Summary
Il circuito di alimentazione in Drosophila melanogaster larve propone un modello semplice ma potente che consente modifiche del tasso di alimentazione per essere correlati con alterazioni della circuiti neurali stomatogastric. Questo circuito è composto di neuroni serotoninergici centrali che inviano proiezioni ai ganci bocca e foregut.
Abstract
Il circuito di alimentazione serotoninergico in Drosophila melanogaster larve può essere usato per studiare substrati neuronali di importanza critica durante lo sviluppo del circuito. Utilizzando l'uscita funzionale del circuito di alimentazione, modifiche della struttura neuronale del sistema stomatogastric può essere visualizzata. Comportamento alimentare può essere registrato osservando il tasso di retrazione dei ganci bocca, che ricevono innervazione dal cervello. Comportamento locomotorio viene utilizzato come controllo fisiologico per l'alimentazione, poiché larve utilizzare loro bocca ganci attraversare le un substrato di agar. Cambiamenti nel comportamento alimentare possono essere correlati con l'architettura assonale dei neuriti innervano l'intestino. Usando immunoistochimica è possibile visualizzare e quantificare questi cambiamenti. L'uso improprio delle larve durante paradigmi di comportamento in grado di alterare i dati in quanto sono molto sensibili alle manipolazioni. La corretta rappresentazione dell'architettura neurite innervanol'intestino è critico per la quantificazione precisa del numero e delle dimensioni delle varici nonché l'entità di nodi ramo. Analisi della maggior parte dei circuiti consentono solo per la visualizzazione di architettura neurite o effetti comportamentali, tuttavia, questo modello permette di correlare l'uscita funzionale del circuito con menomazioni dell'architettura neuronale.
Introduction
Drosophila è estremamente potente sistema modello per lo studio dello sviluppo del circuito neurale a causa di tempi rapidi generazione, a basso costo sperimentale, e la capacità di manipolare e controllare i fattori genetici e ambientali. Neurogenesi, constatazione percorso neuronale e la sinaptogenesi sono conservati tra l'uomo e Drosophila, quindi i meccanismi di creazione, il mantenimento e la modifica dei circuiti neurali sono conservati pure.
Neurotrasmettitori, come la serotonina (5-idrossitriptamina, o 5-HT) possono servire come fattori di crescita prima di adottare il loro ruolo di molecole di segnalazione nel maturo circuito neurale 1-3 Studi precedenti hanno dimostrato che perturbato livelli di 5-HT durante l'embriogenesi alterare la connettività dei neuroni maturi 4. Altri hanno dimostrato che l'applicazione ectopica di 5-HT a neuroni in coltura Helisoma reprimere neuriti e sinaptogenesi 5-7. In Drosophila, sviluppo livelli di 5-HT sono inversamente proporzionali al numero di varici e dimensione, nonché il grado di aborization, lungo la lunghezza dei neuriti sporgenti al foregut dal CNS 8.
Neurotrasmissione serotoninergica ha dimostrato di modulare i comportamenti alimentari di specie diverse, tra cui Drosophila 8-9. Il circuito di alimentazione in Drosophila è relativamente semplice circuito che può essere utilizzato come modello per correlare l'uscita funzionale (alimentazione) con alterazioni nello sviluppo delle proiezioni assonale dal cervello foregut. Schoofs et al. hanno dimostrato che larvale Drosophila è regolata da generatori di pattern centrali che influenzano la muscolatura 10. Mentre l'anatomia muscolare specifico non è completamente compreso, è stato dimostrato che il nervo antenne, nervo mascellare, e prothoracic nervo accessorio sono responsabili dei bersagli muscolari coinvolte nellacomportamento alimentare. La maggior parte dei dati che coinvolgono la muscolatura e del nervo anatomia di alimentazione invertebrato è limitata a Calliphora larve.
Il tasso di alimentazione del secondo larve instar può essere valutato retrazione delle scleriti cephalopharyngeal (ganci bocca), ed è riproducibile e high-throughput. Le piastre cephalopharyngeal sono innervati da fibre di centrali neuroni 5-HT attraverso il nervo frontale. Il proventricolo, o foregut, è innervato da fibre serotoninergici (Recurrens del nervo) che fasciculate nel midgut e sono responsabili per la contrazione del foregut (Figura 1), 11-12. Cambiamenti nella ramificazione assonale, e il numero e le dimensioni delle varici lungo la lunghezza dei neuriti, possono essere quantizzati utilizzando tecniche immunoistochimiche. Manipolazione neuronale 5-HT durante lo sviluppo, direttamente o indirettamente, può modificare la potenza funzionale di questo circuito di alimentazione, che può essere valutato e correlata con i cambiamenti nel morphology dell'architettura neurite.
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Protocol
1. Manutenzione delle Gabbie Popolazione
- Mantenere gabbie popolazione a 25 ° C con un ciclo luce-buio 12 hr. Fintanto che i gruppi di controllo e sperimentali sono esposti alle stesse condizioni di illuminazione, allora questa tecnica può essere eseguita in un ambiente di laboratorio standard.
- Consentire femmine depongono le uova durante la notte su piastre di agar succo di mela.
- Raccogliere le larve neonate mantenendo piatti con le uova appena depositate a 25 ° C per 24 ore. Mettere un piccolo ciuffo di lievito nel centro della piastra per attirare le larve tratteggiata.
- Raccogliere 1 ° instar larve che hanno migrato nel lievito in pasta nel centro della piastra di succo di mela. Utilizzare una spatola metallica per trasferirla a un piatto di succo di mela fresco. Ulteriori lievito in pasta può essere aggiunto a garantire il cibo adeguato finché vengono eseguiti i test. Piastre di succo d'uva possono essere utilizzati anche al posto delle lastre di succo di mela.
- Ottenere in ritardo 2 °-inizio 3 ° instar larvae consentendo il 1 ° stadi di età per 40-48 ore. All'interno di questo campo le tariffe di alimentazione sono costanti 13. Età può essere confermata con l'esame dei ganci bocca in quanto vi sono cambiamenti distinti in questa struttura ad ogni muta larvale.
- Tardo 2 °-inizio 3 ° instar larve vengono raccolti per analisi di comportamento delicatamente e ampiamente lavaggio piatti succo di mela con acqua e raccogliere le larve su un filtro a rete. Le larve sono poi trasferiti ad una piastra di agar.
- Tutte le analisi vengono eseguite in parallelo utilizzando controllo e animali da esperimento.
2. Paradigm Behavioral - Locomotion
- Posizionare un singolo 3 ° larva su un substrato di agar 2% in un piatto di coltura tissutale di 100 mm e consentono la larva acclimatare per 30 sec. Le larve usare i loro scleriti cephalopharyngeal (ganci bocca) per spingere i loro corpi attraverso la superficie del substrato agar. Questo viene fatto su un piatto a parte, perché it è più difficile da visualizzare le contrazioni del corpo nella soluzione lievito come l'animale è quasi lo stesso colore del lievito.
- Osservare e registrare ogni posteriormente al movimento anteriore sopra il substrato per un periodo di 1 min. n = 20 per ogni genotipo. Non più di 10 animali dovrebbero essere testati per piastra.
3. Comportamento Paradigm - Alimentazione
- Uso blunt Inox # 5 pinzette, trasferire accuratamente il 3 ° larva dalla piastra locomotore agar al centro di una piastra di agar-riempite sovrapposti con 5 ml di soluzione di lievito 2% del panettiere attivato. Assicurarsi che la soluzione sia omogenea come il lievito si depositerà nel tempo. Quando nella soluzione di lievito, larve in gran parte mantenute e mangimi, facilitando l'osservazione del comportamento. Il tasso di bocca contrazioni gancio direttamente correlata con la quantità di cibo ingerito 14.
- Lasciare larva di ambientarsi per 30 sec.
- Osservare e registrare il numero dibocca contrazioni gancio per un periodo di 1 min. n = 20 per ogni genotipo.
4. Dissezioni Gut larvali
- Fare una soluzione di fissaggio di formaldeide al 4% EM-grade in 1x tampone fosfato salino (PBS) e mettere in un bicchiere posto a 3-bene.
- Sezionare con attenzione vagando tardi 3 ° instar budella larvali in un piatto di vetro 3-bene usando la soluzione 1x PBS, assicurandosi che ogni volta che proventricolo è lasciata intatta. Con una pinza, tenere l'estremità posteriore, e con l'altra, tenere i ganci bocca. Tenendo l'immobile estremità posteriore, tirare delicatamente i ganci bocca per accedere alle budella. Rimuovere eventuali relativi tessuti (ghiandole salivari, al cervello, corpo grasso, ecc), quindi trasferire ogni intestino al piatto 3-pozzetto contenente la correzione di formaldeide. Vagando 3 ° instar larva vengono utilizzati perché in questa fase di sviluppo, la larva cessa di alimentazione in preparazione per pupariation, e proventricolo viene cancellata di lievito. <li> Incubare coraggio a 4 ° C per una notte in una scatola di coltura di tessuti opachi.
- Prima di rimuovere la soluzione di fissazione di formaldeide dai pozzi, rimuovere il caeca gastrica e agganciare il midgut ~ 150 micron 2 dal proventricolo in modo che le proiezioni possono essere chiaramente visualizzate senza impedimenti.
- Rimuovere formaldeide correzione dai pozzetti e sostituirla con 1x PBT (1x PBS, 0,1% privo di proteasi albumina di siero bovino, 0,1% Triton X-100) soluzione tampone. Lavare accuratamente le budella 6x per 10 min in 1x PBT. Mettere campioni di tessuto su un rotatore meccanico, mentre facendo lavaggi.
- Incubare a 4 ° C per 1 ora a 10 -6 M 5-HT che permettono di migliorare serotonina. Lavare accuratamente le budella 6x per 10 min in 1x PBT. Studi precedenti hanno dimostrato che questa concentrazione di esogeno 5-HT non influisce architettura neuronale o densità varici in analisi immunoistochimica e semplicemente migliora il rapporto segnale-rumore 15-16.
- Incubare a 4 &# 176; C durante la notte in anti-serotonina anticorpo primario (monoclonale cresciuto a mouse o policlonali in coniglio). Lavare accuratamente le budella 6x per 10 min in 1x PBT. Mettere campioni di tessuto su un rotatore meccanico, mentre facendo lavaggi.
- Incubare a 4 ° C per 90 min in anticorpo secondario (Alexa Fluor 568 IgG di capra anti-topo o anti-coniglio; 1:400 diluizione). Lavare accuratamente le budella 6x per 10 min in 1x PBT. Mettere campioni di tessuto su un rotatore meccanico, mentre facendo lavaggi.
- Incubare a 4 mM di carbonato di sodio per 10 minuti su un agitatore rotante, quindi montare in 4% n-propile gallate/20 mM di carbonato di sodio, e vista in fluorescenza. Carbonato di sodio è usato per convertire i campioni al tampone e pH utilizzato nei mezzi di montaggio.
- Cattura immagini di campioni di tessuto immunostained a 400X per l'analisi.
5. Analisi dei circuiti neurali
- Fibre neurite sono stati quantificati (numero e dimensioni delle varicie grado di ramificazione) utilizzando Neuroleucida e Neuroexplorer. Tuttavia, questo può anche essere effettuata manualmente o utilizzando semplici neuriti Tracer (una applicazione che può essere scaricato online gratuito).
- Tracciare le singole proiezioni fibra dal cervello al proventricolo e quantificare il numero varici, le filiali e il numero di grandi varicosità per unità di lunghezza. Le fibre assonali sporgenti dal cervello vengono raggruppati nel nervo Recurrens e non sono accessibili per l'analisi fino a raggiungere proventricolo dove si separano e fasciculate.
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Representative Results
Il circuito di alimentazione serotoninergico nella larva Drosophila può servire come un modello estremamente efficace per osservare l'influenza di fattori particolari sullo sviluppo del sistema nervoso. Con quantificazione tasso di alimentazione, è possibile collegare l'architettura assonale del circuito di alimentazione con la sua uscita funzionale (Figura 1). Il dosaggio locomotore viene utilizzato come controllo fisiologico per le retrazioni dei ganci bocca, poiché larve utilizzare loro bocca ganci per spingersi sulla superficie dell'agar. Non ci dovrebbe essere alcuna differenza nelle risposte locomotore tra controllo e genotipi mutanti se le mutazioni influiscono solo sul circuito di alimentazione 8 (Figura 2A). Se differenze significative si verificano, è possibile che il comportamento larvale è stata compromessa da un uso improprio. Se l'arresto larve durante il saggio per tentare di scavare attraverso il substrato agar, possono essere troppo vecchio, e sono probabilmente la transizione a vagare stadi.E 'anche possibile il substrato agar può essere troppo duro, che renderebbe difficile per bocca ganci larvali per afferrare il substrato agar, che può essere affrontato bagnando la superficie agar.
Questo test può essere utilizzato per valutare se i ceppi di Drosophila con difetti anatomici neuronali influenzano lo sviluppo del circuito di alimentazione serotoninergico. Il corpo ellissoide mutante aperta (ebo 3) ha un difetto strutturale nel corpo ellissoide del complesso centrale. Confronto con il wild-type parentale ceppo Canton-S, CS wu, rivela che questi difetti anatomici durante risultato lo sviluppo del cervello per l'alimentazione depresso mentre locomozione è inalterata (Figura 2B).
I difetti anatomici in ebo 3 mutanti sembrano modificare lo sviluppo dell'architettura neurite dell'intestino. Figura 3 mostra le variazioni di architettura fibra del ebo 3 larve comparosso con CS wu; visualizzare queste larve un aumento della ramificazione, nonché un aumento del numero di piccole e grandi varicosità lungo la lunghezza dei neuriti. Nota: i nodi ramo (frecce), varicosità (punte di freccia), e grandi varici (asterischi). Figura 4 rappresenta la quantificazione di queste immagini.
La corretta quantificazione dell'architettura assonale richiede che le immagini siano estremamente chiara. Figura 5A rappresenta un'immagine appropriata per l'analisi. Immagini di qualità inferiore renderà difficile distinguere tra la fibra e varici (Figura 5B). Quando si fotografa l'architettura fibra, evitare di prendere le immagini che comprendono le proiezioni al anteriore del proventricolo, in quanto le fibre sono strettamente raggruppati e stanno separando gli uni dagli altri e possono apparire come se fossero ramificati. Più fibre posteriori all'interno del midgut sono più ramificati perché fasciculate una volta che un re in all'interno di questo tessuto. Quantificazione del ramo e numero varici, e le dimensioni delle varici, può essere analizzata manualmente o tramite un programma progettato allo scopo di studiare la morfologia dei neuriti, come Neuroleucida. Finché il proventricolo non è danneggiato durante il protocollo di immunoistochimica, e l'immagine è a fuoco, le preparazioni saranno accettabili per l'imaging e analisi. Se l'architettura fibra è chiaramente distinguibile da sfondo, e se i singoli varicosità possono essere identificati sulla lunghezza dei neuriti, la preparazione è appropriato per l'analisi. Inoltre, se i singoli varicosità possono essere identificati dal resto della fibra, questo è anche un altro indicatore di un'immagine di qualità per l'analisi. Tutte le fibre vengono analizzati con l'eccezione di quelli che fuori della gamma di messa a fuoco (in alcuni casi le fibre si curva tra più piani focali).
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Figura 1. Il circuito di alimentazione delle larve. Sfilettare una di 3 ° instar larva mostrando cervello e intestino tessuti (A). Tessuti Gut sezionato dal 3 instar larve sono state immunoistochimica con un anticorpo sollevata contro Drosophila neuronale triptofano idrossilasi (DTRH, B) o 5-HT ( C). A, B. E, dell'esofago; Mh, ganci bocca, Pr, proventricolo, Br, cervello (notare il modello di neuroni 5-HT). Arrowhead designa il nervo frontale; freccia, il nervo Recurrens C.. proventricolo mostra fibre assonali (frecce). Scale bar = 20 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
<br /> Figura 2. Difetti anatomici durante risultati di sviluppo del cervello in comportamento alimentare depresso. Gli animali sono stati analizzati per locomotore (A), e comportamenti alimentari (B). Locomozione è rimasta inalterata. n = 20 per ciascun saggio comportamentale, dal 2-3 esperimenti indipendenti. **** P <0,0001, t-test spaiato. Righe sopra il grafico raffigurano errore standard della media. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 3. Difetti anatomici durante lo sviluppo dei risultati del SNC in aberrazione nell'architettura fibra nell'intestino. Tessuto Gut sezionato dal 3 ° larve instar e immunoistochimica con anticorpi anti-5-HT. Freccia indica il nodo ramo. Arrowhead denota un piccolo varici. Asterisk deosserva grande varici. Scale bar = 40 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 4. Difetti anatomici durante risultato lo sviluppo del cervello in aberrante architettura fibra intestino. Analisi di tessuto proventricolare dal 3 ° larve instar sezionato e incubate con anti-5-HT. Ramificazione neurite (A), il numero di varicosità totali per 0,1 millimetri di lunghezza dei neuriti (B) e il numero di grandi varici (> 1μm 2) per 0,1 millimetri di lunghezza (C). CS wu, 20 fibre provenienti da 17 budella da due esperimenti indipendenti, ebo 3, 20 fibre provenienti da 18 budella da tre esperimenti indipendenti. **** P <0,0001, ** p <0.01, * p <0.05, tt spaiatoLinee est. sopra del grafico rappresentano l'errore standard della media. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
Figura 5. La qualità delle immagini è importante per la corretta quantificazione di architettura fibra intestinale. Tessuti Gut sezionato da CS wu terzo instar larve e immunostained anti-5-HT. (A). Immagine di buona qualità. (B). Immagine di scarsa qualità. Scale bar = 40 micron. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .
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Discussion
Sviluppo aberrante del circuito stomatogastric serotoninergico, che si verifica durante la tarda embriogenesi, influenzerà la sua funzione maturo. Modifiche della struttura neurite innervano l'intestino può essere correlato con l'uscita funzionale del circuito, che sta alimentando tasso (misurato dalla bocca contrazioni gancio in una soluzione di lievito) (Figura 1). L'utilizzo del sistema bipartito UAS-GAL4 in Drosophila permette di indirizzare specificamente up-o down-regolato espressione di un dato trascrizione di un tessuto specifico; cambiamenti nell'espressione di una data proteina può essere quantificato con precisione dato gli strumenti appropriati. Questa tecnica può essere utilizzata per delucidare le regioni del cervello, e anche sottoinsiemi neuronali necessarie per lo sviluppo di un circuito neurale specifico.
Il saggio locomotore è usato per confermare che le larve non sono altrimenti compromessa fisiologicamente, quindi, le larve con 40 contrazioni della parete del corpo o meno shoULD essere esclusi dalle analisi (Figura 2A). Ciò può avvenire sia perché il genotipo provoca anomalie fisiche, o perchè singoli animali sono stati feriti durante la movimentazione. Inoltre, la temperatura del locale in cui viene eseguito il test deve essere controllata, poiché temperature più fredde o calde possono influenzare i dati. Si consiglia di eseguire questo test comportamento tra 24-26 ° C. Nei giorni in cui la temperatura della camera di prova è più fresco, l'agar ha la tendenza ad indurirsi, quindi, riumidificazione della piastra di agar sarà richiesto dopo ogni test locomotiva è compiuta per garantire l'agar è sufficientemente morbido. È importante mantenere la piastra di agar di locomozione umido (non bagnato) per permettere alle larve di viaggiare attraverso la superficie e per impedire loro di penetrazione. Temperature più fredde impatto anche le prestazioni delle larve sul substrato agar, come larve tendono a viaggiare verso temperature preferenziali (24-26 ° C) 17-18. No più di 10 animali devono essere analizzati per piastra, e scartare qualsiasi piatto con forature nel substrato agar.
Quando si esegue il test di alimentazione, è importante tenere presente che la sospensione di lievito si depositerà nel tempo, roteazione del lievito sulla piastra garantisce il lievito rimane omogenea all'interno del dosaggio. Visibilità ridotta dei ganci bocca può verificare se la soluzione di lievito diventa troppo concentrato. Larve sane collocato nel contratto mezzi lievito loro ganci bocca circa 150-170 volte al minuto, l'alimentazione può essere ridotto a partire da 120, e il limite superiore è di 210.
Quando si esegue il protocollo di immunoistochimica, è saggio immunostain sia il controllo e campioni di tessuto sperimentali in parallelo per garantire la qualità simile di campioni di tessuto. Immunofluorescenza della neurite dell'architettura innervano l'intestino può essere migliorata incubando campioni di tessuto in anticorpo primario overnight a 4 ° C. L'incubazione of anticorpi a 4 ° C migliora il rapporto segnale-rumore (Figura 5). La qualità delle immagini è molto importante, in quanto questo è un fattore critico per la quantificazione precisa dell'architettura delle fibre (Figura 3) per rivelare variazioni di ramificazione e numero varici e dimensione (Figura 4). La qualità dei campioni di tessuto può essere distrutta se il rotatore utilizzato durante i periodi di lavaggio riscalda in qualsiasi punto da uso costante. Mentre l'imaging dei campioni di tessuto da essere sicuri di non lasciare i campioni sotto la luce del microscopio per troppo tempo come questo ridurrà l'immunofluorescenza dei campioni, non solo quella attualmente in fase di messa a fuoco, ma i campioni circostanti pure. Analisi dell'architettura fibra può essere facilmente completato con l'ausilio di software, ma ancora può essere eseguita manualmente. Classificazione delle piccole e grandi varici si riferiscono all'area delle varici, varicosità misura maggiore di 1 micron 2 sono classificati come grandi varicosità.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Research Fund del Presidente da Saint Louis University assegnato a WSN
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eclipse E-800 Microscope | Nikon Instruments | ||
| Neuroleucida | MBF Biosciences | NL-15 | Used to analyze gut fiber architecture, not necessary to have |
| Northern Eclipse | Empix Inc | Imaging software | |
| G-2E/C TRITC EX 528-553 | Nikon Instruments | 96312 | Filter for specific secondary antibody |
| N.A. 0.75; W.D. 0.72 mm; DIC Prism: 40xI, 40x I-C; Spring loaded | Nikon Instruments | MRH00400 | Objective used for imaging |
| Simple Neurite Tracer | NIH Image J | http://fiji.sc/Simple_Neurite_Tracer |
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