Summary
Entrega célula intramio em modelos murinos de doenças cardiovasculares, como a hipertensão ou o enfarte do miocárdio, é amplamente utilizado para testar o potencial terapêutico de diferentes tipos celulares em estudos de regeneração. Portanto, uma descrição detalhada e uma visualização clara deste procedimento cirúrgico ajudará a definir os limites e as vantagens das análises terapêuticas celulares cardiovasculares em pequenos roedores.
Abstract
Estudos anteriores mostraram que a entrega de células promove a melhora da função cardíaca pela liberação de citocinas e fatores que aumentam a revascularização do tecido cardíaco e sobrevivência celular. Além disso, observações adicionais revelaram que as células estaminais específicos, tais como células estaminais cardíacas, células estaminais mesenquimais e cardiospheres têm a capacidade de integrar no interior do miocárdio circundante através da diferenciação em cardiomiócitos, células de músculo liso e células endoteliais.
Aqui, apresentamos os materiais e métodos para entregar confiantemente células não contrátil na parede do ventrículo esquerdo de camundongos Imunodeprimido. Os passos mais salientes deste procedimento microcirúrgico envolve anestesia e analgesia injeção, intubação orotraqueal, a incisão para abrir o peito e expor o coração e entrega de células por uma agulha estéril de calibre 30 e uma seringa de precisão microlitro.
Processamento de tecidos que consiste em colher coração, embedding, o seccionamento e a coloração histológicos mostraram que a injecção de células intramio produzido um pequeno dano na área do epicárdio, assim como na parede do ventrículo. Células não contrátil foram mantidas na parede do miocárdio de ratos imunocomprometidos e foram rodeados por uma camada de tecido fibroso, para o proteger de pressão cardíaca e carga mecânica.
Introduction
Vários protocolos de entrega de células foram testados em modelos murinos e de ratazana de doenças cardiovasculares, com o objectivo de traduzir a eficiência, a eficácia e segurança deste procedimento experimental em pacientes humanos. Em pequenos corações de roedores, a entrega de células mostrou ser o método mais viável de fornecimento de células de 1,2, enquanto que no anterógrada coração de rato 3 e infusão de células 4 intracoronária retrógrado também pode ser usado. Ambos os métodos têm limitações e vantagens. Entrega celular por via intracoronária tem vantagens teóricas sobre injeção intramuscular direto em promover a disseminação de células mundial 3, mas também tem o risco de causar 3,5 embolia coronária. Limitações à entrega intramiocárdica estão associados a danos mecânicos, inflamação aguda e danos 6,7 miocárdio. Em humanos, as células para o reparo cardíaco são entregues pela injeção transmural através de um epicardial endocárdio ou cirúrgicoaproximar ou por via arterial intracoronária 8. Injeção por via transvascular é adequado em pacientes com infarto agudo do miocárdio e reperfundido, mas pode não ser possível em caso de oclusões totais ou fluxo de pobres dentro dos vasos do território efetuada 9. Injeção direta na parede ventricular por injeção transendocárdica ou transepicárdica é tecnicamente viável, dependendo do estado de saúde do paciente. De facto, tem sido demonstrado que esta técnica é segura 10,11, embora injectável transepicárdica é necessária uma cirurgia de peito aberto e para transendocárdica se aproxima de um mapeamento electrofisiológico para cada paciente é necessário diferenciar sítios de miocárdio isquémico ou cicatrizes viável 9.
É importante ressaltar que em estudos de terapia celular a escolha do melhor celular para ser transplantado ainda está sob investigação. Análises de curto prazo (4 semanas) mostrou que a injeção de células-tronco cardíacas definidas como cardiospheres
Em modelos de ratos e ratos, estudos de longo prazo revelaram que a injeção de células não melhorar a função cardíaca (12 meses). Com efeito, os enxertos de células derivadas de cardiomiócitos estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias humanas-CM) foram isoladas do hospedeiro do miocárdio por uma camada de tecido fibroso 22,23. Resultados similares foram observados após o transplante de mioblastos esqueléticos intramiocárdica no coração de ratos infartados 24. Furthermore, a capacidade de longo prazo de MSCs alogénicas para preservar a função do coração enfartado foi limitado por uma transição de um estado para immunoprivileged imunogénico após diferenciação 25.
Levando em consideração os desafios e as perspectivas descritas acima, mostramos aqui como entregar as células pela injeção transmural em camundongos. Observamos que as células sem propriedades contráteis de cardiomiócitos não estão relacionadas com o miocárdio hospedeiro e formam uma massa coesa com uma barreira fibrótica fina. Embora, em alguns casos, este resultado pode ser vantajoso, a seguinte análise pode ser útil para compreender como enxerto de células pode ser modulado de modo a gerar estruturas miocárdio funcionalmente ligados bem.
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Protocol
Todos os estudos com animais foram realizados em conformidade com as normas internacionais (Directiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu) e nacional (UK Home Office, Act 1986) regulamentos. Os procedimentos descritos neste documento fazem parte do nosso plano de trabalho sob licença autoridades do Reino Unido e que não tenham sido realizadas com a finalidade de gravação.
1. Preparação de Células
Este protocolo descreve a preparação de uma linha celular específica (rim embrionário humano, células HEK293) para fins de demonstração. Protocolos específicos de células deve ser empregue para o cultivo e, eventualmente, diferenciando pluripotentes ou células estaminais adultas em linhagens celulares específicas.
- Cultivar células em meio DMEM (glucose elevada, 4,500 mg / L) contendo piruvato de sódio 1%, 2 mM de glutamina, 1% de antibiótico de Pen / Strep e 10% de soro fetal bovino (FBS). Uma placa de 10 centímetros deve ser normalmente dividida em 1:03 e meio suplementado fresco a cada dois dias.
- Trate células levemente com Trypsem 1x e ressuspender em meio DMEM, como descrito em 1.1.
- Contar as células numa câmara hemocitómetro e recolher 3 x 10 6 células para um tubo separado.
- Centrifugar em um balanço balde rotor a 100 g por 5 min.
- Descartar o sobrenadante e lava-se o sedimento de células com tampão de fosfato estéril 2x.
- Ressuspender em PBS 1x a uma concentração de 10 6/50 ^ para ser injectada no ventrículo esquerdo de ratos Imunodeprimido.
2. Condições pré-cirúrgicas
- Manter camundongos Imunodeprimido (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) com grânulos estéreis de alimentos e água em um isolador de temperatura controlada (22 ° C; Tabela 1) antes de cada cirurgia.
- Realizar a cirurgia de camundongos Imunodeprimido sob uma capela de fluxo laminar. Limpe a área de trabalho com 70% de etanol e autoclave instrumentos cirúrgicos (pinças e tesouras).
- Ligue almofadas de aquecimento para a cirurgia e para a recuperação. Almofadas de aquecimento são importantespara bloquear a redução da temperatura corporal que ocorre durante e pós-cirurgia.
- Coloque uma gaiola limpa e esterilizada no bloco de recuperação-aquecimento.
- Transportar os ratos em suas gaiolas originais do isolador para a sala de cirurgia em uma bolsa estéril autoclavada.
- Pesa-se o rato e de acordo com o peso corporal injectar por via subcutânea (sc) de uma solução contendo cloridrato de cetamina e medetomidina, diluída em solução salina estéril a 0,9%, para anestesiar o rato, assim como para relaxar a musculatura (medetomidina 1 mg / kg; cloridrato de cetamina 75 mg / kg).
- Remover o rato da gaiola quando totalmente anestesiados (dentro de 1-2 min, nenhum reflexo toe-pitada após estimulação)
- Aplicar creme de depilação no lado esquerdo do peito e da área da garganta. Depois de uma quantidade adequada de tempo (cerca de 2-5 min), limpe os cabelos soltos com um tecido molhado em água.
- Posicione o mouse no painel de cirurgia em decúbito dorsal. A partir deponto de vista do cirurgião, a posição é vertical, cauda para baixo da cabeça para cima.
- Injectar solução analgésica em 0,1-0,2 ug / g diluídos em solução salina estéril (buprenorfina) subcutaneamente no membro posterior e cobrir a área raspada com a solução de iodo povidona asséptica usando um aplicador com ponta de algodão.
- Concentre-se o microscópio (objetiva 2.5X) na área da garganta.
3. Condições cirúrgicas
- Com uma tesoura sem corte fazer uma incisão na pele ventral mediana de cerca de 0,5-1 cm de comprimento um pouco abaixo da cartilagem cricóide. Separa-se a pele do tecido conjuntivo para visualizar as glândulas salivares.
- Dividir as glândulas salivares em sua divisão de linha média naturais puxando simultaneamente cada parte para um lado com retrator peito pinça e magnético e expor a traquéia.
- Puxar a língua suavemente para o lado a expor a laringe. Deslize o tubo de intubação com cuidado na traquéia. A ponta do tubo é visível através da l exibidoarynx e traquéia. Mais importante, se o tubo está no, mas não são claramente visíveis, é no esófago. Removê-lo e alterar a posição da ponta do tubo.
- Conectar o tubo à máquina de ventilação. Defina o volume de curso a 200 mL e 150 AVC / min. Fixe o tubo de ventilação no painel cirurgia com uma fita.
- Com uma tesoura sem corte e uma pinça, faça uma cauda vertical para cabeça 1 - a 1,5 cm da pele de longa incisão sobre a área do tórax esquerdo.
- Solte a pele das camadas de tecido / musculares e conjuntivos as maiores e menores músculos peitorais sem fazer incisões.
- Toracotomia entre as terceira e quarta costela como se segue:
- Perfurar a camada de músculo intercostal beliscando e arranhando com pequenas pinças arredondadas.
- Uma vez que a camada de músculo intercostal é perfurado, coloque o afastador peito para abrir ao máximo a cavidade torácica. As partes superior e médio do ventrículo esquerdo (VE) com a sua orelha sobrejacente (átrio) sãoagora visível.
- Prepara-se uma seringa de precisão com as células. A seringa deve ser capaz de fornecer uma quantidade de volume de 10 ul de cada injecção. Lançar uma agulha G 30, com a ponta da seringa.
- Fixar com fita adesiva uma pequena cânula de plástico (de um Introcan-W 20 L) em que a agulha, deixando exposta apenas 1 mm, incluindo a ponta aberta da agulha. Isto vai evitar que a agulha perfura a parede do ventrículo esquerdo e toda a injecção das células no interior da cavidade do ventrículo esquerdo.
- Com a ajuda de um objetivo 5X, visualizar com este aumento, o ventrículo esquerdo e injetar as células na parede do ventrículo esquerdo em 5 locais diferentes (cada injeção vai entregar 10 ul para um total de 106 células injetadas). Se a injecção for bem sucedido, uma área branca e na ausência de grande retrolavagem das células será visível (se a injecção, não foi bem sucedida, o animal seriam excluídos da análise funcional).
- Retire o afastador. Feche a parede torácica by juntando as duas nervuras separadas com dois pontos de sutura de seda 6-0.
- Hidratar os músculos peitorais e pele com um cotonete embebido em PBS 1x e gentilmente colocou os músculos de volta para a posição original com a pinça.
- Feche a pele com 3-4 pontos de sutura 6-0 seda. Suturar a incisão na garganta com 2-3 pontos para fechar a pele.
- Injetar atipamezole (1 mg / kg de concentração final) para reverter os efeitos anestésicos.
- Assim que o rato começa a respirar de forma autônoma, tirar o tubo da traquéia e coloque o mouse sobre o seu lado direito. O mouse deve se recuperar em poucos minutos.
- Quando o rato começa a girar e andar, colocá-lo na gaiola de recuperação quente (gaiola pequena IVC com top filtrada fechado) por uma hora.
- Deixar os animais durante a noite numa caixa aquecida controlada (37 ° C).
- Encha um prato com água e alimentos pellet para apoiar a recuperação durante os primeiros 2 dias após a cirurgia.
Dez corações injectados com células de controlo e 10 corações não injectados são analisados histologicamente como se segue:
- Realizar a análise das células enxertadas de 1 semana após a injecção (Figuras 1 e 3).
- Após a eutanásia por overdose de isoflurano, perfuse os corações com 20 ml de paraformaldeído 4% (PFA) para fixar o tecido. Desidratar o tecido fixado em percentagens crescentes de etanol (70-100%) e incorporar em blocos de parafina.
- Seção dos corações em parafina com um micrótomo a 5 mM e mancha com hematoxilina e eosina para análise morfológica.
- Visualize tecido conjuntivo usando tricrômico de Masson.
- Analisar as imagens em um microscópio scanner de slides (Figuras 1A, 2A, 3A, 3B e 3C) e visualizar todo o coração em eixo curto usando um microscópio scanner de slides digitais (FiguRes. 1B e 1C).
- Após as análises acima, Retire a parafina os tecidos do coração em xileno, re-hidratados, submergindo as amostras em percentagens decrescentes de etanol (a partir de 100% de água) e um processo para a Microscopia Electrónica de Varrimento (SEM), da seguinte forma:
- Incubar blocos desparafinadas com 1% de ácido tânico, em tampão fosfato 0,1 M durante 1 hora.
- Desidratar espécimes em percentagens crescentes de etanol (25-100%).
- As amostras secas com HMDS (hexametildisilazano).
- Monte os espécimes em Stubbs com Acheson Prata Dag e revesti-los com ouro-paládio.
- Veja amostras em um microscópio eletrônico de varredura analítica (Figura 2B).
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Representative Results
Nós injectadas células HEK293, que são distinguíveis das células do coração pela sua morfologia diferente (Figura 1), com uma forma de paralelepípedos em comparação com os cardiomiócitos alongadas (Figura 1A). Células HEK293 foram mais reativas para corante hematoxilina (cor azul) em comparação com os cardiomiócitos (cor-de-rosa), provavelmente por causa de seu aumento do conteúdo nuclear (Figura 1A). Para além disso, distinguir as células injectadas a partir do tecido do hospedeiro, as células HEK293 foram marcadas com DAPI 2 horas antes da injecção. As células marcadas foram visíveis no tecido do miocárdio, como mostrado na Figura 1E. Ratinhos operados por simulação de controlo não mostraram nenhum dano em todo o coração (Figura 1C) e a integridade do tecido (Figura 1D).
Numa vista de conjunto de eixo curto do coração, células injectadas foram visíveis como um grupo homogéneo na área de injecção (Figura 1B). O c agrupadosvaras foram cercados por uma fina camada de tecido fibroso, que apareceu como uma área azul na coloração tricrômico (Figura 2A). As células não estavam relacionados com o tecido do miocárdio host, como mostrado por microscopia eletrônica de varredura (Figura 2B), provavelmente devido a sua função não contrátil e diferente estrutura celular.
Além das considerações precedentes, notou-se pequenas zonas de dano em que a agulha foi injectada (Figura 3A). Estas áreas de correr a partir da camada externa do epicárdio do coração na parede do miocárdio (Figura 3A). Células injetadas (seta verde, Figura 3B) estão presentes na proximidade da área lesada (setas pretas, Figura 3B). Células DAPI-positivos eram visíveis ao longo do local de injecção (Figura 3C, as setas brancas). Uma semana após a lesão, TUNEL não mostrar um aumento de células apoptóticas no local da lesão, o que sugere que a necroseem vez de apoptose ocorreu após a injeção da agulha (Figura 3D).
Figura 1. A análise histológica das células injetadas. A) Uma semana após a injecção de células corações foram embebidos em parafina e processado para hematoxilina e eosina. Células HEK293 injectados estavam presentes na parede do ventrículo esquerdo. As imagens foram obtidas com um microscópio de fluorescência estéreo. B) Trichrome tecidos corados mostrou que as células foram agrupadas no mesmo local onde são injectadas (seta). Painéis de fundo direita mostram o eixo curto ver com o ventrículos direito (VD) e (LV). O retângulo vermelho mostra a área onde as células são mantidas (1.5X). As imagens foram gravadas com um microscópio de varredura slide. C) Tricrômico ruaaining de corações operados por simulação de controle. Vista todo o coração com uma 5X objetivo. D) Tricrômico coloração de ratos sham-operado, mostrando a integridade do tecido do miocárdio. E) HEK293 células foram marcadas com DAPI 2 horas antes da injeção. Uma semana após a injecção corações foram embebidos em OCT e seccionados num criostato a 6 um. As células foram visualizados sob UV num microscópio fluorescente. Ventrículos esquerdo e direito são mostrados. No ventrículo direito, o painel direito, a linha branca marca a camada epicárdica. Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 2. A formação de uma camada fibrosa entre as células injetadas e tecido hospedeiro. A) mostram coloração Tricrômicotecido colágeno formado entre células HEK293 e tecido miocárdico murino (setas). As imagens foram gravadas com um microscópio de varredura digital. B) Os corações foram desparafinizadas e processados para microscopia eletrônica de varredura. As imagens foram gravadas com um microscópio eletrônico de varredura e mostrar as fibras de colágeno (setas) entre as células injetadas HEK293 (lado esquerdo) e do miocárdio host (lado direito). Clique aqui para ver imagem ampliada.
Figura 3. Injeção de células produzidas pequenas áreas de dano. A) Tricrômico coloração mostra pequenas áreas de danos, onde a agulha foi injetado (cor azul;. Setas) B) seções de parafina foram corados por Tricrômico staIning e a área em que as células foram injectadas está indicado por setas negras. Células injetadas (seta verde) eram visíveis na proximidade da área lesada. C) HEK293 células, coradas com DAPI duas horas antes de injeção, estiveram presentes ao longo do local da injeção (seta branca). O local da injeção é indicada com uma seta verde ea linha aberta branco marca a camada do pericárdio. D) Tunel Ensaio, realizada em cortes de parafina, não mostrou núcleos positivos fluorescentes relevantes. Clique aqui para ver imagem ampliada.
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Discussion
Neste manuscrito, nós mostramos como realizar injeção intramiocárdica de células nos corações murinos. Como prova dessa metodologia, temos usado células HEK293. É importante ressaltar que as células HEK293 não são usados em qualquer estudo de terapia celular e, portanto, as conclusões deste manuscrito não são apropriados para tradução direta para uma abordagem terapêutica. No entanto, o facto de as células HEK293 não são células contrácteis e não transdiferenciar em outros tipos de células chama a atenção para os aspectos técnicos, tais como as propriedades das células a ser entregue e a via de entrega.
Tem sido relatado que um percurso intramio tende a causar aglomerados de células embutidas no tecido cardíaco 24,26, enquanto o percurso intracoronária poderia proporcionar uma distribuição mais homogénea no local da lesão. Para a substituição de cardiomiócitos, a célula ideal doador deve apresentar o, Properti estrutural e contrátil eletrofisiológicoes de cardiomiócitos e deve ser capaz de se integrar funcionalmente e estruturalmente no tecido do hospedeiro, o que sugere a necessidade de um programa de diferenciação celular para ser utilizado antes do transplante.
Os pontos-chave para o sucesso da cirurgia pode ser resumido como se segue:
- Anestesiar ratos com compostos injetáveis para reduzir a frequência cardíaca e facilitar a injeção de células
- Realizar punção intratraqueal de ratos para favorecer a funcionalidade pulmões.
- Realizar toracotomia evitando incisão muscular para manter a funcionalidade do músculo peitoral para um respiração correta.
- Depois de expor o coração, observar o ventrículo esquerdo sob um microscópio para visualizar se a injeção ocorreu (visível como uma cor pálida).
- Use uma agulha fina e uma seringa de precisão para evitar perfuração extensa do tecido do miocárdio e para injectar a quantidade desejada de material, respectivamente.
- Embainhar a agulha com um sistema de tubos de plástico expondo oomente a parte da ponta. Isto iria permitir a introdução da agulha a uma profundidade específica no interior do ventrículo esquerdo (0,5 mm), evitando-se a injecção para dentro da cavidade ventricular.
- Feche o peito e o espaço entre as costelas cuidadosamente para evitar a exposição dos pulmões a uma pressão externa.
Esta técnica tem um alto nível de sucesso, se as condições de saúde pós-operatório são priorizados. Os animais devem ser monitorados intensivamente todos os dias até uma semana para sinais de sofrimento e dor. A injeção de compostos analgésicos para controlar a dor deve ser administrado conforme necessário no pós-operatório. A aplicação tópica de alívio da dor, tal como a lidocaína, podem também ser utilizados. Hemorragia deve ser impedido por meio de técnicas cirúrgicas cuidadosas. No entanto, se ocorrer, pode ser interrompido por compressão ou ligadura de vasos. Temos notado que os animais se recuperar melhor e mais rapidamente se deixado em uma caixa de aquecimento a 37 ° C por 12-20 horas após a cirurgia. Este tratamento vai bloquear uma rápida diminuição da temperatura do corpo, nemmalmente ocorre após o procedimento cirúrgico e administração da anestesia. Podem ocorrer infecções pós-cirúrgicas, mas deve ser inferior a 1%. Procedimentos assépticos devem ser rigorosamente seguidas para evitar a infecção. Infecção local podem ser tratados com aplicação de antibióticos. Mais importante, a desidratação deve ser controlada, por injecção subcutânea de uma solução salina.
É preferível administrar injectável sobre anestésico inalado, tal como o isoflurano. De fato, observamos que a anestesia injetável diminuiu batimento cardíaco, permitindo a injeção mais fácil e menos sangramento sem causar desconforto animal.
Embora invasivo, injeção de pequenos volumes de células (25-50 ul) em camundongos é viável e segura. Tivemos mortalidade inferior a 1% através da injecção de 50 ul de células HEK293 em 5 diferentes áreas da parede do ventrículo esquerdo (10 ul / injecção). Esta metodologia assegurada a presença de células em várias áreas da parede miocárdica, que é importante nasterapia com células estaminais quando áreas mais extensas de dano isquêmico precisa ser alcançado pelas células entregues. Para realizar a cirurgia menos invasiva, vários protocolos foram recentemente publicados, embora sua reprodutibilidade em diferentes laboratórios ainda não foi verificada. Por exemplo, a injeção de células pode ser realizada pela técnica de close-peito usando alta resolução ecocardiografia 27. A utilização do presente sistema requer habilidades elevadas operador visualizar claramente uma imagem bidimensional da parede do ventrículo esquerdo e para manter a agulha num local específico durante ciclos sistólico / diastólico normais. A vantagem desta técnica é a implantação de células no miocárdio do rato para os locais desejados de um período de tempo clinicamente relevante após a indução do enfarte do miocárdio. No entanto, esta abordagem não é possível com os procedimentos de cirurgia, tais como a indução do enfarte do miocárdio ou de bandas transaórtico devido ao aumento de mortalidade dos animais submetidos a uma segunda operação de dois7. Curiosamente, Hamdi e colegas compararam injeção direta intramiocárdica contra entrega de células em um Gelfoam construir na área do epicárdio 28. Eles observaram que o revestimento da célula construir para o epicárdio resultou em uma melhor funcionalidade do enxerto em relação a injeção de células intramiocárdica e informou que esta técnica é reprodutível, de fácil utilização, e menos traumática para os animais 28.
Uma característica importante das experiências de injecção de células é o traçado das células e a sua sobrevivência. Nós demonstramos que as células HEK293 são fáceis de detectar devido à sua morfologia distinguíveis em comparação com as células cardíacas. Estas células sobreviveram à injecção (dados não mostrados) e foram mantidas no tecido de uma semana após a cirurgia. Para rastrear células para estudos de longo prazo e analisar a sua enxerto no tecido do parto, assim como em outros tecidos, várias técnicas estão em uso, incluindo a rotulagem fluorescente e um FISHnálise em experimentos de transplante de sexo incompatibilidade 29. Importante, imagem in vivo irá desempenhar um papel importante no sentido de análises in vitro em estudos futuros. Com efeito, uma das vantagens da imagiologia in vivo em relação aos métodos histológicos é o rastreamento das células em estudos longitudinais dos mesmos animais, sem a necessidade de 29 a eutanásia. Nesta metodologia, as células podem ser marcadas com reagentes bioluminescência, partículas de ferro, e genes repórter específicos a ser trabalhada com a tomografia por emissão de pósitrons (PET) e ressonância magnética (MRI).
As análises mostraram que as células não contrátil tais como células HEK293 preferencialmente agrupadas na zona onde foram injectados rodeado por um tecido conjuntivo fino. Embora os mecanismos patofisiológicos que conduzem à formação de tecido fibroso em um rato Imunodeprimido são desconhecidas, o tecido colagenoso visível em torno das células transplantadas podem ser comparáveis ao ponto de extremidade de umimplante compatível tecido. Neste caso, o material exógeno não podem ser removidos pelas células inflamatórias e torna-se encapsulada numa densa camada de tecido conjuntivo fibroso, que isola-lo a partir dos tecidos circundantes. Da mesma forma que as fases da fase final de cicatrização de feridas, este tecido de granulação é altamente vascularizada e assegura a sobrevivência do material implantado.
Tecnicamente, o método descrito aqui foi bem sucedida, apesar de injecção intramio agulha produzida uma pequena área de danos para o tecido circundante. Embora as medidas de função cardíaca não eram o objetivo desta revisão, estudos futuros devem investigar se o dano tecidual menor pode perturbar as análises de terapia celular. Além disso, seria importante para analisar se a lesão produzida na zona injectada é provocada pela agulha, com a quantidade de células injectadas ou por uma combinação de ambos.
Em apoio das nossas descobertas, foi demonstrado que transplantation de populações mistas de células diferenciadas estaminais embrionárias humanas (hESC) contendo 20-25% cardiomiócitos (hESC-CM) para o coração saudável de ratos imunocomprometidos (NOD-SCID) resultou na rápida formação de enxertos em que os cardiomiócitos se organizou e amadureceu ao longo do tempo ea população noncardiomyocyte se perdeu 23. Curiosamente, os autores observaram que hESC-MC foram isoladas do hospedeiro do miocárdio por uma camada de tecido fibroso, que impediu a formação de um sincício electrofisiológico 22,23. Em um estudo diferente, Kehat et al. Descobriram que hESC-CM passeado com sucesso o ventrículo em suínos com bloqueio cardíaco completo. Este estudo mostrou que as células transplantadas sobreviveram, funcionava, e integrado com as células hospedeiras, proporcionando evidência para a sua capacidade para funcionar como uma alternativa biológica para o pacemaker electrónico 30. Estes dois resultados discordantes podem ser conciliados pela diferença na estrutura e função do hoº e espécies doadoras. De facto, é possível que a eficiência de acoplamento de cardiomiócitos transplantados pode depender da frequência de batimento relativa das células hospedeiras e doadores. No estudo de Van Laake 23, a formação de junções funcionais pode ser prejudicada devido à diferente freqüência de batimento dos cardiomiócitos humanos (60-100 bpm) versus cardiomiócitos roedores (300-600 bpm). Este não seria o caso no ser humano contra as experiências de transplante de suíno, como descrito em análise Kehat 30.
O período de tempo de observação é outro factor de confusão. hESC-CM transplantadas para o coração roedor após infarto do miocárdio induzido função cardíaca melhora apenas para pontos de tempo de curto prazo (4 semanas). No entanto, em 12 semanas, a função cardíaca não foi mais sustentado, apesar de a sobrevida do enxerto 23. Os autores observaram que o tamanho do enxerto (aumento da quantidade de células) não foi associada com uma melhor surv cardíaco a longo prazoival e melhoria funcional 31, o que indica que analisa a longo prazo versus análises de curto ou médio prazo, deve ser realizada em estudos futuros, sem exigir aumento do número de células por injecção.
No presente estudo, várias questões permanecem sobre o tipo de células a ser transplantadas, a selecção da espécie hospedeira de doadores para ser testada e uma avaliação detalhada do potencial arrítmico das células. O ideal é que as células-tronco implantadas no miocárdio para a substituição ou a função do marcapasso deveria funcionalmente casal com os miócitos remanescentes. Em um modelo de rato de enfarte do miocárdio, Fernandes et al. 32 usado Programmed Estimulação Elétrica (PES) para avaliar arritmia suscetibilidade, mostrando um aumento da capacidade de indução de arritmias ventriculares em corações com injeção de mioblastos em comparação com os controles. No mesmo estudo, as injecções de células autólogas da medula óssea derivadas de não resultou num aumento da inducibildade de arritmias ventriculares em comparação com os controles, levando os autores a concluir que mioblastos exibiu um risco arritmogênica específico. Em um estudo, as células derivadas da medula óssea diferentes (BMC) de forma eficiente enxertadas em clusters dentro da cicatriz do infarto ou zona de fronteira, mas mostrou evocado não eletronicamente Ca transientes 33. Curiosamente, Wei et al. Mostraram que as células-tronco mesenquimais (MSC) não adquire as propriedades eletrofisiológicas de cardiomiócitos maduros durante o período de sobrevivência nos corações infartados. No entanto, eles podem aliviar a vulnerabilidade eléctrica e não promovem arritmias ventriculares 34.
A eficácia e a ocorrência de arritmia terapia celular depende das células, bem como sobre as vias de administração. De fato, em corações de ratos após MI 35, injeções BMC intramiocárdicas, apesar de melhorar a função cardíaca, aumento contrações prematuras ventriculares consecutivos e tachycard ventricularia para os primeiros 14 dias. Quando foi utilizada a via intracoronária, a ocorrência de arritmia ventricular foi marcadamente diminuída. Em estudos clínicos, a função pró-arrítmico de células injetadas é difícil avaliar como a maioria dos pacientes recebem agentes beta-bloqueadores como indicado para a doença isquêmica do coração. O tratamento com beta-bloqueadores podem mascarar um potencial efeito pró-arrítmico das células transplantadas. Os estudos em animais são, portanto, crucial para avaliar as bases de estímulos pró-arrítmicos em terapia com células-tronco.
Em resumo, nossos dados demonstram a viabilidade da célula-injeção intramiocárdica em ratos, mas também enfatiza a necessidade de uma análise detalhada sobre as condições de segurança do enxerto celular. Nos seres humanos, tem sido demonstrado que a injecção de células está associada à pró-arritmias 36-38, 39 reestenose, aterosclerose acelerada 40, e obstrução coronária 41. A pesquisa básica será importante no futuro aplicativo clínicacações para entender quais as células devem ser entregues, o tipo de parto, os mecanismos de reparação celular mediada função miocárdica, eo projeto de um protocolo de transplante alogênico contra células autólogas que beneficiam toda a população humana. Devido aos custos elevados associados com grandes ensaios clínicos, a reprodutibilidade de eficiência e eficácia de protocolos de transplante tem de ser resolvida em modelos pré-clínicos, tais como aqueles descritos aqui.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao Instituto Magdi Yacoub (MYI) para apoiar a análise de microscopia e os projetos que envolvem a reparação cardíaca, os técnicos eo Gerente de nossa unidade animal. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Britânica do Coração (BHF), concessão Projeto PG/10/019. MPS é suportado pelo MYI e BHF. TP é um BHF-Research Excellence Fellow. NR é um NH & MRC Austrália Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolator | Pfi systems | Quotation needed | |
| Heating Pad | Vet Tech Solutions | HE006 | For small animals |
| Medetomidine | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Ketamine hydrochloride | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Atipamezole | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Hair removal cream | commercial shops | ||
| Buprenorphine | NVS | Veterinary prescription is necessary | |
| Leica MZFLIII microscope | Leica | Model S6E | With swing arm stand TS0 |
| Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner | Hamamatsu | RS series | |
| Scanning Electron Microscope | Jeol | JSM-6610 | |
| Blunt scissors | FST | 14084-09 | |
| Minivent | Harvard Apparatus | 73-0043 | Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844) |
| Forceps | FST | 11052-10 | |
| Retraction system | FST | 18200-20 | Kit for animals up to 200 g |
| 30 G 12 mm; ½ inch | BBraun | A210 | Fine yellow |
| Microliter syringe | ESSLAB | 81201 | Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700 |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | W1614T |
References
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