心肌内细胞交货：观察在小鼠心脏

Summary

心血管疾病，如高血压或心肌梗死的小鼠模型心肌内细胞递送，被广泛用于测试在再生研究不同细胞类型的治疗潜力。因此，有详细说明，该手术过程有一个清晰的可视化将有助于确定在小型啮齿动物心血管细胞治疗分析的局限性和优势。

Abstract

以往的研究表明，细胞传递促进心功能改善细胞因子和增加心肌组织再血管化和细胞生存因子的释放。此外，进一步的观察发现，特定的干细胞，如心肌干细胞，间充质干细胞和cardiospheres有通过分化成心肌细胞，平滑肌细胞和内皮细胞周围的心肌内整合的能力。

这里，我们提出的材料和方法，以可靠地提供noncontractile细胞进入immunodepleted小鼠的左心室壁。其显着的步骤此显微程序涉及麻醉和镇痛注射液，气管插管，切开打开胸部和无菌30号针头和精密微升注射器暴露细胞的心脏和交付。

包括心脏收获，embeddi组织处理毫微克，切片及组织学染色显示心肌内注射细胞产生一小的伤害的心外膜区域，以及在心室壁上。 Noncontractile细胞被保留到免疫缺陷小鼠的心肌壁并分别由一层纤维组织，有可能从心脏压力和机械负载，以保护所包围。

Introduction

各种细胞输送协议已经在心血管疾病的小鼠和大鼠模型进行了测试与翻译这个实验过程在人类患者的效率，有效性和安全性的目的。在小型啮齿动物的心，心肌内细胞传递是传递细胞^1,2的最可行的方法，而在大鼠心脏顺行³和⁴逆行冠脉内细胞输注，也可以使用。这两种方法有很大的局限性和优势。经冠状动脉内途径细胞递送拥有注射在促进全球细胞传播³直接肌肉注射理论上的优势，但它也有引起冠状动脉栓塞^3,5的风险。在心肌内交付限制与机械性损伤，急性炎症，心肌损害^6,7关联。在人类中，细胞是心脏修复是通过心肌内注射，通过心内膜或心外膜的手术递送接近或冠状动脉内的动脉途径^8。注射液经血管途径适合于治疗急性脑梗死和心肌再灌注，但可能无法进行的情况下完全闭塞或受影响的领土⁹的血管里流动不畅的。直接注射到左心室壁通过经心或transepicardial注射在技术上是可行取决于病人的健康状况。事实上，已经表明，这种技术是安全的^10,11，尽管对于transepicardial注射是必要的开胸手术和经心方法是必需的，以区分存活缺血或心肌疤痕⁹的部位的电生理标测对每个病人。

重要的是，在细胞治疗研究的最佳细胞移植的选择仍在进一步调查中。短期的分析（4周）表明，注射定义为cardiospheres心脏干细胞的13侧群细胞诱导的心功能恢复的小鼠¹⁴和大鼠模型¹⁵心肌梗塞通过减少瘢痕大小和细胞死亡。在没有免疫抑制大鼠心肌梗死模型cardiospheres同种异体移植被认为是安全的，促进心肌再生，并通过内源性修复机制¹⁵刺激改善心脏功能。在心脏Lin-/c-kit +能成体祖细胞被证明是自我更新，克隆，和多能在体外和体内 ，并且当注射到缺血大鼠心脏重构受伤的心肌壁¹⁶的大的部分和有能力，形成导电性和中等大小的冠状动脉^17。这些可喜的数据引发的I期和人类II期临床试验：注射自体和异体骨髓间充质干细胞^{（MSC）18，cardiospheres 19}，或c-Kit阳性心脏干细胞（CSC）20在缺血人类的心灵每个显示，在长期的研究心脏功能的有益作用。然而，大量的长期随访和回顾性荟萃分析表明，干细胞疗法提供了显著的好处有些病人，而不是在别人与一系列不可预知的结果^21。这是可能的，这些限制将需要的细胞递送的每个个人和每一种疾病的具体协议的设计。

在小鼠和大鼠模型中，长期的研究表明，细胞注射未进一步改善心脏功能（12个月）。的确，人胚胎干细胞衍生的心肌细胞（hESC细胞-CM）的移植物主要是由一层纤维组织^22,23的分离自宿主的心肌。骨骼肌成肌细胞心肌内移植到梗死小鼠²⁴的心脏后，类似的结果也被观察到。 Furthermo重，同种异体干细胞的保存功能中的梗塞心脏的长期能力已经通过从immunoprivileged到免疫原性的状态转移分化²⁵后受到限制。

考虑到上述挑战和前景，我们在这里展示如何通过心肌内注射小鼠，提供细胞。我们观察到细胞无心肌收缩性能不与宿主心肌相连形成一个粘合体具有薄纤维化障碍。尽管在某些情况下，这种结果可能是有利的，下面的分析可能是有用的，以了解细胞植入可被调制，以产生功能性连接的心肌的结构为好。

Protocol

所有动物实验均符合国际（欧洲议会指令2010/63/EU）和国家（英国内政部，1986法案）的规定执行。本文所述的方法是我们在英国的许可证主管部门的工作计划的一部分，并没有被进行记录的目的。

1。细胞的制备

本协议描述了用于演示目的编制特定的细胞系（人类胚胎肾，HEK293细胞）。小区特定的协议必须采用用于生长并最终分化多能性或成体干细胞分化成特定细胞谱系。

1. 生长在DMEM培养基（高葡萄糖，4500毫克/升）含1％丙酮酸钠，2mM谷氨酰胺，1％抗生素青霉素/链霉素和10％胎牛血清（FBS）的细胞。一个10cm平板应能正常分裂为1:3和媒体补充新鲜每两天。
2. 轻度治疗细胞tryps作为在1:1的描述1X和重悬在DMEM培养基。
3. 计数细胞在血细胞计数器室中，并收集3×10 ⁶细胞到一个单独的试管中。
4. 离心机在摆动斗转子，在100×g离心5分钟。
5. 弃去上清液并用无菌磷酸盐缓冲液2倍洗涤细胞沉淀。
6. 重悬在PBS 1x在的10 ^6/50微升注射入immunodepleted小鼠的左心室的浓度。

2。手术前的条件

1. 每次手术前，保持immunodepleted小鼠（NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD）用无菌的食物颗粒和水在温度控制隔离器（ 表1 22℃）。
2. 在层流罩进行immunodepleted小鼠的手术。用70％乙醇清洁工作区和高压灭菌手术工具（镊子和剪刀）。
3. 打开加热垫的手术和恢复。加热垫是很重要的阻止发生体温的过程中减少和手术后。
4. 将干净和蒸压笼上的恢复加热垫。
5. 运输老鼠在原来的笼子从隔离到手术室到无菌高压灭菌袋。
6. 称量小鼠并根据体重注射皮下（SC），其中包含美托咪定和盐酸氯胺酮稀释在0.9％无菌生理盐水溶液来麻醉小鼠的溶液，以及放松的肌肉（美托咪定1毫克/千克;盐酸氯胺酮75毫克/千克）。
7. 从笼中取出鼠标时完全麻醉（在1-2分钟，刺激后无脚趾捏反射）
8. 取适量涂抹于胸部左侧脱毛膏和咽喉区。经过一段时间（约2-5分钟）适量，擦干头发松散与水的湿纸巾。
9. 把鼠标在手术面板上的仰卧位置。从外科医生的角度来看的位置是垂直的，尾巴向下的头。
10. 注入镇痛溶液在0.1-0.2微克/克稀释在无菌盐水中的溶液（丁丙诺啡）插入后肢皮下注射，与使用棉尖涂药无菌溶液聚维酮碘覆盖剃的区域。
11. 聚焦显微镜（2.5X物镜）的咽喉地带。

3。手术条件

1. 用钝的剪刀做出0.5-1厘米长度略低于环状软骨的腹面正中线切开皮肤。皮肤结缔组织分开，以可视化的唾液腺。
2. 通过同时拉动各部分侧面带有钳子和磁胸部拉钩各执其自然中线划分唾液腺和暴露气管。
3. 轻轻一拉舌的一侧，露出喉。在插管小心滑入进气管。管尖端可见通过显示升arynx和气管。重要的是，如果管中，但不是清晰可见的，它是在食道。中取出，并改变它的管前端的位置。
4. 管连接到通风的机器。在200微升和150冲程/分钟设定的每搏输出量。固定手术面板用胶带上的通风管道。
5. 用钝的剪刀和镊子，使垂直尾翼头1 - 1.5厘米长的皮肤切口在左胸部区域。
6. 拧松结缔组织/肌肉层和主要的和次要的胸肌皮肤而不做切口。
7. 如下所述第三和第四肋之间进行开胸：
   1. 通过捏和小，圆形钳刮穿孔肋间肌肉层。
   2. 一旦肋间肌层穿孔，放置胸腔牵开器，最大限度地打开胸腔。左心室（LV），其上覆耳廓（心房）的上部和中间部分是现在可见。
8. 准备一个精密注射用细胞。注射器应能提供的10微升体积的量为每次注射。投了30号针头的注射器的尖端。
9. 固定用胶带的小塑料套管（从introcan-W 20 G）上的针，留下暴露的仅1毫米，包括针的开口顶端。这将防止针穿透整个左心室壁和注射细胞到左心室腔。
10. 用5X物镜的帮助下，可视化在此放大率左心室和注入的细胞进入左心室壁在5个不同的位置（每个注射将提供10微升，总共106个细胞的注射）。如果注射是成功的，白色的区域和不存在细胞的主要反冲洗将是可见的（如果注入不成功，该动物将被排除的功能分析）。
11. 取出拉钩。关闭胸腔B墙Ÿ内附两个分离的肋骨6-0丝线缝合两针。
12. 滋润胸肌和皮肤用棉尖湿透的PBS 1x和轻轻把肌肉回到与镊子原来的位置。
13. 关闭3-4针6-0丝线缝合皮肤。缝合切口喉咙用2-3缝线关闭皮肤。
14. 注射阿替美唑（1毫克/千克终浓度）恢复的麻醉作用。
15. 只要鼠标开始自主呼吸，取出管从气管，把鼠标在它的右侧。鼠标预计将在几分钟之内恢复。
16. 当鼠标开始转身，将其放置在温暖的回收笼（IVC小笼子封闭过滤顶部）一个小时。
17. 离开隔夜动物在受控制的加热箱（37℃）。
18. 装满水和食物颗粒菜在手术后第2天，以支持复苏。

十大心中注入细胞和10个控制未注射的心是组织学分析如下：

1. 1周喷射（ 图1和3）后进行移植的细胞的分析。
   1. 安乐死异氟醚的过量后，灌注的心用20毫升4％多聚甲醛（PFA）的修复组织。脱水的固定的组织中增加的乙醇百分比（从70-100％），并嵌入石蜡块。
   2. 节的心在与石蜡切片机在5微米和染色用苏木精和曙红的形态分析。
   3. 通过使用马松三色染色可视化结缔组织。
   4. 分析的滑动扫描器显微镜（ 图1A，2A，3A，3B和3C）下的图像，并使用数字幻灯片扫描仪显微镜（FIGU可视化整个心脏中短轴视图水库1B和1C）。
2. 经过以上分析，deparaffinize的心脏组织中的二甲苯，再水合浸没标本在减少乙醇的百分比（从100％到水中）和过程为扫描电子显微镜（SEM），如下所示：
   1. 孵育脱石蜡块，用1％单宁酸在1小时的0.1M磷酸盐缓冲液中。
   2. 在增加的百分比乙醇（25-100％）脱水标本。
   3. 干样品HMDS（六甲基二）。
   4. 安装在拔标本与艾奇逊银达格和外套，用金 - 钯。
   5. 视图样品中的分析扫描电子显微镜（ 图2B）。

Representative Results

我们注入的HEK293细胞中，这是由它们的不同的形态可区分从心脏细胞（ 图1），用鹅卵石形状较细长的心肌细胞（ 图1A）。相比，心肌细胞（粉红色），有可能的，因为它们的增加的核含量（ 图1A）的HEK293细胞，更具反应性，以苏木精染料（蓝色）。为了进一步区分注射的细胞从宿主组织中，将HEK293细胞用DAPI标记前2小时注射。标记的细胞是可见的心肌组织， 如图1E。控制假手术小鼠显示出在整个心脏（ 图1C）和组织（ 图1D）的完整性没有损害。

在心脏的整体短轴切面，注入的细胞作为注射（ 图1B）领域的同质群体可见。分组ÇELL学生被包围了一层薄薄的纤维组织，从而出现一个蓝色区域中的三色染色（ 图2A）。细胞不与宿主的心肌组织相连，如图所示用扫描电子显微镜（ 图2B），可能是由于其noncontractile函数和不同的蜂窝结构。

除了 ​​上述的观察，我们注意到在针注射（ 图3A）损坏的一小块区域。这些区域从心脏的心外膜外部层进入心肌壁（ 图3A）运行。注射的细胞（绿色箭头， 图3B）是存在于受伤部位（黑色箭头所示， 图3B）的接近度。 DAPI阳性细胞沿注射部位（ 图3C中 ，白色箭头）可见。伤后一周，TUNEL法并没有在损伤部位显示增加细胞凋亡，提示坏死而非凋亡针注射（ 图3D）之后已经发生。

图1。注射的细胞的组织学分析。 A）一个星期后细胞注射心脏石蜡包埋和处理的苏木精伊红染色。注入的HEK293细胞存在进入左心室的壁。图像进行了立体声荧光显微镜。 乙获得）三色染色的组织表明，细胞集中在同一个区域在那里他们被注入（箭头）。右下方的面板显示短轴查看与右（RV）和左心室（LV）。红色矩形显示了细胞被保留（1.5X）的区域。该图像记录用的幻灯片扫描显微镜，C）三色意法半导体癌宁控制假手术心。整个心脏视图与5倍的目标。 四）假手术小鼠显示心肌组织的完整性。 居三色染色）HEK293细胞用DAPI染色前2小时内注射。一个星期后，注射的心被镶嵌在OCT和切片在低温恒温器在6微米。细胞在荧光显微镜紫外光下可视化。左，右心室被示出。在右心室，右面板中，白线标志着心外膜层。 点击这里查看大图。

图2。注入形成细胞和宿主组织之间的纤维化层。 A）三色染色显示HEK293细胞和鼠心肌组织（箭头）之间所形成的胶原组织。该图像记录用数字扫描显微镜B）心脱蜡和处理的扫描电镜观察。图像记录用扫描电子显微镜和显示注射HEK293细胞（左侧）与宿主心肌（右侧）之间的胶原纤维（箭头）。 点击这里查看大图。

图3。细胞注射所产生的损害的一小块区域。 A）三色染色显示损坏的地方针注射（蓝色小区域;箭头）B）石蜡切片，用三色染色站进不去并且其中所述细胞被注射的区域由黑色箭头表示。注射的细胞（绿色箭头）是可见在接近受伤的部位。C）HEK293细胞，用DAPI染色前2小时注射，分别沿着注射部位（白色箭头）存在。注射部位是显示一个绿色箭头和白色的开行，标志着心包层D）TUNEL法，对石蜡切片进行，并未出现相关的荧光阳性核。 点击这里查看大图。

Discussion

在这个手稿中，我们已经展示了如何在小鼠心脏进行心肌内注射细胞。作为这种方法的一个证据，我们已经使用HEK293细胞。需要强调的是HEK293细胞中的任何细胞治疗研究中没有使用，因此该手稿的发现并不适合直接翻译为一种治疗方法是很重要的。然而，事实是HEK293细胞不收缩细胞，不要在其他细胞类型转分化侧重于技术方面，例如要传送的单元的属性和传送路线的注意。

已经报道了一个心肌内途径趋向于引起嵌在心肌组织^24,26的细胞簇，而冠状动脉内途径可以提供更均匀的分布在损伤的部位。对于心肌细胞替代，理想的供体细胞应具有的电，结构和收缩properti心肌细胞的ES，并应能在结构上和功能上整合到宿主组织，这表明有必要进行移植前，可以采用如下的细胞分化程序。

关键点对于一个成功的手术可以概括如下：

1. 麻醉小鼠注射化合物减缓心脏速率并促进细胞注射
2. 小鼠进行气管内插管有利于肺的功能。
3. 执行避免了开胸切开肌肉，保持胸部肌肉功能，正确的呼吸。
4. 暴露心脏后，观察在显微镜下对左心室进行可视化是否已经发生注射（作为一个苍白色可见）。
5. 使用一个薄的针和注射器的精度，以避免心肌组织的广泛穿孔并分别材料的所需量注射。
6. 包住用塑料管系统暴露针ONLY的前端部。这将允许引入针到特定深度的进入左心室（0.5毫米），避免了注射入脑室腔中。
7. 关闭仔细肋骨之间的胸部和空间，以避免肺部暴露于外部压力。

这种技术有一个高层次的成功，如果手术后的健康状况的优先级。动物必须每天集中监控长达一个星期的痛苦和疼痛的迹象。根据需要手术后注射的镇痛化合物，以控制疼痛的必须给药。疼痛缓解，如利多卡因的局部应用，也可使用。出血应通过仔细的手术技术是可以避免的。然而，如果存在，它可以通过压缩血管结扎或停止。我们注意到，动物恢复更好，更快，如果留在一个加热箱，在37℃下手术后12-20小时。这种治疗将阻止快速体温下降，也不麻醉后的手术过程和管理马利发生。可能出现手术后感染，但应小于1％。无菌操作必须严格遵守，以防止感染。局部感染可以应用抗生素治疗。重要的是，脱水应通过皮下注射生理盐水进行控制。

优选的是注射给药过吸入麻醉剂，如异氟烷。事实上，我们观察到注射麻醉剂降低心跳，用户可以方便地注入和出血少而不引起动物不适。

虽然微创，注射少量小鼠细胞（25-50微升）是可行的，安全的。我们通过注射50μl的HEK293细胞中的左心室壁（10微升/注射）的5个不同的区域具有低于1％的死亡率。这种方法确保了细胞在心肌壁，这是重要的几个区域存在干细胞治疗时需要的缺血性损伤扩展区域由传递细胞到达。要执行微创手术，多种协议已于近期出版的，虽然他们在不同的实验室重现性还有待验证。例如，细胞注射可以通过近距离胸部技术，使用高分辨率超声心动图²⁷进行。使用本系统的要求高操作者的技能，以清楚地看到在一个两维图像的左心室壁和在正常收缩/舒张周期保持针在一个特定的位置。这种技术的优点是将细胞植入到小鼠心肌在心肌梗死后诱导临床相关的时间范围所需的位置。然而，这种方法是不可能的手术程序，例如，因为动物的死亡率增加正处于第二操作²的心肌梗塞感应或transaortic绑扎7。有趣的是，哈姆迪和同事比较了直接心肌内注射对在明胶海绵构建到心外膜面积²⁸交货细胞。他们观察到，覆盖在细胞构造到心外膜导致更好的移植物功能相比，心肌内细胞注射和报道，这种技术是可重复的，用户友好，创伤小的动物^28。

的细胞注射实验的一个重要特征是细胞的追踪和它们的生存。我们已经表明，相比于心脏细胞HEK293细胞中很容易就可以检测由于它们的区别的形态。这些细胞存活的注射液（数据未示出）一个星期被保留在组织中的手术后。要跟踪细胞的长期研究和分析其在交付组织以及其他组织移植，多种技术都在使用，包括荧光标记和鱼类nalysis在性别错配移植实验^29。重要的是，对在体外分析在将来的研究中体内成像将起到主要的作用。的确，一个优点体内成像过组织学方法之一是细胞在相同的动物的纵向研究而不安乐死²⁹的需要的跟踪。在这种方法中，细胞可以打上生物发光试剂，铁颗粒，并与正电子发射断层扫描（PET）和磁共振（MRI）的成像特定的报告基因。

我们的分析表明，noncontractile细胞，如HEK293细胞优先地分组在那里他们被注入由薄的胶原组织所包围的面积。虽然导致纤维化组织中的immunodepleted鼠标形成的病理生理机制是未知的，胶原组织周围的移植细胞可见可媲美的一个端点组织相容的植入物。在这种情况下，外源性材料不能由炎性细胞中除去并在致密层的纤维化结缔组织，它从周围组织分离它的变包封。类似于伤口愈合的终末期阶段，这粒状组织是高度血管化，并确保植入材料的存活。

技术上此处所描述的方法是成功的，虽然心肌内注射针产生破坏周围组织的小区域。虽然心功能测量结果并不检讨的目的，未来的研究应该调查轻微的组织损伤是否能干扰细胞的治疗分析。此外，为了分析是否在注射部位产生的损伤是由针引起的，通过细胞的注入量，或由两者的组合将是非常重要的。

为了支持我们的研究结果，它已经表明，移植Ñ​​分化的人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）中含有20-25％的心肌细胞（胚胎干细胞-CM）为免疫功能低下小鼠的心脏健康（NOD-SCID）混合种群导致迅速形成移植物中的心肌细胞变得有组织，有成熟的随着时间的推移和noncardiomyocyte人口失去了^23。有趣的是，作者观察到的hESC-CM在很大程度上隔绝来自主机心肌由一个层，它防止了电生理学合胞体^22,23的形成纤维化组织的。在不同的研究中，Kehat 等人发现，人类胚胎干细胞成功CM节奏心室猪与完整的心脏传导阻滞。这项研究表明，移植的细胞存活，发挥作用，并与宿主细胞结合，提供了证据证明它们的功能作为生物替代电子起搏器³⁰的能力。这两个不和谐的结果可以通过浩结构和功能的差异对账ST和供体物种。事实上，这是可能的，移植的心肌细胞的耦合效率可以依赖于宿主和供体细胞的相对频率的跳动。在范Laake的研究^[23]，功能路口的形成可能是由于人类心肌细胞的不同跳动频率（60-100 BPM） 与啮齿动物心肌细胞（300-600 BPM）减值。这不会是这种情况在人与猪移植实验，如在Kehat分析³⁰所述。

观测时间的长短是另一个干扰因素。人类胚胎干细胞CM移植到啮齿动物心脏心肌梗死后引起的心功能改善只是短期的时间点（4周）。然而，在12周时，心脏功能没有进一步持续，尽管移植物存活率^23。作者观察到移植物的大小（增加细胞的量）不与改善长期心脏存活率相关IVAL和功能改善^31，表明长期分析与短期或中期分析应在将来的研究中，而不需要的细胞数量的增加为喷射来进行。

在本研究中，一些问题依然存在有​​关的细胞被移植的类型，主机供体物种的选择进行测试和单元格的心律失常潜在的详细评测。理想的情况下，干细胞移植到心肌更换或起搏器功能应该在功能夫妇与剩余肌细胞。在心肌梗死的大鼠模型中，费尔南德斯等人 ³²使用程控电刺激（PES）来评价心律失常的易感性，显示与对照组相比的室性心律失常的成肌细胞注入心脏增加诱导能力。在同一研究中，骨髓来源的自体细胞注射并未导致增加inducibil室性心律失常性与对照组相比，从而导致作者的结论是成肌细胞表现出特定的致心律失常的风险。在不同的研究中，骨髓来源的细胞（BMC）有效地接枝在梗死瘢痕或边界区域内的集群，但是没有显示电诱发的钙瞬变^33。有趣的是，魏等人发现，骨髓间充质干细胞（MSC）期间在心肌梗死后的存活期不收购成熟的心肌细胞的电生理特性。但是，它们可以缓解电脆弱性和不提倡的室性心律失常^34。

干细胞疗法的疗效和心律失常的发生依赖于细胞以及投递路线。事实上，在大鼠心肌梗死³⁵后，心肌内注射BMC，虽然改善心脏功能，增加连续的室性早搏和室tachycardIA初始14天。当采用冠状动脉内途径，室性心律失常的发生显着减少。在临床研究中，注射的细胞的促心律失常作用是很难评估，因为大多数的患者接受β-受体阻滞剂药物所指示的缺血性心脏疾病。治疗与β-阻断剂可能掩盖移植的细胞的潜在致心律失常作用。因此动物研究是至关重要的，以评估促心律失常刺激干细胞疗法的基础。

总之，我们的数据表明心肌内细胞注入小鼠的可行性，但也强调需要有关细胞移植的安全状况进行详细分析。在人类中，已经表明细胞注射与亲性心律失常^36-38相关联的，再狭窄^39，加速的动脉粥样硬化^40，和冠状动脉阻塞^41。基础研究将是重要的未来的临床应用lications了解哪些细胞应交付，分娩方式，细胞介导的心肌功能修复的机制，以及异体或自体细胞移植协议，造福所有人类群体的设计。因为与大型临床试验相关的高昂成本，需要在临床前模型如这里所描述要解决的效率和移植协议效力的可重复性。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolator	Pfi systems		Quotation needed
Heating Pad	Vet Tech Solutions	HE006	For small animals
Medetomidine	National Veterinary Service		Veterinary prescription is necessary
Ketamine hydrochloride	National Veterinary Service		Veterinary prescription is necessary
Atipamezole	National Veterinary Service		Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream	commercial shops
Buprenorphine	NVS		Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope	Leica	Model S6E	With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner	Hamamatsu	RS series
Scanning Electron Microscope	Jeol	JSM-6610
Blunt scissors	FST	14084-09
Minivent	Harvard Apparatus	73-0043	Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps	FST	11052-10
Retraction system	FST	18200-20	Kit for animals up to 200 g
30 G 12 mm; ½ inch	BBraun	A210	Fine yellow
Microliter syringe	ESSLAB	81201	Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700
6-0 Silk suture	Ethicon	W1614T