Summary
Consegna cellula intramiocardico in modelli murini di malattie cardiovascolari, come ipertensione o infarto del miocardio, è ampiamente utilizzato per testare il potenziale terapeutico di diversi tipi di cellule in studi rigenerativi. Pertanto, una descrizione dettagliata e una chiara visualizzazione di questa procedura chirurgica contribuiranno a definire i limiti ei vantaggi di cellule cardiovascolari analisi terapeutici in piccoli roditori.
Abstract
Precedenti studi hanno dimostrato che la consegna delle cellule promuove la funzione cardiaca miglioramento da rilascio di citochine e fattori che aumentano la rivascolarizzazione del tessuto cardiaco e la sopravvivenza cellulare. Inoltre, ulteriori osservazioni rivelato che le cellule staminali specifici, come le cellule staminali cardiache, cellule staminali mesenchimali e cardiosfere hanno la possibilità di integrare nel miocardio circostante differenziando in cardiomiociti, cellule muscolari lisce e cellule endoteliali.
Qui vi presentiamo i materiali ei metodi per fornire in modo affidabile le cellule noncontractile nella parete del ventricolo sinistro del mouse immunodepleto. Le fasi salienti di questa procedura microchirurgica coinvolgono l'anestesia e analgesia iniezione, intubazione endotracheale, incisione per aprire la cassa ed esporre il cuore e la consegna di cellule da un ago sterile da 30 gauge e una siringa di precisione microlitro.
Trasformazione del tessuto costituito da raccolta cuore, embedding, sezionamento e colorazione istologica ha mostrato che l'iniezione di cellule intramiocardico prodotto un piccolo danno nella zona epicardico, nonché nella parete ventricolare. Noncontractile cellule sono state mantenute nella parete miocardica di topi immunocompromessi ed erano circondati da uno strato di tessuto fibrotico, probabilmente per proteggere dalla pressione cardiaca e carico meccanico.
Introduction
Vari protocolli di recapito cella sono stati testati in modelli murini e ratto di malattie cardiovascolari con l'obiettivo di tradurre l'efficienza, l'efficacia e la sicurezza di questa procedura sperimentale in pazienti umani. In piccoli cuori roditori, la consegna delle cellule intramiocardico è il metodo più fattibile di consegna delle cellule 1,2, mentre nel anterograda cuore di ratto 3 e retrograda 4 intracoronarica infusione di cellule può essere utilizzato anche. Entrambi i metodi hanno dei limiti e vantaggi. Invio delle cellule per via intracoronarica presenta vantaggi rispetto iniezione intramuscolare diretta nel promuovere la diffusione cella globale 3, ma ha anche il rischio di causare embolia coronarica 3,5. Limiti di consegna intramiocardico sono associati a danni meccanici, infiammazione acuta, e infarto del danno 6,7. Negli esseri umani, cellule per la riparazione cardiaca sono forniti da iniezione intramiocardico attraverso un epicardico endocardiaca o chirurgicaavvicinarsi o per via arteriosa intracoronarica 8. Iniezione per vie transvascolare è adatto nei pazienti con infarto miocardio acuto e riperfusione, ma potrebbe non essere possibile nel caso di occlusioni totali o scarsa flusso all'interno dei vasi del territorio effettuata 9. Iniezione diretta nella parete ventricolare mediante iniezione transendocardial o transepicardial è tecnicamente fattibile a seconda dello stato di salute del paziente. Infatti, è stato dimostrato che questa tecnica è sicura 10,11, sebbene iniettabile transepicardial è necessario un intervento chirurgico a torace aperto e per transendocardial avvicina una mappatura elettrofisiologica per ciascun paziente è necessario differenziare siti di vitale ischemica o sfregiato miocardio 9.
È importante sottolineare che in studi di terapia cellulare la scelta della migliore cella da trapiantare è ancora oggetto di indagine. Analisi a breve termine (4 settimane) hanno mostrato che l'iniezione di cellule staminali cardiache definite come cardiosfere
Nei modelli topi e ratti, studi a lungo termine hanno rivelato che l'iniezione di cellule non migliora ulteriormente la funzione cardiaca (12 mesi). Infatti, innesti di cardiomiociti staminali embrionali umane derivate da cellule (hESC-CM) sono stati in gran parte isolate dal miocardio ospite da uno strato di tessuto fibrotico 22,23. Risultati simili sono stati osservati dopo il trapianto di mioblasti scheletrici intramiocardico nel cuore di topi infartuati 24. Furthermore, la capacità a lungo termine di MSC allogeniche per conservare la funzione nel cuore infartuato è stato limitato dal passaggio da un immunoprivileged ad uno stato immunogenica dopo la differenziazione 25.
Prendendo in considerazione le sfide e le prospettive di cui sopra, vi mostriamo qui come consegnare le cellule mediante iniezione intramiocardico nei topi. Osserviamo che le cellule senza cardiomiociti proprietà contrattili non sono collegati con il miocardio host e una massa coesiva con una barriera fibrotica sottile. Anche se in alcuni casi questo risultato può essere vantaggioso, la seguente analisi può essere utile per capire come attecchimento delle cellule può essere modulata per generare strutture del miocardio funzionalmente collegate pure.
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Protocol
Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità internazionale (direttiva 2010/63/UE del Parlamento europeo) e nazionale (UK Home Office, Act del 1986) regolamenti. Le procedure qui descritte sono parte del nostro piano di lavoro sotto licenza autorità britanniche e non sono state intraprese a fini di registrazione.
1. Preparazione di cellule
Questo protocollo descrive la preparazione di una linea cellulare specifica (rene embrionale umano, cellule HEK293) a scopo dimostrativo. Protocolli specifici di cellule devono essere impiegate per la coltivazione e alla fine differenziazione delle cellule staminali pluripotenti o adulte in linee cellulari specifici.
- Crescere le cellule in DMEM supporti (alto glucosio, 4.500 mg / L) contenente 1% di sodio piruvato, glutammina 2 mM, 1% antibiotico Pen / Strep e 10% siero fetale bovino (FBS). Un piatto di 10 centimetri dovrebbe essere normalmente diviso a 1:3 e mezzi completato fresco ogni due giorni.
- Il trattamento di cellule leggermente con trypsin 1x e risospendere in mezzo DMEM come descritto in 1:1.
- Contare le celle in una camera emocitometro e raccogliere 3 x 10 6 cellule in un tubo separato.
- Centrifugare in un rotore secchio swing a 100 g per 5 min.
- Eliminare il surnatante e lavare il pellet cellulare con tampone fosfato sterile 2x.
- Risospendere in PBS 1x ad una concentrazione di 10 6/50 pi per iniezione nel ventricolo sinistro del mouse immunodepleto.
2. Condizioni presurgical
- Mantenere topi immunodepleto (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) con palline sterili di cibo e acqua in un isolatore a temperatura controllata (22 ° C; Tabella 1) prima di ogni intervento chirurgico.
- Eseguire un intervento chirurgico di topi immunodepleto sotto una cappa a flusso laminare. Pulire l'area di lavoro con il 70% di etanolo e autoclave strumenti chirurgici (pinze e forbici).
- Accendere rilievi di riscaldamento per la chirurgia e per il recupero. Rilievi di riscaldamento sono importantiper bloccare la diminuzione della temperatura corporea si verificano durante e dopo la chirurgia.
- Mettere una gabbia pulita e autoclavato sulla rampa di recupero-riscaldamento.
- Trasportare i topi nelle loro gabbie originali del sezionatore in sala operatoria in un sacchetto autoclavato sterile.
- Pesare il mouse e in base al peso corporeo iniezione sottocutanea (sc) una soluzione contenente medetomidina e ketamina cloridrato diluito in soluzione salina sterile allo 0,9% per anestetizzare il mouse, come pure per rilassare la muscolatura (medetomidina 1 mg / kg; ketamina cloridrato 75 mg / kg).
- Rimuovere il mouse dalla gabbia quando completamente anestetizzato (entro 1-2 minuti, nessun riflesso toe-pinch dopo stimolazione)
- Applicare crema depilatoria sul lato sinistro del petto e la zona della gola. Dopo un congruo periodo di tempo (circa 2-5 minuti), rimuovere i capelli sciolti con un panno bagnato in acqua.
- Posizionare il mouse sul pannello chirurgia in posizione supina. Dapunto di vista del chirurgo la posizione è verticale, coda verso il basso-testa.
- Iniettare la soluzione analgesica a 0,1-0,2 mg / g diluito in soluzione fisiologica sterile (buprenorfina) nel sottocute arto posteriore e coprire la zona rasata con l'asettica iodio povidone soluzione utilizzando un cotton-fioc.
- Mettere a fuoco il microscopio (obiettivo 2.5X) sulla zona della gola.
3. Condizioni chirurgici
- Con le forbici spuntate fanno una linea mediana incisione cutanea ventrale di circa 0,5-1 cm di lunghezza leggermente al di sotto della cartilagine cricoide. Separare la pelle dal tessuto connettivo per visualizzare le ghiandole salivari.
- Dividere le ghiandole salivari sulla loro divisione mediana naturale tirando contemporaneamente ogni lateralmente parte con pinza e magnetico divaricatore toracico ed esporre la trachea.
- Tirare la lingua dolcemente verso il lato per esporre la laringe. Far scorrere il tubo di intubazione con cautela nella trachea. La punta del tubo è visibile attraverso il l visualizzatoarynx e trachea. È importante sottolineare che, se il tubo è in, ma non chiaramente visibile, è nell'esofago. Rimuovere e cambiare la posizione della punta del tubo.
- Collegare il tubo alla macchina di ventilazione. Impostare il volume della corsa a 200 ml e 150 ictus / min. Fissare il tubo di ventilazione sul pannello chirurgia con un nastro.
- Con le forbici smussate e pinze, fare una coda verticale a testa 1 - 1,5 cm a lunga incisione cutanea sopra la zona torace sinistro.
- Allentare la pelle dagli strati di tessuto / muscolari connettivo e delle maggiori e minori muscoli pettorali senza incisioni.
- Eseguire toracotomia tra la terza e la quarta costola come segue:
- Perforare lo strato muscolare intercostale da pizzicare e graffi con le piccole, pinze arrotondate.
- Una volta che lo strato di muscolo intercostale è perforato, posizionare il divaricatore petto per aprire al massimo la cavità toracica. Le parti superiori e medie del ventricolo sinistro (LV) con il suo padiglione auricolare sovrastante (atrio) sonoora visibile.
- Preparare una siringa di precisione con le cellule. La siringa deve essere in grado di erogare una quantità di volume di 10 ul per ogni iniezione. Cast un ago G 30 sulla punta della siringa.
- Fissare con nastro una piccola cannula di plastica (da un introcan-W 20 G) sul ferro, lasciando esposto 1 mm compresa l'estremità aperta dell'ago. Ciò evitare che l'ago perforante tutta la parete del ventricolo sinistro e iniettando le cellule nella cavità ventricolo sinistro.
- Con l'aiuto di un obiettivo 5X, visualizzare in questo ingrandimento del ventricolo sinistro e iniettare le cellule nella parete ventricolare sinistra in 5 posizioni differenti (ogni iniezione fornirà 10 ul per un totale di 106 cellule iniettata). Se l'iniezione è successo, una superficie bianca e l'assenza di importanti controlavaggio delle cellule saranno visibili (se l'iniezione non ha avuto successo, l'animale sarebbe escluso da analisi funzionale).
- Rimuovere il divaricatore. Chiudere la parete toracica by allegando i due costole separate con due punti di sutura di seta 6-0.
- Idratare i muscoli pettorali e la pelle con una punta di cotone intriso di PBS 1x e delicatamente mettere i muscoli della schiena nella posizione originale con le pinze.
- Chiudere la pelle con 3-4 punti di sutura di seta 6-0. Suturare l'incisione della gola con 2-3 punti di sutura per chiudere la pelle.
- Iniettare atipamezolo (1 mg / kg concentrazione finale) per ripristinare gli effetti anestetici.
- Non appena il topo inizia a respirare autonomamente, estrarre il tubo dalla trachea e mettere il mouse sul lato destro. Il mouse si prevede di recuperare in pochi minuti.
- Quando il mouse comincia a girare e camminare, metterlo in gabbia recupero calda (piccola gabbia IVC, con chiusura superiore filtrata) per un'ora.
- Lasciare gli animali durante la notte in una scatola riscaldata controllata (37 ° C).
- Riempire un piatto con acqua e cibo pellet per sostenere la ripresa durante i primi due giorni dopo l'intervento.
Dieci cuori iniettati con cellule e 10 di controllo cuori non iniettati sono analizzati istologicamente come segue:
- Eseguire analisi delle cellule innestate 1 settimana dopo l'iniezione (figure 1 e 3).
- Dopo l'eutanasia per overdose di isoflurano, profumato i cuori con 20 ml di paraformaldeide al 4% (PFA) per fissare il tessuto. Disidratare il tessuto fissato in percentuali crescenti di etanolo (dal 70-100%) e incorporare in blocchi di paraffina.
- Sezione cuori in paraffina con un microtomo a 5 micron e macchia con ematossilina ed eosina per l'analisi morfologica.
- Visualizza tessuto connettivo mediante colorazione tricromica di Masson.
- Analizzare le immagini al microscopio scanner per diapositive (Figure 1A, 2A, 3A, 3B e 3C) e visualizzare l'intero cuore in asse corto utilizzando un microscopio scanner per diapositive digitali (Figures 1B e 1C).
- Dopo le analisi di cui sopra, Deparaffinare i tessuti cardiaci in xilene, reidratare immergendo esemplari discendente percentuali di etanolo (dal 100% acqua) e di processo per microscopia elettronica a scansione (SEM) come segue:
- Incubare blocchi deparaffinate con 1% di acido tannico in tampone fosfato 0,1 M per 1 ora.
- Disidratare i campioni in percentuali crescenti di etanolo (25-100%).
- Campioni secco con HMDS (esametildisilazano).
- Montare gli esemplari di Stubbs con Acheson Argento Dag e cappotto con oro-palladio.
- Visionare campioni in modo analitico microscopio elettronico a scansione (Figura 2B).
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Representative Results
Abbiamo iniettato HEK293 cellule, che sono distinguibili dalle cellule del cuore per la loro diversa morfologia (figura 1), con una forma di ciottoli rispetto ai cardiomiociti allungati (Figura 1A). Cellule HEK293 sono stati più reattivi a ematossilina colorante (colore blu) rispetto ai cardiomiociti (colore rosa), probabilmente a causa del loro elevato contenuto di nucleare (Figura 1A). Per distinguere ulteriormente le cellule iniettate dal tessuto ospite, cellule HEK293 sono state marcate con DAPI 2 ore prima dell'iniezione. -Cellule marcate erano visibili nel tessuto miocardico, come mostrato in Figura 1E. Controllo topi sham hanno mostrato alcun danno in tutto il cuore (Figura 1C) e l'integrità del tessuto (Figura 1D).
In una vista intera asse corto del cuore, cellule iniettate erano visibili come gruppo omogeneo nella zona di iniezione (Figura 1B). Il c raggruppatiells stati circondati da un sottile strato di tessuto fibrotico, che è apparso come area blu nella colorazione tricromica (Figura 2A). Le cellule non erano collegati con il tessuto miocardico ospitante, come dimostrato da microscopia elettronica a scansione (Figura 2B), probabilmente a causa della loro funzione noncontractile e struttura cellulare diversa.
Oltre alle osservazioni di cui sopra, abbiamo notato piccole aree danneggiate in cui l'ago è stato iniettato (Figura 3A). Queste aree eseguiti dallo strato epicardico esterna del cuore nella parete miocardica (Figura 3A). Cellule iniettate (freccia verde, Figura 3B) sono presenti in prossimità della zona danneggiata (frecce nere, Figura 3B). Cellule DAPI-positivi erano visibili lungo il sito di iniezione (Figura 3C, frecce bianche). Una settimana dopo l'infortunio, test Tunel non ha mostrato un aumento apoptosi delle cellule nel sito di lesione, suggerendo che la necrosipiuttosto che l'apoptosi è verificato dopo l'ago per iniezione (Figura 3D).
Figura 1. L'analisi istologica di cellule iniettate. A) Una settimana dopo cuori di iniezione di cellule sono stati inclusi in paraffina e trattati per ematossilina ed eosina. Cellule HEK293 iniettati erano presenti nella parete del ventricolo sinistro. Le immagini sono state ottenute con un microscopio a fluorescenza stereo. B) tricromica tessuti colorati hanno mostrato che le cellule sono state raggruppate nella stessa zona in cui sono stati iniettati (freccia). I pannelli in basso a destra mostrano l'asse corto vista con il destro (RV) e ventricolo sinistro (LV). Il rettangolo rosso indica l'area in cui le cellule vengono conservate (1.5X). Le immagini sono state registrate con un microscopio a scansione di diapositive. C) Trichrome stAining di controllo cuori sham-operated. Vista cuore intere con un 5X obiettivo. D) Colorazione tricromica di topi sham mostrano integrità del tessuto miocardico. E) HEK293 cellule sono state colorate con DAPI 2 ore prima dell'iniezione. Una settimana dopo cuori di iniezione sono stati incorporati in ottobre e sezionati in un criostato a 6 micron. Le cellule sono state visualizzate sotto UV in un microscopio a fluorescenza. Sinistro e ventricoli destro vengono visualizzati. Nel ventricolo destro, pannello di destra, la linea bianca segna il livello epicardico. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Formazione di uno strato fibrotico tra le cellule iniettate e tessuto ospite. A) Trichrome colorazione spettacolotessuto collagene formata tra cellule HEK293 e tessuto miocardico murina (frecce). Le immagini sono state registrate con un microscopio a scansione digitale. B) Hearts sono stati deparaffinate e trattati per microscopia elettronica a scansione. Le immagini sono state registrate con un microscopio elettronico a scansione e mostrano fibre di collagene (frecce) tra le cellule HEK293 iniettate (lato sinistro) e il miocardio host (lato destro). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 3. Iniezione di cellule prodotte piccole aree di danno. A) Trichrome colorazione mostra piccole aree di danno in cui ago è stato iniettato (colore blu;. Frecce) B) Sezioni in paraffina sono state colorate da Trichrome staining e la zona in cui sono state iniettate le cellule è indicato dalle frecce nere. Cellule iniettate (freccia verde) erano visibili in prossimità della zona danneggiata. C) HEK293 cellule colorate con DAPI 2 ore prima iniezione, erano presenti lungo il sito di iniezione (freccia bianca). Il sito di iniezione è indicato con una freccia verde e la linea aperta bianca segna il livello pericardico. D) Tunel Assay, eseguita su sezioni di paraffina, non ha mostrato rilevanti nuclei positivi fluorescenti. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
In questo manoscritto, abbiamo mostrato come eseguire intramiocardico iniezione di cellule nei cuori murini. Come prova di questa metodologia, abbiamo utilizzato cellule HEK293. E 'importante sottolineare che le cellule HEK293 non vengono utilizzate in studi di terapia cellulare e, pertanto, i risultati di questo manoscritto non sono appropriati per la traduzione diretta di un approccio terapeutico. Tuttavia, il fatto che le cellule HEK293 non sono cellule contrattili e non transdifferenziare in altri tipi cellulari concentra l'attenzione su aspetti tecnici come le proprietà delle cellule da consegnare e il percorso di consegna.
E 'stato riportato che un percorso intramiocardico tende a causare raggruppamenti cellulari incorporati nel tessuto cardiaco 24,26, mentre il percorso intracoronarica potrebbe fornire distribuzione più omogenea al sito della lesione. Per la sostituzione dei cardiomiociti, le cellule del donatore ideale dovrebbe presentare il elettrofisiologico, Properti strutturale e contrattilees di cardiomiociti e dovrebbero essere in grado di integrare strutturalmente e funzionalmente nel tessuto ospite, suggerendo la necessità di un programma di differenziazione cellulare per essere impiegati prima del trapianto.
I punti chiave per un intervento chirurgico di successo possono essere riassunti come segue:
- Anestetizzare topi con composti iniettabili per rallentare la frequenza cardiaca e facilitare l'iniezione di cellule
- Eseguire incannulamento tracheale di topi per favorire la funzionalità dei polmoni.
- Eseguire toracotomia evitando incisione muscolare per mantenere la funzionalità del muscolo pettorale per una corretta respirazione.
- Dopo aver esposto cuore, osservare il ventricolo sinistro al microscopio per visualizzare se si sia verificato iniezione (visibile come un colore pallido).
- Utilizzare un ago sottile e una siringa di precisione per evitare vasta perforazione del tessuto miocardico e iniettare rispettivamente la quantità desiderata di materiale.
- Mezzorca l'ago con un sistema di tubi di plastica o esponendoolo la parte punta. Ciò consentirebbe introduzione dell'ago ad una profondità specifica nel ventricolo sinistro (0,5 mm), evitando l'iniezione nella cavità ventricolare.
- Chiudere il petto e lo spazio tra le costole con attenzione per evitare l'esposizione dei polmoni a pressioni esterne.
Questa tecnica ha un alto livello di successo se sono priorità condizioni di salute post-operatorio. Gli animali devono essere attentamente controllati tutti i giorni fino a una settimana per i segni di sofferenza e dolore. Iniezione di composti analgesici per controllare il dolore deve essere somministrato come richiesto nel post-operatorio. L'applicazione topica di sollievo dal dolore, come la lidocaina, può anche essere usato. Il sanguinamento deve essere prevenuta con attente tecniche chirurgiche. Tuttavia, se si verificano, può essere fermato da compressione o legatura dei vasi. Abbiamo notato che gli animali recuperare meglio e più velocemente se lasciato in una scatola di riscaldamento a 37 ° C per 12-20 ore dopo l'intervento chirurgico. Questo trattamento bloccherà rapida diminuzione della temperatura corporea, nénormalmente si verificano dopo intervento chirurgico e la somministrazione di anestesia. Infezioni post-operatorie possono verificarsi, ma dovrebbe essere inferiore all'1%. Procedure asettiche devono essere rigorosamente seguite per prevenire l'infezione. Infezione locale può essere trattata con applicazione di antibiotici. Importante, disidratazione deve essere controllata mediante iniezione sottocutanea di soluzione salina.
E 'preferibile somministrare iniettabile sopra anestesia inalatoria, come isoflurano. Infatti, abbiamo osservato che anestetico iniettabile diminuzione del battito cardiaco, che facilitano l'iniezione e meno sanguinamento senza causare disagio degli animali.
Sebbene invasiva, iniezione di piccoli volumi di cellule (25-50 mL) nei topi è fattibile e sicuro. Avevamo mortalità inferiore all'1% iniettando 50 ml di cellule HEK293 in 5 diverse zone della parete ventricolare sinistra (10 microlitri / iniezione). Questa metodologia assicurata la presenza delle cellule in diverse zone della parete miocardica, che è importante interapia con cellule staminali quando le aree di danno ischemico estesi devono essere raggiunti dalle cellule consegnati. Per effettuare la chirurgia meno invasiva, diversi protocolli sono stati recentemente pubblicati, anche se la loro riproducibilità in diversi laboratori deve ancora essere verificata. Ad esempio, l'iniezione di cellule può essere eseguita mediante la tecnica close-torace utilizzando alta risoluzione ecocardiografia 27. L'uso di questo sistema richiede competenze elevate all'operatore di visualizzare chiaramente una immagine bidimensionale nella parete del ventricolo sinistro e per mantenere l'ago in una posizione specifica nei normali cicli sistolica / diastolica. Il vantaggio di questa tecnica è l'impianto delle cellule nel miocardio mouse per posizioni desiderate in un arco di tempo clinicamente rilevante dopo induzione di infarto del miocardio. Tuttavia, questo approccio non è possibile con le procedure di chirurgia come l'induzione di infarto miocardico o strisce transaortico causa della maggiore mortalità degli animali sottoposti a una seconda operazione 27. È interessante notare, Hamdi e colleghi hanno confrontato iniezione diretta intramiocardico contro consegna di cellule in un Gelfoam costruire sull'area epicardico 28. Essi hanno osservato che sovrapponendo la cella costruire sul epicardio portato a una migliore funzionalità del trapianto rispetto a iniezione di cellule intramiocardico e ha riferito che questa tecnica è riproducibile, user-friendly, e meno traumatico per gli animali 28.
Una caratteristica importante di esperimenti di iniezione delle cellule è il tracciamento delle cellule e la loro sopravvivenza. Abbiamo dimostrato che le cellule HEK293 sono facili da rilevare a causa della loro morfologia distinguibile rispetto alle cellule cardiache. Queste cellule sopravvissute l'iniezione (dati non mostrati) e sono stati mantenuti in tessuto una settimana dopo l'intervento chirurgico. Per tracciare cellule per studi a lungo termine e analizzare il loro attecchimento nel tessuto di consegna, nonché in altri tessuti, diverse tecniche sono in uso, inclusa marcatura fluorescente e un FISHnalisi in sex-disadattamento trapianto esperimenti 29. Importante, imaging in vivo avrà un ruolo importante nei confronti analisi in vitro in studi futuri. Infatti, uno dei vantaggi di imaging in vivo rispetto ai metodi istologici è l'inseguimento delle cellule in studi longitudinali nelle stesse animali senza la necessità di eutanasia 29. In questa metodologia, le cellule possono essere contrassegnati con reagenti bioluminescenza, particelle di ferro, e geni reporter specifici per essere ripreso con la tomografia ad emissione di positroni (PET) e la risonanza magnetica (MRI).
Le nostre analisi hanno mostrato che le cellule noncontractile quali cellule HEK293 preferenzialmente raggruppati nella zona in cui sono stati iniettati circondato da un sottile tessuto collagene. Sebbene i meccanismi fisiopatologici che portano alla formazione di tessuto fibrotico in un mouse immunodepleto sono sconosciute, il tessuto collagene visibile intorno alle cellule trapiantate può essere paragonabile al punto finale di untessuto di impianto compatibile. In questo caso, il materiale esogeno non può essere rimosso dalle cellule infiammatorie e viene incapsulato in un denso strato di tessuto connettivo fibroso, che la isola dai tessuti circostanti. Analogamente alle fasi terminali di guarigione delle ferite, questo tessuto granulare è altamente vascolarizzato e assicura la sopravvivenza del materiale impiantato.
Tecnicamente il metodo qui descritto è riuscita, sebbene iniezione intramiocardico ago prodotta una piccola area di danno al tessuto circostante. Anche se le misure della funzione cardiaca non sono l'obiettivo di questa revisione, gli studi futuri dovrebbero esaminare se il danno tissutale minore può perturbare analisi di terapia cellulare. Inoltre, sarebbe importante analizzare se il danno prodotto nella zona iniettata è causato dall'ago, dalla quantità di cellule iniettate o da una combinazione di entrambi.
A sostegno dei nostri risultati, è stato dimostrato che transplantation di popolazioni miste di cellule differenziate staminali embrionali umane (hESC) contenenti il 20-25% cardiomiociti (hESC-CM) nel cuore sano di topi immunocompromessi (NOD-SCID) ha determinato la rapida formazione di innesti in cui i cardiomiociti divennero organizzati e maturati nel tempo e la popolazione noncardiomyocyte stato perso 23. È interessante notare, gli autori hanno osservato che hESC-CM sono stati in gran parte isolato dal miocardio ospitante da uno strato di tessuto fibrotico che impediva la formazione di un sincizio elettrofisiologica 22,23. In uno studio diverso, Kehat et al. Ha rilevato che hESC-CM ritmo con successo il ventricolo in suini con blocco cardiaco completo. Questo studio ha dimostrato che le cellule trapiantate sopravvissute, funzionavano, e integrati con cellule ospiti, fornendo prove per la loro capacità di funzionare come alternativa biologica al pacemaker elettronico 30. Questi due risultati discordanti possono essere conciliati dalla differenza di struttura e la funzione di Host e specie donatori. Infatti, è possibile che l'efficienza di accoppiamento di cardiomiociti trapiantati può dipendere dalla frequenza battito relativa di cellule ospiti e donatori. Nello studio di Van Laake 23, la formazione di giunzioni funzionali potrebbe essere compromessa a causa della diversa frequenza pestaggio di cardiomiociti umani (60-100 bpm) rispetto cardiomiociti roditori (300-600 bpm). Ciò non sarebbe il caso umano contro esperimenti di trapianto suina, come descritto in analisi Kehat 30.
La lunghezza del tempo di osservazione è un altro fattore di confusione. hESC-CM trapiantato nel cuore dei roditori dopo infarto miocardico indotto funzione cardiaca miglioramento solo per i punti a termine a breve termine (4 settimane). Tuttavia, a 12 settimane, la funzione cardiaca non è stata ulteriormente sostenuta nonostante la sopravvivenza del trapianto 23. Gli autori hanno osservato che la dimensione dell'innesto (quantità aumentata di cellule) non è stato associato a un miglioramento Surv cardiaca a lungo termineival e funzionale miglioramento del 31, indicando che a lungo termine le analisi contro analisi a breve o medio termine deve essere eseguito in studi futuri senza la necessità di un maggior numero di cellule per l'iniezione.
Nel presente studio, alcune domande rimangono sul tipo di cellule da trapiantare, la selezione della specie ospite-donatori da testare e una valutazione dettagliata del potenziale aritmico delle cellule. Idealmente, le cellule staminali impiantate nel miocardio per la sostituzione o la funzione del pacemaker dovrebbe funzionalmente coppia con i rimanenti miociti. In un modello murino di infarto miocardico, Fernandes et al. 32 usato Stimolazione elettrica programmata (PES) per valutare aritmia suscettibilità, mostri un maggiore inducibilità di aritmie ventricolari in cuori mioblasti-iniettato rispetto ai controlli. In questo stesso studio, iniezioni di cellule autologhe derivate dal midollo osseo non hanno comportato un aumento inducibillità di aritmie ventricolari rispetto ai controlli, portando così gli autori a concludere che mioblasti hanno mostrato un rischio arrhythmogenic specifico. In uno studio diverse, derivate dal midollo osseo cellule (BMC) in modo efficiente innestati in cluster all'interno della cicatrice infartuale o zona di confine, ma ha mostrato evocato non elettronicamente Ca transitori 33. È interessante notare che, Wei et al. Ha dimostrato che le cellule staminali mesenchimali (MSC) non acquisiscono le proprietà elettrofisiologiche dei cardiomiociti maturi durante il periodo di sopravvivenza nei cuori infartuati. Tuttavia, essi possono alleviare la vulnerabilità elettrica e non promuovere aritmie ventricolari 34.
L'efficacia e l'aritmia di terapia con cellule staminali dipende dalle cellule così come sui percorsi di consegna. Infatti, in cuori di ratto dopo infarto miocardico 35, iniezioni BMC intramiocardiche, anche se il miglioramento della funzione cardiaca, aumento consecutivi ventricolari premature contrazioni ventricolari e tachycardia per i primi 14 giorni. Quando è stata usata la via intracoronarica, eventi di aritmia ventricolare era marcatamente diminuita. Negli studi clinici, la funzione pro-aritmico di cellule iniettate è difficile valutare come la maggior parte dei pazienti ricevono agenti beta-bloccanti come indicato per cardiopatia ischemica. Il trattamento con beta-bloccanti può mascherare un potenziale effetto pro-aritmico delle cellule trapiantate. Gli studi su animali sono quindi cruciali per valutare le basi di stimoli pro-aritmici in terapia con cellule staminali.
In sintesi, i nostri dati dimostra la fattibilità di cellula-iniezione intramiocardico nei topi, ma anche sottolinea la necessità di un'analisi dettagliata per quanto riguarda le condizioni di sicurezza del trapianto cellulare. Nell'uomo, è stato dimostrato che l'iniezione cella è associata a pro-aritmie 36-38, restenosi 39, accelerata aterosclerosi 40, e ostruzione coronarica 41. La ricerca di base sarà importante in futuro app clinicablicazioni per capire quali dovranno essere consegnate le cellule, le modalità di consegna, i meccanismi di riparazione del miocardio funzione delle cellule-mediata e la progettazione di un allogenico rispetto autologo protocollo di trapianto di cellule che beneficiano tutta la popolazione umana. A causa dei costi elevati associati con i grandi studi clinici, la riproducibilità di efficienza ed efficacia dei protocolli di trapianto deve essere affrontato in modelli preclinici come quelli qui descritti.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il Magdi Yacoub Institute (MYI) per supportare l'analisi di microscopia e progetti che coinvolgono riparazione cardiaca, i tecnici e il Direttore del nostro stabulario. Questo lavoro è stato sostenuto dalla British Heart Foundation (BHF), Progetto a PG/10/019. MPS è supportato dal MYI e BHF. TP è un BHF-Research Excellence Fellow. NR è un NH & MRC in Australia Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolator | Pfi systems | Quotation needed | |
| Heating Pad | Vet Tech Solutions | HE006 | For small animals |
| Medetomidine | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Ketamine hydrochloride | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Atipamezole | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Hair removal cream | commercial shops | ||
| Buprenorphine | NVS | Veterinary prescription is necessary | |
| Leica MZFLIII microscope | Leica | Model S6E | With swing arm stand TS0 |
| Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner | Hamamatsu | RS series | |
| Scanning Electron Microscope | Jeol | JSM-6610 | |
| Blunt scissors | FST | 14084-09 | |
| Minivent | Harvard Apparatus | 73-0043 | Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844) |
| Forceps | FST | 11052-10 | |
| Retraction system | FST | 18200-20 | Kit for animals up to 200 g |
| 30 G 12 mm; ½ inch | BBraun | A210 | Fine yellow |
| Microliter syringe | ESSLAB | 81201 | Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700 |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | W1614T |
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