Summary
उच्च रक्तचाप या रोधगलन के रूप में हृदय रोगों के murine मॉडल में intramyocardial सेल वितरण, व्यापक रूप से पुनर्योजी पढ़ाई में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के चिकित्सीय क्षमता का परीक्षण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इसलिए, एक विस्तृत विवरण और इस शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया का एक स्पष्ट दृश्य छोटे कृन्तकों में हृदय कोशिका चिकित्सीय विश्लेषण की सीमा और लाभ को परिभाषित करने में मदद मिलेगी.
Abstract
पिछले अध्ययनों सेल वितरण साइटोकिन्स और हृदय ऊतक revascularization और सेल अस्तित्व को बढ़ाने वाले कारकों की रिहाई से हृदय समारोह सुधार को बढ़ावा देता है कि पता चला है. इसके अलावा, टिप्पणियों आगे इस तरह के हृदय की स्टेम कोशिकाओं, mesenchymal स्टेम सेल और cardiospheres के रूप में विशिष्ट स्टेम सेल, cardiomyocytes, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं और endothelial कोशिकाओं में फर्क से आसपास मायोकार्डियम भीतर एकीकृत करने की क्षमता है कि पता चला.
यहाँ, हम मज़बूती से immunodepleted चूहों के बाएं निलय दीवार में noncontractile कोशिकाओं वितरित करने के लिए सामग्री और तरीके प्रस्तुत करते हैं. इस microsurgical प्रक्रिया की मुख्य कदम संज्ञाहरण और analgesia इंजेक्शन, intratracheal इंटुबैषेण, छाती खोलने के लिए और एक बाँझ 30 गेज सुई और एक सटीक microliter सिरिंज से कोशिकाओं का दिल और वितरण का पर्दाफाश करने के लिए चीरा शामिल है.
दिल कटाई, embeddi से मिलकर ऊतक प्रसंस्करणएनजी, सेक्शनिंग और ऊतकीय धुंधला intramyocardial सेल इंजेक्शन एक छोटे epicardial क्षेत्र में क्षति, साथ ही निलय दीवार में उत्पादित दिखाया. Noncontractile कोशिकाओं immunocompromised चूहों के दौरे दीवार में बनाए रखा गया और हृदय दबाव और यांत्रिक लोड से बचाने के लिए की संभावना fibrotic ऊतक की एक परत, से घिरे हुए थे.
Introduction
विभिन्न सेल वितरण प्रोटोकॉल मानव रोगियों में इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया की दक्षता, प्रभावकारिता और सुरक्षा का अनुवाद करने के उद्देश्य के साथ हृदय रोग का murine और चूहे मॉडल में परीक्षण किया गया है. चूहा दिल सामान्य गति की दिशा में जैसा कि रक्त प्रवाह में था तथा कुंचन में 3 और प्रतिगामी 4 intracoronary सेल निषेचन में भी इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि छोटे कृंतक दिलों में, intramyocardial सेल वितरण, सेल वितरण 1,2 का सबसे व्यावहारिक तरीका है. दोनों तरीकों सीमा और फायदे हैं. Intracoronary मार्ग के माध्यम से सेल वितरण वैश्विक सेल प्रसार 3 को बढ़ावा देने में प्रत्यक्ष इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन से अधिक सैद्धांतिक फायदे हैं, लेकिन यह भी कोरोनरी दिल का आवेश 3,5 पैदा होने का खतरा है. Intramyocardial वितरण पर सीमाएं यांत्रिक चोट, तीव्र सूजन, और दौरे क्षति 6,7 के साथ जुड़े रहे हैं. मनुष्यों में हृदय की मरम्मत के लिए कोशिकाओं को एक endocardial या शल्य epicardial के माध्यम से intramyocardial इंजेक्शन द्वारा दिया जाता हैदृष्टिकोण या intracoronary धमनी मार्ग 8 से. Transvascular मार्गों से इंजेक्शन तीव्र रोधगलितांश और reperfused मायोकार्डियम के साथ रोगियों में उपयुक्त है, लेकिन कुल occlusions या प्रभावित क्षेत्र में 9 की वाहिकाओं में खराब प्रवाह के मामले में संभव नहीं हो सकता. Transendocardial या transepicardial इंजेक्शन द्वारा निलय दीवार में प्रत्यक्ष इंजेक्शन रोगी के स्वास्थ्य की स्थिति पर निर्भर करता है तकनीकी रूप से संभव है. दरअसल, यह transepicardial इंजेक्शन के लिए एक खुली छाती सर्जरी आवश्यक है और transendocardial के लिए व्यवहार्य इस्कीमिक या जख्म मायोकार्डियम 9 की साइटों को अलग करने के लिए आवश्यक है कि प्रत्येक रोगी के लिए एक electrophysiological मानचित्रण दृष्टिकोण हालांकि इस तकनीक, 10,11 सुरक्षित है कि दिखाया गया है.
महत्वपूर्ण बात है, सेल थेरेपी पढ़ाई में प्रत्यारोपित किया जा के लिए सबसे अच्छा सेल का चुनाव जांच के तहत अब भी है. लघु अवधि के विश्लेषण (4 सप्ताह) से पता चला है कि cardiospheres के रूप में परिभाषित हृदय की स्टेम कोशिकाओं के इंजेक्शन
माउस और चूहा मॉडल में, लंबे समय तक अध्ययन सेल इंजेक्शन आगे हृदय समारोह (12 महीने) में सुधार नहीं किया कि पता चला. दरअसल, मानव भ्रूण स्टेम सेल व्युत्पन्न cardiomyocytes (hESC सेमी) की grafts काफी हद तक fibrotic ऊतक 22,23 की एक परत से मेजबान मायोकार्डियम से अलग थे. इसी तरह के परिणाम infarcted चूहों 24 के दिल में कंकाल myoblasts के intramyocardial प्रत्यारोपण के बाद देखा गया है. Furthermo, पुनः infarcted दिल में समारोह रक्षा अल्लोजीनिक MSCs के दीर्घकालिक क्षमता भेदभाव 25 के बाद एक immunogenic राज्य के लिए एक immunoprivileged से संक्रमण द्वारा सीमित किया गया है.
ध्यान से ऊपर उल्लिखित चुनौतियों और संभावनाओं में ले रहा है, हम चूहों में intramyocardial इंजेक्शन द्वारा कोशिकाओं वितरित करने के लिए कैसे यहाँ दिखा. हम cardiomyocyte सिकुड़ा गुणों के बिना कोशिकाओं मेजबान मायोकार्डियम के साथ जुड़ा हुआ है और एक पतली तांतव बाधा के साथ एक जोड़नेवाला व्यापक फार्म नहीं कर रहे हैं कि निरीक्षण करते हैं. कुछ मामलों में यह परिणाम लाभप्रद हो सकता है, निम्नलिखित विश्लेषण सेल engraftment के रूप में अच्छी तरह से कार्यात्मक जुड़े दौरे संरचनाओं उत्पन्न करने के लिए modulated किया जा सकता है समझने के लिए कैसे उपयोगी हो सकता है.
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Protocol
सभी जानवरों के अध्ययन इंटरनेशनल (यूरोपीय संसद के निर्देशक 2010/63/EU) और राष्ट्रीय (यूके गृह मंत्रालय, अधिनियम 1986) के नियमों के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया. यहाँ बताया प्रक्रियाओं ब्रिटेन लाइसेंस के अधिकारियों के तहत काम करने की हमारी योजना का हिस्सा हैं और रिकॉर्डिंग के प्रयोजन के लिए शुरू नहीं किया.
1. कक्ष की तैयारी
इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन प्रयोजनों के लिए एक विशेष सेल लाइन (मानव भ्रूण गुर्दे, HEK293 कोशिकाओं) की तैयारी का वर्णन है. सेल विशिष्ट प्रोटोकॉल बढ़ रही है और अंत में विशिष्ट सेल प्रजातियों में pluripotent या वयस्क स्टेम सेल फर्क के लिए नियोजित किया जाना चाहिए.
- DMEM मीडिया 1% सोडियम पाइरूवेट, 2 मिमी glutamine, 1% एंटीबायोटिक पेन / Strep और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त (उच्च ग्लूकोज, 4500 मिलीग्राम / एल) में कोशिकाओं को विकसित. एक 10 सेमी प्लेट सामान्य रूप से 1:03 पर विभाजित किया जाना चाहिए और मीडिया हर दो दिन ताजा पूरक.
- Tryps साथ हल्का कोशिकाओं का इलाज01:01 के रूप में वर्णित DMEM मध्यम में 1x और resuspend में.
- एक hemocytometer कक्ष में कक्षों की गणना और एक अलग ट्यूब में 3 एक्स 10 6 कोशिकाओं को इकट्ठा.
- 5 मिनट के लिए 100 ग्राम पर एक स्विंग बाल्टी रोटर में अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और बाँझ फॉस्फेट बफर 2x के साथ सेल गोली धोने.
- Immunodepleted चूहों के बाएं वेंट्रिकल में इंजेक्शन के लिए 10 6/50 उल की एकाग्रता में पीबीएस 1x में Resuspend.
2. Presurgical स्थितियां
- प्रत्येक सर्जरी से पहले, एक तापमान नियंत्रित अलगाने में बाँझ भोजन छर्रों और पानी (1 टेबल 22 डिग्री सेल्सियस) के साथ immunodepleted चूहों (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) बनाए रखें.
- एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत immunodepleted चूहों की सर्जरी प्रदर्शन. 70% इथेनॉल के साथ काम करने के क्षेत्र को साफ और सर्जिकल उपकरणों (संदंश और कैंची) आटोक्लेव.
- सर्जरी के लिए और वसूली के लिए हीटिंग पैड पर मुड़ें. ताप पैड महत्वपूर्ण हैंके दौरान होने वाली शरीर के तापमान की कमी और बाद सर्जरी ब्लॉक करने के लिए.
- वसूली हीटिंग पैड पर एक स्वच्छ और autoclaved पिंजरे रखें.
- अलगाने से एक बाँझ autoclaved बैग में सर्जरी के कमरे में उनके मूल पिंजरों में चूहों को परिवहन.
- माउस वजन और शरीर के वजन के अनुसार सुई subcutaneously (सुप्रीम कोर्ट) medetomidine और माउस anesthetize को 0.9% बाँझ खारा समाधान में पतला ketamine हाइड्रोक्लोराइड युक्त एक समाधान है, साथ ही (मांसलता आराम करने medetomidine 1 मिलीग्राम / किग्रा, ketamine हाइड्रोक्लोराइड 75 मिलीग्राम / किग्रा).
- पूरी तरह से anesthetized जब (1-2 मिनट के भीतर उत्तेजना के बाद कोई पैर के अंगूठे चुटकी पलटा) पिंजरे से माउस निकालें
- सीने के बाईं ओर बालों को हटाने क्रीम और गले क्षेत्र पर लागू करें. समय (लगभग 2-5 मिनट) के एक उचित मात्रा में करने के बाद, एक पानी में गीला ऊतक के साथ ढीला बाल पोंछ.
- एक लापरवाह स्थिति में सर्जरी पैनल पर माउस रखें. सेसर्जन के दृष्टिकोण स्थिति खड़ी, पूंछ नीचे सिर के ऊपर है.
- पिछले अंग subcutaneously में बाँझ खारा समाधान (buprenorphine) में पतला 0.1-0.2 ग्राम / जी पर एनाल्जेसिक समाधान इंजेक्षन और एक कपास टिप applicator का उपयोग सड़न रोकनेवाला समाधान povidone आयोडीन के साथ मुंडा क्षेत्र को कवर किया.
- गले क्षेत्र पर माइक्रोस्कोप (2.5X उद्देश्य) ध्यान दें.
3. सर्जिकल स्थितियां
- कुंद कैंची थोड़ा मुद्रिका उपास्थि नीचे के बारे में 0.5-1 सेमी लंबाई की एक midline उदर त्वचा चीरा बनाने के साथ. लार ग्रंथियों कल्पना करने के लिए संयोजी ऊतक से त्वचा को अलग.
- एक साथ forcep और चुंबकीय छाती प्रत्याकर्षक साथ प्रत्येक हिस्सा बगल की ओर खींच कर उनके प्राकृतिक midline विभाजन पर लार ग्रंथियों भाजित और ट्रेकिआ बेनकाब.
- गला बेनकाब करने के पक्ष को धीरे जीभ खींच लें. ध्यान से श्वासनली में इंटुबैषेण ट्यूब स्लाइड. ट्यूब टिप प्रदर्शित एल के माध्यम से दिखाई दे रहा हैarynx और श्वासनली. ट्यूब में है, लेकिन स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं देता है, तो महत्वपूर्ण बात, यह घुटकी में है. यह निकालें और ट्यूब टिप की स्थिति बदल जाते हैं.
- वेंटिलेशन मशीन के लिए ट्यूब कनेक्ट करें. 200 μl और 150 स्ट्रोक / मिनट पर स्ट्रोक मात्रा निर्धारित करें. एक टेप के साथ सर्जरी पैनल पर वेंटिलेशन ट्यूबिंग सुरक्षित.
- बाईं छाती क्षेत्र पर 1.5 सेमी लंबे त्वचा चीरा के लिए - कुंद कैंची और संदंश के साथ, 1 सिर पर खड़ी पूंछ बनाने.
- चीरों बनाने के बिना संयोजी ऊतक / मांसपेशियों की परतों और बड़ी और छोटी कवच की मांसपेशियों से त्वचा थोड़ा ढीला.
- इस प्रकार के रूप में तीसरे और चौथे पसलियों के बीच thoracotomy कार्य करें:
- बन्द रखो और छोटे, गोल संदंश के साथ scratching से पसलियों के बीच मांसपेशियों परत छेदना.
- पसलियों के बीच मांसपेशियों परत छेदा जाता है एक बार, ज़्यादा से ज़्यादा छाती गुहा को खोलने के लिए छाती प्रत्याकर्षक जगह है. इसके overlying अलिन्द (आलिंद) के साथ बाएं वेंट्रिकल (एल.वी.) के ऊपरी और मध्यम भागों रहे हैंअब दिखाई.
- कोशिकाओं के साथ एक सटीक सिरिंज तैयार करें. सिरिंज प्रत्येक इंजेक्शन के लिए 10 उल की मात्रा की राशि देने के लिए सक्षम होना चाहिए. सिरिंज की नोक पर एक 30 जी सुई डाली.
- संपर्क में सुई का खुला टिप सहित केवल 1 मिमी, छोड़ सुई पर टेप (एक introcan-W 20 जी से) एक छोटे से प्लास्टिक प्रवेशनी साथ ठीक करें. इस पूरे बाएं निलय दीवार perforating और बाएं वेंट्रिकल गुहा में कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने से सुई को रोकने जाएगा.
- (प्रत्येक इंजेक्शन इंजेक्शन 106 कोशिकाओं के लिए कुल 10 उल वितरित करेंगे) एक 5X उद्देश्य की मदद से, इस बढ़ाई बाएं वेंट्रिकल में कल्पना और 5 अलग अलग स्थानों में बाएं निलय दीवार में कोशिकाओं इंजेक्षन. इंजेक्शन सफल होता है, एक सफेद क्षेत्र और कोशिकाओं के प्रमुख लहर की अनुपस्थिति (इंजेक्शन सफल नहीं था, तो जानवर कार्यात्मक विश्लेषण से बाहर रखा जाएगा) दिखाई जाएगी.
- प्रतिकर्षक निकालें. वक्ष दीवार ख बंद करेंY 6-0 रेशम सीवन के दो टांके के साथ दो अलग पसलियों enclosing.
- कवच की मांसपेशियों और पीबीएस 1x में भीग एक कपास टिप के साथ त्वचा को नमी और धीरे वापस संदंश के साथ मूल स्थिति में मांसपेशियों डाल दिया.
- 6-0 रेशम सीवन के 3-4 टांके के साथ त्वचा को बंद करें. त्वचा को बंद करने के लिए 2-3 टांके के साथ गले चीरा सीवन.
- संवेदनाहारी प्रभाव वापस लौटने के लिए atipamezole (1 मिलीग्राम / किग्रा अंतिम एकाग्रता) इंजेक्षन.
- माउस स्वायत्त साँस लेने शुरू होता है जैसे ही, श्वासनली से ट्यूब बाहर ले और अपने सही पक्ष पर माउस रख दिया. माउस मिनट के भीतर ठीक हो जाने की उम्मीद है.
- माउस की बारी है और चलना, एक घंटे के लिए गर्म वसूली पिंजरे (बंद फ़िल्टर्ड शीर्ष के साथ छोटे IVC पिंजरे) में जगह के लिए शुरू होता है.
- एक नियंत्रित गरम बॉक्स (37 डिग्री सेल्सियस) में रात भर पशुओं छोड़ दें.
- सर्जरी के बाद पहले 2 दिनों के दौरान वसूली का समर्थन करने के लिए पानी और गोली खाने के साथ एक पकवान भरें.
इस प्रकार के रूप कोशिकाओं और 10 नियंत्रण इंजेक्शन नहीं दिल के साथ इंजेक्शन दस दिलों histologically विश्लेषण कर रहे हैं:
- 1 सप्ताह इंजेक्शन (आंकड़े 1 और 3) के बाद grafted कोशिकाओं का विश्लेषण करते हैं.
- Isoflurane की अधिक मात्रा से इच्छामृत्यु के बाद, ऊतक को ठीक करने के लिए 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 20 मिलीलीटर के साथ दिल छिड़कना. (70-100% से) इथेनॉल के प्रतिशत में वृद्धि और तेल ब्लॉकों में एम्बेड में तय ऊतक निर्जलीकरण.
- धारा रूपात्मक विश्लेषण के लिए hematoxylin और eosin के साथ 5 माइक्रोन और दाग पर एक सूक्ष्म साथ आयल में दिल.
- मैसन का Trichrome दाग का उपयोग करके संयोजी ऊतक कल्पना.
- एक स्लाइड स्कैनर माइक्रोस्कोप (आंकड़े 1 ए, 2A, 3 ए, 3 बी, और 3 सी) के तहत छवियों का विश्लेषण और एक डिजिटल स्लाइड स्कैनर माइक्रोस्कोप (figu का उपयोग कम अक्ष दृश्य में पूरे दिल कल्पनारेस -1 बी और 1 सी).
- ऊपर विश्लेषण, xylene में हृदय के ऊतकों deparaffinize बाद, इथेनॉल का प्रतिशत कम करने में नमूनों submerging (100% से पानी के लिए) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के लिए प्रक्रिया के रूप में निम्न द्वारा rehydrate:
- 1 घंटे के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर में 1% tannic एसिड के साथ deparaffinized ब्लॉक सेते हैं.
- (25-100% से) इथेनॉल का प्रतिशत बढ़ाने में नमूनों निर्जलीकरण.
- HMDS (hexamethyldisilazane) के साथ सूखी नमूने.
- Acheson रजत डेग और सोने पैलेडियम के साथ कोट उनके साथ स्टब्स पर नमूनों माउंट.
- एक विश्लेषणात्मक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 बी) में नमूने देखें.
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Representative Results
हम लम्बी cardiomyocytes (चित्रा 1 ए) की तुलना में एक पत्थर के आकार के साथ (चित्रा 1) अपने अलग आकारिकी द्वारा हृदय कोशिकाओं से अलग पहचाना जाता है जो HEK293 कोशिकाओं,, इंजेक्शन. HEK293 कोशिकाओं, क्योंकि वे अधिक परमाणु सामग्री (चित्रा 1 ए) की संभावना cardiomyocytes (गुलाबी रंग), की तुलना में hematoxylin डाई (नीला रंग) को अधिक प्रतिक्रियाशील रहे थे. आगे मेजबान ऊतक से इंजेक्शन कोशिकाओं को अलग करने के लिए, HEK293 कोशिकाओं इंजेक्शन के लिए पहले DAPI 2 घंटे के साथ लेबल रहे थे. चित्रा 1E में दिखाया गया के रूप में चिह्नित कोशिकाओं दौरे के ऊतकों में दिखाई दे रहे थे. नियंत्रण दिखावा संचालित चूहों पूरे दिल (चित्रा 1C) और ऊतक (चित्रा -1) की अखंडता में कोई नुकसान दिखाया.
दिल की एक पूरी कम अक्ष दृश्य में, इंजेक्शन कोशिकाओं इंजेक्शन के क्षेत्र (चित्रा 1 बी) में एक सजातीय समूह के रूप में दिखाई दे रहे थे. समूहीकृत गएल्स trichrome धुंधला (2A चित्रा) में एक नीले क्षेत्र के रूप में दिखाई दिया जो fibrotic ऊतक की एक पतली परत, से घिरे हुए थे. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 बी), के कारण उनके noncontractile समारोह और विभिन्न सेलुलर संरचना की संभावना के रूप में दिखाया कोशिकाओं, मेजबान दौरे ऊतक के साथ नहीं जुड़े थे.
ऊपर टिप्पणियों के अलावा, हम सुई (चित्रा 3) इंजेक्ट किया गया था जहां नुकसान के छोटे क्षेत्रों का उल्लेख किया. इन क्षेत्रों में दौरे दीवार में दिल की बाहरी epicardial परत (चित्रा 3) से चलाते हैं. इंजेक्शन कोशिकाओं (हरा तीर, चित्रा 3 बी) घायल क्षेत्र (काला तीर, चित्रा 3 बी) की निकटता में मौजूद हैं. DAPI पॉजिटिव कोशिकाओं इंजेक्शन के स्थल (चित्रा -3 सी, सफेद तीर) के साथ दिखाई दे रहे थे. एक सप्ताह की चोट के बाद, TUNEL परख कि परिगलन, सुझाव चोट के स्थल पर वृद्धि हुई apoptotic कोशिकाओं नहीं दिखा थाबल्कि apoptosis से सुई इंजेक्शन (चित्रा 3 डी) के बाद हुई है.
चित्रा 1. इंजेक्शन कोशिकाओं के histological विश्लेषण. सेल इंजेक्शन दिलों आयल में एम्बेडेड और hematoxylin और eosin धुंधला के लिए प्रोसेस किया गया एक) एक सप्ताह के बाद. इंजेक्शन HEK293 कोशिकाओं बाएं वेंट्रिकल की दीवार में मौजूद थे. छवियाँ) एक स्टीरियो प्रतिदीप्ति खुर्दबीन. बी के साथ प्राप्त किया गया Trichrome दाग ऊतकों वे (तीर) इंजेक्ट किया गया जहां कोशिकाओं को एक ही क्षेत्र में वर्गीकृत किया गया है कि पता चला है. सही नीचे पैनल कम अक्ष अधिकार (आर वी) और बाएं निलय (एल.वी.) के साथ दिखाते हैं. लाल आयत कोशिकाओं (1.5X) को रखा जाता है, जहां क्षेत्र से पता चलता है. छवियों को एक स्लाइड स्कैनिंग खुर्दबीन के साथ दर्ज किए गए. सी) Trichrome सेंटनियंत्रण दिखावा संचालित दिलों की aining. एक 5X उद्देश्य. डी) दौरे ऊतक अखंडता. ई दिखा दिखावा संचालित चूहों की Trichrome धुंधला) के साथ पूरे दिल देखने HEK293 कोशिकाओं इंजेक्शन के लिए पहले DAPI 2 घंटे के साथ दाग रहे थे. इंजेक्शन दिलों 6 माइक्रोन पर अक्टूबर में एम्बेडेड और एक cryostat में sectioned थे एक सप्ताह के बाद. कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप में यूवी के तहत कल्पना कर रहे थे. वाम और सही निलय दिखाए जाते हैं. सही वेंट्रिकल में, सही पैनल, सफेद लाइन epicardial परत के निशान. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. इंजेक्शन कोशिकाओं और मेजबान ऊतक के बीच एक तांतव परत के गठन. ए) Trichrome धुंधला शोHEK293 कोशिकाओं और murine दौरे ऊतक (तीर) के बीच का गठन श्लेषजनउत्पादी ऊतक. छवियों को एक डिजिटल स्कैनिंग खुर्दबीन के साथ दर्ज किए गए. बी) दिल स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए deparaffinized और प्रोसेस किया गया. छवियाँ एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ दर्ज की गई और इंजेक्शन HEK293 कोशिकाओं (बाईं ओर) और मेजबान मायोकार्डियम (दाएं) के बीच कोलेजन फाइबर (तीर) दिखा रहे थे. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. सेल इंजेक्शन नुकसान के छोटे क्षेत्रों का उत्पादन किया. ए) Trichrome धुंधला सुई (नीले रंग इंजेक्ट किया गया था जहां नुकसान के छोटे क्षेत्रों से पता चलता है;.) तीर बी) आयल वर्गों Trichrome स्टेशन से दाग रहे थेining और कोशिकाओं को इंजेक्शन गया जहां क्षेत्र काला तीर द्वारा संकेत दिया है. इंजेक्शन कोशिकाओं (हरी तीर) DAPI 2 घंटे पहले इंजेक्शन के साथ दाग HEK293 कोशिकाओं,, इंजेक्शन साइट (सफेद तीर) के साथ मौजूद थे) घायल क्षेत्र. सी से निकटता में दिखाई दे रहे थे. इंजेक्शन की साइट पर एक हरे तीर के साथ संकेत और सफेद खुले रेखा आयल वर्गों पर प्रदर्शन, पेरिकार्डियल परत. डी) TUNEL परख के निशान, प्रासंगिक फ्लोरोसेंट सकारात्मक नाभिक नहीं दिखा था है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
इस पांडुलिपि में, हम murine दिलों में कोशिकाओं की intramyocardial इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए कैसे पता चला है. इस पद्धति का एक सबूत के रूप में, हम HEK293 कोशिकाओं का इस्तेमाल किया है. यह HEK293 कोशिकाओं किसी भी सेल थेरेपी अध्ययन में इस्तेमाल नहीं है और इसलिए इस पांडुलिपि के निष्कर्षों को एक चिकित्सकीय दृष्टिकोण को सीधे अनुवाद के लिए उपयुक्त नहीं हैं कि जोर देना जरूरी है. हालांकि, HEK293 कोशिकाओं सिकुड़ा कोशिकाओं नहीं कर रहे हैं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं में transdifferentiate नहीं तथ्य यह है कि इस तरह से वितरित किया जा कोशिकाओं के गुणों और वितरण के मार्ग के रूप में तकनीकी पहलुओं पर ध्यान केंद्रित है.
यह intracoronary मार्ग चोट के स्थल पर अधिक सजातीय वितरण प्रदान कर सकता है, जबकि एक intramyocardial मार्ग, हृदय ऊतक 24,26 में एम्बेडेड सेल समूहों पैदा करता है कि दी गई है. Cardiomyocyte प्रतिस्थापन के लिए, आदर्श दाता सेल electrophysiological, संरचनात्मक और सिकुड़ा properti प्रदर्शन करना चाहिएcardiomyocytes की तों और प्रत्यारोपण से पहले नियोजित किया जा करने के लिए एक सेल भेदभाव कार्यक्रम के लिए आवश्यकता है, सुझाव मेजबान ऊतक में संरचनात्मक और कार्यात्मक एकीकृत करने में सक्षम होना चाहिए.
इस प्रकार के रूप में एक सफल सर्जरी के लिए मुख्य बिंदुओं संक्षेप किया जा सकता है:
- दिल की दर को धीमा और सेल इंजेक्शन की सुविधा के लिए इंजेक्शन यौगिकों के साथ चूहों anesthetize
- फेफड़ों की कार्यक्षमता के पक्ष में चूहों की intratracheal केन्युलेशन प्रदर्शन करना.
- एक सही साँस लेने के लिए कवच की मांसपेशियों की कार्यक्षमता को बनाए रखने की मांसपेशी चीरा परहेज thoracotomy प्रदर्शन करना.
- दिल को प्रकाश में लाने के बाद, इंजेक्शन (एक पीला रंग रूप में दिखाई) हो गई है कि क्या कल्पना करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे बाएं वेंट्रिकल निरीक्षण करते हैं.
- दौरे के ऊतकों की व्यापक वेध से बचने के लिए एक पतली सुई और एक सटीक सिरिंज का प्रयोग करें और क्रमशः सामग्री के वांछित राशि इंजेक्षन.
- ओ उजागर एक प्लास्टिक टयूबिंग प्रणाली के साथ सुई बंद करनाटिप हिस्सा nly. इस निलय गुहा में इंजेक्शन से बचने, बाएं वेंट्रिकल (0.5 मिमी) में एक विशिष्ट गहराई को सुई की शुरूआत की अनुमति होगी.
- बाहरी दबाव को फेफड़ों के जोखिम से बचने के लिए सावधानी से पसलियों के बीच सीने और अंतरिक्ष को बंद करें.
इस तकनीक को पोस्ट ऑपरेटिव स्वास्थ्य की स्थिति प्राथमिकता के आधार पर कर रहे हैं, तो सफलता की एक उच्च स्तरीय है. पशु अधिकता संकट और दर्द के लक्षण के लिए एक सप्ताह के लिए हर दिन निगरानी की जानी चाहिए. बाद operatively आवश्यकता के रूप में दर्द को नियंत्रित करने के लिए एनाल्जेसिक यौगिकों इंजेक्शन प्रशासित किया जाना चाहिए. ऐसे lidocaine के रूप में दर्द से राहत, सामयिक आवेदन, भी इस्तेमाल किया जा सकता है. खून बह रहा सावधान सर्जरी तकनीक से रोका जाना चाहिए. होने वाली है, हालांकि, यह जहाजों के संपीड़न या बंधाव से रोका जा सकता है. हम जानवरों की सर्जरी के बाद 12-20 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग बॉक्स में छोड़ दिया, तो बेहतर और तेजी से ठीक हो कि उल्लेख किया है. इस इलाज के तेजी से शरीर के तापमान में कमी ब्लॉक, और न ही होगामैली संज्ञाहरण की शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया और प्रशासन के बाद होने वाली. Postsurgical संक्रमण होने पर हो सकती है, लेकिन 1% से कम होना चाहिए. सड़न रोकनेवाला प्रक्रियाओं का कड़ाई से संक्रमण को रोकने के लिए पीछा किया जाना चाहिए. स्थानीय संक्रमण एंटीबायोटिक दवाओं के आवेदन के साथ इलाज किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात है, निर्जलीकरण खारा के चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा नियंत्रित किया जाना चाहिए.
यह ऐसी isoflurane के रूप में, साँस संवेदनाहारी से अधिक इंजेक्शन प्रशासन के लिए बेहतर है. दरअसल, हम इंजेक्शन संवेदनाहारी जानवर असुविधा के कारण के बिना आसान इंजेक्शन और कम से खून बह रहा है, की अनुमति दिल की धड़कन की कमी हुई है कि मनाया.
आक्रामक हालांकि, चूहों में कोशिकाओं (25-50 μl) की छोटी मात्रा के इंजेक्शन संभव है और सुरक्षित है. हम बाएं निलय की दीवार (10 μl / इंजेक्शन) के 5 विभिन्न क्षेत्रों में HEK293 कोशिकाओं के 50 μl इंजेक्शन द्वारा 1% से कम मृत्यु दर था. इस पद्धति में महत्वपूर्ण है जो दौरे दीवार, के कई क्षेत्रों में कोशिकाओं की उपस्थिति सुनिश्चित कीइस्कीमिक क्षति की विस्तारित क्षेत्रों वितरित कोशिकाओं द्वारा पहुँचा जा करने की आवश्यकता है जब स्टेम सेल थेरेपी. विभिन्न प्रयोगशालाओं में उनके reproducibility सत्यापित किया जाना अभी बाकी है हालांकि कम आक्रामक सर्जरी को करने के कई प्रोटोकॉल हाल ही में प्रकाशित किया गया है. उदाहरण के लिए, सेल इंजेक्शन उच्च संकल्प इकोकार्डियोग्राफी 27 का उपयोग करते हुए पास के सीने तकनीक के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है. इस प्रणाली के उपयोग के एक दो आयाम छवि में स्पष्ट रूप से बाएं वेंट्रिकल की दीवार कल्पना करने के लिए और सामान्य सिस्टोलिक / डायस्टोलिक चक्र के दौरान एक विशिष्ट स्थान में सुई बनाए रखने के लिए उच्च ऑपरेटर कौशल की आवश्यकता है. इस तकनीक का लाभ दौरे रोधगलितांश प्रेरण के बाद एक नैदानिक प्रासंगिक समय सीमा में वांछित स्थानों के लिए माउस मायोकार्डियम में कोशिकाओं का प्रत्यारोपण है. हालांकि, इस दृष्टिकोण क्योंकि एक दूसरे ऑपरेशन के 2 दौर से गुजर जानवरों की वृद्धि की मृत्यु के दौरे रोधगलितांश प्रेरण या transaortic बैंडिंग के रूप में शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के साथ संभव नहीं है7. दिलचस्प है, Hamdi और उनके सहयोगियों ने एक Gelfoam epicardial क्षेत्र 28 पर निर्माण में कोशिकाओं का वितरण बनाम प्रत्यक्ष intramyocardial इंजेक्शन की तुलना में. वे intramyocardial सेल इंजेक्शन की तुलना में सेल epicardium पर निर्माण overlaying बेहतर भ्रष्टाचार कार्यक्षमता के परिणामस्वरूप मनाया और इस तकनीक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है कि सूचना दी, उपयोगकर्ता के अनुकूल है, और जानवरों के 28 के लिए कम दर्दनाक.
सेल इंजेक्शन प्रयोगों की एक महत्वपूर्ण विशेषता कोशिकाओं की ट्रेसिंग और उनके जीवित रहने की है. हम HEK293 कोशिकाओं हृदय कोशिकाओं की तुलना में होने के कारण उनके अलग पहचाना आकारिकी को पता लगाने के लिए आसान कर रहे हैं कि पता चला है. इन कोशिकाओं को इंजेक्शन (नहीं दिखाया डेटा) बच गया और सर्जरी के बाद एक सप्ताह के ऊतकों में बनाए रखा गया. लंबे समय तक अध्ययन के लिए कोशिकाओं का पता लगाने और वितरण के ऊतकों में और साथ ही अन्य ऊतकों में उनके engraftment का विश्लेषण करने के लिए, कई तकनीकों फ्लोरोसेंट लेबलिंग और मछली एक सहित, उपयोग में हैंसेक्स बेमेल प्रत्यारोपण के प्रयोगों 29 में nalysis. इन विट्रो भविष्य के अध्ययनों में विश्लेषण करती है ओर महत्वपूर्ण बात है, vivo इमेजिंग में एक प्रमुख भूमिका निभानी होगी. दरअसल, ऊतकीय तरीकों पर vivo इमेजिंग में से एक फायदा इच्छामृत्यु 29 की आवश्यकता के बिना ही पशुओं में अनुदैर्ध्य अध्ययन में कोशिकाओं की ट्रैकिंग है. इस पद्धति में, कोशिकाओं हटाया टोमोग्राफी (पीईटी) और चुंबकीय अनुनाद (एमआरआई) के साथ imaged किया जा bioluminescence अभिकर्मकों, लोहे के कणों, और विशिष्ट रिपोर्टर जीन के साथ चिह्नित किया जा सकता है.
हमारे विश्लेषण से पता चला है कि इस तरह की रियायत के तौर पर वे एक पतली श्लेषजनउत्पादी ऊतक से घिरा इंजेक्शन थे जहां क्षेत्र में वर्गीकृत किया HEK293 कोशिकाओं के रूप में noncontractile कोशिकाओं. एक immunodepleted माउस में fibrotic ऊतक के गठन के लिए प्रमुख pathophysiological तंत्र अज्ञात हालांकि, प्रतिरोपित कोशिकाओं के चारों ओर दिखाई श्लेषजनउत्पादी ऊतक एक का समापन बिंदु के बराबर हो सकता हैऊतक संगत प्रत्यारोपण. इस मामले में, एक्सोजेनस सामग्री भड़काऊ कोशिकाओं से हटाया नहीं जा सकता है और आसपास के ऊतकों से अलग कर जो तांतव संयोजी ऊतक, के एक घने परत में समझाया जाता है. इसी घाव भरने के अंत में मंच के चरणों में, इस दानेदार ऊतक अत्यधिक vascularized है और प्रत्यारोपित सामग्री के अस्तित्व को सुनिश्चित करता है.
Intramyocardial सुई इंजेक्शन आसपास के ऊतकों को नुकसान के एक छोटे से क्षेत्र का उत्पादन किया है, हालांकि तकनीकी तौर पर यहाँ वर्णित विधि, सफल रहा था. हृदय समारोह माप इस समीक्षा का उद्देश्य नहीं थे हालांकि, भविष्य के अध्ययनों नाबालिग ऊतकों को नुकसान सेल थेरेपी विश्लेषण उपद्रव कर सकते हैं कि क्या जांच करनी चाहिए. इसके अलावा, यह इंजेक्शन क्षेत्र में उत्पादित चोट इंजेक्शन कोशिकाओं की राशि से या दोनों के संयोजन से, सुई की वजह से हो रहा है या विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण होगा.
हमारे निष्कर्ष के समर्थन में, यह है कि transplantatio दिखाया गया हैimmunocompromised चूहों की स्वस्थ दिल (इशारा-SCID) में 20-25% cardiomyocytes (hESC सेमी) युक्त विभेदित मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) की मिश्रित आबादी के एन cardiomyocytes संगठित और परिपक्व हो गया, जिसमें grafts के तेजी से निर्माण के परिणामस्वरूप समय और noncardiomyocyte जनसंख्या से अधिक 23 खो गया था. दिलचस्प है, लेखकों hESC मुख्यमंत्री काफी हद तक एक electrophysiological संकोश 22,23 के गठन को रोका जो fibrotic ऊतक की एक परत से मेजबान मायोकार्डियम से अलग थे. एक अलग अध्ययन में, Kehat एट अल. HESC मुख्यमंत्री सफलतापूर्वक पूरा दिल ब्लॉक के साथ सूअर में निलय पुस्तक में पाया गया कि. इस अध्ययन प्रतिरोपित कोशिकाओं, बच कार्य किया, और मेजबान कोशिकाओं के साथ एकीकृत, इलेक्ट्रॉनिक पेसमेकर 30 के लिए एक जैविक विकल्प के रूप में कार्य करने की क्षमता के लिए साक्ष्य उपलब्ध कराने दिखाया. इन दोनों बेताल परिणामों हो की संरचना और समारोह में अंतर से मेल मिलाप किया जा सकता हैअनुसूचित जनजाति और दाता प्रजातियों. दरअसल, यह प्रत्यारोपित cardiomyocytes के युग्मन की दक्षता मेजबान और दाता कोशिकाओं के सापेक्ष पिटाई आवृत्ति पर निर्भर हो सकता है कि संभव है. वान LAAKE के अध्ययन में 23, कार्यात्मक जंक्शनों के गठन के कारण मानव cardiomyocytes के विभिन्न पिटाई आवृत्ति कृंतक cardiomyocytes बनाम (60-100 BPM) (300-600 bpm) को प्रभावित किया जा सकता है. Kehat विश्लेषण 30 में वर्णित के रूप में यह, सुअर का प्रत्यारोपण प्रयोगों बनाम मानव में मामला नहीं होगा.
अवलोकन समय की लंबाई एक और confounding कारक है. रोधगलन केवल अल्पकालिक समय अंक (4 सप्ताह) के लिए हृदय समारोह सुधार प्रेरित बाद hESC मुख्यमंत्री कृंतक दिल में प्रत्यारोपित. हालांकि, 12 सप्ताह में, हृदय समारोह आगे भ्रष्टाचार के अस्तित्व 23 के बावजूद निरंतर नहीं किया गया था. लेखकों भ्रष्टाचार आकार (कोशिकाओं की वृद्धि हुई राशि) में सुधार के लिए लंबे समय तक हृदय surv के साथ नहीं जुड़े थे कि मनायालंबे समय तक कम या मध्यावधि विश्लेषण बनाम विश्लेषण करती है यह दर्शाता है कि ival और कार्यात्मक सुधार 31, इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं की बढ़ी संख्या की आवश्यकता के बिना भविष्य के अध्ययन में किया जाना चाहिए.
अध्ययन में मौजूद है, कई सवाल प्रत्यारोपित किया जा कोशिकाओं के प्रकार, परीक्षण किया जाना मेजबान दाता प्रजातियों का चयन और कोशिकाओं की अतालता क्षमता का एक विस्तृत मूल्यांकन के विषय बने हुए हैं. आदर्श रूप में, प्रतिस्थापन या पेसमेकर समारोह के लिए मायोकार्डियम में प्रत्यारोपित स्टेम सेल चाहिए शेष myocytes साथ कार्यात्मक जोड़े. रोधगलन के एक चूहे मॉडल में, फर्नांडीस एट अल. 32 नियंत्रण के साथ तुलना myoblast इंजेक्शन दिलों में वेंट्रिकुलर अतालता का एक बढ़ा inducibility दिखा, अतालता संवेदनशीलता का मूल्यांकन करने के लिए प्रोग्राम विद्युत उत्तेजना (पी इ एस) का इस्तेमाल किया. कि इसी अध्ययन में, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न ऑटोलॉगस कोशिकाओं के इंजेक्शन एक बढ़ा inducibil में परिणाम नहीं थावेंट्रिकुलर अतालता के अल्पसंख्यक जिससे myoblasts एक विशिष्ट arrhythmogenic जोखिम का प्रदर्शन समाप्त करने के लिए लेखकों प्रमुख, नियंत्रण के साथ तुलना. कुशलतापूर्वक रोधगलितांश निशान या सीमा क्षेत्र के भीतर समूहों में grafted, लेकिन पता चला है एक अलग अध्ययन, अस्थि मज्जा व्युत्पन्न कोशिकाओं (बीएमसी) में कोई इलेक्ट्रॉनिक रूप सीए 33 यात्रियों पैदा की. दिलचस्प है, वी एट अल. Mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) infarcted दिलों में जीवित रहने की अवधि के दौरान परिपक्व cardiomyocytes की electrophysiological गुण हासिल नहीं है कि पता चला है. हालांकि, वे बिजली भेद्यता को कम कर सकते हैं और वेंट्रिकुलर अतालता 34 का प्रचार नहीं करते.
स्टेम सेल थेरेपी की प्रभावकारिता और अतालता घटना की कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह से वितरण मार्गों पर निर्भर करता है. हृदय समारोह में सुधार वास्तव में, हालांकि चूहे दिलों में एमआई 35 के बाद, intramyocardial बीएमसी इंजेक्शन,, लगातार निलय समयपूर्व संकुचन और निलय tachycard वृद्धि हुईप्रारंभिक 14 दिनों के लिए आइए. Intracoronary मार्ग का इस्तेमाल किया गया था, वेंट्रिकुलर अतालता घटना स्पष्ट रूप से कमी आई थी. नैदानिक अध्ययन में, इंजेक्शन कोशिकाओं के समर्थक अतालता समारोह इस्कीमिक हृदय रोग के लिए संकेत के रूप में रोगियों के सबसे बीटा ब्लॉकर एजेंटों प्राप्त के रूप में आकलन करना मुश्किल है. बीटा ब्लॉकर्स के साथ उपचार प्रतिरोपित कोशिकाओं का एक संभावित समर्थक अतालता प्रभाव मुखौटा हो सकता है. जानवरों के अध्ययन इसलिए स्टेम सेल थेरेपी में समर्थक अतालता उत्तेजनाओं के ठिकानों का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण हैं.
संक्षेप में, हमारे डेटा चूहों में intramyocardial सेल इंजेक्शन की व्यवहार्यता को दर्शाता है लेकिन यह भी सेल ग्राफ्टिंग की सुरक्षा की स्थिति के बारे में एक विस्तृत विश्लेषण के लिए की जरूरत पर जोर दिया. मनुष्यों में, यह सेल इंजेक्शन समर्थक arrhythmias 36-38 के साथ जुड़े पता चला है कि 39 restenosis, atherosclerosis 40, और कोरोनरी बाधा 41 त्वरित किया गया है. बुनियादी अनुसंधान भविष्य के नैदानिक अनुप्रयोग में महत्वपूर्ण होगाकोशिकाओं को जन्म दिया जाना चाहिए जो समझने के लिए lications, प्रसव के मोड, सेल की मध्यस्थता दौरे समारोह की मरम्मत के तंत्र, और सभी मानव आबादी को लाभ है कि ऑटोलॉगस कोशिका प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल बनाम एक allogeneic के डिजाइन. क्योंकि बड़े नैदानिक परीक्षण के साथ जुड़े उच्च लागत की, दक्षता और प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता के reproducibility ऐसे में यहाँ वर्णित उन लोगों के रूप preclinical मॉडल में संबोधित किया जाना चाहिए.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम माइक्रोस्कोपी विश्लेषण और हृदय की मरम्मत, तकनीशियनों और हमारे जानवरों की सुविधा के प्रबंधक से संबंधित परियोजनाओं के समर्थन के लिए Magdi याकूब संस्थान (MYI) धन्यवाद. इस काम ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन (BHF), परियोजना अनुदान PG/10/019 द्वारा समर्थित किया गया है. एमपीएस MYI और BHF द्वारा समर्थित है. टी.पी. एक BHF-अनुसंधान उत्कृष्टता फैलो हैं. एनआर एक राष्ट्रीय राजमार्ग और एमआरसी ऑस्ट्रेलिया फैलो हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolator | Pfi systems | Quotation needed | |
| Heating Pad | Vet Tech Solutions | HE006 | For small animals |
| Medetomidine | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Ketamine hydrochloride | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Atipamezole | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Hair removal cream | commercial shops | ||
| Buprenorphine | NVS | Veterinary prescription is necessary | |
| Leica MZFLIII microscope | Leica | Model S6E | With swing arm stand TS0 |
| Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner | Hamamatsu | RS series | |
| Scanning Electron Microscope | Jeol | JSM-6610 | |
| Blunt scissors | FST | 14084-09 | |
| Minivent | Harvard Apparatus | 73-0043 | Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844) |
| Forceps | FST | 11052-10 | |
| Retraction system | FST | 18200-20 | Kit for animals up to 200 g |
| 30 G 12 mm; ½ inch | BBraun | A210 | Fine yellow |
| Microliter syringe | ESSLAB | 81201 | Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700 |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | W1614T |
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