Summary
Intramyokardialer Zellabgabe in murinen Modellen von kardiovaskulären Erkrankungen, wie Hypertonie oder Myokardinfarkt, wird häufig verwendet, um das therapeutische Potential von verschiedenen Zelltypen in der Regenerationsstudien getestet. Daher wird eine ausführliche Beschreibung und eine klare Visualisierung dieses chirurgische Verfahren helfen, die Grenzen und Vorteile der Herz-Kreislauf-Zelle therapeutische Analysen in kleinen Nagern zu definieren.
Abstract
Frühere Studien haben gezeigt, dass Zellabgabe fördert Verbesserung der Herzfunktion durch Freisetzung von Zytokinen und Faktoren, die Herzgewebe Revaskularisation und das Überleben der Zelle zu erhöhen. Darüber hinaus sind weitere Beobachtungen zeigten, dass bestimmte Stammzellen, wie Herzstammzellen, mesenchymale Stammzellen und cardiospheres haben die Fähigkeit, innerhalb der umgebenden Myokard durch Differenzierung in Kardiomyozyten, glatte Muskelzellen und Endothelzellen zu integrieren.
Hier präsentieren wir die Materialien und Methoden, um zuverlässig zu liefern noncontractile Zellen in der linken Herzkammerwand der immunodepleted Mäusen. Die wesentlichen Schritte dieser mikrochirurgischen Verfahren beinhalten Anästhesie und Analgesie Injektion, intratracheale Intubation, Schnitt, um die Truhe zu öffnen und setzen das Herz und die Lieferung von Zellen durch eine sterile 30-Gauge-Nadel und einer Präzisionsmikroliter-Spritze.
Gewebeverarbeitung, bestehend aus Herz Ernte, embedding, Schneiden und histologische Färbung zeigte, dass intramyokardialer Zellinjektion erzeugt eine kleine Beschädigung in der epikardialen Fläche, als auch in der Herzkammerwand. Noncontractile Zellen in die Wand des Myokards immunsupprimierten Mäusen erhalten und wurden durch eine Schicht aus faserigem Gewebe, wahrscheinlich von Herz Druck und mechanischer Belastung zu schützen, umgeben ist.
Introduction
Verschiedene Zellabgabe-Protokolle in murinen und Rattenmodellen von kardiovaskulären Erkrankungen, die mit dem Ziel der Umsetzung der Effizienz, Wirksamkeit und Sicherheit dieser experimentellen Verfahren in menschlichen Patienten getestet. In kleinen Nager Herzen, ist intramyokardialen Zellabgabe die praktikabelste Methode der Zellabgabe 1,2, während in der Rattenherzantegrade und retrograde 3 4 intrakoronare Infusion Zelle kann ebenfalls verwendet werden. Beide Methoden haben Grenzen und Vorteile. Zell Lieferung über die intrakoronare Route hat theoretischen Vorteile gegenüber der direkten intramuskuläre Injektion in die Förderung der weltweiten Verbreitung Zelle 3, aber es hat auch die Gefahr, dass Herzkranzembolie 3,5. Einschränkungen bei der Lieferung intramyokardialen sind mit mechanischen Verletzungen, akute Entzündungen und Herzmuskelschäden 6,7 verbunden. Beim Menschen werden die Zellen für die Reparatur von Herz intramyokardiale Injektion durch eine endokardiale oder epikardiale chirurgischen zugenähern oder durch intrakoronare arteriellen Linie 8. Injection von transvaskuläre Routen ist bei Patienten mit akutem Infarkt und Herzmuskel reperfundierten geeignet, kann aber nicht möglich sein, im Falle von Totalverschlüssen oder schlechte Fluss innerhalb der Gefäße des Gebietes erfolgen 9. Direkte Injektion in die Herzkammerwand durch transendokardialen oder transepikardialen Injektion technisch möglich je nach Patient Gesundheitszustand. Tatsächlich hat es sich gezeigt, dass diese Technik sicher 10,11, obwohl für transepikardialen Injektion eine offene Brustchirurgie notwendig ist und für ein elektro transendokardialen nähert Zuordnung für jeden Patienten erforderlich ist, um lebensfähige Stellen von ischämischen oder vernarbten Herzmuskel 9 unterscheiden.
Wichtig ist, dass in der Zelltherapie-Studien die Auswahl der besten Zelle zu trans wird noch untersucht. Kurzzeitanalysen (4 Wochen) zeigten, dass die Injektion von Herzstammzellen definiert als cardiospheres
In Maus-und Rattenmodellen zeigten Langzeitstudien, dass Zellinjektion nicht weiter Herzfunktion (12 Monate) zu verbessern. Tatsächlich Transplantate von menschlichen embryonalen Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten (hES-CM) wurden weitgehend von der Host-Myokard durch eine Schicht von fibrotischen Gewebes 22,23 isoliert. Ähnliche Ergebnisse wurden nach der Transplantation von intramyokardialen Skelettmyoblasten in das Herz des infarzierten Mäusen 24 beobachtet. Furthermore, die langfristige Möglichkeit der allogenen MSCs Funktion in der Infarkt Herzen bewahren durch Übergang von einer immun eine immunogene Zustand nach Differenzierung 25 begrenzt.
Unter Berücksichtigung der Herausforderungen und Perspektiven oben dargelegt, zeigen wir hier, wie man Zellen durch intramyokardialen Injektion in Mäusen zu liefern. Wir beobachten, dass Zellen ohne Herzmuskelkontraktionseigenschaften nicht mit dem Host-Myokard verbunden und bilden eine zusammenhängende Masse mit einer dünnen fibrotischen Barriere. Obwohl in einigen Fällen dieses Ergebnis kann vorteilhaft sein, kann die folgende Analyse nützlich sein, um zu verstehen, wie Zelltransplantations kann moduliert werden, um funktionsfähig verbunden myokardialen Strukturen sowie zu erzeugen.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit internationalen (Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments) und nationale (UK Home Office, Act 1986) Bestimmungen durchgeführt. Die hier beschriebenen Verfahren sind Teil unseres Arbeitsplan nach britischem Lizenz Behörden und wurden nicht zum Zwecke der Aufnahme durchgeführt.
1. Herstellung von Zellen
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer bestimmten Zelllinie (Human Embryonic Kidney, HEK293-Zellen) zu Demonstrationszwecken. Zell-spezifische Protokolle müssen für wachsende und schließlich differen pluripotente oder adulte Stammzellen in spezifische Zelllinien verwendet werden.
- Wachsen Zellen in DMEM-Medium (hohe Glucose, 4,500 mg / l) mit 1% Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin, 1% Antibiotikum Pen / Strep und 10% fötalem Rinderserum (FBS). Ein 10-cm-Platte sollte in der Regel 01.03 aufgeteilt und Medien ergänzt Frisch alle zwei Tage.
- Gönnen Zellen leicht mit trypsin 1x und resuspendieren in DMEM-Medium, wie in einem 1:1 beschrieben.
- Zählen von Zellen in einem Hämozytometer-Kammer und sammeln 3 x 10 6 Zellen in ein separates Röhrchen.
- Zentrifuge in einem Ausschwingrotor bei 100 g für 5 min.
- Überstand verwerfen und waschen das Zellpellet mit sterilem Phosphatpuffer 2x.
- Resuspendieren in PBS 1x in einer Konzentration von 10 6/50 &mgr; l zur Injektion in den linken Ventrikel des immunodepleted Mäusen.
2. Prächirurgische AGB
- Aufrechterhaltung immunodepleted Mäusen (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) mit sterilem Futterpellets und Wasser in einem temperaturgeregelten Isolator (22 ° C; Tabelle 1) vor jeder Operation.
- Führen Chirurgie immunodepleted Mäuse unter einer Steril. Reinigen Sie die Arbeitsfläche mit 70% Ethanol und Autoklavieren chirurgische Werkzeuge (Zange und Schere).
- Schalten Sie Heizkissen für die Chirurgie und für die Wiederherstellung. Heizkissen sind wichtigum die Abnahme der Körpertemperatur auftreten, während und nach der Operation zu blockieren.
- Einen sauberen und autoklaviertem Käfig auf die Rückgewinnung-Heizkissen.
- Transportieren Sie die Mäuse in ihrem ursprünglichen Käfige aus dem Isolator zu dem Operationssaal in einen sterilen Beutel autoklaviert.
- Wiegen Sie die Maus und nach dem Körpergewicht inject subkutan (sc) eine Lösung, Medetomidin und Ketamin-Hydrochlorid in 0,9% steriler Kochsalzlösung verdünnt, um die Maus zu betäuben enthält, sowie auf die Muskeln entspannen (Medetomidin 1 mg / kg Ketamin-Hydrochlorid 75 mg / kg).
- Entfernen Sie die Maus aus dem Käfig, wenn sie vollständig betäubt (innerhalb von 1-2 min, keine Zehen Prise Reflex nach Stimulation)
- Bewerben Enthaarungscreme auf der linken Seite der Brust und den Hals-Bereich. Nach einer angemessenen Zeit (ca. 2-5 min), wischt die losen Haare mit einem mit Wasser nass Gewebe.
- Platzieren Sie die Maus auf dem OP-Panel in Rückenlage. AusSicht des Chirurgen eine vertikale Position erreicht, Schwanz-Kopf nach unten.
- Spritzen Sie Analgetikum Lösung bei 0,1-0,2 g / g in steriler Kochsalzlösung (Buprenorphin) verdünnt in die hinteren Gliedmaßen subkutan und decken den rasierten Bereich mit der aseptischen Lösung Povidoniod mit einem Wattestäbchen.
- Fokus des Mikroskops (2,5 fach Objektiv) auf den Hals-Bereich.
3. Chirurgische AGB
- Mit stumpfen Schere einen ventralen Mittellinie Hautschnitt von etwa 0,5 bis 1 cm Länge, die etwas unterhalb des Ringknorpels. Trennen Sie die Haut von Bindegewebe um die Speicheldrüsen zu visualisieren.
- Teilen Sie die Speicheldrüsen auf ihren natürlichen Mittellinie Division durch gleichzeitiges Ziehen jedes Teil seitlich mit Pinzette und Magnet Brust Retraktor und setzen die Luftröhre.
- Ziehen Sie die Zunge sanft zur Seite, um den Kehlkopf aus. Schieben Sie die Intubationstubus vorsichtig in die Luftröhre. Die Rohrspitze ist durch die angezeigte l sichtbararynx und Luftröhre. Wichtiger ist, wenn das Rohr in, aber nicht deutlich sichtbar ist, ist es in der Speiseröhre. Entfernen Sie es und ändern Sie die Position der Rohrspitze.
- Schließen Sie den Schlauch an den Lüftungs Maschine. Stellen Sie das Schlagvolumen bei 200 ul und 150 Hub / min. Befestigen Sie die Lüftungsschlauch auf dem OP-Panel mit einer Band.
- Mit stumpfen Schere und Pinzette, machen Sie eine vertikale Schwanz zum Kopf 1 - bis 1,5 cm langen Hautschnitt über der linken Thoraxbereich.
- Lösen Sie die Haut vor den Bindegewebs-/ Muskelschichten und die großen und kleinen Brustmuskeln ohne Einschnitte.
- Führen Thorakotomie zwischen der dritten und vierten Rippen sich wie folgt:
- Perforieren die Zwischenrippenmuskelschicht durch Kneifen und Kratzen mit kleinen, abgerundeten Pinzette.
- Sobald die Zwischenrippenmuskelschicht ist perforiert, legen Sie die Brust Retraktor bis maximal öffnen Sie die Brusthöhle. Die oberen und mittleren Teile des linken Ventrikels (LV) mit darüberliegenden Vorhof (Atrium) sindjetzt sichtbar.
- Bereiten Sie eine Präzisionsspritze mit Zellen. Die Spritze ist in der Lage, eine Menge an Volumen von 10 ul für jede Injektion zu liefern. Werfen Sie einen 30 G Nadel an der Spitze der Spritze.
- Fix mit Band eine kleine Kunststoffkanüle (von einem Introcan-W 20 G) an der Nadel, so dass nur 1 mm ausgesetzt, einschließlich der offenen Spitze der Nadel. Dadurch wird die Nadel aus Perforieren des gesamten linken ventrikulären Wand und die Injektion der Zellen in die linke Herzkammer Hohlraum zu verhindern.
- Mit Hilfe eines 5X Ziel, visualisieren bei dieser Vergrößerung der linken Herzkammer und injizieren die Zellen in der linken Herzkammerwand in 5 verschiedenen Standorten (jeweils 10 ul Injektion wird für insgesamt 106 Zellen injiziert liefern). Wenn die Einspritz erfolgreich ist, wird eine weiße Fläche und die Abwesenheit von großen Rückspülung der Zellen sichtbar ist (wenn die Einspritz nicht erfolgreich war, würde das Tier von der funktionalen Analyse ausgeschlossen werden.)
- Entfernen Sie den Aufroller. Schließen Sie die Brustwand by umschließt die beiden getrennten Rippen mit zwei Maschen von 6-0 Seidenfaden.
- Befeuchten Sie die Brustmuskeln und die Haut mit einem Wattestäbchen in PBS 1x durchnässt und legte sanft die Muskeln wieder in die Ausgangsposition mit der Zange.
- Schließen Sie die Haut mit 3-4 Stichen von 6-0 Seidenfaden. Naht der Kehle Schnitt mit 2-3 Stichen, um die Haut zu schließen.
- Inject Atipamezol (1 mg / kg Endkonzentration), um die betäubende Wirkung zurück.
- Sobald die Maus selbstständig zu atmen beginnt, nehmen Sie den Schlauch aus der Luftröhre und setzen Sie die Maus auf die rechte Seite. Die Maus wird erwartet, dass innerhalb von Minuten wiederherstellen.
- Wenn die Maus beginnt sich zu drehen und zu Fuß, legen Sie sie in der warmen Erholungskäfig (kleine IVC-Käfig mit geschlossenen gefilterte oben) für eine Stunde.
- Lassen Sie die Tiere über Nacht in einem geregelten beheizten Feld (37 ° C).
- Füllen Sie eine Schüssel mit Wasser und Pellet Essen zur Erholung während der ersten 2 Tage nach der Operation zu unterstützen.
Zehn Herzen mit Zellen und 10 Kontroll nicht gespritzt Herzen injiziert werden histologisch wie folgt analysiert:
- Führen Analyse der transplantierten Zellen von 1 Woche nach Injektion (Fig. 1 und 3).
- Nach Euthanasie durch Überdosierung von Isofluran, durchströmen die Herzen mit 20 ml 4% Paraformaldehyd (PFA), um das Gewebe zu beheben. Entwässern der festen Gewebe in steigenden Prozentsätzen von Ethanol (70-100%) und in Paraffinblöcke einbinden.
- § die Herzen in Paraffin mit einem Mikrotom in 5 um und Fleck mit Hämatoxylin und Eosin für die morphologische Analyse.
- Visualisieren Bindegewebe durch die Verwendung Masson Trichrome Fleck.
- Analysieren Sie die Bilder unter einem Dia-Scanner-Mikroskop (1A, 2A, 3A, 3B und 3C) und zu visualisieren, das gesamte Herz in kurzen Achse mit einem digitalen Mikroskop-Dia-Scanner (Figures 1B und 1C).
- Nachdem die obigen Analysen entparaffinieren Herzgewebe in Xylol rehydrieren Proben durch Eintauchen in abnehmProzente Ethanol (100% Wasser) und Verfahren für die Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wie folgt:
- Inkubieren entparaffinierten Blöcke mit 1% Gerbsäure in 0,1 M Phosphatpuffer für 1 Stunde.
- Entwässern Proben bei der Erhöhung der Prozentsätze Ethanol (25-100%).
- Trockenproben mit HMDS (Hexamethyldisilazan).
- Montieren Sie die Proben auf Stubbs mit Acheson Silber Dag und überziehen sie mit Gold-Palladium.
- Anwendungsbeispiel in einem analytischen Rasterelektronenmikroskops (Fig. 2B).
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Representative Results
Wir injizierten HEK293-Zellen, die unterscheidbar von der Herzzellen durch ihre unterschiedliche Morphologie (Fig. 1) sind, mit einer Kopfsteinform im Vergleich zu den länglichen Kardiomyozyten (Fig. 1A). HEK293-Zellen waren zu Hämatoxylin Farbstoff (blaue Farbe) reaktiven Vergleich zu Kardiomyozyten (rosa Farbe), wahrscheinlich wegen ihrer erhöhten Kerngehalt (Abbildung 1A). Zur weiteren Unterscheidung der injizierten Zellen aus dem Wirtsgewebe wurden HEK293-Zellen mit DAPI 2 Stunden vor der Injektion gekennzeichnet. -Markierte Zellen wurden in das Myokardgewebe sichtbar, wie in Fig. 1E gezeigt. Steuerscheinoperierten Mäusen zeigten keine Schäden in der ganzen Herzen (1C) und der Integrität des Gewebes (1D).
In einer ganz kurzen Achse des Herzens waren injizierten Zellen als eine homogene Gruppe im Bereich der Injektion (1B) ersichtlich. Die gruppiert cEllen wurden durch eine dünne Schicht von faserigem Gewebe, das als blaue Bereich in der Trichrom-Färbung (Fig. 2A) erschienen umgeben. Die Zellen wurden nicht mit dem Host-Myokardgewebe verbunden, wie durch Rasterelektronenmikroskopie (2B), wahrscheinlich aufgrund ihrer Funktion und noncontractile verschiedenen Zellstruktur dargestellt.
Zusätzlich zu den obigen Beobachtungen haben wir festgestellt kleinen Schadstellen, wo die Nadel injiziert wurde (Fig. 3A). Diese Bereiche laufen von der externen epikardialen Schicht des Herzens in die Herzmuskelwand (3A). Injizierten Zellen (grüner Pfeil, 3B) sind in der Nähe des verletzten Bereich (schwarze Pfeile, 3B) vor. DAPI-positiven Zellen waren an der Injektionsstelle (3C, weiße Pfeile) sichtbar. Eine Woche nach der Verletzung war Tunel Assay nicht erhöht apoptotischen Zellen zeigen, an der Stelle der Verletzung, was darauf hindeutet, dass die Nekroseanstatt Apoptose Nadel nach Injektion (Fig. 3D) aufgetreten ist.
Fig. 1 ist. Histologische Analyse der injizierten Zellen. A) Eine Woche nach der Zellinjektion Herzen wurden in Paraffin eingebettet und für Hämatoxylin-und Eosin-Färbung verarbeitet. Spritzt HEK293-Zellen wurden in die Wand der linken Herzkammer vorhanden ist. Bilder wurden mit einem Stereofluoreszenzmikroskop. B) erhaltenen dreifarbig gefärbten Geweben zeigte, dass die Zellen in der Umgebung gruppiert, wo sie (Pfeil) injiziert. Rechten unteren Felder zeigen die kurze Achse sehen Sie mit der rechten (RV) und linken Ventrikel (LV). Das rote Rechteck zeigt den Bereich, in dem Zellen erhalten (1.5X). Die Bilder wurden mit einer Rutsche-Scanning-Mikroskop aufgenommen. C) Trichrome staining Kontrolle scheinoperierten Herzen. Ganzen Herzen Ansicht mit einem 5fach-Ziel. D) Trichromfärbung der scheinoperierten Mäusen zeigt myokardialen Gewebeintegrität. E) HEK293-Zellen wurden mit DAPI 2 Stunden vor der Injektion gefärbt. Eine Woche nach der Injektion Herzen wurden im Oktober bei 6 um eingebettet und in einem Kryostaten geschnitten. Zellen wurden unter UV in einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht. Linke und rechte Ventrikel dargestellt. In der rechten Herzkammer, rechte Tafel, die weiße Linie markiert den epikardialen Schicht. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. Die Bildung einer fibrotischen Schicht zwischen injizierten Zellen und Wirtsgewebe. A) Trichromfärbung ShowKollagengewebe zwischen HEK293-Zellen und Maus-Herzmuskelgewebe (Pfeile) gebildet. Die Bilder wurden mit einer digitalen Rastermikroskop aufgenommen. B) Die Herzen wurden entparaffiniert und verarbeitet für die Rasterelektronenmikroskopie. Die Bilder wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop aufgenommen und zeigen Kollagenfasern (Pfeile) zwischen den injizierten HEK293-Zellen (links) und dem Host-Myokard (rechte Seite). Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. Zellinjektion hergestellt kleine Bereiche von Schäden. A) Trichromfärbung zeigt kleine Schadstellen, wo Nadel wurde (blaue Farbe eingespritzt wird;. Pfeile) B) Paraffinschnitte wurden von Trichrome sta gebeiztining und der Bereich, in dem die Zellen injiziert wird durch schwarze Pfeile angedeutet. Injizierten Zellen (grüner Pfeil) zu sehen waren in der Nähe des verletzten Bereich. C) HEK293-Zellen mit DAPI 2 Stunden vor Injektion gefärbt, an der Injektionsstelle (weißer Pfeil) vorhanden waren. Die Injektionsstelle ist mit einem grünen Pfeil angezeigt und die weiße Linie markiert die offene Herzbeutel-Schicht. D) Tunel Assay auf Paraffinschnitten durchgeführt wird, nicht relevant Fluoreszenz positiven Kerne zu zeigen. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
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Discussion
In diesem Manuskript haben wir gezeigt, wie man intramyokardialen Injektion von Zellen in murinen Herzen durchzuführen. Als Beweis dieser Methodik haben wir HEK293-Zellen verwendet. Es ist wichtig zu betonen, dass HEK293-Zellen sind nicht in einer Zelltherapie Studie verwendet und damit die Ergebnisse des Manuskripts für die direkte Übersetzung zu einem therapeutischen Ansatz nicht geeignet sind. Die Tatsache, dass HEK293-Zellen nicht kontraktilen Zellen und nicht in anderen Zelltypen zu trans Aufmerksamkeit konzentriert sich jedoch auf technische Aspekte, wie den Eigenschaften der Zellen geliefert werden und der Verabreichungsweg.
Es wurde berichtet, dass eine Route intramyokardialer neigt Zellcluster im Herzgewebe eingebettet 24,26 bewirken, während die intrakoronare Route konnte homogenere Verteilung an der Stelle der Verletzung bereitzustellen. Für Kardiomyozyten Ersatz, sollte die ideale Spenderzelle die elektrophysiologischen, strukturellen und kontraktilen Properti ausstellenn von Herzmuskelzellen und sollte in der Lage, die strukturell und funktionell in das Wirtsgewebe integriert werden, was die Notwendigkeit für eine Zelldifferenzierungsprogramms vor der Transplantation verwendet werden können.
Die Eckpunkte für eine erfolgreiche Operation kann wie folgt zusammengefasst werden:
- Anesthetize Mäuse mit injizierbaren Verbindungen Verlangsamung der Herzfrequenz und erleichtern die Zellinjektion
- Führen intratracheale Kanülierung Mäuse Lungen Funktionalität begünstigen.
- Führen Thorakotomie vermieden Muskel Inzision Brustmuskel Funktionalität für eine richtige Atmung aufrecht zu erhalten.
- Nach Darstellung des Herzens, beobachten die linke Herzkammer unter dem Mikroskop sichtbar zu machen, ob Injektion aufgetreten ist (als eine blasse Farbe sichtbar).
- Verwenden eine dünne Nadel und eine Präzisionsspritze umfangreiche Perforation des Herzgewebes zu verhindern und um die gewünschte Menge an Material bzw. einzuspritzen.
- Steckt die Nadel mit einer Kunststoffrohrsystem auszusetzen our den Spitzenteil. Dies würde die Einführung der Nadel zu einer bestimmten Tiefe in den linken Ventrikel (0,5 mm) zu ermöglichen, die Vermeidung Injektion in die Herzkammer.
- Schließen der Brust und den Raum zwischen den Rippen sorgfältig Exposition der Lunge auf externen Druck zu vermeiden.
Diese Technik hat ein hohes Maß an Erfolg, wenn postoperative gesundheitlichen Bedingungen priorisiert werden. Die Tiere müssen intensiv überwacht werden jeden Tag bis zu einer Woche auf Anzeichen von Leiden und Schmerzen. Die Injektion von schmerzlindernden Verbindungen, um Schmerzen zu kontrollieren, müssen nach Bedarf postoperativ verabreicht werden. Die topische Anwendung von Schmerzlinderung, wie Lidocain, können ebenfalls verwendet werden. Die Blutung sollte durch sorgfältige chirurgische Techniken verhindert werden. Wenn jedoch vorkommen, kann durch Pressen oder Ligation von Gefäßen angehalten werden. Wir haben festgestellt, dass die Tiere erholen besser und schneller, wenn in einem Heizkasten gelassen bei 37 ° C für 12-20 Stunden nach der Operation. Diese Behandlung wird eine schnelle Abnahme der Körpertemperatur zu blockieren, nochnormalerweise nach dem chirurgischen Eingriff und Verwaltung der Narkose auftreten. Postoperative Infektionen auftreten, sollte aber weniger als 1% betragen. Aseptische Verfahren müssen strikt eingehalten werden, um eine Infektion zu verhindern. Lokale Infektion kann unter Anwendung von Antibiotika behandelt werden. Wichtig ist, dass Dehydratisierung durch subkutane Injektion von Kochsalzlösung gesteuert werden.
Es ist bevorzugt, injizierbare über inhalierten Narkose verabreichen, wie Isofluran. Tatsächlich beobachteten wir, dass Injektionsanästhesie verringerte Herzschlag, was eine leichtere und weniger Blutungen Injektion ohne Tier Beschwerden.
Obwohl invasive, ist die Injektion kleiner Mengen von Zellen (25-50 &mgr; l) in Mäusen und sicher durchführbar. Wir hatten weniger als 1% Mortalität durch Injektion von 50 ul 5 HEK293-Zellen in unterschiedlichen Bereichen des linken Herzkammerwand (10 &mgr; l / Injektion). Diese Methode gewährleistet die Anwesenheit der Zellen in mehreren Bereichen des Herzwand, die wichtig ist,Stammzelltherapie, wenn ausgedehnte Bereiche von ischämischem Schaden müssen von den Zellen abgegeben werden, erreicht. Weniger invasive Operation durchzuführen, wurden verschiedene Protokolle wurden kürzlich veröffentlicht, obwohl ihre Reproduzierbarkeit in verschiedenen Labors hat noch nicht verifiziert werden. So kann beispielsweise Zellinjektion durch enge Brust-Technik mit hochauflösenden 27-Echokardiographie durchgeführt werden. Die Verwendung dieses Systems erfordert eine hohe Bedienerfähigkeiten deutlich in einem zweidimensionalen Bild sichtbar mit der Wand des linken Ventrikels und die Nadel in einer bestimmten Position während des normalen systolischen / diastolischen Zyklen aufrechtzuerhalten. Der Vorteil dieser Methode ist die Implantation der Zellen in die Maus Myokard zu gewünschten Positionen in einer klinisch relevanten Zeitrahmen nach Myokardinfarkt Induktion. Allerdings ist diese Vorgehensweise nicht möglich, mit Chirurgie wie Myokardinfarkt Induktion oder transaortale Streifenbildung aufgrund der erhöhten Sterblichkeit der Tiere, sich in einer zweiten Operation 27. Interessant ist, Hamdi und Kollegen verglichen Direkt intramyokardialen Injektion gegen Lieferung von Zellen in einem Gelfoam bauen auf der epikardialen Bereich 28. Sie beobachteten, dass die Überlagerung der Zelle zu konstruieren, auf das Epikard zu einer besseren Funktionalität Transplantat gegenüber intramyokardialer Zellinjektion und berichtet, dass dieses Verfahren ist reproduzierbar, benutzerfreundlich und für die Tiere 28 weniger traumatisch.
Ein wichtiges Merkmal der Zelle Injektionsexperimenten ist die Rückverfolgung der Zellen und ihr Überleben. Wir haben gezeigt, dass HEK293-Zellen sind leicht zu unterscheiden durch ihre Morphologie zu erkennen im Vergleich zu Herzzellen. Diese Zellen überlebten die Injektion (Daten nicht gezeigt) und in das Gewebe von einer Woche nach der Operation erhalten. Um Zellen für Langzeitstudien zu verfolgen und deren Transplantation in das Gewebe der Auslieferung sowie in anderen Geweben zu analysieren, sind verschiedene Techniken in Gebrauch, einschließlich Fluoreszenzmarkierung und eine FISHnalyse im Sex-Mismatch Transplantationsversuche 29. Wichtig ist, dass in-vivo-Bildgebung eine wichtige Rolle spielen auf in vitro-Analysen in zukünftigen Studien. Tatsächlich besteht ein Vorteil der in-vivo-Bildgebung über histologischen Methoden der Verfolgung von Zellen in Langzeitstudien bei denselben Tieren ohne die Notwendigkeit der Euthanasie 29. Bei dieser Methode können die Zellen mit Biolumineszenz-Reagenzien, Eisenteilchen und spezifischen Reportergene mit Positronenemissionstomographie (PET) und Magnetresonanz (MRI) abgebildet werden, markiert werden.
Die Analysen zeigten, dass noncontractile Zellen wie HEK293-Zellen, bevorzugt in dem Bereich, wo sie injiziert wurden, durch eine dünne Kollagengewebe umgeben gruppiert. Obwohl die pathophysiologischen Mechanismen, die zu der Bildung von fibrotischen Gewebe in einem immunodepleted Maus unbekannt sind, kann die Kollagengewebe um die transplantierten Zellen sichtbar vergleichbar mit dem Endpunkt eines seinGewebe-Implantat kompatibel. In diesem Fall kann das exogene Material von den Entzündungszellen entfernt werden und wird in einer dichten Schicht von fibrotischen Bindegewebe, die sie von den umgebenden Geweben isoliert eingekapselt ist. Ähnlich zu den im Endstadium Phasen der Wundheilung, ist dies Granulationsgewebe gefäß und sichert das Überleben der implantierten Materials.
Technisch wird das hier beschriebene Verfahren erfolgreich war, obwohl intramyokardialer Nadelinjektion erzeugt einen kleinen Bereich der Beschädigung des umgebenden Gewebes. Obwohl die Herzfunktion Messungen waren nicht das Ziel dieser Überprüfung sollten zukünftige Studien untersuchen, ob kleinere Gewebeschäden können Zelltherapie Analysen stören. Weiterhin wäre es wichtig zu untersuchen, ob die in der Injektionsstelle erzeugt Verletzungen durch die Nadel verursacht wird, durch die Menge der injizierten Zellen oder durch eine Kombination von beiden.
Unterstützung unserer Ergebnisse wurde gezeigt, dass transplantation von Mischpopulationen von differenzierten humanen embryonalen Stammzellen (hES), die 20-25% Kardiomyozyten (hES-CM) in die gesunde Herzen von immungeschwächten Mäusen (NOD-SCID) führte zu einer schnellen Bildung von Transplantaten, in der die Herzmuskelzellen wurde organisiert und gereift über die Zeit und die Bevölkerung wurde noncardiomyocyte 23 verloren. Interessanterweise beobachteten die Autoren, dass die HES-CM weitgehend vom Host Myokard durch eine Schicht aus faserigem Gewebe, das die Bildung eines elektro Syncytium 22,23 verhindert isoliert. In einer anderen Studie, Kehat et al. Festgestellt, dass hES-CM erfolgreich ging im Ventrikel bei Schweinen mit komplettem Herzblock. Diese Studie zeigte, dass die transplantierten Zellen überlebten, funktioniert, und integriert in Wirtszellen, Nachweis für ihre Fähigkeit, als biologische Alternative zu elektronischen Herzschrittmacher 30 funktioniert. Diese zwei diskordanten Ergebnisse können durch den Unterschied in der Struktur und Funktion ho vereinbarenst und Geberarten. Tatsächlich ist es möglich, daß der Wirkungsgrad der Kopplung von transplantierten Kardiomyozyten kann auf die relative Schlagfrequenz von Host-und Spenderzellen abhängen. Van Laake Studie 23 konnte die Bildung von funktionellen Übergänge aufgrund der unterschiedlichen Schlagfrequenz des menschlichen Kardiomyozyten (60-100 bpm) gegen Nagetier Kardiomyozyten (300-600 bpm) beeinträchtigt werden. Dies wäre der Fall bei Schweinen gegenüber menschlichen Transplantationsversuche nicht, wie in Kehat Analyse 30 beschrieben.
Die Länge der Beobachtungszeit ist ein weiterer Störfaktor. hES-CM in die Nagetier-Herz transplantiert nach Myokardinfarkt induzierte Verbesserung der Herzfunktion nur für die kurzfristige Zeitpunkten (4 Wochen). Doch nach 12 Wochen, die Herzfunktion nicht weiter trotz Transplantatüberleben 23 getragen. Die Autoren stellten fest, daß Transplantatgröße (erhöhte Menge von Zellen) wurde mit verbesserter Langzeit kardialen surv zugehörigenival-und Funktionsverbesserungs 31 zeigt an, dass Langzeitanalysen gegen kurz-oder mittelfristige Analysen sollten in zukünftigen Studien, ohne dass eine erhöhte Anzahl von Zellen für die Injektion durchgeführt werden.
In der vorliegenden Studie, bleiben mehrere Fragen über die Art der Zellen transplantiert werden, die Auswahl der Host-Spenderspezies getestet werden und eine detaillierte Auswertung der Herzrhythmuspotential der Zellen. Im Idealfall, Stammzellen in den Herzmuskel implantiert für den Austausch oder die Schrittmacherfunktion sollte funktionell Paar mit den übrigen Muskelzellen. In einem Rattenmodell für Herzinfarkt, Fernandes et al. Verwendet 32 Programmierte elektrische Stimulation (PES), um Herzrhythmusstörungen Anfälligkeit zu bewerten, zeigt eine erhöhte Induzierbarkeit von ventrikulären Arrhythmien in Myoblasten injiziert Herzen verglichen mit den Kontrollen. In derselben Studie wurde Injektionen von Knochenmark abgeleiteten autologen Zellen nicht in einer erhöhten inducibil führenkeit von ventrikulären Rhythmusstörungen im Vergleich zu Kontrollen, damit was die Autoren zu dem Schluss, dass die Myoblasten wies eine spezifische arrhythmogene Risiko. In einer anderen Studie, Knochenmark-abgeleiteten Zellen (BMC) in Clustern innerhalb der Infarktnarbe oder Grenzzone effizient gepfropft, zeigte aber keine elektronisch evozierte Ca-Transienten 33. Interessanterweise Wei et al. Zeigten, dass mesenchymale Stammzellen (MSC) nicht die elektrophysiologischen Eigenschaften von reifen Herzmuskelzellen während der Überlebenszeit in den Infarktherzen erwerben. Sie können jedoch die elektrische Anfälligkeit lindern und fördern nicht ventrikuläre Arrhythmien 34.
Die Wirksamkeit und das Auftreten von Rhythmusstörungen Stammzellentherapie hängt von den Zellen als auch auf den Lieferrouten. In der Tat, in Rattenherzen nach MI 35, intramyokardialen BMC Injektionen, obwohl Verbesserung der Herzfunktion, erhöht in Folge ventrikuläre Kontraktionen und ventrikuläre tachycardua für die ersten 14 Tage. Wenn die intrakoronare Route verwendet wurde, ventrikuläre Arrhythmie Auftreten deutlich verringert. In klinischen Studien ist die proarrhythmischen Funktion der injizierten Zellen schwierig zu beurteilen, wie die meisten der Patienten erhalten Beta-Blocker als Mittel für ischämische Herzerkrankungen angegeben. Behandlung mit Beta-Blockern kann eine Potential pro-arrhythmischen Effekt der transplantierten Zellen zu maskieren. Tierexperimentelle Studien sind daher von entscheidender Bedeutung, um die Grundlagen der proarrhythmischen Reize in der Stammzelltherapie zu beurteilen.
Zusammenfassend zeigen unsere Daten demonstriert die Machbarkeit von intramyokardialen Zell-Injektion in Mäusen, aber auch die Notwendigkeit für eine detaillierte Analyse über die Sicherheitsbedingungen der Zelltransplantation. Beim Menschen wurde gezeigt, dass Zellinjektion mit pro-Arrhythmien zugeordnet 36-38, Restenose 39, 40 beschleunigte Atherosklerose und koronare Hindernis 41. Die Grundlagenforschung wird in Zukunft wichtig sein, klinische Appchungen zu verstehen, welche Zellen geliefert werden sollen, der Art der Lieferung, die Mechanismen der Zell-vermittelten myokardialen Funktion reparieren, und das Design einer allogenen gegenüber autologen Zelltransplantation Protokoll, das die ganze Bevölkerung profitieren. Wegen der hohen Kosten, die mit großen klinischen Studien, die Reproduzierbarkeit der Effizienz und Wirksamkeit der Transplantation Protokollen muss in präklinischen Modellen, wie sie hier beschrieben behandelt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken der Magdi Yacoub Institute (MYI) zum Tragen mikroskopische Analyse und die Projekte mit Herz Reparatur, die Techniker und die Manager der unsere Tieranlage. Diese Arbeit wurde von der British Heart Foundation (BHF), Projekt PG/10/019 Zuschuss unterstützt. MPS wird von der BHF MYI und unterstützt. TP ist ein BHF-Research Excellence Fellow. NR eine NH & MRC Australien Fellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolator | Pfi systems | Quotation needed | |
| Heating Pad | Vet Tech Solutions | HE006 | For small animals |
| Medetomidine | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Ketamine hydrochloride | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Atipamezole | National Veterinary Service | Veterinary prescription is necessary | |
| Hair removal cream | commercial shops | ||
| Buprenorphine | NVS | Veterinary prescription is necessary | |
| Leica MZFLIII microscope | Leica | Model S6E | With swing arm stand TS0 |
| Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner | Hamamatsu | RS series | |
| Scanning Electron Microscope | Jeol | JSM-6610 | |
| Blunt scissors | FST | 14084-09 | |
| Minivent | Harvard Apparatus | 73-0043 | Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844) |
| Forceps | FST | 11052-10 | |
| Retraction system | FST | 18200-20 | Kit for animals up to 200 g |
| 30 G 12 mm; ½ inch | BBraun | A210 | Fine yellow |
| Microliter syringe | ESSLAB | 81201 | Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700 |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | W1614T |
References
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