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Biology

Análise de apoptose em embriões Zebrafish por Whole-mount imunofluorescência para detectar Caspase 3 ativado

Published: December 20, 2013 doi: 10.3791/51060
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Oncological Sciences, University of Utah

Abstract

Whole-mount imunofluorescência para detectar ativado Caspase 3 (ensaio CASP3) é útil para identificar células em apoptose ou intrínseca ou extrínseca em embriões de peixe-zebra. A análise de todo o monte fornece informação espacial em relação à especificidade do tecido de células apoptosing, embora o corte e / ou colabeling é finalmente obrigado a identificar os tipos de células em apoptose exatas. O ensaio todo-mount CASP3 é otimizado para análise de embriões fixadas entre o estágio de 4 células e 32 horas pós-fecundação e é útil para uma série de aplicações, incluindo a análise de mutantes peixe-zebra e morphants, superexpressão de tipo selvagem e mutante mRNAs, e exposição a substâncias químicas. Comparado com coloração laranja de acridina, que pode identificar células em apoptose em embriões vivos em uma questão de horas, CASP3 e TUNEL ensaios levar muito mais tempo para ser concluído (2-4 dias). No entanto, devido ao carácter dinâmico da formação de células apoptóticas e de apuramento, análise de correcçãoembriões ed assegura comparação precisa de células apoptóticas através de múltiplas amostras em pontos de tempo específicos. Descobrimos também o ensaio CASP3 ser superior à análise de células em apoptose pelo ensaio todo-mount TUNEL em relação ao custo e confiabilidade. Em geral, o ensaio CASP3 representa, um ensaio altamente reprodutível robusto, em que a análise de células em apoptose em embriões de peixe-zebra iniciais.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 ml tubes  Denville Scientific c2170 Nonhazardous. Any similar 1.5 m plastic tubes will suffice.
10x Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma Aldrich P5493 Nonhazardous.
a-activated-human-Caspase-3 antibody Fisher Scientific BDB559565 May be harmful if inhaled or swallowed.
a-GFP monoclonal antibody (mouse) Life Technologies 33-2600 May be harmful if inhaled or swallowed.
a-HuC/HuD human neuronal protein, mouse IgG2b, monoclonal 16A11 - UNCONJ Life Technologies A21271 May be harmful if inhaled or swallowed.
Albumin, Bovine BSA Heat Shock Isolation  Amresco CAS 9048-46-8 Nonhazardous. Can also be purchased through Bioexpress: 0332-1006
Alexa Fluor 488 Donkey anti-mouse IgG Life Technologies A11029 Use at 1:200 dilution.  May be harmful if inhaled or swallowed.
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A21206 Use at 1:200 dilution.  May be harmful if inhaled or swallowed.
Alexa Fluor 568 Donkey anti-Rabbit IgG Life Technologies A10042 Use at 1:200 dilution.  May be harmful if inhaled or swallowed.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D8418 Flammable.
Dumont #5 Inox Forceps (standard tips/straight) Fine Science Tools 11251-20 Sharp!
FBS HyClone Fetal Bovine Serum  Thermo-Fisher SH3091003 Nonhazardous.
Fisher Scientific Ocelot Rotator Fisher Scientific 05-450-21 Any rotator with manual speed control is suitable.
Instant Ocean Aquarium Salt  Petco 1373684 Nonhazardous.
Methanol (acetone-free) Sigma Aldrich M1775 Flammable: toxic by inhalation, ingestion and contact.
Methylcellulose Sigma Aldrich M0387-1006 Nonhazardous.
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148 Flammable: toxic by inhalation, ingestion and contact.
Probe (Angled 80 Short/15.5cm/0.15mm tip diameter) Fine Science Tools 10140-02 Sharp!
Pronase Roche 11459643001 Nonhazardous.
Pyrex Spot Plate Fisher Scientific 13-748B Nonhazardous.
Transfer Pipets, Samco general purpose Thermo-Scientific 204 Nonhazardous.
Triton X-100 Sigma Aldrich T8787 Irritant: harmful by ingestion or contact.
Tween-20 Sigma Aldrich P7949 Nonhazardous. Other brands include VWR #97063-872.

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Sorrells, S., Toruno, C., Stewart, R. A., Jette, C. Analysis of Apoptosis in Zebrafish Embryos by Whole-mount Immunofluorescence to Detect Activated Caspase 3. J. Vis. Exp. (82), e51060, doi:10.3791/51060 (2013).

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