Summary
Интрамиокардиальной доставка клеток в мышиных моделях сердечно-сосудистых заболеваний, таких как гипертония или инфаркта миокарда, широко используется для проверки терапевтический потенциал различных типов клеток в регенеративной исследований. Таким образом, подробное описание и четкое визуализация этой хирургической процедуры поможет определить пределы и преимущества сердечно-сосудистых клеток терапевтических анализов в мелких грызунов.
Abstract
Предыдущие исследования показали, что доставка клеток способствует улучшение состояния сердечной функции по высвобождению цитокинов и факторов, которые увеличивают сердечную ткань реваскуляризации и выживаемость клеток. Кроме того, дальнейшие наблюдения показали, что специфические стволовые клетки, такие как сердечная стволовых клеток, мезенхимальных стволовых клеток и cardiospheres иметь возможность интеграции в окружающую миокарда путем дифференцирования в кардиомиоциты, клетки гладких мышц и эндотелиальных клеток.
Здесь мы представляем материалы и методы, чтобы надежно обеспечивают noncontractile клеток в стенки левого желудочка в immunodepleted мышей. Характерные этапы этого микрохирургической процедуры включают анестезии и инъекции обезболивания, эндотрахеальном интубации, разрез, чтобы открыть сундук и подвергать сердце и доставку клеток стерильной 30-иглы и точность микролитра шприца.
Обработка ткани, состоящий из сердца уборки, embeddiнг, секционирование и гистологическое окрашивание показало, что инъекции клеток интрамиокардиальной произведено небольшое повреждение в области эпикарда, а также в стенку желудочка. Noncontractile клетки были сохранены в инфаркт стенки с ослабленным иммунитетом мышей и были окружены слоем фиброзной ткани, вероятно, для защиты от сердечного давления и механической нагрузки.
Introduction
Различные протоколы доставки клеток были протестированы в мышиных и крысиных моделей сердечно-сосудистых заболеваний с целью перевода эффективности, эффективности и безопасности этой экспериментальной процедуры на людях. В небольших грызунов сердца, интрамиокардиальной доставка клетка является наиболее подходящим способом доставки клеток 1,2, тогда как в сердца крысы антеградном 3 и 4 ретроградной инфузии интракоронарного клеток также могут быть использованы. Оба метода имеют ограничения и преимущества. Доставка сотовый через интракоронарного маршруту имеет теоретические преимущества по сравнению с прямой внутримышечной инъекции в продвижении глобального распространения клеток 3, но он также имеет риска причинения коронарной эмболии 3,5. Ограничения на интрамиокардиальной поставки связаны с механической травмы, острого воспаления и повреждения 6,7 инфаркта. В организме человека клетки для сердечной ремонта доставляются интрамиокардиальной инъекции через эндокардиальной или хирургического эпикардиальнойподойти или интракоронарного артериальной маршрут 8. Инъекции по transvascular маршрутов подходит у пациентов с острым инфарктом и реперфузии миокарда, но не может быть возможно в случае общего закупорки или плохого потока в сосудах, произведенное территории 9. Прямой впрыск в стенки желудочка по transendocardial или transepicardial инъекции технически возможно в зависимости от состояния здоровья пациента. Действительно, было показано, что этот метод является безопасным 10,11, хотя для инъекций transepicardial открытой хирургии грудной клетки необходимо и для transendocardial подходы электрофизиологического отображение для каждого пациента необходимо дифференцировать участки жизнеспособного ишемического миокарда или травмированной 9.
Важно отметить, что в исследованиях клеточной терапии выбор наилучшей соты для пересадки находится в стадии расследования. Краткосрочные анализы (4 недели), показали, что инъекции сердечных стволовых клеток определяется как cardiospheres
В мышей и крыс моделей, долгосрочные исследования показали, что инъекции клеток не дальнейшего улучшения сердечной функции (12 месяцев). В самом деле, прививки эмбриональных клеток, полученных кардиомиоцитов человеческих стволовых (чЭСК-КМ) были в значительной степени изолированы от принимающей миокарда слоем фиброзной ткани 22,23. Аналогичные результаты наблюдались после трансплантации интрамиокардиальной скелетных миобластов в сердце инфаркта у мышей 24. Furthermoповторно, долгосрочная способность аллогенных МСК сохранить функцию в инфарктом сердце было ограничено перехода от immunoprivileged к иммуногенной состоянии после дифференцирования 25.
Принимая во внимание проблемы и перспективы, изложенные выше, мы показываем здесь, как доставить клетки путем интрамиокардиальной инъекции в мышей. Заметим, что клетки без свойств сократительных кардиомиоцитов не связаны с принимающей миокарда и образуют сплоченную массу тонким фиброзной барьера. Хотя в некоторых случаях этот результат может быть выгодно, следующий анализ может быть полезно понять, как приживление клеток можно модулировать, чтобы генерировать функционально связаны миокарда структуры, а также.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования на животных были проведены в соответствии с нормами международного (Директива 2010/63/EU Европейского парламента) и национальной (внутренних дел Великобритании, Закон 1986 г.) правил. Процедуры, описанные здесь, являются частью нашего плана работы в рамках лицензионных британских властей и не были предприняты с целью записи.
1. Подготовка клеток
Этот протокол описывает получение определенной клеточной линии (эмбриона человека в почках, HEK293 клетки) для демонстрационных целей. Протоколы Сотовые конкретных должны быть использованы для выращивания и в конечном итоге дифференциации плюрипотентных или взрослые стволовые клетки в конкретные клеточных клонов.
- Рост клеток в DMEM среде (с высоким содержанием глюкозы, 4500 мг / л), содержащем 1% пирувата натри, 2 мМ глутамина, 1% антибиотик Pen / Strep и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Один 10 см пластина должна быть нормально разделить на 1:03 и СМИ дополняется свежими каждые два дня.
- Лечить клетки мягко с trypsв 1х и ресуспендируют в среде DMEM, как описано в 1:01.
- Граф клеток в гемоцитометре камеры и собрать 3 х 10 6 клеток в отдельную пробирку.
- Центрифуга в ведро ротора качели в 100 г в течение 5 мин.
- Удалите супернатант и мыть осадок клеток стерильным фосфатного буфера 2х.
- Ресуспендируют в PBS 1X в концентрации 10 6/50 мкл для инъекции в левый желудочек immunodepleted мышей.
2. Предоперационного условия
- Поддержание immunodepleted мышей (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) стерильными пищевых гранул и воды в изоляторе с контролируемой температурой (22 ° С; табл. 1) до каждой операции.
- Выполните хирургия immunodepleted мышей под ламинаре. Очистите рабочую зону с 70% этанола и автоклав хирургические инструменты (щипцы и ножницы).
- Включите грелки для хирургии и для восстановления. Электрогрелки важныблокировать снижение температуры тела во время и после операции.
- Место чистое и автоклавного клетку на восстановление-грелку.
- Транспорт мышей в свои первоначальные клетки из изолятора в комнату хирургии в стерильной автоклавного сумке.
- Взвесьте мыши и в соответствии с массой тела впрыскивает подкожно (п) раствора, содержащего медетомидина и кетамина гидрохлорид, разбавленного в 0,9% стерильного солевого раствора в анестезию мыши, а также, чтобы расслабить мускулатуру (медетомидин 1 мг / кг; гидрохлорид кетамина 75 мг / кг).
- Удалите мышь из клетки, когда полностью под наркозом (в пределах 1-2 мин, не схождение щепотку рефлекс после стимуляции)
- Применить удаления крем для волос на левой стороне груди и области горла. После соответствующего периода времени (примерно 2-5 мин), вытереть волоски с смоченного водой ткани.
- Наведите мышь на хирургии панели в положении лежа на спине. Отточка зрения хирурга позиция вертикальная, хвост вниз головой вверх.
- Введите обезболивающее решение на 0,1-0,2 мкг / г разведенного в стерильный физиологический раствор (бупренорфин) в задней конечности подкожно и самого бритая области с асептической решение раствор йода с использованием хлопка наконечником аппликатором.
- Фокус микроскопа (2.5X цель) на области горла.
3. Хирургические Условия
- С тупыми ножницами сделать срединный брюшной разрез кожи около 0,5-1 см длиной чуть ниже перстневидного хряща. Отделите кожу от соединительной ткани визуализировать слюнные железы.
- Сплит слюнных желез на их естественное средней линии разделения, одновременно вытягивая каждую часть в стороны с Forcep и магнитного груди втягивающим и подвергать трахеи.
- Вытяните язык нежно в сторону, чтобы выставить гортань. Вставьте интубации трубки тщательно в трахею. Кончик трубки виден через отображаемого лarynx и трахеи. Важно отметить, что если трубка находится, но не видны, то в пищевод. Удалите ее и изменить положение кончика трубки.
- Подключите трубку к вентиляции машины. Установите ударный объем в 200 мкл и 150 ходов / мин. Закрепите трубку вентиляции на хирургии панели с лентой.
- С тупыми ножницами и щипцами, сделать вертикальное оперение, чтобы возглавить 1 - 1,5-см длиной разрез кожи над левой части грудной клетки.
- Ослабить кожу от соединительной слоев ткани / мышц и большой и малой грудных мышц, не делая надрезы.
- Выполнение торакотомии между третьим и четвертым ребрами следующим образом:
- Проколите межреберных мышечный слой, зажимая и царапин с маленькими, округлыми щипцами.
- После того, как межреберная слой мышц перфорированная, поместите в груди втягивающего максимально открыть грудную полость. Верхняя и средняя части левого желудочка (ЛЖ) с его вышележащих ушной раковины (атриум) являютсятеперь видны.
- Приготовьте шприц с точностью клеток. Шприц должен быть способен передавать некоторое количество объема 10 мкл для каждой инъекции. Литые 30 G иглу на конце шприца.
- Fix с лентой маленький пластиковый канюли (из introcan-W 20 г) на иглу, оставив подвергаются только 1 мм в том числе на открытом кончике иглы. Это позволит избежать иглу от перфорации всей стенки левого желудочка и инъекционных клетки в полости левого желудочка.
- С помощью объектива 5X, визуализировать на этом увеличении левого желудочка и впрыснуть клетки в стенки левого желудочка в 5 разных местах (каждая инъекция будет поставлять 10 мкл в общей сложности 106 клеток введенного). Если инъекция прошла успешно, белая область и отсутствие крупных обратной промывки клеток будут видны (если инъекции не было успешным, то животное будет исключена из функционального анализа).
- Снимите втягивающим. Закройте грудной стенки бу приложив две отдельные ребра с двумя стежками 6-0 шелковой нити.
- Увлажнение грудные мышцы и кожу с наконечником хлопка скользкой в PBS 1X и аккуратно положить мышцы обратно в исходное положение при помощи щипцов.
- Закройте кожу 3-4 стежков 6-0 шелковой нити. Шовный горло разрез с 2-3 стежков, чтобы закрыть кожу.
- Введите Атипамезол (1 мг / кг конечная концентрация) для возврата в анестезирующий эффект.
- Как только мышь начинает дышать самостоятельно, вынуть трубку из трахеи и положить мышь на правый бок. Мышь, как ожидается, восстановить в течение нескольких минут.
- Когда мышь начинает свою очередь и ходить, поместите его в теплое клетке восстановления (маленький IVC клетке с закрытой фильтрованной сверху) в течение часа.
- Оставьте животных в течение ночи в контролируемой нагретой коробке (37 ° C).
- Заполните блюдо с водой и гранул пищи, чтобы поддержать восстановление в течение первых 2 дней после операции.
Десять сердца, инъецированных клеток и 10 контрольных сердец не вводили проанализированы гистологически следующим образом:
- Выполнение анализа трансплантированных клеток через 1 неделю после инъекции (фиг. 1 и 3).
- После эвтаназии путем передозировки изофлуран, заливать сердца с 20 мл 4% параформальдегида (PFA), чтобы зафиксировать ткань. Высушить фиксированную ткани в увеличении процентного содержания этанола (от 70-100%) и вставлять в парафиновые блоки.
- Раздел сердца в парафин с микротоме в 5 мкм и пятно с гематоксилином и эозином для морфологического анализа.
- Визуализация соединительной ткани с помощью трихромовым красителем Массона.
- Проанализируйте изображений при сканера слайд микроскопа (1А, 2А, 3А, 3В и 3С) и визуализировать все сердце в короткая ось с помощью цифрового микроскопа сканера слайд (FIGUразрешением 1В и 1С).
- После этого анализа deparaffinize сердечные ткани в ксилоле, увлажняет путем погружения образцов в снижении процентного содержания этанола (от 100% в воде) и процесс сканирующей электронной микроскопии (SEM) следующим образом:
- Инкубировать парафина блоков с 1% дубильной кислоты в 0,1 М фосфатном буфере в течение 1 часа.
- Высушить образцов в увеличении процентного содержания этанола (25-100%).
- Сухие образцы с HMDS (Гексаметилдисилазан).
- Установите образцов на Стаббс с Acheson Silver Даг и пальто их золотом-палладия.
- Посмотреть образцы в аналитическом сканирующем электронном микроскопе (рис. 2b).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы вводили HEK293 клетки, которые отличаются от клеток сердца их различной морфологии (рис. 1), с формой булыжной сравнению с удлиненными кардиомиоцитов (рис. 1А). НЕК293 были более реактивный гематоксилин красителя (синий цвет) по сравнению с кардиомиоцитов (розовый цвет), вероятно из-за их повышенной ядерной контента (рис. 1А). Для того чтобы отличать впрыскиваемого клеток из ткани хозяина, HEK293 клетки метили DAPI 2 часа до инъекции. Меченые-клетки были видны в ткани миокарда как показано на рисунке 1Е. Ложно-оперированных Контрольные мыши не показали ущерб в всем сердцем (рис. 1в) и целостности ткани (рис. 1D).
В целом вид короткой оси сердца, введенные клетки были видны в виде однородной группы в области инъекции (фиг. 1В). Сгруппированы слоктей были окружены тонким слоем фиброзной ткани, которая появилась в виде синей области в трихромом окрашивания (рис. 2А). Клетки не были связаны с хост ткани миокарда, как показано на сканирующей электронной микроскопии (рис. 2В), вероятно, из-за их noncontractile функции и другой клеточной структуре.
В дополнение к указанным выше наблюдений мы отметили, небольшие участки повреждений, где игла вводили (фиг. 3А). Эти области запуска от внешнего слоя эпикарда сердца в стенке миокарда (фиг.3А). Введенные клетки (зеленая стрелка, рис. 3б) присутствуют в непосредственной близости от поврежденной области (черные стрелки, рис. 3б). DAPI-позитивных клеток были видны вдоль месте инъекции (фиг. 3C, белые стрелки). Через неделю после травмы, Tunel анализ не показал увеличение апоптоза клеток в месте повреждения, предполагая, что некроза не апоптоз произошло после инъекции иглой (фиг. 3D).
Рисунок 1. Гистологический анализ инъецированных клеток. А) Через неделю после инъекции клеток сердца заливали парафином и обработаны для окрашивания гематоксилином и эозином. Вводили клетки НЕК293 присутствовали в стенке левого желудочка. Изображения были получены с стерео флуоресцентный микроскоп. B) TriChrome окрашенных тканей показали, что клетки были сгруппированы в том же месте, где они были введены (стрелка). Справа нижние панели показывают короткой оси просмотра с правом (RV) и левого желудочков (ЛЖ). Красный прямоугольник показывает область, где клетки сохраняются (1.5X). Изображения были записаны с помощью сканирующего слайд микроскопом. C) TriChrome STAining контрольных ложнооперированных сердцах. Всего вид сердце с 5-кратным цель. D) Trichrome окрашивание ложнооперированных мышей, показывающих целостность ткани миокарда. E) HEK293 клетки окрашивали DAPI 2 часа до инъекции. Через неделю после инъекций сердца были встроены в октябре и секционные в криостат на 6 мкм. Клетки визуализировали в УФ в флуоресцентным микроскопом. Левый и правый желудочки показаны. В правом желудочке, правая панель, белая линия знаменует эпикардиальной слой. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Формирование фиброзной слоя между вводили клетки и ткани хозяина. А) окрашивание Trichrome шоуколлагеновый ткань образована между НЕК293 и мышиного ткани миокарда (стрелки). Изображения были записаны с помощью цифрового сканирующего микроскопа. B) Сердца парафина и обработаны для сканирующей электронной микроскопии. Изображения были записаны с помощью сканирующего электронного микроскопа и показать коллагеновые волокна (стрелки) между вводили НЕК293 (левая сторона) и принимающей миокарда (правая сторона). Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Впрыска сотовый производится небольшие участки повреждений. А) Trichrome окрашивание показывает небольшие участки повреждений, где игла вводили (синий цвет;. Стрелки) B) Парафиновые срезы окрашивали трехцветный станцийining и область, где вводили клетки обозначено черными стрелками. Введенные клетки (зеленая стрелка) были видны в непосредственной близости к поврежденной области. C) НЕК293, окрашенные DAPI 2 часа до инъекции, присутствовали вместе в месте инъекции (белая стрелка). Место инъекции указывается с зеленой стрелкой и белый открыта линия отмечает перикарда слой. D) Tunel Анализ, выполненный на парафиновых срезах, не показали соответствующие флуоресцентные положительных ядер. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой рукописи, мы показали, как выполнить интрамиокардиальной инъекцию клеток в мышиных сердцах. В качестве доказательства этой методологии, мы использовали НЕК293. Важно подчеркнуть, что НЕК293 не используются ни в одном исследовании клеточной терапии и, следовательно, выводы этой рукописи не подходят для прямого пересчета терапевтического подхода. Однако тот факт, что клетки HEK293 не сократительные клетки и не трансдифференцироваться в других типах клеток обращает внимание на технических аспектах, таких как свойств клеток быть доставлено и маршрута доставки.
Было сообщено, что интрамиокардиальной маршрут имеет тенденцию вызывать клеточные кластеры, внедренные в сердечной ткани 24,26, тогда как внутрикоронарное маршрут может обеспечить более равномерное распределение в месте повреждения. Для замены кардиомиоцитов, идеальным донором клеток должны проявлять электрофизиологические, структурную и сократительную Пропертиэс кардиомиоцитов и должны быть в состоянии интегрировать структурно и функционально в ткани хозяина, предполагая необходимость программы клеточной дифференцировки, чтобы быть использованы до трансплантации.
Ключевые моменты для успешной операции можно резюмировать следующим образом:
- Обезболить мышей с инъекционными соединений замедлять частоту сердечных сокращений и облегчения инъекции клеток
- Выполните эндотрахеальном катетеризации мышей в пользу функциональности легких.
- Выполните торакотомия избегая мышц разрез для поддержания грудной функциональность мышц для правильного дыхания.
- После разоблачения сердце, наблюдать за левый желудочек под микроскопом, чтобы визуализировать, имело ли место инъекции (видим в виде бледно-цвета).
- С помощью тонкой иглы и прецизионного шприц, чтобы избежать обширные перфорации ткани миокарда и придать нужное количество материала соответственно.
- Вложите в ножны иглу с пластиковой системы трубопроводов подвергая оNLY наконечника. Это позволило бы введение иглы к определенной глубине в левый желудочек (0,5 мм), избегая инъекции в полости желудочковой.
- Закройте грудь и пространство между ребрами тщательно, чтобы избежать воздействия легких к внешнему давлению.
Этот метод имеет высокий уровень успеха, если условия послеоперационный здравоохранения приоритетный. Животные должны быть интенсивно контролировать каждый день в течение недели на наличие признаков бедствия и боли. Инъекция обезболивающих соединений для контроля боли должны быть введены в соответствии с требованиями после операции. Местное применение облегчения боли, такой как лидокаин, также могут быть использованы. Кровотечение должно быть предотвращено тщательных хирургических методов. Однако, если происходит, то может быть остановлен путем прессования или лигирования сосудов. Мы отметили, что животные восстановить лучше и быстрее, если оставить в нагревательной коробки при 37 ° С в течение 12-20 часов после операции. Это лечение будет блокировать быстрое снижение температуры тела, ниформально происходит после хирургического вмешательства и администрирования анестезии. Послеоперационный инфекции могут иметь место, но должна быть не менее 1%. Процедуры асептические должны быть строго соблюдены, чтобы предотвратить инфекцию. Местное инфекции можно лечить с применением антибиотиков. Важно отметить, что обезвоживание следует контролировать путем подкожной инъекции физиологического раствора.
Желательно, чтобы управлять для инъекций ингаляционной анестезии в течение, например, изофлуран. В самом деле, мы обнаружили, что инъекции анестетика уменьшилось сердцебиение, что позволяет легче инъекции и меньше кровотечение, не вызывая животный дискомфорт.
Хотя инвазивными, инъекции небольших объемов клеток (25-50 мкл) в мышах возможно и безопасно. У нас было меньше 1% смертности путем введения 50 мкл НЕК293 в 5 различных областях стенки левого желудочка (10 мкл / впрыска). Эта методология обеспечивается присутствие клеток в нескольких областях инфаркта стене, что очень важно влечение стволовыми клетками, когда расширенные области ишемического повреждения должны быть достигнуты поставленные клеток. Для выполнения менее инвазивной хирургии, несколько протоколов были недавно опубликованы, хотя их воспроизводимость в разных лабораториях до сих пор не проверена. Например, инъекции клеток может быть выполнена методом крупным груди с высоким разрешением с помощью эхокардиографии 27. Использование этой системы требует высокой квалификации оператора для визуализации четко в двумерной картинки в стенку левого желудочка и поддерживать иглу в определенном месте в течение обычного систолического / диастолического циклов. Преимущество этого метода является имплантация клеток в миокард мыши на нужное место в клинически значимом сроки после индукции инфаркта миокарда. Однако этот подход не представляется возможным с процедур по хирургии, таких как инфаркт миокарда индукции или transaortic полосы из-за повышенной смертности животных переживает вторую операцию 27. Интересно, что Хамди и коллеги сравнили прямой интрамиокардиальной инъекцию против доставки клеток в Gelfoam построить на эпикардиальной области 28. Они отметили, что наложение клетка построить на эпикарда привело к улучшению функциональности трансплантата по сравнению с интрамиокардиальной инъекции клеток и сообщил, что этот метод является воспроизводимым, удобный и менее травматично для животных 28.
Важной особенностью инъекции клеток экспериментов является отслеживание клеток и их выживание. Мы показали, что клетки HEK293 легко обнаружить из-за их различимой морфологии по сравнению с сердечных клеток. Эти клетки пережили инъекции (данные не показаны) и были сохранены в ткани через одну неделю после операции. Чтобы проследить клетки для долгосрочных исследований и анализировать их приживление в ткани поставки, а также в других тканях, несколько методов используются, в том числе люминесцентных маркировки и рыбы внализ в секс-несоответствия трансплантации экспериментов 29. Важно отметить, что естественных изображений в будет играть важную роль в направлении в пробирке анализ в будущих исследованиях. В самом деле, одним из преимуществ в естественных изображений по гистологических методов является отслеживание клеток в продольных исследованиях в тех же животных без необходимости эвтаназии 29. В этой методологии клетки могут быть выделены биолюминесценции реагентов, частиц железа и специфических генов-репортеров, которые будут полученную с позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) и магнитно-резонансной (МРТ).
Наш анализ показал, что noncontractile клетки, такие как клетки HEK293 предпочтительно сгруппированы в районе, где им вводили окружена тонкой коллагеновой ткани. Хотя патофизиологические механизмы, приводящие к формированию фиброзной ткани в качестве immunodepleted мыши неизвестны, коллагеновый ткани видны вокруг трансплантированных клеток может быть сравнима с конечнойткани совместимы имплантат. В этом случае экзогенный материал не может быть удалена с помощью воспалительных клеток и становится инкапсулированы в плотном слое фиброзной соединительной ткани, который изолирует его от окружающих тканей. Как и в терминальной стадии этапах заживления ран, это гранулированный ткань насыщена сосудами и обеспечивает выживание имплантированного материала.
Технически метод, описанный здесь был успешным, хотя интрамиокардиальные инъекционная игла подготовила небольшую площадь повреждения окружающих тканей. Хотя измерения сердечной функции не были Целью данного обзора, будущие исследования должны исследовать, может ли незначительное повреждение тканей возмущают анализы клеточной терапии. Кроме того, было бы важно, чтобы проанализировать ли травма производится в области инъекции вызвано иглы, по количеству впрыскиваемого клеток или комбинацией того и другого.
В поддержку нашим данным, было показано, что transplantatioн смешанных популяций дифференцированных человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК), содержащих 20-25% кардиомиоцитов (чЭСК-см) в здоровом сердце иммунитетом мышей (NOD-SCID) привело к быстрому образованию трансплантатов, в которых кардиомиоциты стали организованы и созрел с течением времени и населения noncardiomyocyte погиб 23. Интересно, что авторы наблюдали, что чЭСК-СМ были в значительной степени изолированы от принимающей миокарда слоем фиброзной ткани, которая предотвратить образование электрофизиологического синцитий 22,23. В другом исследовании, Кехат соавт. Обнаружили, что чЭСК-CM успешно развивающийся желудочка у свиней с полной блокады сердца. Это исследование показало, что трансплантированные клетки выжили, функционировал, и интегрирован с клетками-хозяевами, что свидетельствует их способность функционировать в качестве биологического альтернативы электронного кардиостимулятору 30. Эти два противоречивые результаты могут быть согласованы по разнице в структуре и функции хой и виды доноров. В самом деле, возможно, что эффективность сцепления трансплантированных кардиомиоцитов, может зависеть от относительной частоты размола принимающих и донорских клеток. В исследовании Ван Laake в 23, формирование функциональных узлов может быть нарушена в связи с разной частотой биений человеческих кардиомиоцитов (60-100 ударов в минуту) в зависимости от грызунов кардиомиоцитов (300-600 ударов в минуту). Это не было бы в случае с человеком против свиных экспериментов по трансплантации, как описано в Кехат анализа 30.
Длина времени наблюдения является еще одним отягощающим фактором. чЭСК-CM пересадили в сердце грызуна после инфаркта миокарда индуцированных функцию мелиорации сердечную только для краткосрочных временных точках (4 недели). Тем не менее, в 12 недель, сердечная функция была не дальше поддерживать, несмотря трансплантата выживания 23. Авторы отметили, что размер имплантата (увеличение количества клеток) не было связано с улучшением долгосрочной сердечной выжIval и функциональное улучшение 31, указывая, что долгосрочный анализ по сравнению с краткосрочной или среднесрочной перспективе анализов должны быть выполнены в будущих исследованиях, не требуя увеличение количества клеток для инъекций.
В настоящем исследовании, несколько вопросов остаются относительно типа клеток для пересадки, выбор вида хост-доноры быть проверены и детальной оценке аритмии потенциала клеток. В идеале, стволовые клетки имплантированы в миокард для замены или функции кардиостимулятора должны функционально пара с остальных миоцитов. В крысиной модели инфаркта миокарда, Фернандес и др.. 32 используется программируемого электростимуляции (PES), чтобы оценить аритмии восприимчивость, что свидетельствует о повышении Индуцируемость желудочковой аритмии в миобластов впрыском сердцах сравнению с контрольной группой. В этом же исследовании, инъекции мозга, полученных аутологичных клеток костного не приведет к увеличению inducibilность желудочковых аритмий по сравнению с контрольной, что приводит авторов к выводу, что миобласты выставлены конкретный аритмогенной риск. В другом исследовании, костномозгового происхождения клеток костного (BMC) эффективно привитых в кластерах в рамках инфаркта шрам или пограничной зоне, но показали не в электронном виде не вызывали Са переходных 33. Интересно, Вэй и др.. Показали, что мезенхимальные стволовые клетки (МСК) не приобретают электрофизиологические свойства зрелых кардиомиоцитов в период выживания в инфаркта сердца. Тем не менее, они могут облегчить электрическую уязвимость и не способствуют желудочковой аритмии 34.
Эффективность и появление аритмии терапии стволовой клетки зависит от клеток, а также на маршрутах доставки. Действительно, в сердцах крыс, перенесших ИМ 35, интрамиокардиальной инъекции BMC, хотя улучшения функции сердца, увеличение последовательных желудочковых преждевременные сокращения и желудочка tachycardIA для начальных 14 дней. При использовании внутрикоронарное маршрут, появление желудочковой аритмии был заметно снизилась. В клинических исследованиях, про-аритмии функция вводили клетки трудно оценить, поскольку большинство пациентов получают бета-блокатор агентов, как указано для ишемической болезни сердца. Лечение бета-блокаторами может маскировать потенциальную про-аритмической эффект трансплантированных клеток. Исследования на животных, таким образом, важно оценить основы про-аритмических стимулов в клеточной терапии.
Таким образом, наши данные демонстрирует возможность интрамиокардиальной клеток-инъекции у мышей, но и подчеркивает необходимость детального анализа об условиях безопасности клеточной трансплантации. В организме человека, было показано, что введение клеток связано с про-аритмии 36-38, рестеноз 39, ускоренное развитие атеросклероза 40 и коронарную обструкцию 41. Фундаментальные исследования будет иметь важное значение в будущем клинической приложенияlications, чтобы понять, какие клетки должны быть доставлены, способ доставки, механизмы ремонта инфаркта функции клеточного и дизайн аллогенных против аутологичных протокола трансплантации клеток, что на пользу всем человеческой популяции. Из-за высоких затрат, связанных с крупных клинических испытаний, воспроизводимость и эффективности протоколов трансплантации необходимо решать на доклинических моделях, таких как те, что описаны здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Магди Якуб институт (MYI) для поддержки анализа микроскопии и проектов, связанных с сердечной ремонт, техники и менеджер нашей вивария. Эта работа была поддержана Сердца Британского фонда (BHF), Проект по гранту PG/10/019. MPS поддерживается MYI и BHF. TP является BHF-исследовательский Совершенство сотрудник. NR является NH & MRC Австралия сотрудник.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolator | Pfi systems | Quotation needed | |
| Heating Pad | Vet Tech Solutions | HE006 | For small animals |
| Medetomidine | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Ketamine hydrochloride | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Atipamezole | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Hair removal cream | commercial shops | ||
| Buprenorphine | NVS | Veterinary prescription is necessary | |
| Leica MZFLIII microscope | Leica | Model S6E | With swing arm stand TS0 |
| Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner | Hamamatsu | RS series | |
| Scanning Electron Microscope | Jeol | JSM-6610 | |
| Blunt scissors | FST | 14084-09 | |
| Minivent | Harvard Apparatus | 73-0043 | Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844) |
| Forceps | FST | 11052-10 | |
| Retraction system | FST | 18200-20 | Kit for animals up to 200 g |
| 30 G 12 mm; ½ inch | BBraun | A210 | Fine yellow |
| Microliter syringe | ESSLAB | 81201 | Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700 |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | W1614T |
References
- Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
- Taylor, D. A., et al. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat. Med. 4, 929-933 (1998).
- Suzuki, K., et al. Cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction using vascular endothelial growth factor-expressing skeletal myoblasts. Circulation. 104, 207-212 (2001).
- Suzuki, K., et al. Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function. Circulation. 110, 225-230 (2004).
- Robinson, S. W., et al. Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant. 5, 77-91 (1996).
- Muller-Ehmsen, J., et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 107-116 (2002).
- Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
- Dimmeler, S., Zeiher, A. M., Schneider, M. D. Unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair. J. Clin. Invest. 115, 572-583 (2005).
- Oettgen, P., Boyle, A. J., Schulman, S. P., Hare, J. M. Cardiac Stem Cell Therapy. Need for Optimization of Efficacy and Safety Monitoring. Circulation. 114, 353-358 (2006).
- Krause, K., et al. Percutaneous intramyocardial stem cell injection in patients with acute myocardial infarction: first-in-man study. Heart. 95, 1145-1152 (2009).
- Rodrigo, S. F., et al. Intramyocardial injection of bone marrow mononuclear cells in chronic myocardial ischemia patients after previous placebo injection improves myocardial perfusion and anginal symptoms: an intra-patient comparison. Am. Heart J. 164, 771-778 (2012).
- Smith, R. R., et al. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation. 115, 896-908 (2007).
- Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 2, 173-181 (2009).
- Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
- Malliaras, K., et al. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells. Circulation. , 125-1100 (2012).
- Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, 763-776 (2003).
- Bearzi, C., et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15885-15890 (2009).
- Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308, 2369-2379 (2012).
- Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379, 895-904 (2012).
- Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, 1847-1857 (2011).
- Brunt, K. R., Weisel, R. D., Li, R. K. Stem cells and regenerative medicine - future perspectives. Can. J. Physiol. Pharmacol. 90, 327-335 (2012).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
- van Laake, L. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction. Stem Cell Res. 1, 9-24 (2007).
- Leobon, B., et al. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7808-7811 (2003).
- Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122, 2419-2429 (2010).
- Reinecke, H., Poppa, V., Murry, C. E. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 241-249 (2002).
- Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, 1307-1314 (2005).
- Hamdi, H., et al. Cell delivery: intramyocardial injections or epicardial deposition? A head-to-head comparison. Ann. Thorac. Surg. 87, 1196-1203 (2009).
- Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marban, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circ. Res. 106, 479-494 (2008).
- Kehat, I., et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
- van Laake, L. W., et al. Improvement of mouse cardiac function by hESC-derived cardiomyocytes correlates with vascularity but not graft size. Stem Cell Res. 3, 106-112 (2009).
- Fernandes, S., et al. Autologous myoblast transplantation after myocardial infarction increases the inducibility of ventricular arrhythmias. Cardiovasc. Res. 69, 348-358 (2006).
- Scherschel, J. A., Soonpaa, M. H., Srour, E. F., Field, L. J., Rubart, M. Adult bone marrow-derived cells do not acquire functional attributes of cardiomyocytes when transplanted into peri-infarct myocardium. Mol. Ther. 16, 1129-1137 (2008).
- Wei, F., et al. Mesenchymal stem cells neither fully acquire the electrophysiological properties of mature cardiomyocytes nor promote ventricular arrhythmias in infarcted rats. Basic Res Cardiol. 107, 274 (2012).
- Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
- Bartunek, J., et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation. 112, 178-183 (2005).
- Britten, M. B., et al. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Circulation. 108, 2212-2218 (2003).
- Smits, P. C., et al. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J. Am. Coll. Cardiol. 42, 2063-2069 (2003).
- Kang, H. J., et al. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet. 363, 751-756 (2004).
- Fernandez-Aviles, F., et al. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ. Res. 95, 742-748 (2004).
- Vulliet, P. R., Greeley, M., Halloran, S. M., MacDonald, K. A., Kittleson, M. D. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs. Lancet. 363, 783-784 (2004).
