокрашивания и флуоресцентной микроскопии является то, что меньше времени требуется для приготовления образцов. Все основные этапы сперматогенеза могут быть легко идентифицированы с помощью этой техники 24. Действительно, несколько групп использовали фазоконтрастной микроскопический анализ семенников в качестве основного экрана для характеристики фенотипы Drosophila мужской стерильностью мутантных линий 21-23. Во время мейоза подразделений, митохондрии и хромосомы одинаково распределяют дочерним клеткам. Уникальной особенностью сперматогенеза у Drosophilи другие насекомые включает формирование митохондрий совокупности (Nebenkern) в круглых сперматид 24. Круглые сперматиды содержать Nebenkern поэтапного темно и фазовый света ядро примерно одинакового размера в соотношении 1:1 (рис. 3). Диаметр ядра отражает содержание ДНК круглых сперматид, поэтому ошибки в сегрегации хромосом во время мейоза может привести к изменчивости в ядерной размера 33. Нарушение мейоза цитокинезе следующие результаты сегрегации хромосом в многоядерных круглых сперматид в которой предохранитель Nebenkerne в единый совокупный 34. Таким образом, любое изменение в соотношении 1:1 или в размере или форме Nebenkern и ядра в круглых сперматидах можно легко обнаружить с помощью фазово-контрастной микроскопии живых яичек и часто диагностики дефектов мейоза. Слияние двух или более взаимосвязанных элементов в рамках общей кисты часто происходит как артефакт процедуры выжимании (фиг.3А, Желтый наконечник стрелы); отношение ядер к Nebenkerne 1:1, однако, по-прежнему поддерживается.

Иммуноокрашивание основных препаратов Drosophila яичек может быть выполнена на сцене клеток, подвергающихся сперматогенез, а также для оценки паттерны экспрессии и субклеточных локализации белков, представляющих интерес. Уточненная схема классификации этапы Drosophila сперматогенеза, основанные на клеточной морфологии, организации хроматина и микротрубочек механизмов клеток семенников иммунному окрашиванию для тубулина и ДНК-окрашенных была описана 19. Drosophila сперматоциты относительно крупные клетки, и мейоза шпинделя может быть четко наблюдается при использовании этого подхода. Coimmunostaining для центросомах (например, с использованием антител против гамма-тубулина) могут быть выполнены, чтобы получить более точное представление о структуре мейоза шпинделя. Формальдегид является подходящим, когда фиксатор иммунного окрашивания яички с широким диапазоном antibodх годов (например, анти-ламин и анти-динеин тяжелой цепи). Морфология микротрубочек и центросомах, однако, лучше сохраняются с метанолом, следовательно, метанол обычно используется в качестве фиксатора при выполнении иммунного окрашивания с антителами против альфа-тубулина и гамма-тубулина.

Если антитела против белка, представляющего интерес недоступны, трансгенные дрозофилы линии, экспрессирующие флуоресцентно меченый (например. MCherry или GFP) версию белка могут быть получены в качестве альтернативного подхода. Внутриклеточной локализации белка может быть определена с помощью микроскопа, чтобы просмотреть флуоресценции GFP в живых или фиксированных препаратов ткани; альтернативно, анти-GFP антитела могут быть использованы для обнаружения слитый белок в фиксированных образцов. На фиг.4 микротрубочки в препарате фиксированных семенников были визуализированы с помощью собственной флуоресценции GFP с метками бета1-тубулина (выраженного от трансгена под управлением шарсоюзником выразил убиквитин промотор). Кроме того, трансгенные мухи, в котором выражение под контролем ткане-специфическим промотором, например, промотор гена бета-2-тубулина были использованы для семенников-специфической экспрессии 35. Альтернативно, экспрессия белка интереса может быть ограничена конкретными мужских половых клетках с использованием системы UAS-Gal4 36. Наночастицы-Gal4 могут быть использованы для индукции экспрессии белка под контролем промотора в UAS в сперматогониальных клеток, в то время как бац-Gal4 может использоваться, чтобы вызвать свое выражение в сперматоцитах 37. Нокдаун белка интереса также может быть индуцирован в семенниках по выражения шпильки конструкцию RNAi под контролем на UAS промотора в комбинации с этих драйверов Gal4 37.

Развитие методов анализа проживанию изображения дрозофилы яичек клеток расширил круг вопросов, которые могут бытьрешить с помощью этой системы. События мейоза цитокинезе могут быть визуализированы фазово-контрастной микроскопии сперматоцитов культивировали в сгустков фибрина внутри камеры перфузии для того, чтобы продлить жизнь клеток 35. Покадровый конфокальной микроскопии Drosophila сперматоцитах выражающих дневно с тегом белки также был мощный подход (например, для изучения мейоза сборку шпинделя) 38. Использование конфокальной микроскопии для живых изображений более ранней стадии, разделительные зародышевой линии стволовых клеток из яичек дрозофилы, привело к более глубокому пониманию регулирования стволовых клеток. В дополнение к фазоконтрастных и иммунофлюоресценции микроскопии подходов, представленных здесь, просвечивающей электронной микроскопии также широко используется для изучения Drosophila сперматогенез 31.

В дополнение к визуализации, Drosophila яички могут быть использованы в качестве источника материала для биохимического анас. Для иммуноблоттинга экспериментов, рассеченные летать яички могут гомогенизироваться в 6x буфера для образца (5 мл / яички пары), вареные, и непосредственно наносили на гель SDS-PAGE (~ 4 яички пар / пер). Например, этот подход был использован для оценки уровней компонентов динеин-dynactin в семенниках нескольких мутантов дрозофилы. Семенники экстракты альтернативно могут быть получены путем гомогенизации ткани в неденатурирующих буфере для лизиса, если важно сохранить целостность белка. Например, Drosophila семенников экстракты были использованы в коиммунопреципитации подтверждено экспериментами, чтобы продемонстрировать наличие стабильных белковых комплексов в этой ткани 41-43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Майкла Андерсона для установления в лаборатории Ли эти принятые методы изучения сперматогенез с экспертным советом из Карен Хейлзом. Х. Ода и Y. Акияма-Ода любезно предоставили γ-тубулина-GFP летать запас. Эта работа была поддержана грантом NIH R01 в LAL (GM074044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).

Tags

Основной протокол выпуск 83, Рассечение яички сперматогенез мейоза половые клетки фазово-контрастной микроскопии иммунофлюоресценции
Цитологического анализа сперматогенеза: Живые и Исправлены Препараты<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Семенники
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee,… More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter