Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Cytologisk analys av Spermatogenesen: Live och fasta Beredningar av Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/51058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Metoder för att isolera och förbereda Drosophila testiklar prover (levande och fast) för avbildning av fas-kontrast och fluorescensmikroskopi beskrivs här.

Abstract

Drosophila melanogaster är en kraftfull modellsystem som har använts i stor omfattning för att belysa en mängd olika biologiska processer. Till exempel har studier av både kvinnliga och manliga könslinjer Drosophila hög grad bidragit till den nuvarande förståelsen av meios och stamcellsbiologi. Utmärkt protokoll finns tillgängliga i litteraturen för isolering och avbildning av Drosophila äggstockar och testiklar 3-12. Häri finns metoder för dissekering och beredning av Drosophila testiklar för mikroskopisk analys beskrivs med en medföljande video demonstration. Ett protokoll för att isolera testiklar från buken av vuxna män och förbereda diabilder av levande vävnad för analys av fas-kontrast mikroskopi samt ett protokoll för fixering och immunfärgning testiklar för analys av fluorescensmikroskopi presenteras. Dessa tekniker kan användas i karaktäriseringen av Drosophila mutanter som uppvisar defects i spermatogenes liksom i visualiseringen av subcellulära lokaliseringar av proteiner.

Introduction

Drosophila testiklar är ett perfekt modellsystem för studier av många biologiska processer, inklusive regleringen av stamceller, meios och spermier utveckling 13-18. De spermatocyter och deras meiotiska spindlarna är stora och därmed bekvämt för cytologisk analys och avslappnade cellcykelkontrollpunkter under spermatogenes lätta studier av mutationer i cellcykelgener. Olika celltyper kan observeras i beställas progression längs testiklarna, och eventuella störningar i spermatogenesen kan leda till förändringar i denna övergripande överenskommelse. Dessa egenskaper i kombination med Drosophila genetiska verktyg har underlättat mutationsanalys av spermatogenes 21-23.

Stegen i Drosophila spermatogenes har väl definierade. Nedärvda celler som utvecklas synkront inom cystor utvecklas sekventiellt genom de olika stadierna av spermatogenes längs längden av testiklarna. Under both den mitotiska och meiotiska divisioner av de manliga könsceller, sker cytokines ofullständigt så att dottercellerna förbli anslutna genom cytoplasma broar kallas ring kanaler (figur 1). Den apikala spetsen av testikel innehåller en population av nedärvda stamceller som ger upphov till spermatogoniala celler, som undergår fyra mitotiska delningar med ofullständig cytokines för att generera 16-cell-cystor av primära spermatocyter. Efter premeiotic S-fasen, primära spermatocyter anger G2, en längre tillväxtperiod på ~ 90 timmar, under vilken cellvolymökningar ~ 25-faldigt. Progression genom meios I och meios II resulterar i bildning av 32-cell cystor av sekundära spermatocyter och 64-cell-cystor av haploida spermatider resp. De omogna, runda spermatider genomgår omfattande cellulära ombyggnad för att bilda mogna spermier. Post-meiotiska celler, särskilt buntar av förlängning och mogna spermatider, upptar en stor del av volymen av testiklarna.

Than framgångsrik transport av funktionell sperma till kvinnliga flugor kräver samordning mellan de olika delarna av det manliga reproduktiva systemet, som består av flera ihopkopplade strukturer (testiklarna, sädesblåsorna och tillbehör körtlar) och en enda ejakulation kanal (figur 2). Spermier produceras i testiklarna och lagras i sädesblåsorna tills parning 24. Tillbehörs körtlar innehåller sekretoriska celler som producerar sädesvätska. Spermierna migrerar från sädesblåsorna blandas med sädesvätska inom ejakulation kanal som är ansluten till båda sädesblåsorna och de accessoriska körtlarna. Denna blandning av sperma och sädesvätska slutligen pumpas ut av den manliga i vagina av den kvinnliga flyga genom ejakulation glödlampa placerad vid den bakre änden av den manliga buken 25. Proteiner i sädesvätskan är avgörande för långvarig lagring av sperma inom specialiserade organ som kallas spermathecae i reproductive kanalen hos Drosophila honor 26.

Utmärkta metoder för isolering av Drosophila testiklar och visualisering av celler i olika stadier av spermatogenesen finns i den vetenskapliga litteraturen 3-12. Vi lägger här till denna samlade kunskap genom att presentera exempel på dessa protokoll med en medföljande video demonstration. Protokollet för framställning av levande testiklar prover för faskontrastmikroskopi är baserad på en tidigare beskriven metod 27. Protokollet för formaldehydfixering och immunfärgning av testiklarna är också baserad på en tidigare beskriven metod 28. De metoder som beskrivs här har använts i många studier av Drosophila spermatogenesen (t.ex. för att bedöma de roller dynein, ett minus-end-riktad mikrotubuli motor, under Drosophila spermatogenesen).

Förutom de grundläggande protokollen ges förslag anges varying dissektion för att berika för spermatogonier, spermatocyter eller mogna spermier. Olika metoder för behandling av testiklarna sådana att cystor antingen förbli intakt eller störs behov beskrivs. En fördel med att använda Drosophila testiklar som ett modellsystem är att, jämfört med Drosophila-oocyter och embryon kan antikroppar och färgämnen lätt penetrera celler efter att de är spridda från testiklarna, och färre tvättsteg erfordras, och därför kan protokollen utföras i en relativt kort tid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Testiklar Dissection

  1. Söva flugor i en flaska eller ampull med hjälp av en ström av CO2 och överför till en fluga dyna.
  2. Sortera flugor under ett dissektionsmikroskop med användning av en liten målarpensel, och samla in ett lämpligt antal (beroende på provet) av Drosophila hanar av de önskade genotyper. Unga män (0-2 dagar gamla) är idealiska för att undersöka celler under tidigare stadier av spermatogenesen (t.ex. spermatogonier, spermatocyter, och tidiga post meiotiska spermatider), medan lite äldre män (2-5 dagar gamla) är idealiska för att undersöka celler i slutskedet av spermatogenesen (särskilt mogna spermier).
  3. Använd pincett för att ta bort vingarna från varje flyga (för att hindra flugorna från flytande i vätska under dissektion).
  4. Lägg till ~ 500 ml fosfatbuffrad saltlösning (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4, PBS) i en droppe till ett silikonbelagt dissektion skålen påen svart bakgrund. Andra vattenlösningar har med framgång använts för testiklar dissektion 3.
  5. Point pincett mot den främre av flugan, ta tag i den genom bröstkorgen, och doppa den i PBS-drop. Medan du tittar igenom dissekera mikroskop, använder en annan pincett för att ta tag och dra i yttre könsorganen (mörkbrun struktur som ligger vid den bakre änden av den ventrala delen av buken) posteriort tills den lossnar från buken. I de flesta fall kommer testiklarna, sädesblåsorna och tillbehör körteln tas bort från buken tillsammans med de yttre könsorganen, om inte, sätt in en pincett i buken och locka fram testiklarna.
  6. Separata testiklar från tillbehörs körtel och yttre könsorganen med hjälp av två par pincett i PBS-drop (Figur 2). Vildtyp testiklar är lätt skiljas från angränsande vita vävnader genom sin gula färg. Omedelbart gå till steg 2.
  7. För att isolera testiklar från pharate män (i.. E innesluten i PUPP fallet), måste ett ytterligare steg först genomföras som innebär att ta bort flugan från PUPP fallet, detta steg har tidigare beskrivits på annan plats 31. Fortsätt med dissekering som för de vuxna testiklarna börjar vid steg 1.2.
  8. För att isolera testiklar från larv män, utför en ändring av ett protokoll för att isolera Drosophila larver äggstockar 32. I korthet kan man larver skiljas från kvinnliga larver genom närvaron av ett par stora, tydliga, ovala strukturer (larver testiklar) inbäddade i den bakre tredjedelen av fettet kroppen. För att isolera larv testiklar, delvis flay öppna manliga larv att isolera testiklarna och det omgivande fettet kroppen från buken, såsom beskrivits för isolering av larv äggstockar. Omedelbart gå till steg 2 i det protokoll som beskrivs häri, testiklarna kan senare tas bort från fett kroppen strax före montering (steg 2.3 eller 3.14) som beskrivs för äggstockarna 32.

  1. Använd en pincett för att försiktigt placera 2-3 par testiklar i en droppe av 4-5 ml PBS på en fyrkantig glaskupa halka. Notera att förhållandet mellan testiklarna nummer till PBS-volymen kan behöva justeras: för mycket vätska kommer att förhindra celler från att sprida sig ordentligt när hoptryckt, medan för lite vätska kommer att få cellerna att brista när hoptryckt. Tillval: Använd silikontäckglas för att minimera vidhäftning av vävnad för att täcka slip i steg 3.2.
  2. Använd en pincett för att riva upp varje testikel vid ett lämpligt läge för att maximera närvaron av de önskade typerna könsceller cell i beredningen (observera att innehållet i testiklarna kommer mestadels utträde ur härjade området på bilden under kross steg.) Att berika för spermatogonier och spermatocyter, riva öppna testiklarna intill dess apikala spets (nivå 1, figur 2B). Att berika för spermatocyter och spermatider, riva öppna testiklarna på en posUtgåva något basal till nivå 1 (nivå 2, figur 2B). För att anrika för mer mogna könsceller celler, slita upp testis närmare där krökningen börjar (nivå 3, Figur 2B).
  3. Placera försiktigt ett glas objektglas under täckglas att squash testiklarna, inte utöva påtryckningar manuellt som vikten av enbart täckglas är tillräcklig för att få en korrekt hoptryckt prov. Försök att undvika att droppa luftbubblor. Tillval: Använd poly-L-lysin belagda objektglas för att främja vidhäftning av vävnad för att glida i steg 3.2.
  4. Använd förberedelser omedelbart (helst inom 15 minuter efter framställningen) att observera levande celler genom faskontrastmikroskopi, för transgena flugor med uttryck av fluorescerande taggade proteiner i testiklarna, kan levande celler undersökas genom fluorescensmikroskopi i detta steg. Alternativt, fortsätt med fixering och antikroppar färgning (protokoll 3).
  5. Försiktigt veke överflödig vätska från under täckglaset med en rengörings wIPE för att möjliggöra tillplattning av preparatet tills könscellerna är tydligt i fokus.

3. Formaldehyd Fixering och antikroppar färgning

  1. Snap frysa varje bild innehåller klämd testiklar (från protokoll nr 2) med hjälp av ett par metalltänger för att fördjupa det kort i flytande kväve (tills flytande kväve stannar bubblande).
  2. Ta av locket glida omedelbart med hjälp av ett rakblad.
  3. Använd metall tång för att överföra bilder till en förkyld glasskiva rack fyllda med iskall 95% etanol (spektrofotometrisk kvalitet, metanolfritt). Lagra vid -20 ° C under 10 min.
  4. Använd metall tång för att överföra bilder till en glasskiva rack fylld med 4% formaldehyd i PBS plus 0,1% Triton X-100 (PBS-T). Förvara i rumstemperatur i 7 min.
  5. Använd metall tång för att överföra bilder till en glasskiva rack fylld med PBS. Tvätta objektglasen i PBS under 5 min vid rumstemperatur. Upprepa 1x. Utför alla tvättar genom att kasta lösningen i glasskiva rack (
  6. Kassera PBS och doppa glasen i PBS-T under 30 minuter vid rumstemperatur för att permeabilisera cellmembranen.
  7. Tvätta objektglasen i PBS under 5 min vid rumstemperatur. Upprepa 2x.
  8. Blockering steg (tillval): Sänk ned objektglasen i PBS plus 1% BSA i 45 minuter vid rumstemperatur.
  9. Använd en hydrofob barriär penna för att rita en cirkel på bilden runt klämd vävnad (väl synlig med ögat) för att begränsa de lösningar antikropp (tillsätts i steg 3.9 och 3.11). Vävnaden bör hållas fuktig hela tiden när de utför immunfärgning.
  10. Lägg 30-40 ml primär antikropp (utspädd i PBS-T, 1:400 till 1:50, beroende på antikropp) till vävnad inom cirkeln. Om blockering utfördes, utspädd primär antikropp i PBS-T plus 1% BSA. Anti-gamma-tubulin-antikropp (för färgning av centrosomes i figur 4) späddes 1:100. Inkubera i en fuktig, mörk kammare (t ex. Sluten plastlådamed fuktiga pappershanddukar) under 2 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
  11. Tvätta objektglasen i PBS under 5 min vid rumstemperatur 3x. Om blockering utfördes, tvätta två gånger i PBS-T och en gång i PBS (5 min vid rumstemperatur vardera).
  12. Lägg till från 30 till 40 ml av fluorofor-konjugerad sekundär antikropp (spädd 1:400 i PBS) till vävnaden och inkubera i mörker i 1-2 timmar vid rumstemperatur.
  13. Tvätta objektglasen i PBS under 5 min vid rumstemperatur. Upprepa 2x.
  14. Lägg 30-40 ml DAPI-lösning (0,2 mg / ml i PBS) till vävnaden inom cirkeln.
  15. Placera försiktigt en glaskupa halka över vävnaden, var noga med att undvika att droppa luftbubblor. Om luftbubblor ska visas, försiktigt röra locket glida utan att förstöra squash tills bubblorna fly från sidorna av täckglaset.
  16. Använd en rengöring torka för att utplåna överskottet DAPI från kanterna på bilden.
  17. Täta täckglas till bilden med hjälp av genomskinligt nagellack.
  18. Använd denna beredninginom de närmaste 3-4 timmar för att visa immunceller genom fluorescensmikroskopi. För långsiktig lagring av bilder (upp till åtminstone flera veckor), använd en glycerolbaserad hård montera media med DAPI, och lagra glider vid -20 ˚ C.
  19. Alternativt fixera proverna i metanol istället för formaldehyd (beroende på antigenet). Efter att ha avslutat hela protokollet till steg 3.2, sänk diabilder av squashed testiklar i metanol i 10 min vid -20 ° C och fortsätt med steg 3.5 och framåt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett exempel på ett korrekt dissekerades par Drosophila manliga reproduktionsorgan visas i fig. 2A. Testiklar avlägsnades från buken av den vuxna manliga flugan är vanligtvis fäst vid ejakulation kanalen (brun, figur 2A) och ett par av accessoriska körtlarna (grön, figur 2A) via ett par sädesblåsor (blå, figur 2A) . För att separera testiklarna från de flesta av den åtföljande somatisk vävnad, ejaculatorius kanalen och de accessoriska körtlarna bör tas bort och kasseras, så att endast det testiklarna paret och sädesblåsorna kvar (fig. 2B och 2B). Sädesblåsorna kan också tas bort, vilket innebär att endast den testiklarna paret som ska bearbetas vidare.

Åldern hos vuxna män som valts ut för testiklar dissektion är ett viktigt övervägande. Hos unga män (0-2 dagar efter eclosion), sädesblåsorna är småoch nästan tom, och testiklarna är vid sin maximala diameter (såsom i figur 2). Med hjälp av yngre män ger ett relativt stort antal delar sig könsceller celler (som genomgår antingen mitos eller meios) och tidiga post meiotiska spermatider. När äldre män (3-5 dagar efter eclosion) används för dissektion (bild visas ej), sädesblåsorna är mer framträdande eftersom de utbuktande med sperma, och testiklarna är smalare än hos yngre män. Äldre män är att föredra om målet är att visualisera mogna spermier.

På grund av den beställda utvecklingen av utvecklingsmässiga händelser längs Drosophila testiklar, kan könsceller celler vid specifika stadier av spermatogenesen berikas utifrån den position där dissekerade testiklar slits innan squash. Till exempel, riva upp testiklarna nära dess apikala spets (nivå 1, figur 2B ') ger ett överflöd av celler i tidiga stadier av spermatogenesen figur. 3A visar en fas-kontrast bild av en representativ population av spermatogonier (vit pil), tidiga primära spermatocyter (gul pil), och sena primära spermatocyter (röd pil) som erhållits på detta sätt. Alternativt kan riva upp testiklarna på en något mer basal läge (nivå 2, figur 2B) ger främst spermatocyter och spermatider. Figur 3B visar en fas-kontrast bild av en representativ cellpopulation av primära spermatocyter (röd pil), runda spermatider ( grön pil), förlängning spermatider (orange pil) och mogna spermier buntar (blå pil) som erhållits på detta sätt.

Fas-kontrast avbildning av testiklar kan användas för att karakterisera defekter i Drosophila spermatogenes följd av mutationer i gener som är kritiska för denna process. De runda spermatider har en väldigt stereotypa utseende när de betraktas genom ett faskontrastmikroskop. Var och en av dessa omogna spermatider har en enda, PHAe-ljus, rund kärna och en enda, fas-mörk, rund mitokondrie aggregat av ungefär samma storlek (markerad med lila pilspets och pil, respektive, i figur 3C). Variationen i den relativa antal eller storlekar av dessa organeller kan bero på avvikande meiotiska divisioner (se diskussion). Ett exempel på en sådan defekt är visad i fig. 3D. Runda spermatider från vuxna män med mutation av sönder (Asun)-genen innehåller en enda stor mitochondrial aggregat och multipla små kärnor som ett resultat av defekter i cytokines och kromosomsegregation 29.

Fluorescensmikroskopi är en annan kraftfull metod för att studera Drosophila spermatogenesen. Ett exempel på en fluorescerande bild av fixerade celler från en hoptryckt testes prov visas i Figur 4. Testiklar erhölls från transgena flugor som uttrycker GFP-beta1-tubulin (produkt av bTub56D genen smält vid sin C-terPol slut på GFP och under kontroll av Ubi-p63E ubiquitin genpromotom, gåva från H. Oda och Y. Akiyama-Oda, JT Biohistory Research Hall, Osaka, Japan) för att märka mikrotubuli (gröna i figur 4D, gråskala i Figur 4A). De transgena testiklar immunfärgades med hjälp av en mus-antikropp mot gamma-tubulin (sekundär antikropp: anti-mus Cy3) för att markera centrosomes (röda i figur 4D, gråskala i Figur 4C) och DAPI-färgade för att markera DNA (blå i Figur 4D, gråskala i figur 4B). Celler i olika stadier av spermatogenesen kan lätt identifieras genom att undersöka arrangemanget av mikrotubuli, centrosomes och kromosomer (se förklaring).

Figur 1
Figu re 1. Schematisk bild av könsceller celldelningar i Drosophila män. Varje stamcells Divisionen tillverkar en gonial cell som genomgår fyra rundor av mitotiska divisioner med ofullständig cytokines för att producera en 16-cell cysta av primära spermatocyter. Varje primär spermatocyte undergår en långvarig tillväxtfasen innan de genomgått de två meiotiska delningar, återigen med ofullständig cytokines, för att bilda en 32-cell-cysta av sammankopplade sekundära spermatocyter följt av en 64-cell-cysta av förbundna runda spermatider. Runda spermatider kännetecknas av närvaron av en fas-ljus kärna och en fas-mörk mitokondriell aggregat (det Nebenkern) av liknande storlek. De runda spermatider genomgå töjning och individualisering för att bilda den mogna spermier. Mogna spermiehuvuden kan identifieras genom sina nålformade kärnor. Kärnor visas i blått, Nebenkerne (mitokondriella aggregat) i svart, cytoplasman i solbränna./ 50981fig1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2
Figur 2. Reproduktionsorganen hos Drosophila hanar. Yngre vuxna män (0-2 dagar efter eclosion) valdes ut för dissekering. Ljusmikrofotografier av isolerade fortplantningsorgan visas i A och B med motsvarande karikatyrerna i A 'och B'. (A, A ') Drosophila testiklar (rött) som avlägsnas från buken hos en vuxen man flugan är anslutna till utlösningskanal (brun) via sädesblåsorna (blå). Ett par tillbehör körtlar (grön) är anslutet till ejaculatory kanalen. (B, B ') Testiklarna bör separeras från tillbehörs körtlar böre glida förberedelser. Innan squashing, riva upp testiklarna på nivå 1 att anrika celler vid tidiga stadier av spermatogenesen, på nivå 2 för att få en blandad befolkning på meiotisk och post meiotiska könsceller celler, och på nivå 3 för att berika för mogna spermier. Skala bar, 250 mm. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3
Figur 3. Fas-kontrast i Drosophila testiklar. (A) Ett överflöd av celler vid tidiga stadier av spermatogenesen, inklusive spermatogonier (vit pil), tidiga primära spermatocyter (gul pil), och sena primära spermatocyter (röd pil) vanligtvis frigörs när testiklarna slits på nivå 1 (se figurure 2B). Två eller flera förbundna celler (en konsekvens av ofullständig cytokines) smälter ofta fullständigt som en artefakt av krossförfarandet (gul pilspets markerar en fusion av två tidiga spermatocyter). (B) En kombination av spermatocyter (röd pil markerar slutet primära spermatocyte) och post-meiotiska celler, inklusive runda spermatider (grön pil), som sträcker spermatider (orange pil markerar partiell cysta) och mogna spermier buntar (blå pil), är vanligtvis frigöras när testis rivs på nivå 2 (se figur 2B). (C, D) fas-kontrast avbildning av squashed testiklar kan användas för att lätt identifiera brister i den rikliga och stereotypa runda spermatider. Vildtyp spermatider har en kärna (fas-ljus, markerad med lila pilspets) fäst vid ett enda mitokondrie aggregat (fas-dark, markerad med lila pil) för ungefär lika stora (C). Spermatider från asunf02815Testiklarna innehåller många små kärnor och en stor mitokondrie aggregat till följd av misslyckade cytokines och fel i kromosomsegregering (D). Skala bar, 10 mm. Klicka här för att visa en större bild.

Figur 4
.. Figur 4 Fluorescerande bild av Drosophila testiklar Beredningar av squashed testiklar isolerade från män som uttrycker GFP-märkta beta1-tubulin (grön i D, gråskala i A) fixerades och färgades för både DNA (DAPI, blått i D, gråskala i B) och centrosomes (gamma-tubulin antikropp, röd i D, gråskala i C). En uppdelning spermatocyte (vit pilspets) syns bredvid ett stort fält av runda spermatider (vit pil markerar en representativa celler) och en bunt mogen sperma (gul pil). Skala bar, 10 mm. Klicka här för att visa en större bild.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om testiklarna av vildtyp flugor kan lätt identifieras på grund av sin gula färg (i kontrast grann vita vävnader), testiklarna av vita muterade flugor är vita och därför kan ibland förväxlas med tarmen. De flesta transgena stammar, som vanligtvis är i en vit bakgrund, har också vita testiklar eftersom mini-vita gen som finns i P-element inte främjar pigment ackumulering i testiklarna. När Drosophila testiklar inte kan särskiljas genom färg, andra lätt igenkännbara funktioner inkluderar deras spiralmönster och förekomst i par 12. Observera att vissa arbetare har lättare att använda dissektion nålar istället för pincett för att isolera testiklarna 12.

Ett kritiskt steg i detta protokoll är att förbereda de squashed testiklar. En användbar metod är att sväva bilden några millimeter över täckglas som innehåller testiklarna så att ytan tension av PBS på locket glida lyfter upp locket glida med vävnaden mot bilden. Denna metod tenderar att störa cystor och utspridda celler i bilden, vilket gör den idealisk för att avbilda enskilda celler. Alternativt att behålla hela eller en del cystor för avbildning, volymen av PBS placeras på täckglas kan ökas (4-5 ml till 7-8 ml).

Om en viss Drosophila mutant av intresse inte överlever till vuxen ålder, då larver eller PUPP testiklar kan alternativt användas för att studera spermatogenes. I protokollet avsnittet finns referenser ges för isolering av pharate män och larver äggstockar, en modifiering av det senare protokollet kan användas för att isolera larver testiklar. Stegen för att riva sönder, krossa, och färgning larver eller PUPP testiklarna är i huvudsak identisk med den som beskrivs häri för de vuxna testiklarna. Även om linan som ska studeras kan nå vuxen ålder, kan isolering av larver eller PUPP testiklarna vara att föredra om gOAL är att få cellerna i de tidigaste stadierna av spermatogenesen. Som beskrivs i resultat avsnittet representant, kan celler i tidiga eller sena stadier av spermatogenesen berikas enligt önskemål genom att variera den nivå där testiklarna rivs innan squash.

Faskontrastmikroskopi erbjuder en relativt enkel metod för att studera Drosophila spermatogenesen. En fördel med faskontrastmikroskopi över immunfärgning och fluorescerande mikroskopi är att mindre tid krävs för att bereda proverna. Alla de viktigaste stegen i spermatogenesen kan lätt identifieras med hjälp av denna teknik 24. I själva verket har flera grupper använt fas-kontrast mikroskopisk analys av testiklar som primär skärm för att karakterisera de fenotyper av Drosophila hansterila muterade linjerna 21-23. Under meiotiska divisioner, är mitokondrierna och kromosomer lika partitionerad till dottercellerna. Unikt för spermatogenesen i Drosophila och andra insekter innebär bildandet av en mitokondriell aggregat (det Nebenkern) i runda spermatider 24. Runda spermatider innehåller en fas-mörk Nebenkern och en fas-ljus kärna av ungefär samma storlek i förhållandet 1:1 (Figur 3). Diametern hos kärnan reflekterar DNA-innehållet i de runda spermatider, så att fel i kromosomsegregation under meios kan leda till variabilitet i nukleär storlek 33. Störningar av meiotisk cytokines efter kromosom segregering leder flerkärniga runda spermatider där Nebenkerne säkringen till en enda samlings 34. Därför kan någon variation i förhållandet 1:1 eller i storlek eller form av Nebenkern och kärnan i runda spermatider lätt upptäckas genom faskontrastmikroskopi av levande testiklar och är ofta diagnostik av defekter i meios. Fusion av två eller flera förbundna celler inom en gemensam cysta uppstår ofta som en artefakt av den krossförfarandet (figur 3A, Gul pilspets); den 01:01-förhållande av kärnor till Nebenkerne emellertid fortfarande upprätthålls.

Immunfärgning av fasta beredningar av Drosophila testiklar kan utföras för att iscensätta celler genomgår spermatogenes liksom att utvärdera uttrycksmönster och subcellulära lokaliseringar av proteiner av intresse. En raffinerad system för att klassificera de olika stadierna i Drosophila spermatogenes baserade på cellulär morfologi, kromatin organisation, och mikrotubuli arrangemang av testikelceller immunostained till tubulin och DNA-färgade har beskrivits 19. Drosophila primära spermatocyter är relativt stora celler, och de meiotiska spindlarna kan tydligt observeras med hjälp av denna metod. Coimmunostaining för centrosomes (till exempel med användning av antikroppar mot gamma-tubulin) kan utföras för att erhålla en mera exakt bild av den meiotiska spindelstrukturen. Formaldehyd är ett lämpligt fixativ när immunofärgning testes med ett brett spektrum av Antibodies (till exempel anti-lamin och anti dynein tunga kedjan). Morfologin hos mikrotubuli och centrosomes är emellertid bättre bevarad med metanol, och därför är metanol normalt används som fixativ vid utförande av immunfärgning med antikroppar mot alfa-tubulin och gamma-tubulin.

Om antikroppar mot ett protein av intresse är tillgänglig, kan transgena Drosophila-linjer som uttrycker en fluorescensmärkta (t ex. MCherry eller GFP) version av proteinet genereras som ett alternativt tillvägagångssätt. Den subcellulära lokaliseringen av proteinet kan sedan bestämmas genom att använda ett mikroskop för att se GFP-fluorescens i levande eller fixerade preparat av vävnad, alternativt kan anti-GFP-antikroppar användas för att detektera fusionsproteinet i fasta prover. I fig 4, var mikrotubuli i ett fast testiklar beredning visualiseras via den inre fluorescens av GFP-tagged beta1-tubulin (uttryckt från en transgen under kontroll av en globbundsförvant uttryckt ubikitinpromotor). Alternativt kan transgena flugor där uttryck är under kontroll av en vävnadsspecifik promotor, till exempel, har promotorn av beta2-tubulin gen använts för testiklar-specifika uttryck 35. Alternativt kan uttrycket av ett protein av intresse att begränsas till specifika manliga könsceller celler genom användning av UAS-Gal4-systemet 36. Nano-Gal4 kan användas för att inducera expression av ett protein under kontroll av en UAS promotor inom spermatogoniala celler, medan bam-Gal4 kan användas för att inducera dess uttryck inom spermatocyter 37. Knockdown av ett protein av intresse kan också induceras i testiklarna genom att uttrycka en RNAi hårnål konstrukt under kontroll av en UAS-promotorn tillsammans med dessa Gal4 förare 37.

Utveckling av metoder för levande bildanalys av Drosophila testiklar celler har utökat utbudet av frågor som kan varaadresseras med hjälp av detta system. Händelserna meiotisk cytokines kan visualiseras genom faskontrastmikroskopi av spermatocyter odlas i fibrinkoagel inuti en perfusion kammare för att förlänga livslängden på cellerna 35. Time-lapse konfokalmikroskopi av Drosophila spermatocyter uttrycker fluorescerande taggade proteiner har också varit en kraftfull metod (till exempel för att studera meiotisk spindelenhet) 38. Användningen av konfokalmikroskopi för live-avbildning av ett tidigare skede, skilje nedärvda stamceller från Drosophila testiklar, har lett till en ökad förståelse för stamcellsreglering. Utöver de fas-kontrast och immunofluorescensmikroskopi metoder som presenteras här, har transmissionselektronmikroskop också använts i stor utsträckning för att studera Drosophila spermatogenes 31.

Förutom avbildning, kan Drosophila testiklar användas som en källa för material för biokemiska analysier. För immunblot experiment, kan dissekerade flyga testiklar homogeniseras i 6x provbuffert (5 ml / testiklar par), kokt, och direkt lastas på en SDS-PAGE-gel (~ 4 testiklar par / bana). Exempelvis har detta tillvägagångssätt använts för att bedöma nivåerna av dynein-dynactin komponenter i testiklarna av flera Drosophila mutanter. Testiklar extrakten kan alternativt framställas genom homogenisering av vävnaden i nondenaturing lysbuffert om det är viktigt att upprätthålla proteinintegritet. T.ex. Drosophila testiklar extrakt har använts i coimmunoprecipitation experiment för att visa närvaron av stabila protein-komplex i denna vävnad 41-43.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Michael Anderson för att fastställa i Lee labbet dessa vedertagna metoder för att studera spermatogenes med expertråd från Karen Hales. H. Oda och Y. Akiyama-Oda generöst under förutsättning att γ-tubulin-GFP flyga lager. Detta arbete stöddes av en NIH R01 bidrag till LAL (GM074044).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).

Tags

Grundprotokollet , Dissektion testiklar spermatogenes meios könsceller faskontrastmikroskopi immunofluorescens
Cytologisk analys av Spermatogenesen: Live och fasta Beredningar av<em&gt; Drosophila</em&gt; Testiklar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee,… More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter