Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Intramyocardial Cell Levering: Observasjoner i murine Hearts

Published: January 24, 2014 doi: 10.3791/51064
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1,2
1Magdi Yacoub Institute, Imperial College London, 2National Heart and Lung Institute, Imperial College London, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

Intramyocardial celle levering i murine modeller av kardiovaskulære sykdommer, så som hypertensjon eller myokardialt infarkt, er mye brukt for å teste det terapeutiske potensial av forskjellige celletyper i regenerative studier. Derfor vil en detaljert beskrivelse og en klar visualisering av denne kirurgiske prosedyren bidra til å definere grensene og fordeler av hjerte-celle terapeutiske analysene i smågnagere.

Abstract

Tidligere studier viste at celle levering fremmer hjertefunksjon forbedring ved frigjøring av cytokiner og faktorer som øker hjertevevet revaskularisering og celle overlevelse. I tillegg er ytterligere observasjoner viste at bestemte stamceller, slik som hjerte-stamceller, mesenchymale stamceller og cardiospheres har evnen til å integrere i den omkringliggende hjertemuskelen ved å differensiere til kardiomyocytter, glatte muskelceller og endotelceller.

Her presenterer vi de materialer og metoder for å pålitelig levere noncontractile celler inn i venstre ventrikkel vegg av immunodepleted mus. De fremspringende trinn i denne fremgangsmåten involverer mikro anestesi og analgesi injeksjon, intratrakeal intubasjon, innsnitt for å åpne brystkassen og blottlegge hjertet og levering av celler av en steril 30-gauge nål og en presisjonsmikroliter sprøyte.

Tissue behandling bestående av hjerte høsting, embedding, snitting og histologisk farging viste at intramyocardial celleinjeksjon ga en liten skade i epicardial område, så vel som i den ventrikulære veggen. Noncontractile celler ble opprettholdt i den myokardial vegg av immunkompromitterte mus og var omgitt av et lag av fibrøst tissue, sannsynlighet for å beskytte mot kardial trykk og mekanisk belastning.

Introduction

Ulike celleleverings protokoller har blitt testet i murine og rottemodeller av hjerte-og karsykdommer med sikte på å oversette effektivitet, effekt og sikkerhet av denne eksperimentelle prosedyren hos mennesker. I små gnagere hjerter, er intramyocardial celle levering mest mulig metode for celle levering 1,2, mens den i rottehjerte antegrad 3 og retrograd fire intracelle infusjon kan også anvendes. Begge metodene har begrensninger og fordeler. Cell levering intrakoronart har teoretiske fordeler fremfor direkte intramuskulær injeksjon i å fremme global celle formidling tre, men det har også risikoen for å forårsake koronar emboli 3,5. Begrensninger på intramyocardial levering er forbundet med mekanisk skade, akutt betennelse, og hjerteinfarkt skader 6,7. Hos mennesker er celler for hjerte reparasjon levert av intramyocardial injeksjon gjennom en endokardiale eller kirurgisk epikardialtnærme eller ved intra arteriell rute 8. Injeksjon av transvascular ruter er egnet hos pasienter med akutt infarkt og reperfusert myokard, men kan ikke være mulig i tilfelle av total okklusjon eller dårlig flyt i blodårene i berørt område 9. Direkte injeksjon inn i den ventrikulære veggen ved transendocardial eller transepicardial injeksjon er teknisk mulig, avhengig av pasientens helsetilstand. Faktisk har det vist seg at denne teknikken er trygt 10,11, selv om det for transepicardial injeksjon en åpen bryst operasjon er nødvendig og for transendocardial nærmer seg en elektro kartlegging for hver pasient er nødvendig for å skille områder av levedyktige iskemisk eller arret 9. myokardiet.

Viktigere, i celleterapi studier valget av den beste mobil å bli transplantert er fortsatt under etterforskning. Kortsiktige analyser (4 uker) viste at injeksjon av kardiale stamceller definert som cardiospheres 13 indusert hjertestans funksjonell bedring i murine 14 og rotte 15 modeller av hjerteinfarkt ved å redusere arr størrelse og celledød. Allogen transplantasjon av cardiospheres i en rotte hjerteinfarkt modell uten immunsuppresjon ble funnet å være trygg, fremmet hjerte gjenfødelse, og forbedret hjertefunksjon gjennom stimulering av endogene reparasjonsmekanismene 15. Lin-/c-kit + voksne stamceller i hjertet ble vist å være selvforsynt, clonogenic, og multipotent in vitro og in vivo, og når det injiseres en iskemisk rottehjerte rekonstruert store deler av den skadde hjerteinfarkt veggen 16 og hadde den evne til å danne ledende og mellomstore koronar arterier 17. Disse lovende data drevet fase I og II kliniske studier på mennesker: injeksjon av autologe og allogene stamceller (MSC) 18, cardiospheres 19eller c-Kit positive kardiale stamceller (CSC) 20 i iskemiske menneskers hjerter hver viste gunstige effekter i hjertefunksjon i langtidsstudier. Likevel omfattende langsiktig oppfølging og retrospektiv meta-analysen viste at stamcelleterapi gir betydelig fordel for noen pasienter, men ikke i andre med en rekke uforutsigbare utfall 21. Det er mulig at disse begrensningene vil nødvendiggjøre utformingen av spesifikke protokoller i celle levering for hvert individ, og hver sykdom.

I mus og rottemodeller, langtidsstudier viste at celle injeksjon ikke ytterligere forbedre hjertefunksjon (12 måneder). Faktisk, grafts av humane embryonale stamcelle avledet cardiomyocytes (hESC-CM) ble i stor grad isolert fra verts myocardium av et lag av fibrotisk vev 22,23. Lignende resultater har blitt observert etter intramyocardial transplantasjon av skjelett myoblasts inn i hjertet av infarkt mus 24. Furthermore, den langsiktige evne til allogene MSCs å bevare funksjonen i infarkt hjerte har vært begrenset av overgangen fra en immunoprivileged til en immunogent tilstand etter differensiering 25.

Tatt i betraktning de utfordringene og prospekter som er skissert ovenfor, viser vi her hvordan du kan levere celler ved intramyocardial injeksjon i mus. Vi ser at celler uten cardiomyocyte kontraktile egenskaper ikke er forbundet med verts myokardium og danne en sammenhengende masse med en tynn fibrotisk barriere. Selv om det i noen tilfeller er dette resultatet kan være fordelaktig, kan den følgende analysen være nyttig for å forstå hvordan celle engraftment kan være modulert for å generere funksjonsmessig forbundne myokardielle strukturer også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyrestudier ble utført i samsvar med internasjonale (Direktiv 2010/63/EU av Europaparlamentet) og nasjonalt (UK Home Office, Act 1986) regelverk. Prosedyrene beskrevet her er en del av vår plan for arbeid under britiske konsesjonsmyndighetene, og har ikke blitt foretatt i den hensikt opptaket.

En. Utarbeidelse av celler

Denne protokollen beskriver utarbeidelse av en bestemt cellelinje (Human embryonale nyre, HEK293 celler) for demonstrasjonsformål. Cell-spesifikke protokoller må være ansatt for å vokse og til slutt skille pluripotent eller voksne stamceller til spesifikke celle linjene.

  1. Dyrk celler i DMEM medier (høy glukose, 4,500 mg / l) inneholdende 1% natrium-pyruvat, 2 mM glutamin, 1% antibiotisk Pen / Strep og 10% kalvefosterserum (FBS). En 10 cm plate bør normalt delt på 01:03 og media supplert frisk hver dag.
  2. Unn celler mildt med Trypsi 1x og resuspender i DMEM medium som beskrevet i 01:01.
  3. Antall celler i et hemocytometer kammeret og samle 3 x 10 til 6 celler i et separat rør.
  4. Sentrifuger i en sving bucket rotor ved 100 g i 5 min.
  5. Kast supernatanten og vask cellepelleten med steril fosfatbuffer 2 x.
  6. Resuspender i PBS 1x ved en konsentrasjon på 10 6/50 yl injeksjonsvæske inn i den venstre ventrikkel i immunodepleted mus.

2. Presurgical betingelser

  1. Oppretthold immunodepleted mus (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) med sterile mat pellets og vann i et temperaturkontrollert isolator (22 ° C, Tabell 1) før hver operasjon.
  2. Utføre kirurgi på immunodepleted mus under en laminær hette. Rengjør arbeidsområde med 70% etanol og autoklav kirurgiske verktøy (tang og saks).
  3. Slå på varmeputer for kirurgi og for gjenvinning. Varmeplatene er viktigtil å blokkere reduksjonen i kroppstemperatur som oppstår under og etter operasjonen.
  4. Plasser en ren og autoklaveres bur på recovery-varmeputen.
  5. Transporter musene i deres opprinnelige bur fra isolatoren til kirurgi rom i en steril pose autoklavert.
  6. Vei mus og i henhold til kroppsvekt injisere subkutant (sc) en oppløsning inneholdende medetomidin og ketamin hydroklorid fortynnet i 0,9% steril saltoppløsning for å bedøve mus, så vel som til å slappe av muskulaturen (medetomidin 1 mg / kg; ketamin hydroklorid 75 mg / kg).
  7. Fjern musen fra buret når den er fullt bedøvet (innen 1-2 minutter, ingen toe-pinch refleks etter stimulering)
  8. Påfør hårfjerningskrem på venstre side av brystet og halsen området. Etter en passende tid (ca. 2-5 min), tørke bort de løse hårene med en vann-vått vev.
  9. Plasser musen på kirurgi panel i liggende stilling. Frakirurgens synspunkt stillingen er vertikal, hale ned-head up.
  10. Injiser analgetisk løsning på 0,1-0,2 ug / g fortynnet i steril saltløsning (buprenorfin) i den hind lem subkutant og dekke det barberte området med den aseptiske løsning povidonjodid ved hjelp av en applikator med bomullstupp.
  11. Fokuser mikroskop (2.5x objektiv) på halsen området.

Tre. Kirurgiske tilstander

  1. Med sløv saks lage en midtlinjen ventral hud innsnitt på ca 0,5-1 cm lengde litt under cricoid brusk. Separer huden fra bindevevet for å visualisere spyttkjertlene.
  2. Splitte spyttkjertler på deres naturlige midtlinjen divisjon med samtidig trekker hver del sideveis med forcep og magnetisk brystet retractor og avsløre luftrøret.
  3. Trekk tungen forsiktig til siden for å eksponere strupehodet. Skyv intubasjon røret forsiktig inn i luftrøret. Røret tips er synlig gjennom det viste larynx og luftrør. Viktigere, hvis røret er i, men ikke klart synlig, er det i spiserøret. Fjern det og endre plasseringen av røret spissen.
  4. Koble røret til ventilasjons maskinen. Sett slagvolum på 200 mL og 150 slag / min. Fest ventilasjon rør på kirurgi panelet med et bånd.
  5. Med sløv saks og pinsett, lage en vertikal hale til hodet 1 - til 1,5-cm lange snitt i huden over venstre thorax området.
  6. Løsne huden fra bindevevet / muskellagene og de store og små brystmuskulaturen uten å gjøre snitt.
  7. Utfør torakotomi mellom den tredje og fjerde ribber som følger:
    1. Perforere interkostalrom muskel laget ved å klemme og skrape med små, runde tang.
    2. Når interkostalrom muskel laget er perforert, plasserer brystet beltesnellen å maksimalt åpne brysthulen. De øvre og midtre deler av venstre ventrikkel (LV) med sin overliggende atriet (atrium) ernå synlig.
  8. Forbered en presisjon sprøyte med celler. Sprøyten må være i stand til å levere en mengde av volum på 10 ul til hver injeksjon. Kastet en 30 G nål på tuppen av sprøyten.
  9. Fest med tape en liten plastkateter (fra en introcan-W 20 G) på nålen, forlater utsatt bare en mm inkludert den åpne tuppen av nålen. Dette vil hindre nålen fra å perforere hele venstre ventrikkel vegg og injisere cellene inn i venstre hjertekammer hulrom.
  10. Med hjelp av en 5X objektiv, visualisere at denne forstørrelsen venstre ventrikkel og injisere cellene inn i det venstre ventrikulære veggen i 5 forskjellige steder (hver injeksjon vil levere 10 ul for totalt 106 celler injisert). Hvis injeksjonen er vellykket, vil et hvitt område og fraværet av vesentlig tilbakespylings av cellene være synlig (injeksjonen var ikke vellykket, vil dyret utelukkes fra funksjonell analyse).
  11. Ta rullen. Lukk brystvegg by omslutter de to atskilte ribbe med to sting med 6-0 silke sutur.
  12. Fukte pectoral muskler og hud med en bomullstupp gjennomvåt i PBS 1x og forsiktig sette musklene tilbake til utgangsposisjon med pinsett.
  13. Lukk huden med 3-4 sting av 6-0 silke sutur. Sy halsen snittet med 2-3 masker for å lukke huden.
  14. Injisere atipamezol (1 mg / kg endelig konsentrasjon) for å tilbakestille bedøvende effekter.
  15. Så snart musen begynner å puste selvstendig, ta ut røret fra luftrøret og sette musen på sin høyre side. Musen er ventet å komme i løpet av minutter.
  16. Når musen begynner å snu og gå, plasser den i den varme utvinning bur (små IVC bur med lukket filtrert toppen) for en time.
  17. La dyrene natten over i et kontrollert oppvarmet boks (37 ° C).
  18. Fyll en skål med vann og pellet mat for å støtte utvinning i løpet av de første to dagene etter operasjonen.

Ti hjerter injisert med celler og 10 kontroll ikke injisert hjerter er analysert histologisk som følger:

  1. Analyser podet celler 1 uke etter injeksjonen (figur 1 og 3).
    1. Etter dødshjelp ved overdose av isofluran, perfuse hjertene med 20 ml 4% Paraformaldehyde (PFA) å fikse vevet. Dehydratisere den faste vev i økende prosentandeler av etanol (70-100%) og bygge inn i parafinblokker.
    2. Seksjon hjertene i parafin med en mikrotom på 5 mikrometer og beis med hematoxylin og eosin for morfologisk analyse.
    3. Visual bindevev ved hjelp Masson er Trikrom flekken.
    4. Analysere bilder under et lysbilde skanner mikroskop (figur 1A, 2A, 3A, 3B og 3C) og visualisere hele hjertet i aksesnitt ved hjelp av en digital lysbildeskanner mikroskop (Figures 1B og 1C).
  2. Etter at de ovennevnte analyser, deparaffinize hjertevevet i xylen, rehydratiseres ved å nedsenke prøvestykkene i avtagende andeler av etanol (fra 100% til vann) og fremgangsmåte for scanning elektronmikroskopi (SEM) som følger:
    1. Inkuber deparaffinized blokker med 1% garvesyre i 0,1 M fosfatbuffer i 1 time.
    2. Dehydrate prøvene i stigende andeler av etanol (25-100%).
    3. Tørre prøver med HMDS (heksametyldisilazan).
    4. Monter prøvene på Stubbs med Acheson Silver Dag og frakk dem med gull-palladium.
    5. Se eksempler i en analytisk scanning elektronmikroskop (fig. 2B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi injisert HEK293 celler, som er skjelnes fra hjerteceller ved sin annen morfologi (fig. 1), med en brostein form i forhold til de langstrakte cardiomyocytes (Figur 1a). HEK293 cellene var mer reaktiv til hematoxylin fargestoff (blå farge) i forhold til cardiomyocytes (rosa farge), sannsynligvis på grunn av deres økte kjerneinnhold (figur 1A). For ytterligere å skille de injiserte celler fra vertsvevet, ble HEK293-celler merket med DAPI 2 timer før injeksjon. Merkede-cellene var synlig i myokardialt vev som vist på figur 1E. Kontroll skinn-opererte mus viste ingen skade i det hele hjertet (figur 1C), og integriteten av vev (Fig. 1D).

I en helt aksesnitt av hjertet, injiserte cellene var synlig som en homogen gruppe i området av injeksjonen (figur 1B). Den gruppert calen var omgitt av et tynt sjikt av fibrøst vev, som viste seg som en blå område i Trichrome farging (figur 2A). Celler ble ikke forbundet med verts myokardialt vev, som vist ved Scanning Elektron Mikroskopi (figur 2B), sannsynligvis på grunn av deres noncontractile funksjon og forskjellige cellestruktur.

I tillegg til de ovenstående observasjoner, ble det registrert små områder av skadet hvor nålen ble injisert (figur 3A). Disse områder løpe fra det ytre epikardialt lag av hjertet inn i myocardial veggen (figur 3A). Injisert celler (grønn pil, Figur 3B) er til stede i nærhet av det skadde området (svarte piler, Figur 3B). DAPI-positive cellene var synlig langs injeksjonsstedet (Figur 3C, hvite piler). En uke etter skade, gjorde Tunel analysen ikke viser økt apoptotiske celler på stedet av skader, noe som tyder på at nekrosesnarere enn apoptose har oppstått etter injeksjonen (Figur 3D).

Figur 1
Figur 1. Histologisk analyse av injiserte celler. A) En uke etter celle injeksjon hjerter ble innleiret i paraffin og bearbeidet for hematoxylin og eosin farging. Injiserte HEK293-celler var tilstede i veggen av den venstre ventrikkel. Bilder ble erholdt med en stereo fluorescens mikroskop. B) Trichrome farget vev viste at cellene ble gruppert i det samme område hvor de ble injisert (pil). Høyre bunnpanel viser de korte aksen view med høyre (RV) og venstre ventrikkel (LV). Den røde firkanten viser området der cellene er beholdt (1,5 X). Bildene ble tatt med et lysbilde scanning mikroskop. C) Trikrom staining av kontroll sham-opererte hjerter. Hele hjertet visning med en 5x objektiv. D) Trikrom farging av skinn-opererte mus viser hjerteinfarkt vev integritet. E) HEK293 celler ble farget med DAPI 2 timer før injeksjonen. En uke etter injeksjon hjerter ble forankret i oktober og seksjonert i en kryostat på 6 mikrometer. Celler ble visualisert under UV i en fluorescerende mikroskop. Venstre og høyre ventrikkel vises. I høyre hjertekammer, høyre panel, den hvite linjen markerer epicardial lag. Klikk her for å se større bilde.

Fig. 2
Figur 2. Dannelse av en fibrotisk lag mellom injiserte celler og verten vev. A) Trikrom farging showetkollagene vev dannet mellom HEK293-celler og murine myokardialt vev (piler). Bildene ble tatt opp med en digital scanning mikroskop. B) Hjerter ble deparaffinized og behandlet for Scanning elektronmikroskopi. Bildene ble tatt opp med en scanning elektronmikroskop og viser kollagenfibre (piler) mellom de injiserte HEK293 celler (venstre side) og verts myokard (høyre side). Klikk her for å se større bilde.

Figur 3
Figur 3. Cell injeksjon produserte små områder av skade. A) Trikrom flekker viser små områder av skade der nålen ble injisert (blå farge;. Piler) B) Parafin seksjonene ble farget av Trikrom staining og området hvor cellene ble injisert er indikert med sorte piler. Injisert celler (grønn pil) var synlig i nærhet til den skadde området. C) HEK293 celler, farget med DAPI to timer før injeksjon, var til stede sammen injeksjonsstedet (hvit pil). Injeksjonsstedet er markert med en grønn pil og hvit åpen linje markerer perikardial lag. D) Tunel analysen, utført på parafinsnitt, viste ikke relevante fluorescerende positive kjerner. Klikk her for å se større bilde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskriptet, har vi vist hvordan du utfører intramyocardial injeksjon av celler i murine hjerter. Som et bevis på denne metodikken, har vi brukt HEK293 celler. Det er viktig å understreke at HEK293 celler ikke blir brukt i noen celleterapi studie og derfor resultatene av dette manuskriptet er ikke egnet for direkte oversettelse til en terapeutisk tilnærming. Imidlertid, det faktum at HEK293-celler ikke er kontraktile celler og ikke transdifferentiate i andre celletyper retter oppmerksomheten mot tekniske aspekter som egenskapene til cellene som skal leveres og ruten for levering.

Det har blitt rapportert at en intramyocardial rute har en tendens til å forårsake celleklynger innleiret i hjertevev 24,26, mens intrakoronart kunne gi mer homogen fordeling på stedet for skade. For cardiomyocyte erstatning, bør den ideelle donor celle vise den elektrofysiologisk, strukturelle og kontraktile properties av kardiomyocytter og bør være i stand til å integrere strukturelt og funksjonelt i vertsvevet, noe som tyder på at det er nødvendig for en celledifferensiering program som skal anvendes før transplantasjon.

De viktigste punktene for en vellykket operasjon kan oppsummeres som følger:

  1. Anesthetize mus med injiserbare forbindelser reduserer hjertefrekvensen og lette celle injeksjon
  2. Utfør intratrakeal cannulation av mus for å favorisere lungene funksjonalitet.
  3. Utfør Thoracotomi unngå muskel snitt for å opprettholde brystmuskelen funksjonalitet for en riktig pust.
  4. Etter å eksponere hjertet, observerer venstre ventrikkel under et mikroskop for å visualisere hvorvidt injeksjon har forekommet (synlig som en blek farge).
  5. Med en tynn nål og en presisjonssprøyte for å unngå utstrakt perforering av myokardialt vev, og for å injisere den ønskede mengde materiale hhv.
  6. Sheathe nålen med et plastrør system utsette oNLY spissen del. Dette ville tillate innføring av nålen til en bestemt dybde inn i den venstre ventrikkel (0,5 mm), unngå injeksjon i den ventrikulære hulrom.
  7. Lukke brystet og rommet mellom ribbene nøye for å unngå eksponering av lungene til ytre trykk.

Denne teknikken har en høy grad av suksess dersom post-operativ helsetilstander er prioritert. Dyr må følges nøye hver dag opp til en uke for tegn på stress og smerte. Injeksjon av analgetiske forbindelser for å kontrollere smerte må administreres etter behov post-operativt. Topisk påføring av smertelindring, slik som lidokain, kan også anvendes. Blødning bør forebygges ved forsiktig kirurgiske teknikker. Imidlertid, hvis forekommende, kan den stoppes ved komprimering eller ligering av fartøyer. Vi har registrert at dyrene komme bedre og raskere hvis den forblir i en varmeboks ved 37 ° C i 12-20 timer etter kirurgi. Denne behandlingen vil blokkere rask kroppstemperatur nedgang, og hellernormalt oppstår etter kirurgisk inngrep og administrasjon av anestesi. Postsurgical infeksjoner kan forekomme, men bør være mindre enn 1%. Aseptiske prosedyrer må følges nøye for å hindre smitte. Lokale infeksjoner kan behandles med påføring av antibiotika. Viktigere, bør dehydrering reguleres ved subkutan injeksjon av saltvann.

Det er foretrukket å administrere injiserbare løpet inhalert anestetikum, for eksempel isofluran. Faktisk, observerte vi at injiserbare bedøvelse redusert hjerterytme, slik at lettere injeksjon og mindre blødninger uten å forårsake dyr ubehag.

Selv invasiv, er injeksjon av små volumer av celler (25 til 50 mikroliter) i mus bart og trygt. Vi hadde dødelighet mindre enn 1% ved å injisere 50 pl av HEK293-celler i 5 forskjellige områder av det venstre ventrikulære veggen (10 mL / injeksjon). Denne metoden sikrer tilstedeværelsen av cellene i flere områder av myocardial vegg, noe som er viktig istamcelleterapi når utvidede områder av iskemisk skade må nås med de leverte celler. For å utføre mindre invasiv kirurgi, har flere protokoller nylig blitt publisert, selv om deres reproduserbarhet i forskjellige laboratorier har ennå ikke bekreftet. For eksempel, kan celle injeksjon utføres av nær-brystet teknikk med høyoppløselig ekkokardiografi 27. Bruken av dette systemet krever høye operatørens ferdigheter for å visualisere klart i en to-dimensjon bilde veggen i venstre ventrikkel, og for å opprettholde nålen på et bestemt sted under normal systolisk / diastolisk sykluser. Fordelen med denne teknikken er at implantering av cellene i musen myocardium til ønskede steder i et klinisk relevant tidsramme etter myokardialt infarkt induksjon. Imidlertid er denne metode ikke mulig med kirurgiske prosedyrer slik som myokardisk infarkt induksjon eller transaortic striper på grunn av økt dødelighet av dyr som gjennomgår et andre operasjon 27. Interessant, Hamdi og kolleger sammenlignet direkte intramyocardial injeksjon versus levering av celler i en Gelfoam konstruere på epicardial området 28. De observerte at overliggende cellen konstruere på epikardet resultert i bedre pode funksjonalitet i forhold til intramyocardial celle injeksjon og rapportert at denne teknikken er reproduserbar, brukervennlig, og mindre traumatisk for dyrene 28.

Et viktig trekk ved cellen injeksjonseksperimenter er sporing av cellene og deres overlevelse. Vi har vist at HEK293-celler er lett å oppdage på grunn av sin morfologi skjelnes i forhold til hjerteceller. Disse cellene overlevde injeksjon (data ikke vist), og ble opprettholdt i vevet én uke etter operasjonen. Å spore celler for langtidsstudier og analysere deres engraftment i vevet av levering samt i andre vev, flere teknikker er i bruk, inkludert fluorescerende merking og FISH ennalysis i sex-mismatch transplantasjons eksperimenter 29. Viktigere, vil in vivo avbildning spille en viktig rolle mot in vitro analyser i fremtidige studier. Det er faktisk en fordel av in vivo avbildning løpet histologiske metoder sporing av cellene i langsgående studier i de samme dyr uten behov for avliving 29.. I denne metoden, kan cellene være merket med bioluminesens reagenser, jernpartikler, og spesifikke rapportørgener som skal avbildes med positronemisjonstomografi (PET) og magnetisk resonans (MRI).

Våre analyser viste at noncontractile celler slik som HEK293-celler fortrinnsvis gruppert i det område hvor de ble injisert omgitt av en tynn kollagene vev. Selv om de patofysiologiske mekanismene som fører til dannelsen av det fibrøse vev i en immunodepleted mus er ukjente, kan de kollagene vevet synlige rundt de transplanterte cellene kunne sammenlignes med endepunktet til envevskompatibelt implantat. I dette tilfelle kan det eksogene materialet ikke fjernes ved de inflammatoriske cellene og blir innkapslet i et tett lag av fibrøst bindevev, som isolerer den fra det omkringliggende vev. I likhet med de siste-stadium faser av sårheling, er dette kornet vev høyt vaskularisert og sikrer overlevelse av implantert materiale.

Teknisk sett den fremgangsmåte som er beskrevet her var vellykket, selv om intramyocardial injeksjonen fremstilt et lite område av skade på det omkringliggende vev. Selv om hjertefunksjon målinger var ikke målet med denne anmeldelsen, bør fremtidige studier undersøke om mindre vevsskade kan forurolige celleterapi analyser. Videre ville det være viktig å analysere om skaden som produseres i det injiserte området er forårsaket av nålen, av mengden av celler injisert eller ved en kombinasjon av begge.

Til støtte for våre funn, har det vist seg at transplantation av blandede bestander av differensierte humane embryonale stamceller (hESC) som inneholder 20-25% cardiomyocytes (hESC-CM) inn i sunt hjerte av immunsupprimerte mus (NOD-SCID) resulterte i rask dannelse av grafts der cardiomyocytes ble organisert og modnet over tid og noncardiomyocyte befolkningen ble tapt 23. Interessant nok forfatterne observert at hESC-CM ble i stor grad isolert fra verts myocardium av et lag av fibrotisk vev som hindret dannelsen av en elektro syncytium 22,23. I en annen studie, Kehat et al. Fant at hESC-CM hell tempoet ventrikkelen i svin med fullstendig hjerteblokk. Denne studien viste at de transplanterte cellene overlevde, fungerte, og integrert med vertsceller, som gir bevis for deres evne til å fungere som en biologisk alternativ til den elektroniske pacemaker 30.. Disse to uharmoniske utfall kan bli forsonet med forskjellen i struktur og funksjon av host og giver arter. Det er faktisk mulig at effektiviteten av koblingen av transplanterte kardiomyocytter kan være avhengig av den relative vibrerende frekvens på verts-og giverceller. I Van Laake studie 23, kan dannelsen av funksjonelle veikryss bli svekket på grunn av ulik juling hyppigheten av menneskelige cardiomyocytes (60-100 bpm) versus gnager cardiomyocytes (300-600 bpm). Dette ville ikke være tilfelle i human versus svin transplantasjonsforsøk, som beskrevet i Kehat analyse 30.

Lengden av observasjonstiden er en annen problemfaktor. hESC-CM transplantert inn gnager hjertet etter hjerteinfarkt indusert hjertefunksjon amelioration kun for kortsiktig tidspunkter (4 uker). Men på 12 uker, hjertefunksjon ble ikke videre næring til tross graft overlevelse 23. Forfatterne observerte at pode-størrelse (økt mengde celler) som ikke var forbundet med forbedret langtids kardial survival og funksjonell forbedring 31, noe som indikerer at langsiktige analyser versus kort eller mellomlang sikt analysene skal utføres i fremtidige studier uten å kreve økt antall celler for injeksjon.

I den foreliggende undersøkelse, forblir flere spørsmål vedrørende den type av celler som skal transplanteres, valg av vert-donorarter som skulle testes, og en detaljert vurdering av arytmisk potensial av cellene. Ideelt sett, stamceller implantert i hjertemuskelen for utskifting eller pacemaker funksjon bør funksjonelt par med de resterende myocytes. I en rottemodell for hjerteinfarkt, Fernandes et al. 32 brukes Programmert elektrisk stimulering (PES) for å evaluere arytmi mottakelighet, viser en økt induserbarhet av ventrikkelarytmi i myoblast-injisert hjerter sammenlignet med kontrollene. I den samme studien, fikk injeksjoner av beinmarg-avledet autologe celler ikke resultere i en økt inducibilligheten av ventrikkelarytmi sammenlignet med kontroller, og dermed føre forfatterne å konkludere med at myoblasts utstilt en bestemt arytmogene risiko. I en annen studie, benmarg-avledet celler (BMC) effektivt podet i klynger innenfor infarktet arr eller randsonen, men viste ingen elektronisk fremkalt Ca transienter 33. Interessant, Wei et al. Viste at mesenchymale stamceller (MSC) ikke erverve de elektrofysiologiske egenskaper modne cardiomyocytes løpet overlevelse perioden i infarkt hjerter. Men de kan lindre den elektriske sårbarhet og ikke fremmer ventrikulære arytmier 34.

Effekt og arytmi forekomst av stamcelleterapi avhenger av celler, så vel som av leverings-ruter. Faktisk, i rottehjerter etter MI 35, intramyocardial BMC injeksjoner, selv om bedre hjertefunksjon, økt påfølgende ventrikulære premature rier og ventrikkel tachycardia for de første 14 dagene. Når intrakoronart ble brukt, ble ventrikkelarytmi forekomst markert redusert. I kliniske studier, er vanskelig å vurdere som de fleste av pasientene får beta-blocker agenter som indikert for iskemisk hjertesykdom den pro-arytmisk funksjon av injiserte celler. Behandling med betablokkere kan maskere en potensiell pro-arytmisk effekt av de transplanterte cellene. Dyrestudier er derfor avgjørende for å vurdere grunnlaget for pro-arytmisk stimuli i stamcelleterapi.

I sammendraget, demonstrerer vår data muligheten for intramyocardial celle-injeksjon i mus, men også understreker behovet for en detaljert analyse om sikkerhetstilstanden celle pode. I mennesker er det blitt vist at celleinjeksjon er forbundet med pro-arytmi 36-38, restenose 39, akselerert aterosklerose 40 og koronar obstruksjon 41.. Grunnleggende forskning vil være viktig i framtidig klinisk applications å forstå hvilke celler skal leveres, er modusen for levering, mekanismene for celle-mediert hjerteinfarkt funksjon reparasjon, og utformingen av en allogen kontra autolog celletransplantasjon protokoll som gagner hele den menneskelige befolkning. På grunn av de høye kostnadene forbundet med store kliniske studier, trenger reproduserbarhet av effektivitet og effekt av transplantasjons protokoller for å tas opp i prekliniske modeller slik som de som er beskrevet her.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi takker Magdi Yacoub Institute (MYI) for å støtte mikros analyse og prosjekter som involverer hjerte reparasjon, teknikerne og lederen av vår dyre anlegget. Dette arbeidet har vært støttet av British Heart Foundation (BHF), prosjektstøtte PG/10/019. MPS er støttet av MYI og BHF. TP er en BHF-Forskning Excellence Fellow. NR er en NH & MRC Australia Fellow.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolator Pfi systems Quotation needed
Heating Pad Vet Tech Solutions HE006 For small animals
Medetomidine National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Ketamine hydrochloride National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Atipamezole National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream commercial shops
Buprenorphine NVS Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope Leica Model S6E With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner Hamamatsu RS series
Scanning Electron Microscope Jeol JSM-6610
Blunt scissors FST 14084-09
Minivent Harvard Apparatus 73-0043 Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps FST 11052-10
Retraction system FST 18200-20 Kit for animals up to 200 g
30 G 12 mm; ½ inch BBraun A210 Fine yellow
Microliter syringe ESSLAB 81201 Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700
6-0 Silk suture Ethicon W1614T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
  2. Taylor, D. A., et al. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat. Med. 4, 929-933 (1998).
  3. Suzuki, K., et al. Cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction using vascular endothelial growth factor-expressing skeletal myoblasts. Circulation. 104, 207-212 (2001).
  4. Suzuki, K., et al. Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function. Circulation. 110, 225-230 (2004).
  5. Robinson, S. W., et al. Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant. 5, 77-91 (1996).
  6. Muller-Ehmsen, J., et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 107-116 (2002).
  7. Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
  8. Dimmeler, S., Zeiher, A. M., Schneider, M. D. Unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair. J. Clin. Invest. 115, 572-583 (2005).
  9. Oettgen, P., Boyle, A. J., Schulman, S. P., Hare, J. M. Cardiac Stem Cell Therapy. Need for Optimization of Efficacy and Safety Monitoring. Circulation. 114, 353-358 (2006).
  10. Krause, K., et al. Percutaneous intramyocardial stem cell injection in patients with acute myocardial infarction: first-in-man study. Heart. 95, 1145-1152 (2009).
  11. Rodrigo, S. F., et al. Intramyocardial injection of bone marrow mononuclear cells in chronic myocardial ischemia patients after previous placebo injection improves myocardial perfusion and anginal symptoms: an intra-patient comparison. Am. Heart J. 164, 771-778 (2012).
  12. Smith, R. R., et al. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation. 115, 896-908 (2007).
  13. Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 2, 173-181 (2009).
  14. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
  15. Malliaras, K., et al. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells. Circulation. , 125-1100 (2012).
  16. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, 763-776 (2003).
  17. Bearzi, C., et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15885-15890 (2009).
  18. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308, 2369-2379 (2012).
  19. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379, 895-904 (2012).
  20. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, 1847-1857 (2011).
  21. Brunt, K. R., Weisel, R. D., Li, R. K. Stem cells and regenerative medicine - future perspectives. Can. J. Physiol. Pharmacol. 90, 327-335 (2012).
  22. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  23. van Laake, L. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction. Stem Cell Res. 1, 9-24 (2007).
  24. Leobon, B., et al. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7808-7811 (2003).
  25. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122, 2419-2429 (2010).
  26. Reinecke, H., Poppa, V., Murry, C. E. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 241-249 (2002).
  27. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, 1307-1314 (2005).
  28. Hamdi, H., et al. Cell delivery: intramyocardial injections or epicardial deposition? A head-to-head comparison. Ann. Thorac. Surg. 87, 1196-1203 (2009).
  29. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marban, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circ. Res. 106, 479-494 (2008).
  30. Kehat, I., et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
  31. van Laake, L. W., et al. Improvement of mouse cardiac function by hESC-derived cardiomyocytes correlates with vascularity but not graft size. Stem Cell Res. 3, 106-112 (2009).
  32. Fernandes, S., et al. Autologous myoblast transplantation after myocardial infarction increases the inducibility of ventricular arrhythmias. Cardiovasc. Res. 69, 348-358 (2006).
  33. Scherschel, J. A., Soonpaa, M. H., Srour, E. F., Field, L. J., Rubart, M. Adult bone marrow-derived cells do not acquire functional attributes of cardiomyocytes when transplanted into peri-infarct myocardium. Mol. Ther. 16, 1129-1137 (2008).
  34. Wei, F., et al. Mesenchymal stem cells neither fully acquire the electrophysiological properties of mature cardiomyocytes nor promote ventricular arrhythmias in infarcted rats. Basic Res Cardiol. 107, 274 (2012).
  35. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  36. Bartunek, J., et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation. 112, 178-183 (2005).
  37. Britten, M. B., et al. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Circulation. 108, 2212-2218 (2003).
  38. Smits, P. C., et al. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J. Am. Coll. Cardiol. 42, 2063-2069 (2003).
  39. Kang, H. J., et al. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet. 363, 751-756 (2004).
  40. Fernandez-Aviles, F., et al. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ. Res. 95, 742-748 (2004).
  41. Vulliet, P. R., Greeley, M., Halloran, S. M., MacDonald, K. A., Kittleson, M. D. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs. Lancet. 363, 783-784 (2004).

Tags

Medisin intramyocardial celle injeksjon hjerte pode celleterapi stamceller fibrotisk vev
Intramyocardial Cell Levering: Observasjoner i murine Hearts
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poggioli, T., Sarathchandra, P.,… More

Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (83), e51064, doi:10.3791/51064 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter