Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar Published: January 20, 2014 doi: 10.3791/51058
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University Medical Center

Summary

Izole edilmesi ve faz kontrast ve floresan mikroskobu ile görüntüleme için Drosophila testis örnekleri (canlı ve sabit) hazırlanması için yöntemler burada tarif edilmiştir.

Abstract

Drosophila melanogaster yaygın olarak biyolojik süreçlerin çeşitli aydınlatmak için kullanılmış olan güçlü bir model sistem. Örneğin, kadın ve Drosophila erkek germ hatlarının hem de çalışmaları mevcut mayoz anlayış yanı sıra kök hücre biyolojisi büyük ölçüde katkıda bulunmuştur. Mükemmel protokolleri Drosophila yumurtalık ve testis 3-12 izolasyonu ve görüntüleme için literatürde mevcuttur. Burada, mikroskobik analiz için diseksiyon ve Drosophila testis hazırlanması için yöntemler, eşlik eden bir video gösterimi ile tarif edilmiştir. Yetişkin erkeklerin karından testisler izole edilmesi ve faz kontrast mikroskopisi ile analiz hem de floresan mikroskobu ile analiz için sabitleme testisler ve immünboyama için bir protokol için canlı doku slaytlar hazırlanması için bir protokol sunulmaktadır. Bu teknikler, d gösteren Drosophila mutantlar karakterizasyonunda uygulanabilirspermatogenezde yanı sıra, proteinlerin hücre içi yerleşimlerin görselleştirme efects.

Introduction

Drosophila testis kök hücrelerin düzenlenmesi, mayoz, ve sperm gelişimi 13-18 dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçlerin çalışma için ideal bir model sistem. Spermatosit ve öz değişmesine ait iğ büyük ve sitolojik analiz için bu nedenle uygun olan ve spermatogenez sırasında rahat bir hücre döngüsü kontrol noktası hücre döngüsü genlerdeki mutasyonların çalışma kolaylaştırır. Farklı hücre tipleri testislerin uzunluğu boyunca düzenli ilerleme gözlenebilir, spermatogenez ve herhangi bir bozulma bu genel düzenleme değişikliklere yol açabilir. Drosophila genetik araçlar ile birlikte bu özellikler, spermatogenez 21-23 mutasyonel analiz kolaylaştırmıştır.

Drosophila Spermatogenezin evreleri çok iyi tanımlanmıştır. Kistlerinin içinde eşzamanlı geliştirmek Germline hücreleri testis uzunluğu boyunca spermatogenez aşamalarında sırayla ilerleme. Bo sırasındamitoz ve erkek germ hücrelerinin miyoza bölünmeler inci, sitokinez kızı hücreleri (Şekil 1) halka kanallar olarak bilinen sitoplazmik köprülerle bağlı kalmasını eksik böyle oluşur. Testisin apikal uç birincil spermatositlerin 16-hücre kistler oluşturmak için eksik sitokinez dört mitotik bölünmeleri geçmesi spermatogonial hücreleri doğurur germ kök hücrelerin bir nüfus içerir. Premeiotic S aşamasından sonra, birincil spermatosit G2, ~ 90 saat hangi hücresel hacmi artar ~ 25 kat sırasında uzun bir büyüme dönemine giriyoruz. Mayoz I ve sırasıyla ikincil spermatositlerin ve haploid spermatidlerin 64-hücreli kist, 32-hücreli kist oluşumu mayoz II sonuçları yoluyla ilerleme. Olgunlaşmamış, yuvarlak spermatidlere olgun sperm oluşturmak için kapsamlı hücresel yeniden geçmesi. Post-öz değişmesine ait hücreler, uzatma demetleri ve olgun spermatidler özellikle, testis hacminin çok işgal.

Tdişi sinek fonksiyonel sperm o başarılı taşıma birkaç eşleştirilmiş yapıların (testisler, seminal kesecikler ve aksesuar bezleri) ve tek bir boşalma yolunun oluşan erkek üreme sistemi, (Şekil 2) farklı parçaları arasındaki koordinasyonu gerektirir. Sperm testislerde içinde üretilen ve çiftleşme 24 kadar seminal keseler içinde saklanır. Aksesuar bezleri seminal sıvıyı üreten salgı hücreleri içerir. Seminal veziküllerin göç sperm seminal keseler ve aksesuar bezleri hem de bağlı olduğu ejakülasyon kanal içerisindeki seminal sıvı ile karıştırılır. Sperm ve seminal sıvı Bu karışım sonuçta kadın erkek karın 25 arka ucunda bulunan ejakülasyon ampul sayesinde sinek vajina içine erkek dışarı pompalanır. Seminal sıvı içinde Proteinler rep spermatekada olarak bilinen uzman organların içinde sperm uzun süreli depolama için gerekli olanDrosophila kadın 26 roductive yolu.

Drosophila testislerin izolasyonu ve spermatogenez çeşitli aşamalarında hücreleri görselleştirilmesi için mükemmel yöntemler bilimsel literatürde 3-12 mevcuttur. Biz burada beraberindeki video gösterimi ile bu protokollerin örnekleri sunarak bu bilgi gövdesine ekleyin. Faz-kontrast mikroskopi için canlı testis numunelerin hazırlanması için protokol daha önce tarif edilen yönteme 27 dayanmaktadır. Formaldehit tespit ve testislerde immün için protokol, aynı zamanda, daha önce tarif edilen metodu takip 28 dayanmaktadır. Burada tarif edilen yaklaşımlar, (örneğin, Drosophila spermatogenez sırasında, bir eksi uç yönlendirilmiş mikrotübül motoru dinein rollerini değerlendirmek için) Drosophila spermatogenez birçok çalışmada kullanılmıştır.

Temel protokol ek olarak, öneri varyin verilmektedirg diseksiyon spermatogonia spermatositler, ya da olgun sperm için zenginleştirecek şekilde. Bu kistlerin ki testisler işlenmesi için farklı yöntemler bozulmadan kalması ya da tarif edilmektedir gerektiği gibi bozulur ya. Bir model sistem olarak Drosophila testisler kullanılmasının bir avantajı, Drosophila oositler ve embriyolar ile karşılaştırıldığında, antikorlar ve boyalar kolayca testis kendi dağılımı aşağıdaki hücreleri nüfuz edebilir ve daha az sayıda yıkama adımları gereklidir, yani, bu yüzden, protokoller nispeten gerçekleştirilebilir kısa bir süre.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Testisler Diseksiyon

  1. CO2 akımı kullanılarak bir şişe ya da viyal sinekleri anestezisi ve bir sinek ped transfer.
  2. Sıralama küçük bir fırça kullanarak bir diseksiyon mikroskop altında uçar, ve istenilen genotiplerin Drosophila erkek (deneye bağlı olarak) uygun bir sayı toplamak. (2-5 gün) biraz eski erkek hücrelerin incelenmesi için ideal olan ise (0-2 gün), genç erkekler, spermatogenez önceki aşamalarında (örn. spermatogonium, spermatosit ve erken post-miyoza Spermatidler) boyunca hücrelerin incelenmesi için idealdir spermatogenez son aşamasında (özellikle sperm olgun).
  3. (Diseksiyon sırasında sıvı içinde yüzen sinekler önlemek için) her sinek gelen kanatları çıkarmak için forseps kullanın.
  4. Bir silikon kaplı diseksiyon çanak bir damla olarak, fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3 mM NaH 2 PO 4) arasında ~ 500 ml eklesiyah bir arka plan. Diğer sulu çözeltiler, başarılı bir şekilde testis diseksiyon 3 için kullanılmıştır.
  5. Noktası sineğin öne doğru forseps, toraks bunu kavramak ve PBS açılan batırmayın. Diseksiyon mikroskobu ile görüntüleme iken, karın ayrılana kadar posteriora dış genital (ventral karın arka ucunda bulunan koyu kahverengi yapısı) kavramak ve çekin forseps başka bir çift kullanın. Çoğu durumda, testisler, seminal veziküller ve aksesuar bez dış genital ile karın boyunca kaldırılır olacak; değilse, karın içine forseps bir tek bir çift eklemek ve testisler didiklemek.
  6. PBS damla forseps iki çift (Şekil 2) kullanılarak aksesuar bezi ve dış genital ayırın testisler. Yabani tip testis kolayca sarı renk ile komşu beyaz dokulardan ayırt edilirler. 2. adıma hemen geçin.
  7. Pharate erkeklerden (i Testisler izole etmek.. E pupa durum içinde kapalı), ek bir adım ilk pupa kasasından kaldırılması sinek içermesidir gerçekleştirilmelidir, bu adım, daha önce başka bir yerde 31 tarif edilmiştir. Adım 1.2 başlayan erişkin testis gibi diseksiyon ile devam edin.
  8. Larva erkeklerden testisler ayırmak için, Drosophila larva overler 32 izole etmek için bir protokol bir değişiklik yapmak. Kısaca, erkek larva yağ gövdesinin arka üçte gömülü büyük, berrak, oval yapı (larva testis) bir çift varlığı ile dişi larva ayırt edilebilir. Larva testisler izole edilmesi için, kısmen larva yumurtalıkların izolasyonu için tarif edildiği gibi karından testisler ve çevredeki vücut yağ izole etmek için erkek larva açık parasını. Burada tarif edilen protokolün adım 2'ye geçin hemen, testisler, daha sonra hemen önce yumurtalık 32 için tarif edildiği gibi (2.3 ya da 3.14 adım) montaj için yağ vücuttan çıkarılabilir.

  1. Nazikçe bir kare cam kapak slip PBS 4-5 ml'lik bir damla testisler 2-3 çiftleri yerleştirmek için bir çift forseps kullanın. Çok az sıvı ne zaman ezilmiş hücrelerinin patlamasına neden olacak ise, çok fazla sıvı ezilmiş düzgün yayılmasını hücrelerini engeller: PBS hacmine testisler sayısına oranının ayarlanması gerekebilir unutmayın. İsteğe bağlı: Kullanım silikonlu kapak adım 3.2 'de kayma kapsayacak doku yapışmasını en aza indirmek için kayıyor.
  2. (Not hazırlanmasında istenen tohum çizgisi hücre tiplerinin varlığını en üst düzeye çıkarmak üzere uygun bir konumda açık her testis gözyaşı forseps bir çift kullanım olup ezilmesini sırasında slayt üzerine testis parçalanmış bölgeden olacak çok çıkış içeriğinin adım.) spermatogonia ve spermatositlerin için zenginleştirmek için, apikal ucu (seviye 1, Şekil 2B) bitişik testis açın gözyaşı. Spermatositlerin ve Spermatidler zenginleştirmek için, gözyaşı bir pos testis açınseviye 1 (düzey 2, Şekil 2B) biraz bazal ition. , Daha olgun germ hücreleri zenginleştirmek yakın eğrilik (düzey 3, Şekil 2B) nerede başladığını açık testis gözyaşı.
  3. Yavaşça testisler squash kapak kayma üzerinde bir cam mikroskop lamı yerleştirmek; yalnız kapak kayma ağırlığı düzgün ezilmiş numune elde etmek için yeterli olduğu gibi elle baskı uygulamayın. Hava kabarcıklarını yakalama önlemek için deneyin. İsteğe bağlı: Kullanım poli-L-lizin kaplı mikroskop aşama 3.2 'de kayma doku uyumu geliştirmek için kayar.
  4. Faz-kontrast mikroskobu ile canlı hücreleri gözlemlemek (ideal hazırlık 15 dakika içinde) hemen hazırlanmasını kullanarak, testislerde floresan etiketli proteinlerin ekspresyonu ile transgenik Sinekler için, canlı hücreler bu aşamada floresan mikroskobu ile incelenebilir. Alternatif olarak, tespit ve antikor boyama (Protokolü 3) ile devam.
  5. Yavaşça bir temizlik w kullanarak coverslip altında herhangi bir aşırı sıvı fitilgerm hücreleri, odak net kadar ipe preparasyonun düzleşme izin vermek.

3. Formaldehit Fiksasyon ve Antikor Boyama

  1. Yapış (sıvı azot köpüren durana kadar) sıvı azot içinde kısaca batırmak için metal maşa kullanılarak (Protokolü 2) ezilmiş testisler içeren her slayt dondurma.
  2. Bir jilet kullanarak hemen kapak kayma çıkarın.
  3. Buz soğukluğundaki% 95 etanol ile dolu önceden soğutulmuş bir cam slayt, raf (spektrofotometrik sınıf, metanol içermeyen) Slaytları aktarmak için metal maşa kullanın. 10 dakika boyunca -20 ° C'de saklayın.
  4. % 4 formaldehid, PBS artı% 0.1 Triton X-100 (PBS-T) ile dolu bir cam slayt raf Slaytları aktarmak için metal maşa kullanın. 7 dakika boyunca oda sıcaklığında saklayın.
  5. PBS ile dolu bir cam slayt rafa slaytlar aktarmak için metal maşa kullanın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar yıkayın. 1x tekrarlayın. (Cam slayt rafa çözüm atarak tüm yıkar gerçekleştirin
  6. PBS atın ve hücre zarının geçirgen hale getirilmesi, oda sıcaklığında 30 dakika için PBS-T içinde slaytlar bırakın.
  7. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar yıkayın. 2x tekrarlayın.
  8. Adım (isteğe bağlı) Bloklama: oda sıcaklığında 45 dakika boyunca PBS içinde slaytlar artı% 1 BSA bırakın.
  9. (Adımları 3.9 ve 3.11 'de eklenmiştir) antikor çözümleri sınırlandırmak için (gözle kolayca görülebilir) ezilmiş doku etrafında slayt üzerinde bir daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın. Immün yaparken doku her zaman nemli tutulmalıdır.
  10. Daire içinde dokuya (antikora bağlı olarak 1:50 PBS-T içinde seyreltilmiş 1:400) birincil antikor 30-40 ml ilave edilir. Engelleme ile gerçekleştirilen, PBS-T artı% 1 BSA içinde birincil antikor seyreltin. (Şekil 4'te sentrozom boyanması için) Anti-gamma-tubulin antikoru 1:100 seyreltilmiştir. Nemli, karanlık odaya (örn.. Kapalı plastik kutu içinde inkübenemli kağıt, oda sıcaklığında 2 saat boyunca havlu) veya gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta ile
  11. Oda sıcaklığında 3 x 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar yıkayın. Engelleme ile gerçekleştirilen, PBS-T içinde iki kez yıkayın ve bir kez PBS (oda sıcaklığında her biri 5 dakika).
  12. Dokuya fluorofor-konjuge sekonder antikor (PBS içinde 1:400 seyreltilmiş) 30-40 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 1-2 saat boyunca karanlıkta inkübe edilir.
  13. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde slaytlar yıkayın. 2x tekrarlayın.
  14. 30-40 daire içinde dokuya DAPI çözeltisi (PBS içinde 0.2 mg / ml) ilave edin.
  15. Yavaşça, hava kabarcığı oluşmaması için dikkat çekici, doku üzerinde bir cam kapak kayma yerleştirin. Hava kabarcıkları görünmesi gerekiyorsa, kabarcıkları kapak kayma tarafına kaçmak kadar kabak bozmadan kapak kayma etrafında dikkatli hareket.
  16. Bir temizlik kullanabilirsiniz slayt kenarları aşırı DAPI leke silin.
  17. Net oje kullanarak slayt kapak kayma mühür.
  18. Bu hazırlık kullanınfloresan mikroskop ile immunosteyn hücreler görüntülemek için sonraki 3-4 saat içinde. (En azından birkaç haftaya kadar) slaytlar uzun süreli saklama için -20 ˚ C'de gliserol tabanlı monte sert DAPI ile medya, ve mağaza slaytlar kullanın
  19. Seçenek olarak ise, (antijen bağlı olarak) metanol yerine formaldehitle örnekleri saptamak. Adım 3.2 ile tüm protokol tamamladıktan sonra, -20 ° C'de 10 dakika boyunca metanol içinde ezilmiş testislerin slaytlar daldırın ve ileriye adım 3.5 ile devam edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Drosophila erkek üreme organlarının bir şekilde parçalanmış bir çiftin bir örneği, Şekil 2A'da gösterilmiştir. Yetişkin erkek sineğin karın çıkarıldı Deneyler tipik haliyle seminal veziküllerin bir çift (mavi, Şekil 2A ') ile boşalma kanalına (kahverengi, Şekil 2A') ve yardımcı bezleri bir çift (yeşil, Şekil 2A ') bağlıdırlar . Ekteki somatik doku, ejakülasyon kanal ve aksesuar bezlerinin çoğundan testislerin ayırmak için müstakil ve testisler çifti ve seminal veziküller sadece ('Şekil 2B ve 2B) kalması gibi atılmalıdır. Seminal veziküller daha da işlenmesi gereken sadece testisler çift bırakarak kaldırılabilir.

Testisler diseksiyon için seçilen yetişkin erkeklerin yaşı önemli bir husustur. (0-2 gün eclosion sonra) genç erkeklerde, seminal veziküller küçükve neredeyse boş ve testisler (Şekil 2'deki gibi) maksimal çapta bulunmaktadır. Genç erkek Kullanma (mitoz veya mayoz ya geçirmekte) bölünmesi eşey hücrelerinde ve erken post-miyoza spermatidlerin nispeten çok sayıda sağlar. Yaşlı erkek (3-5 gün sonra eclosion) diseksiyon (görüntü gösterilmemiştir) için kullanılır, bunlar sperm ile şişkin çünkü seminal veziküller daha belirgin ve testisler genç erkeklerde daha dardır. Amaç olgun sperm görselleştirmek için ise eski erkek tercih edilir.

Drosophila testislerin uzunluğu boyunca gelişimsel olayların sipariş ilerlemesi sayesinde, spermatogenez belirli aşamalarında germ hücreleri testislerde önce Ezici yırtılırlar disseke hangi pozisyonuna göre zenginleştirilmiş olabilir. Örneğin, apikal uç (düzey 1, Şekil 2B ') yakın testis yırtılarak açılması spermatogenez erken aşamalarında hücreleri bolluğu elde edilir. Şekil 3.A bu yolla elde spermatogonia (beyaz ok), erken primer spermatositlerde (sarı ok), ve geç primer spermatositlerde (kırmızı ok) temsilcisi nüfusun faz-kontrast görüntü gösterir. Alternatif olarak, biraz daha bazal pozisyonunda (düzey 2, Şekil 2B ') de testis yırtarak öncelikle spermatosit ve spermatidlerin verir. Şekil 3B primer spermatositlerde (kırmızı ok), yuvarlak spermatidlerin (temsili bir hücre popülasyonunun bir faz-kontrast görüntü gösterir yeşil ok), bu şekilde elde spermatidlerin (Turuncu ok), ve olgun sperm demetleri (mavi ok) uzayarak.

Testis faz kontrastlı görüntüleme Bu işlem için kritik olan genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanan Drosophila spermatogenezde kusurları karakterize etmek için kullanılabilir. Bir faz-kontrast mikroskop ile bakıldığında yuvarlak Spermatidler çok basmakalıp görünüme sahip. Bu olgunlaşmamış spermatidlerin her biri tek, PHA varE-ışık, yuvarlak nükleus ve (Şekil 3C, sırasıyla, mor ok ucu ve okla işaretli) kabaca aynı boyutta bir tek faz-koyu, yuvarlak mitokondriyal agrega. Bu organellerin göreli numaraları veya boyutlarda varyasyon anormal miyoza tümen (tartışma) neden olabilir. Böyle bir arıza bir örneği Şekil 3B 'de gösterilmiştir. Asunder (asun) gen mutasyonu olan erişkin erkeklerde yuvarlak Spermatidler sitokinez ve kromozom ayrımı 29 kusurlar sonucunda tek bir büyük mitokondriyal agrega ve birden fazla küçük çekirdekleri içerir.

Floresan mikroskopi Drosophila spermetogenez eğitim için başka güçlü bir yaklaşımdır. Sıkıştırılmış testis numuneden sabit bir hücre floresan görüntü bir örneği Şekil 4'te gösterilmektedir. Deneyler, C-ter da kaynaşık bTub56D geninin GFP-beta1-tubulin (ürün ifade eden transjenik sinekler elde edilmiştirminal GFP ve Ubi-p63E ubikuitin gen promoter kontrolü altında son bulur; H. Oda'nın ve Y. Akiyama-Oda, JT Biohistory Araştırma Hall, Osaka, Japonya) dan hediye mikrotubullere (Şekil 4D, gri tonda yeşil etiket amacıyla Şekil 4A). Transgenik testisler gama-tubulin karşı bir fare antikoru kullanılarak immunohistokimyasal (ikincil antikor: anti-fare Cy3) ve (Şekil 4D, Şekil 4C tonlamayla kırmızı) centrosomes münasebetiyle Şekil 4D DNA (mavi, gri tonlama işaretlemek için DAPI-lekeli Şekil 4B'de). Spermatogenez farklı aşamalarında hücreler kolayca mikrotübüllerin, sentrozom ve kromozom (açıklamasına bakınız) dizilişini incelenerek belirlenebilir.

Şekil 1
Figu 1. Drosophila erkeklerde germ hücre bölünmeleri şematik yeniden. Her kök hücre bölünmesi birincil spermatositlerin 16-hücreli kist üretmek için eksik sitokinez ile mitoz bölünmeler dört tur geçer bir gonial hücre üretir. Her birincil spermatosit önce birbirine yuvarlak spermatidlerin 64-hücreli kist ardından birbirine ikincil spermatositlerin 32-hücreli kist oluşturur, eksik sitokinez ile tekrar, iki mayotik bölünmeler geçiren uzun bir büyüme evresine geçer. Yuvarlak Spermatidler bir faz ışık çekirdeğin mevcudiyetinde ve benzer büyüklükte bir faz koyu mitokondriyal agrega (Nebenkern) ile karakterize edilir. Yuvarlak Spermatidler olgun sperm oluşturmak için uzamaya ve kişiselleştirmeyi tabi. Olgun sperm kafaları kendi iğne biçimli çekirdekler tarafından tespit edilebilir. Çekirdekler mavi gösterilir; siyah Nebenkerne (mitokondriyal agrega); tan sitoplazma./ 50981fig1highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 2,
Drosophila erkeklerin Figure 2. Üreme organları. Genç yetişkin erkekler (0-2 gün eclosion sonra) diseksiyon için seçildi. Izole edilmiş üreme organları hafif mikrograflan A içinde karşılık gelen çizgi 've B' ile A ve B'de gösterilmiştir. (A, A ') yetişkin bir erkek sineğin karın kaldırıldı Drosophila testisler (kırmızı) seminal keseciklerin (mavi) yoluyla boşalma yolunun (kahverengi) bağlanır. Aksesuar bezleri (yeşil) bir çift de ejakülasyon kanalına takılır. (B, B ') testisler aksesuar bezleri b ayrılmalıdırefore hazırlık kaydırın. 2. seviyede Mayotik ve post-mayotik eşey hücrelerinde oluşan karışık bir nüfus elde etmek için, önce kontrol Ezici için, seviye 1 testisler spermatogenez erken aşamalarında hücreleri zenginleştirmek açık gözyaşı ve 3 seviyesinde olgun sperm zenginleştirmek için. Ölçeği bar, 250 mm. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,
Drosophila testislerin Şekil 3. Faz kontrastlı görüntüler. (A) spermatogonia (beyaz ok), erken primer spermatositlerde (sarı ok), ve geç primer spermatositlerde (kırmızı ok) dahil olmak üzere spermatogenez erken aşamalarında, hücrelerin bir bolluk genellikle yayımlanan Testis 1 seviyesi yırtık olduğunda (bkz. Şekilure 2B '). İki veya daha fazla birbirine bağlı hücreleri (tamamlanmamış sitokinez sonucu) sık sık bastırılması yöntemi (sarı ok ucu iki erken spermatositlerin bir füzyon işaretleri) bir eser olarak tamamen kaynaştırmak. (B) yuvarlak spermatidler (yeşil ok), uzatma spermatidler (Turuncu ok kısmi kist işaretler), ve olgun sperm demetleri (mavi ok) dahil spermatositlerin (kırmızı ok geç primer spermatosit işaretler) ve post-mayotik hücreleri, bir arada, tipik olarak Testis 2 düzeyinde yırtık olduğunda ('Şekil 2B) yayınladı. Ezilmiş testislerin (C, D) Faz-kontrast görüntüleme kolayca bol ve basmakalıp yuvarlak spermatidler kusurları tanımlamak için kullanılır. Tek bir mitokondriyal agrega (faz-koyu; mor okla işaretli) bağlı kabaca eşit büyüklükte (C); vahşi tip Spermatidler bir çekirdeği (mor ok ile işaretlenmiş faz-ışık) var. Asunf02815 dan Spermatidtestis kromozom segregasyonu (D) başarısız sitokinez ve hataların bir sonucu olarak çok küçük bir çekirdek ve bir büyük mitokondriyal agrega içerir. Ölçek çubuğu, 10 mm. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 4,
.. Drosophila testislerin Şekil 4 Floresan görüntü GFP etiketli beta1-tübüline (D yeşil, A gri tonlama) ifade erkeklerden izole ezilmiş testislerin hazırlıklar sabit ve lekeli hem DNA (DAPI; D mavi, B tonlama) ve sentrozomlar (gama-tubulin antikor; D kırmızı, C gri tonlama). Bir bölme spermatositlerdeEritrosit (beyaz ok başı) aşağıdaki yuvarlak spermatidler (beyaz ok temsili hücreleri işaretler) ve olgun sperm (sarı ok) bir paket büyük bir alana görülebilir. Ölçek çubuğu, 10 mm. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vahşi tip sinekler testisler kolayca nedeniyle sarı renk (aksine komşu beyaz dokular) ile tespit edilebilir, ancak beyaz sinek mutant testisler beyazdır ve bu nedenle zaman zaman gut ile karışabilir. P-elemanları bulunan beyaz mini-gen testislerde pigment birikimini teşvik etmez, çünkü beyaz bir arka planda genellikle çoğu transgenik suşları, aynı zamanda beyaz testisler var. Drosophila testisler renk ile ayırt edilemeyen zaman, diğer kolayca tanınabilir özellikleri çiftler 12 kendi spiral desen ve oluşumunu içerir. Bazı işçiler daha kolay testislerde 12 yalıtmak için diseksiyon iğneleri yerine forseps kullanmak bulabilirsiniz unutmayın.

Bu protokolün kritik bir adım ezilmiş testislerin hazırlıktır. Yararlı bir yaklaşım, bir kaç milimetre, öyle ki testisler içeren kapak astar üzerine slayt seyretmeye olan yüzey tekapak kayma PBS nsion slayt doğru doku içeren kapak kayma yukarı kaldırır. Bu yöntem kist bozabilir ve bireysel görüntüleme hücreleri için idealdir, slayt üzerinde hücreleri yayılma eğilimindedir. Alternatif olarak, görüntüleme için tüm ya da kısmi kistleri korumak için, PBS hacmi kapak kayma yeri (4-5 ml 7-8 ml) artırılabilir.

Ilgi belirli bir Drosophila mutant yetişkinliğe hayatta değilse, o zaman larva veya pupa testis alternatif spermatogenez incelemek için kullanılabilir. Protokol bölümde, başvurular pharate erkek ve larva yumurtalıkların izolasyonu için sağlanır; ikinci protokolün bir modifikasyonu larva testisler izole etmek için kullanılabilir. , Yırtılma ezme ve larva ve pupa testisler boyama için adımlar yetişkin testis için burada tarif edilen esas itibariyle aynıdır. Çalışılacak sinek çizgi yetişkinlik ulaşmak bile, larva veya pupa testislerin izolasyonu tercih edilebilir eğer goal spermatogenez erken aşamalarında hücreleri elde etmektir. Temsilcisi sonuç bölümünde açıklandığı gibi, testis önce Ezici yırtılarak hangi seviyesini değiştirerek istediğiniz gibi, spermatogenez erken veya geç dönemlerinde hücreler zenginleştirilmiş olabilir.

Faz-kontrast mikroskobu Drosophila spermetogenez eğitim için nispeten basit bir yaklaşım sunuyor. Immun boyama ve floresan mikroskobu fazla faz kontrast mikroskopisi bir avantajı, daha az zaman örnekleri hazırlamak için gerekli olmasıdır. Spermatogenez ana aşamada tüm bu teknik hali hazırda 24 kullanılarak belirlenebilir. Gerçekten de, çeşitli gruplar Drosophila erkek steril mutant satır 21-23 fenotipleri karakterize etmek için bir ana eleme olarak testis faz-kontrast mikroskopik analiz kullanılmıştır. Mayotik bölünmeler sırasında, mitokondri ve kromozomlar eşit kızı hücrelere bölünür. Drosophil spermatogenezisin benzersiz bir özelliğia ve diğer böceklerin yuvarlak spermatidler 24 mitokondriyal bir agrega (Nebenkern) oluşturulmasını içerir. Yuvarlak Spermatidler bir faz koyu Nebenkern ve bir 1:1 oranında kabaca eşit büyüklükte bir faz hafif çekirdek (Şekil 3) içerir. Çekirdeğin çapı yuvarlak spermatidler DNA içeriğini yansıtır, bu mayoz sırasında kromozomların dağılması hataları nükleer ebatları 33 değişkenliğe yol açabilir. Çekirdekli yuvarlak Spermatidler kromozom ayrımı sonuçlarına aşağıdaki miyoza sitokinez bozulması hangi bir tek toplam 34 içine Nebenkerne sigorta. Bu nedenle, 1:1 oranında veya yuvarlak spermatidler olarak boyutunda veya Nebenkern şekline ve çekirdeğinde herhangi bir değişiklik kolayca canlı testis faz-kontrast mikroskobu ile tespit ve mayoz kusurları genellikle teşhis edilebilir. Ortak bir kist içinde iki ya da daha fazla birbirine bağlı hücre füzyonu sıklıkla silinmesine prosedürünün bir eser olarak ortaya çıkar (Şekil 3A, Sarı ok); Nebenkerne için çekirdeklerin oranı 1:01, ancak yine de korunur.

Drosophila testis sabit preparasyonlar immün hücreleri geçiren spermatogenez sahne için hem de ekspresyonu ve ilgi konusu olan proteinlerin hücre içi lokalizasyonu değerlendirilmesi için gerçekleştirilebilir. Hücresel morfoloji, kromatin organizasyon ve tubulin ve DNA-lekeli immunohistokimyasal testis hücreleri mikrotübül düzenlemelerine göre Drosophila spermatogenez aşamalarını sınıflandırmak için bir rafine düzeni Drosophila birincil spermatosit nispeten büyük hücrelerdir. 19 tarif edilmiştir ve bu öz değişmesine ait iğ can açık bir şekilde bu yaklaşım kullanılarak gözlemlenebilir. (Örneğin, gamma-tubulin karşı antikorlar kullanılarak) sentrozom için Coimmunostaining öz değişmesine ait mili yapının daha net bir görünüm elde etmek için yapılabilir. Antibod geniş bir yelpazede ile testisler immünolekeleme zaman Formaldehit uygun bir fiksatifies (örneğin, anti-lamin ve anti-dynein ağır zincir). Mikrotübül ve sentrozom morfolojisi, ancak, metanol ile daha da korunmuş, alfa-tübülin ve gamma-tubulin karşı antikorlarla immün gerçekleştirirken bu nedenle, tipik olarak metanol tespit edici olarak kullanılır.

Ilgi konusu bir proteine ​​karşı antikorlar kullanılamaz, proteinin bir floresan etiketli (örneğin,. MCherry veya GFP) sürüm Drosophila ifade eden transjenik çizgiler alternatif bir yaklaşım olarak oluşturulabilir. Alternatif olarak, anti-GFP antikorlar sabit örneklerde füzyon proteinini tespit etmek için de kullanılabilir; proteininin hücre-altı lokalizasyonu sonra doku canlı veya sabit preparasyonlarda GFP floresan görüntülemek için bir mikroskop kullanılarak belirlenebilir. Şekil 4'te, bir sabit testisler hazırlanmasında mikrotübüller bir topak kontrolü altında transgen ekspresyonu GFP-etiketli beta1-tübülin içsel floresans (yoluyla görselleştirilmiştirally) ubikuitin promoteri ifade edilmiştir. Alternatif olarak, transgenik sinekler bu ifade, bir dokuya özgü promoterin kontrolü altında olan, örneğin, beta2-tubulin geninin promoter testisler spesifik ifadesi 35 kullanılmaktadır. Alternatif olarak, ilgi konusu bir protein ekspresyon UAS-Gal4 sistemini 36 kullanmak sureti ile spesifik erkek tohum çizgisi hücreleri ile sınırlı olabilir. Nanos-Gal4 spermatogonial hücreleri içinde bir UAS promoterin kontrolü altında bir proteinin ifadesini uyarmak için kullanılabilir, bam-Gal4 spermatositler 37 içindeki ekspresyonunu başlatmak için kullanılabilir iken. Ilgi konusu bir proteinin demonte ayrıca Gal4 sürücüsü 37 ile bağlantılı olarak bir UAS promotörün kontrolü altında bir RNAi saç tokası yapısını ifade ile, testislerde indüklenebilir.

Drosophila testis hücrelerinin canlı görüntü analiz yöntemleri geliştirilmesi olabilir sorular yelpazesini genişlettiBu sistemi kullanarak ele. Mayotik sitokinez olaylar hücrelerin 35 ömrünü uzatmak için bir perfüzyon odasının içine fibrin pıhtısı kültürlenebilmektedir spermatositlerin faz-kontrast mikroskobu ile görülebilir. Floresan etiketli proteinlerin ifade Drosophila spermatositlerin Time-lapse konfokal mikroskopi ayrıca 38 (miyoza mili düzeneğini incelemek için, örneğin) güçlü bir yaklaşım olmuştur. Daha önceki bir aşamada canlı görüntüleme için konfokal mikroskopi kullanımı, Drosophila testislerin bölünen germlıne kök hücreler, kök hücre düzenleme bir anlayışın artmasına yol açmıştır. Burada sunulan faz-kontrast mikroskobi yaklaşımlara ek olarak, transmisyon elektron mikroskobu da Drosophila spermatogenez 31 incelemek için yaygın olarak kullanılır olmuştur.

Görüntülemeye ek olarak, Drosophila testis biyokimyasal analysi için bir malzeme kaynağı olarak da kullanılabilirs. Immunoblotting deneyleri için, kesilmiş sinek testis, 6x numune tamponu (5 ml / testis çifti) içinde homojenize kaynatıldı ve doğrudan bir SDS-PAGE jel (~ 4 testis çift / şerit) üzerine yüklenebilir. Örneğin, bu yaklaşım, çok sayıda Drosophila mutantların testislerde dynein-dynactin bileşenlerinin seviyelerinin tayin edilmesi için kullanılmıştır. Testis ekstreler alternatif olarak, protein bütünlüğünün muhafaza edilmesi için önemli olup olmadığını nondenaturing liziz tamponu içinde homojenize etmek suretiyle hazırlanabilir. Örneğin, Drosophila özler, bu doku 41-43 kararlı protein kompleksleri varlığını göstermek için coimmunoprecipitation deneylerde kullanılmıştır testisler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Yazarlar Lee laboratuarda Karen Hales uzman tavsiyesi ile spermetogenez eğitim için kabul edilen bu yöntemlerin kurulması için Michael Anderson teşekkür etmek istiyorum. H. Oda ve Y. Akiyama-Oda cömertçe γ-tubulin-GFP stok sinek sağladı. Bu çalışma LAL (GM074044) bir NIH R01 hibe tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard World Precision Instruments SYLG184 Two-part silicon elastomer for making silicone-coated dissection dish from Kimax Petri dish
PAP pen Fisher Scientific NC9888126 Ted Pella #22309
Clear nail protector Wet n Wild 7780235001
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI Life Technologies P36931
Mouse anti-gamma-tubulin antibody (clone GTU-88) Sigma-Aldrich T6557
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG  Jackson ImmunoResearch 115-165-003
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100
Ethanol Fisher Scientific AC61511-0040
Methanol Fisher Scientific A412-4
16% Formaldehyde Thermo Fisher Scientific 28908
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 Use according to manufacturer's directions to siliconize cover slips
DAPI Sigma-Aldrich D-9542 0.5 mg/ml in 75% ethanol; store at -20 °C
NaCl Research Products International Corp. S23020
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S9763
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S0751
Kimwipes delicate task wipers Fisher Scientific S47299
BSA Research Products International Corp. A30075 Molecular biology grade
Glass Coplin staining jar, screw cap Electron Microscopy Sciences 70315
Single frosted microscope slides Corning 2948-75X25
Poly-L-lysine coated microscope slides Polysciences, Inc. 22247-1 Optional (to replace untreated microscope slides )
Square cover glass Corning 2865-22
Razor blades Fisher Scientific 12-640
Kimax Petri dish Fisher Scientific S31473 Kimble #23060 10015 EMD
Forceps Dumont 52100-51S Pattern 5 INOX
Stemi 2000-CS stereoscope Carl Zeiss
Eclipse 80i Nikon
Plan-Fluor 40X objective Nikon
Axiophot Carl Zeiss
Plan-Neofluar Ph2 40X objective Carl Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McKim, K. S., Joyce, E. F., Jang, J. K. Cytological analysis of meiosis in fixed Drosophila ovaries. Methods Mol. Biol. 558, 197-216 (2009).
  2. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  3. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 87-109 (2000).
  4. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1273-1275 (2011).
  5. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Methanol-acetone fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, 1270-1272 (2011).
  6. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Preparation of live testis squashes in Drosophila. Cold Spring Harb. Protoc.. 2011, (2011).
  7. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Formaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, (2012).
  8. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 102-104 (2012).
  9. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. F-actin staining of Drosophila testes. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 105-106 (2012).
  10. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Anal. Biochem. 436, 55-64 (2013).
  11. Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological techniques for studying the Drosophila male germline stem cell. Methods Mol. Biol. 450, 45-59 (2008).
  12. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster Testes. J. Vis. Exp. (2641), (2011).
  13. de Cuevas, M., Matunis, E. L. The stem cell niche: lessons from the Drosophila testis. Development. 138, 2861-2869 (2011).
  14. Fabian, L., Brill, J. A. Drosophila spermiogenesis: Big things come from little packages. Spermatogenesis. 2, 197-212 (2012).
  15. Giansanti, M. G., Sechi, S., Frappaolo, A., Belloni, G., Piergentili, R. Cytokinesis in Drosophila male meiosis. Spermatogenesis. 2, 185-196 (2012).
  16. Matunis, E. L., Stine, R. R., de Cuevas, M. Recent advances in Drosophila male germline stem cell biology. Spermatogenesis. 2, 137-144 (2012).
  17. McKee, B. D., Yan, R., Tsai, J. H. Meiosis in male Drosophila. Spermatogenesis. 2, 167-184 (2012).
  18. Zoller, R., Schulz, C. The Drosophila cyst stem cell lineage: Partners behind the scenes. Spermatogenesis. 2, 145-157 (2012).
  19. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell Sci.. 107, 3521-3534 (1994).
  20. Rebollo, E., Gonzalez, C. Visualizing the spindle checkpoint in Drosophila spermatocytes. EMBO Rep. 1, 65-70 (2000).
  21. Castrillon, D. H., et al. Toward a molecular genetic analysis of spermatogenesis in Drosophila melanogaster: characterization of male-sterile mutants generated by single P element mutagenesis. Genetics. 135, 489-505 (1993).
  22. Giansanti, M. G., et al. Genetic dissection of meiotic cytokinesis in Drosophila males. Mol. Biol. Cell. 15, 2509-2522 (2004).
  23. Wakimoto, B. T., Lindsley, D. L., Herrera, C. Toward a comprehensive genetic analysis of male fertility in Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 207-216 (2004).
  24. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-147 (1993).
  25. Wolfner, M. F. Tokens of love: functions and regulation of Drosophila male accessory gland products. Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 179-192 (1997).
  26. Tram, U., Wolfner, M. F. Male seminal fluid proteins are essential for sperm storage in Drosophila melanogaster. Genetics. 153, 837-844 (1999).
  27. Kemphues, K. J., Raff, E. C., Raff, R. A., Kaufman, T. C. Mutation in a testis-specific beta-tubulin in Drosophila: analysis of its effects on meiosis and map location of the gene. Cell. 21, 445-451 (1980).
  28. Gunsalus, K. C., et al. Mutations in twinstar, a Drosophila gene encoding a cofilin/ADF homologue, result in defects in centrosome migration and cytokinesis. J. Cell Biol. 131, 1243-1259 (1995).
  29. Anderson, M. A., et al. Asunder is a critical regulator of dynein-dynactin localization during Drosophila spermatogenesis. Mol. Biol. Cell. 20, 2709-2721 (2009).
  30. Sitaram, P., Anderson, M. A., Jodoin, J. N., Lee, E., Lee, L. A. Regulation of dynein localization and centrosome positioning by Lis-1 and asunder during Drosophila spermatogenesis. Development. 139, 2945-2954 (2012).
  31. Martins, A. R., Machado, P., Callaini, G., Bettencourt-Dias, M. Microscopy methods for the study of centriole biogenesis and function in Drosophila. Methods in cell biology. 97, 223-242 (2010).
  32. Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and staining of Drosophila larval ovaries. J. Vis. Exp. (10), (2011).
  33. Gonzalez, C., Casal, J., Ripoll, P. Relationship between chromosome content and nuclear diameter in early spermatids of Drosophila melanogaster. Genet. Res. 54, 205-212 (1989).
  34. Liebrich, W. The effects of cytochalasin B and colchicine on the morphogenesis of mitochondria in Drosophila hydei during meiosis and early spermiogenesis. An in vitro study. Cell Tissue. Res. 224, 161-168 (1982).
  35. Wong, R., et al. PIP2 hydrolysis and calcium release are required for cytokinesis in Drosophila spermatocytes. Curr. Biol. 15, 1401-1406 (2005).
  36. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  37. White-Cooper, H. Tissue cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2, 11-22 (2012).
  38. Rebollo, E., Llamazares, S., Reina, J., Gonzalez, C. Contribution of noncentrosomal microtubules to spindle assembly in Drosophila spermatocytes. PLoS Biol. 2, (2004).
  39. Cheng, J., Hunt, A. J. Time-lapse live imaging of stem cells in Drosophila testis. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol.. 2, 10-1002 (2009).
  40. Sheng, X. R., Matunis, E. Live imaging of the Drosophila spermatogonial stem cell niche reveals novel mechanisms regulating germline stem cell output. Development. 138, 3367-3376 (2011).
  41. Belloni, G., et al. Mutations in Cog7 affect Golgi structure, meiotic cytokinesis and sperm development during Drosophila spermatogenesis. J. Cell Sci. 125, 5441-5452 (2012).
  42. Moon, S., Cho, B., Min, S. H., Lee, D., Chung, Y. D. The THO complex is required for nucleolar integrity in Drosophila spermatocytes. Development. 138, 3835-3845 (2011).
  43. Wang, Z., Mann, R. S. Requirement for two nearly identical TGIF-related homeobox genes in Drosophila spermatogenesis. Development. 130, 2853-2865 (2003).

Tags

Temel Protokol Sayı 83, Diseksiyon testis spermatogenez mayoz germ hücreleri faz-kontrast mikroskobu immunofloresan
Spermatogenez sitolojik analizi: Canlı ve Sabit Hazırlıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Testisler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee,… More

Sitaram, P., Hainline, S. G., Lee, L. A. Cytological Analysis of Spermatogenesis: Live and Fixed Preparations of Drosophila Testes. J. Vis. Exp. (83), e51058, doi:10.3791/51058 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter