Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Intramyocardial Cell Levering: Observationer i murine Hjerter

Published: January 24, 2014 doi: 10.3791/51064
Automatic Translation
1,2, 1,2, 2,3, 1,2
1Magdi Yacoub Institute, Imperial College London, 2National Heart and Lung Institute, Imperial College London, 3Australian Regenerative Medicine Institute, Monash University

Summary

Intramyocardial celle levering i murine modeller af hjerte-kar-sygdomme, såsom forhøjet blodtryk eller myokardieinfarkt, er meget udbredt at teste det terapeutiske potentiale af forskellige celletyper i regenerative studier. Derfor vil en detaljeret beskrivelse og en klar visualisering af denne kirurgiske procedure hjælpe med at definere grænserne og fordelene ved hjerte-kar-celle terapeutiske analyser i små gnavere.

Abstract

Tidligere undersøgelser har vist, at celle levering fremmer hjertefunktionen forbedring af frigivelse af cytokiner og faktorer, der øger hjertevæv revaskularisering og celleoverlevelse. Endvidere bør observationer viste, at specifikke stamceller, såsom hjerte-stamceller, mesenchymale stamceller og cardiospheres har evnen til at blive integreret i den omgivende myocardium ved at differentiere i cardiomyocytter, glatte muskelceller og endotelceller.

Her præsenterer vi de materialer og metoder til pålideligt levere noncontractile celler i venstre ventrikel væg immunodepleted mus. De vigtigste trin i denne microsurgical procedure involverer anæstesi og analgesi injektion, intratracheal intubation indsnit at åbne kisten og udsætte hjertet og levering af celler med en steril 30 gauge kanyle og en præcision mikroliter sprøjte.

Vævsbehandling bestående af hjerte høst, embedding, sektionering og histologisk farvning viste, at intramyocardial celle injektion produceret en lille skade i epicardial område, såvel som i den ventrikulære væg. Noncontractile celler blev bevaret i den myocardiale væg af immunkompromitterede mus og var omgivet af et lag af fibrøst væv, forventes at beskytte mod hjerte-tryk og mekanisk belastning.

Introduction

Forskellige celle levering protokoller er blevet testet i murine og rotte modeller af hjerte-kar-sygdomme med henblik på at omsætte den effektivitet, effekten og sikkerheden af ​​denne eksperimentelle procedure i menneskelige patienter. I små gnavere hjerter, intramyocardial celle levering er den mest brugbare metode til celle levering 1,2, mens den i rottehjerte antegrad 3 og retrograd 4 intrakoronar celle infusion også kan anvendes. Begge metoder har begrænsninger og fordele. Cell levering via intrakoronar har teoretiske fordele end direkte intramuskulær injektion i at fremme global formidling 3 celle, men det har også risiko for at forårsage koronar emboli 3,5. Begrænsninger intramyocardial levering er forbundet med mekanisk skade, akut inflammation og myocardieskade 6,7. Hos mennesker er celler til hjerte-reparation leveret af intramyocardial injektion gennem en endokardial eller kirurgisk epikardialnærmer sig eller ved intrakoronar arteriel rute 8. Injektion af transvascular ruter er velegnet til patienter med akut infarkt og reperfunderet myokardiet, men kan ikke være muligt i tilfælde af samlede tillukning eller dårlig strømning inden for fartøjer af sted territorium 9.. Direkte indsprøjtning i ventrikelvæggen ved transendocardial eller transepicardial injektion er teknisk muligt, afhængigt af patientens sundhedstilstand. Faktisk har det vist sig, at denne teknik er sikkert 10,11, selv om transepicardial injektion en åben kiste kirurgi er nødvendig, og for transendocardial nærmer en elektrofysiologiske kortlægning for hver patient er forpligtet til at differentiere steder af levedygtige iskæmisk eller arret myokardiet 9.

Vigtigere er det, i undersøgelser celleterapi valget af den bedste celle, der skal transplanteres, er stadig under undersøgelse. Kortfristede analyser (4 uger) viste, at injektion af hjerte stamceller defineret som cardiospheres 13 kardielle funktionel genopretning i murine 14 og rotte 15 modeller af myokardieinfarkt ved at mindske ar størrelse og celledød. Allogen transplantation af cardiospheres i en rotte myokardieinfarkt model uden immunosuppression blev fundet at være sikker, forfremmet hjerte-regeneration, og forbedret hjertefunktion gennem stimulering af endogene reparationsmekanismer 15. Lin-/c-kit + voksne stamceller i hjertet viste sig at være selvfornyende, klonogene og multipotente in vitro og in vivo, og når det injiceres i en iskæmisk rottehjerte rekonstitueret store dele af den skadede myocardial væg 16 og havde evne til at danne ledende og mellemliggende størrelse kranspulsårerne 17. Disse lovende data drevne fase I og II kliniske forsøg i mennesker: injektion af autologe og allogene mesenkymale stamceller (MSC) 18, cardiospheres 19eller c-Kit positive kardiel stamceller (CSC) 20 i humane iskæmiske hjerter hver viste gavnlig effekt på hjertets funktion i langtidsstudier. Ikke desto mindre omfattende langsigtet opfølgning og retrospektiv meta-analyse viste, at stamcelleterapi giver betydelig fordel for nogle patienter, men ikke i andre med en række uforudsigelige resultater 21. Det er muligt, at disse begrænsninger vil nødvendiggøre udformningen af ​​specifikke protokoller celle levering for den enkelte og hver sygdom.

I mus og rotte modeller langtidsstudier, afslørede, at celle indsprøjtning ikke yderligere at forbedre hjertets funktion (12 måneder). Faktisk blev transplantater af humane embryonale stamceller afledt cardiomyocytes (embryonale-CM) stort set isoleret fra værten myokardiet af et lag af fibrøst væv 22,23. Lignende resultater er blevet observeret efter intramyocardial transplantation af skeletmyoblaster ind i hjertet af infarcted mus 24. Furthermore, den langsigtede evne til allogene MSC for at bevare funktionen i infarcted hjerte er blevet begrænset af overgangen fra en immunoprivileged til en immunogen tilstand efter differentiering 25.

Under hensyntagen til de udfordringer og perspektiver, der er skitseret ovenfor, viser vi her, hvordan man leverer celler ved intramyocardial injektion i mus. Vi observerer, at celler uden cardiomyocyte kontraktile egenskaber ikke er forbundet med værten myokardiet og danne en sammenhængende masse med en tynd fibrøs barriere. Selvom der i nogle tilfælde dette resultat kan være en fordel, kan følgende analyse være nyttigt at forstå, hvordan celle transplantation kan gradueres for at generere funktionelt forbundne myokardie strukturer samt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med international (direktiv 2010/63/EF af Europa-Parlamentet) og nationale (britiske indenrigsministerium, Act 1986) regler. Procedurerne beskrevet heri er en del af vores plan for arbejdet under britisk licens myndigheder og ikke er blevet iværksat med henblik på optagelse.

1.. Fremstilling af celler

Denne protokol beskriver fremstillingen af ​​en specifik cellelinie (humane embryonale nyre, HEK293-celler) til demonstration. Cell-specifikke protokoller skal være ansat til dyrkning og til sidst differentiere pluripotente eller voksne stamceller i specifikke cellelinier.

  1. Dyrk cellerne i DMEM-medium (høj glucose, 4,500 mg / l) indeholdende 1% natriumpyruvat, 2 mM glutamin, 1% antibiotikum Pen / Strep og 10% føtalt bovint serum (FBS). Et 10 cm pladen skal opdeles normalt på 1:03 og medier suppleret frisk hver to dage.
  2. Forkæl celler mildt med tryps1x og resuspender i DMEM-medium, som beskrevet i 1:1.
  3. Tæl cellerne i et hæmocytometer kammer og indsamle 3 x 10 6 celler i et separat rør.
  4. Centrifuger i en gynge spandrotor ved 100 g i 5 minutter.
  5. Supernatanten fjernes, og vaske cellepellet med steril phosphatpuffer 2x.
  6. Resuspender i PBS 1x ved en koncentration på 10 6/50 ul til injektion i den venstre ventrikel af immunodepleted mus.

2. Prækirurgisk Betingelser

  1. Bevar immunodepleted mus (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) med sterile foderpiller og vand i en temperatur-kontrolleret isolator (22 ° C, tabel 1) før hver operation.
  2. Udføre kirurgi på immunodepleted mus under en laminar flow hætte. Rengør arbejdsområde med 70% ethanol og autoklaveres kirurgiske værktøjer (pincet og saks).
  3. Tænd varmepuder for kirurgi og inddrivelse. Varmepuder er vigtigeat blokere fald i kropstemperatur forekommer under og efter kirurgi.
  4. Placer en ren og autoklaveret bur på recovery-varmepude.
  5. Transportere musene i deres oprindelige bure fra isolatoren til operationen værelse i en steril autoklaveres taske.
  6. Mus vejes, og i henhold til kropsvægt indsprøjtes subkutant (sc) en opløsning indeholdende medetomidin og ketamin-hydrochlorid fortyndet i 0,9% sterilt saltvand til at bedøve mus, såvel som til at slappe af muskulaturen (medetomidin 1 mg / kg; ketaminhydrochlorid 75 mg / kg).
  7. Fjern musen fra buret når den er fuldt bedøvet (inden for 1-2 min, ikke tå-knivspids refleks efter stimulering)
  8. Påfør hårfjerning creme på venstre side af brystet og svælget. Efter en passende mængde tid (ca. 2-5 min), tørre de løse hår med en vand-vådt væv.
  9. Placer musen på operation panel i en liggende stilling. Frakirurgens synspunkt stillingen er lodret, hale ned-head up.
  10. Sprøjt smertestillende løsning på 0,1-0,2 pg / g fortyndet i steril saltvandsopløsning (buprenorphin) i bagbenet subkutant og dækker barberede område med aseptisk løsning povidoniod ved hjælp af en vatpind.
  11. Fokuser mikroskop (2,5 x objektiv) på hals-området.

3. Kirurgiske Betingelser

  1. Med stumpe saks gøre en midtlinie ventral incision i huden på omkring 0,5-1 cm længde lidt under ringbrusk. Adskil hud fra bindevæv at visualisere spytkirtlerne.
  2. Split spytkirtlerne på deres naturlige midterlinjen division samtidig trækker hver del sideværts med Forcep og magnetisk bryst retractor og eksponere luftrøret.
  3. Træk tungen forsigtigt til siden for at eksponere strubehovedet. Skub intubationsrøret forsigtigt ind i luftrøret. Røret spidsen er synlig gennem den viste larynx og luftrør. Vigtigere er det, hvis røret er i, men ikke klart synlig, er det i spiserøret. Fjern den og ændre placeringen af ​​røret spids.
  4. Tilslut slangen til ventilationssystemet maskinen. Indstil slagvolumen på 200 ul og 150 slag / min. Fastgør ventilation slange på operation panel med et bånd.
  5. Med stumpe saks og pincet, foretage en lodret hale til hoved 1 - til 1,5 cm lang incision i huden over den venstre brystkasse område.
  6. Løsne huden fra bindevævet / muskel lag og de større og mindre brystmuskler uden at gøre indsnit.
  7. Udfør thoracotomi mellem tredje og fjerde ribben som følger:
    1. Perforere intercostal muskel lag ved at klemme og skrabe med små, afrundede pincet.
    2. Når intercostal muskel lag er perforeret, placeres retractor brystet til maksimalt åbne brysthulen. Den øverste og midterste dele af den venstre ventrikel (LV) med dens overliggende forkammer (atrium) ernu synlige.
  8. Forbered en præcision sprøjte med celler. Sprøjten skal være i stand til at levere en mængde volumen på 10 ul til hver injektion. Støbt en 30 G nål på spidsen af ​​sprøjten.
  9. Fix med tape en lille plastik kanyle (fra introcan-B 20 G) på nålen, således at kun udsættes 1 mm, herunder den åbne spids af nålen. Dette vil forhindre nålen i at perforere hele venstre ventrikulære væg og injektion af cellerne ind i den venstre ventrikel hulrum.
  10. Ved hjælp af et 5X objektiv, visualisere på forstørrelse den venstre ventrikel og injicere cellerne i den venstre ventrikelvæg i 5 forskellige steder (hver injektion vil levere 10 ul for i alt 106 celler injiceret). Hvis injektionen er lykkes, vil et hvidt område og fraværet af store returskyl af cellerne være synlige (hvis injektionen ikke var lykkes, vil dyret blive udelukket fra funktionel analyse).
  11. Fjern retractoren. Luk thorax væg By omslutter de to adskilte ribber med to sting af 6-0 silke sutur.
  12. Fugter brystfinner muskler og hud med en vatpind gennemblødt i PBS 1x og forsigtigt sætte musklerne tilbage i den oprindelige position med pincet.
  13. Luk huden med 3-4 sting af 6-0 silke sutur. Sy halsen indsnit med 2-3 sting for at lukke huden.
  14. Injicer atipamezol (1 mg / kg slutkoncentration) for at nulstille de bedøvende virkning.
  15. Så snart musen begynder at trække vejret selvstændigt, tage røret fra luftrør og sætte musen på sin højre side. Forventes musen for at komme inden for få minutter.
  16. Når musen begynder at vende om og gå, placere den i den varme opsving bur (lille IVC bur med lukket filtreret øverst) i en time.
  17. Lad dyrene natten over i en temperaturregulering kasse (37 ° C).
  18. Fyld en skål med vand og pellet fødevarer til recovery løbet af de første 2 dage efter kirurgi.

Ti hjerter injiceret med celler og 10 kontrol ikke injicerede hjerter analyseres histologisk som følger:

  1. Udfør en analyse af de podede celler 1 uge efter injektion (figur 1 og 3).
    1. Efter dødshjælp ved overdosis af isofluran, perfuse hjerter med 20 ml 4% paraformaldehyd (PFA) fastsætte vævet. Dehydrere den faste væv i stigende procenter af ethanol (70-100%) og integrere i paraffinblokke.
    2. Afsnit hjerter i paraffin med en mikrotom til 5 um og pletten med hematoxylin og eosin til morfologisk analyse.
    3. Visualisere bindevæv ved hjælp af Massons Trichrome pletten.
    4. Analyser billeder under en dias scanner mikroskop (figur 1A, 2A, 3A, 3B og 3C) og visualisere hele hjerte i korte akse visning ved hjælp af en digital dias scanner mikroskop (Figures 1B og 1C).
  2. Efter ovenstående analyse, afparaffiniser hjerte væv i xylen, rehydrere ved at nedsænke prøver i faldende procenter af ethanol (fra 100% til vand) og proces til Scanning Electron Microscopy (SEM) som følger:
    1. Inkuber afparaffinerede blokke med 1% garvesyre i 0,1 M phosphatpuffer i 1 time.
    2. Dehydrer prøver i stigende procenter af ethanol (25-100%).
    3. Tørre prøver med HMDS (hexamethyldisilazan).
    4. Monter prøver på Stubbs med Acheson Sølv Dag og pels dem med guld-palladium.
    5. Se prøver i en analytisk scanning elektron mikroskop (figur 2B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi injicerede HEK293-celler, som kan skelnes fra hjerteceller ved deres forskellige morfologi (figur 1), med en brosten form i forhold til de langstrakte cardiomyocytter (Figur 1A). HEK293-celler var mere reaktive over for hematoxylin farvestof (blå farve) i forhold til cardiomyocytter (lyserød farve), sandsynligvis på grund af deres øgede nukleare indhold (figur 1A). For yderligere at adskille de injicerede celler fra værtsvævet blev HEK293-celler mærket med DAPI 2 timer før injektion. Mærkede-celler var synlige i myokardievæv som vist i figur 1E. Kontrol skinopererede mus viste ingen skader i hele hjertet (figur 1C) og integriteten af væv (figur 1D).

I en hel korte akse visning af hjertet, injicerede celler var synlige som en homogen gruppe på injektionsstedet (figur 1B). Den grupperet calen var omgivet af et tyndt lag fibrøst væv, som optrådte som en blå område i trichrom-farvning (figur 2A). Celler blev ikke forbundet med værten myocardievæv, som vist ved Scanning Electron Microscopy (figur 2B), sandsynligvis på grund af deres noncontractile funktion og anderledes cellestruktur.

Ud over de ovenstående bemærkninger bemærkede vi små områder af skader, hvor nålen blev injiceret (figur 3A). Disse områder løber fra den ydre epikardial lag af hjerte i myokardiets væg (figur 3A). Injicerede celler (grøn pil, figur 3B) er til stede i nærheden af det skadede område (sorte pile, figur 3B). DAPI-positive celler var synlige langs injektionsstedet (figur 3C, hvide pile). En uge efter skaden, var Tunel assay viser ikke øget apoptotiske celler på stedet for skaden, tyder på, at nekrosesnarere end apoptose er opstået efter nål injektion (figur 3D).

Figur 1
Figur 1. Histologisk analyse af injicerede celler. A) En uge efter celleinjektion hjerter blev indlejret i paraffin og behandlet til hematoxylin og eosin-farvning. Injicerede HEK293-celler var til stede i væggen af ​​den venstre ventrikel. Billeder blev opnået med et stereo fluorescensmikroskop. B) Trichrome farvede væv viste, at cellerne blev samlet i det samme område, hvor de blev injiceret (pil). Nederste højre paneler viser de korte akse se med højre (RV) og venstre ventrikler (LV). Den røde trekant viser det område, hvor celler bevares (1,5 x). Billederne blev optaget med et dias scanning mikroskop. C) Trichrome staining af kontrol skinopererede hjerter. Hele hjertet visning med en 5X mål. D) Trichrome farvning af sham-opererede mus viser myocardievæv integritet. E) HEK293-celler blev farvet med DAPI 2 timer før injektion. En uge efter injektion hjerter var indlejret i OLT og snittet i en kryostat ved 6 mM. Cellerne blev visualiseret under UV i et fluorescensmikroskop. Venstre og højre ventrikler er vist. I det højre hjertekammer, højre panel, den hvide linie markerer epicardial lag. Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2. Dannelse af en fibrotisk lag mellem injicerede celler og værtsvæv. A) Trichrom-farvning viserkollagent væv dannet mellem HEK293-celler og muse myokardievæv (pile). Billederne blev optaget med et digitalt scanningmikroskop. B) Hjerter blev afparaffiniseret og forarbejdet til Scanning Electron Microscopy. Billeder blev optaget med en scanning elektron mikroskop og vise kollagen fibre (pile) mellem de injicerede HEK293 celler (venstre side) og værten myokardiet (højre side). Klik her for at se større billede.

Figur 3
Figur 3. Cell injektion produceret små områder af skader. A) Trichrome farvning viser små områder af skader, hvor nålen blev injiceret (blå farve. Pile) B) Paraffinsnit blev farvet af Trichrome stalingen og det område, hvor cellerne blev injiceret er angivet med sorte pile. Injicerede celler (grøn pil) var synlige i nærhed til skadede område. C) HEK293 celler, farvet med DAPI 2 timer før injektion, var til stede sammen injektionsstedet (hvid pil). Injektionsstedet er angivet med en grøn pil, og det hvide åben linje markerer pericardial lag. D) Tunel Assay, udført på paraffinsnit, ikke vise relevante fluorescerende positive kerner. Klik her for at se større billede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette manuskript, har vi vist, hvordan man udfører intramyocardial injektion af celler i murine hjerter. Som et bevis på denne metode, har vi brugt HEK293 celler. Det er vigtigt at understrege, at HEK293 cellerne ikke anvendes i enhver celle terapi studie, og derfor resultaterne af dette manuskript er ikke egnede til direkte oversættelse til en terapeutisk tilgang. Den omstændighed, at HEK293-celler ikke er kontraktile celler og ikke transdifferentiate i andre celletyper sætter fokus på de tekniske aspekter såsom egenskaberne af de celler, der skal leveres, og rute for levering.

Det er blevet rapporteret, at en intramyocardial vej tendens til at forårsage celleklynger indlejret i hjertets væv 24,26, mens intrakoronar kunne give mere homogen fordeling på skadestedet. For cardiomyocyte udskiftning bør den ideelle donorcellen udstille den elektrofysiologiske, strukturelle og kontraktile properties af cardiomyocytes og bør være i stand til at integrere strukturelt og funktionelt i værtens væv, hvilket tyder på nødvendigheden af ​​en celle differentiering program at være ansat før transplantationen.

De vigtigste punkter for en vellykket operation kan opsummeres som følger:

  1. Bedøver mus med injicerbare forbindelser til langsom puls og lette celle injektion
  2. Udfør intratracheal kanylering af mus at favorisere lungerne funktionalitet.
  3. Udfør thoracotomi undgå muskel snit til at opretholde brystmuskel funktionalitet til en korrekt vejrtrækning.
  4. Efter eksponering af hjertet, observere den venstre ventrikel under et mikroskop for at visualisere om der er sket injektion (synlig som en bleg farve).
  5. Brug en tynd nål og en præcision sprøjte for at undgå omfattende perforering af myocardievæv og at injicere den ønskede mængde materiale hhv.
  6. Sheathe nålen med en plastslange systemet udsætte oun spidsen del. Dette vil muliggøre indførelsen af ​​nålen til en bestemt dybde i den venstre ventrikel (0,5 mm), så man undgår injektion i den ventrikulære hulrum.
  7. Luk brystet og mellemrummet mellem ribberne omhyggeligt for at undgå eksponering af lungerne til ydre tryk.

Denne teknik har en høj grad af succes, hvis postoperativ sundhedsmæssige forhold prioriteres. Dyr skal overvåges intenst hver dag op til en uge for tegn på lidelse og smerte. Injektion af analgetiske forbindelser til at kontrollere smerte skal administreres efter behov postoperativt. Topisk anvendelse af smertelindring, såsom lidocain, kan også anvendes. Blødning bør forhindres ved omhyggelige kirurgiske teknikker. Men hvis der forekommer, kan stoppes ved sammenpresning eller ligering af fartøjer. Vi har bemærket, at dyr kommer bedre og hurtigere, hvis det efterlades i et varmekammer ved 37 ° C i 12-20 timer efter operationen. Denne behandling vil blokere hurtigt fald kropstemperatur ellernormalt forekommer efter kirurgiske indgreb og administration af anæstesi. Postsurgical infektioner forekomme, men bør være mindre end 1%. Aseptiske procedurer skal følges nøje for at forebygge infektion. Lokal infektion kan behandles med anvendelse af antibiotika. Vigtigere er det, bør dehydrering styres ved subkutan injektion af saltvand.

Det foretrækkes at administrere injicerbare løbet inhaleret bedøvelsesmiddel, såsom isofluran. Faktisk bemærkede vi, at injicerbar bedøvelsesmiddel nedsat hjerterytme, giver lettere indsprøjtning og mindre blødninger uden at forårsage dyr ubehag.

Selv invasiv indsprøjtning af små mængder af celler (25-50 ul) i mus er muligt og sikkert. Vi havde mindre end 1% mortalitet ved injektion af 50 pi af HEK293-celler i 5 forskellige områder af venstre ventrikulære væg (10 ul / injektion). Denne metode sikrer tilstedeværelsen af ​​celler i flere områder af den myocardiale væg, hvilket er vigtigt istamcellebehandling når store områder med iskæmisk skade skal nås med de leverede celler. For at udføre mindre invasiv kirurgi, har flere protokoller er for nylig blevet offentliggjort, selv om deres reproducerbarhed på forskellige laboratorier har endnu ikke verificeret. For eksempel kan celle injektion udføres ved tæt brystet teknik med høj opløsning ekkokardiografi 27. Brugen af ​​dette system kræver høje operatør færdigheder til at visualisere klart i en to-dimension billede væggen i venstre hjertekammer og opretholde nålen i et bestemt sted under normale systolisk / diastolisk cykler. Fordelen ved denne teknik er, at implantation af cellerne i musen myocardium til ønskede steder i et klinisk relevant tidsramme efter myocardieinfarkt induktion. Men denne fremgangsmåde er ikke muligt med kirurgi procedurer såsom myokardieinfarkt induktion eller transaortic banding grund af den øgede dødelighed blandt dyrene undergår en anden operation 27.. Interessant Hamdi og kolleger sammenlignet direkte intramyocardial injektion versus levering af celler i en Gelfoam konstruere på epikardial område 28. De bemærkede, at overliggende cellen konstruere på epicardium resulterede i bedre graft-funktionalitet i forhold til intramyocardial celle indsprøjtning og rapporterede, at denne teknik er reproducerbare, brugervenligt og mindre traumatisk for dyrene 28.

Et vigtigt element i celle injektion eksperimenter er sporing af celler og deres overlevelse. Vi har vist, at HEK293-celler er let at opdage på grund af deres skelnes morfologi i forhold til hjerteceller. Disse celler overlevede injektion (data ikke vist) og blev tilbageholdt i vævet en uge efter operationen. At spore celler for langtidsstudier og analysere deres transplantation i væv af levering samt i andre væv, flere teknikker er i brug, herunder fluorescerende mærkning og FISH enNALYSE i sex-mismatch transplantationsforsøg 29. Vigtigere er det, vil in vivo billeddannelse spiller en stor rolle i retning af in vitro analyser i fremtidige studier. Faktisk er en fordel af in vivo imaging i histologiske metoder er sporing af cellerne i longitudinelle studier i de samme dyr uden behov for eutanasi 29. I denne metode kan celler mærkes med bioluminescens reagenser, jernpartikler og specifikke reporter gener, der skal afbildes med positronemissionstomografi (PET) og magnetisk resonans (MRI).

Vores analyser viste, at noncontractile celler, såsom HEK293-celler fortrinsvis grupperet i det område, hvor de blev injiceret omgivet af en tynd collagent væv. Skønt de patofysiologiske mekanismer, der fører til dannelsen af ​​fibrøst væv i et immunodepleted mus er ukendte, kan kollagen væv synlig omkring de transplanterede celler kunne sammenlignes med slutpunktet for envævskompatibelt implantat. I dette tilfælde kan det eksogene materiale ikke fjernes af de inflammatoriske celler og bliver indkapslet i et tæt lag af fibrøst bindevæv, der isolerer det fra det omgivende væv. I lighed med de afsluttende fase faser af sårheling, dette kornet væv er meget vaskulariseret og sikrer overlevelse af den implanterede materiale.

Tekniske den her beskrevne fremgangsmåde var en succes, selvom intramyocardial nåleinjektion produceret et lille område af skader på det omgivende væv. Selv hjertefunktionen målinger var ikke formålet med denne gennemgang bør fremtidige studier undersøge, om mindre vævsskader kan forurolige analyser celleterapi. Desuden vil det være vigtigt at undersøge, om den skade, der er produceret i det injicerede område er forårsaget af nålen, af mængden af ​​celler injiceret eller ved en kombination af begge.

Til støtte for vores resultater, har det vist sig, at transplantation af blandede populationer af differentierede humane embryonale stamceller (hESC) indeholdende 20-25% cardiomyocytes (embryonale-CM) ind i sundt hjerte af immunkompromitterede mus (NOD-SCID) resulterede i en hurtig dannelse af podninger, hvor cardiomyocytes blev organiseret og modnet over tid, og det noncardiomyocyte befolkning var tabt 23. Interessant, forfatterne observeret, at embryonale-CM i vid udstrækning blev isoleret fra værten myokardiet af et lag af fibrøst væv, der forhindrede dannelsen af en elektrofysiologiske syncytium 22,23. I en anden undersøgelse fandt Kehat et al. At embryonale-CM held tempo ventriklen i svin med komplet hjerteblok. Denne undersøgelse viste, at de transplanterede celler overlevede, fungerede, og integreret med værtsceller, som giver bevis for deres evne til at fungere som en biologisk alternativ til den elektroniske pacemaker 30. Disse to disharmoniske udfald kan forenes ved forskellen i struktur og funktion af host og donorarterne. Faktisk er det muligt, at effektiviteten af ​​koblingen af ​​transplanterede cardiomyocytter kan afhænge af den relative slagfrekvens for værts-og donorceller. I Van Laake undersøgelse 23, kan dannelsen af funktionelle knudepunkter blive svækket på grund af den anderledes bankende hyppigheden af menneskelige cardiomyocytes (60-100 bpm) versus gnaver cardiomyocytes (300-600 bpm). Dette ville ikke være tilfældet i menneskelig versus svin transplantationsforsøg, som beskrevet i Kehat analyse 30.

Længden af ​​observationstid er en anden forstyrrende faktor. hESC-CM transplanteres ind i gnaver hjerte efter myokardieinfarkt induceret hjertefunktion forbedring kun for kortsigtede tidspunkter (4 uger). Men efter 12 uger, hjertefunktion ikke yderligere opretholdt på trods af graft overlevelse 23. Forfatterne bemærkede, at graft størrelse (øget mængde af celler) ikke var forbundet med forbedret langsigtet cardiac Ovival og funktionel forbedring 31, hvilket indikerer, at langsigtede analyser versus kort eller mellemlangt sigt analyser skal udføres i fremtidige undersøgelser uden at kræve øget antal celler til injektion.

I den foreliggende undersøgelse, forbliver flere spørgsmål vedrørende den type celler, der skal transplanteres, udvælgelse af host-donorarterne skal testes, og en detaljeret vurdering af den arytmiske potentiale af cellerne. Ideelt stamceller implanteret i myokardiet for udskiftning eller pacemaker funktionen skal funktionelt par med de resterende myocytter. I en rotte model af myokardieinfarkt, Fernandes et al. 32. brugt programmeret elektrisk stimulering (PES) for at evaluere arytmi modtagelighed, viser en øget inducerbarhed af ventrikulære arytmier i myoblast-indsprøjtning hjerter sammenlignet med kontroller. I samme undersøgelse fik injektioner af knoglemarv-afledte autologe celler ikke resultere i en forøget inducibilhed for ventrikulær arytmi sammenlignet med kontrolgruppen, hvilket fører forfatterne til at konkludere, at myoblaster udviste en specifik arytmogene risiko. I en anden undersøgelse, knoglemarv-afledte celler (BMC) effektivt podet i klynger i infarkt ar eller grænseområdet, men viste ikke elektronisk fremkaldte Ca transienter 33. Interessant, Wei et al. Viste, at mesenkymale stamceller (MSC) ikke erhverve de elektrofysiologiske egenskaber af modne cardiomyocytes løbet overlevelse periode i infarktområdet hjerter. Men de kan lindre den elektriske sårbarhed og ikke fremmer ventrikulære arytmier 34.

Effekten og arytmi forekomst af stamcelleterapi afhænger af celler såvel som på levering ruter. Faktisk i rottehjerter efter MI 35, intramyocardiale BMC injektioner, selv om at forbedre hjertets funktion, øget træk ventrikulære præmature sammentrækninger og ventrikulær tachycardIA for de første 14 dage. Når intrakoronar blev brugt, var ventrikulær arytmi forekomsten faldet markant. I kliniske undersøgelser er vanskelig at vurdere, da de fleste af patienterne modtager beta-blokker agenter som angivet for iskæmisk hjertesygdom den proarytmisk funktion af injicerede celler. Behandling med betablokkere kan maskere en potentiel proarytmisk virkning af de transplanterede celler. Dyreforsøg er derfor afgørende for at vurdere grundlaget for proarytmiske stimuli i stamcellebehandling.

Sammenfattende vores data viser mulighederne for intramyocardial celle-injektion i mus, men også understreger behovet for en detaljeret analyse vedrørende betingelserne for celle podning sikkerhed. Hos mennesker er det blevet vist, at celle injektion er forbundet med pro-arytmier 36-38, restenose 39, accelereret aterosklerose 40 og koronar obstruktion 41. Grundforskning vil være vigtigt i fremtidige kliniske appner til at forstå, hvilke celler der skal leveres, den leveringsmåde, mekanismerne i cellemedieret myokardie funktion reparation og design af en allogen versus autolog celle transplantation protokol, til gavn for alle den menneskelige befolkning. På grund af de høje omkostninger forbundet med store kliniske forsøg, skal behandles i prækliniske modeller som de her beskrevne reproducerbarhed effektivitet og effekt af transplantationscentre protokoller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker Magdi Yacoub Institute (MYI) til at støtte mikroskopi analyse og de projekter, der involverer hjerte-reparation, teknikerne og Manager af vores dyr facilitet. Dette arbejde er blevet støttet af British Heart Foundation (BHF), Projektbevilling PG/10/019. MPS er støttet af MYI og BHF. TP er en BHF-Research Excellence Fellow. NR er en NH & MRC Australien Fellow.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolator Pfi systems Quotation needed
Heating Pad Vet Tech Solutions HE006 For small animals
Medetomidine National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Ketamine hydrochloride National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Atipamezole National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream commercial shops
Buprenorphine NVS Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope Leica Model S6E With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner Hamamatsu RS series
Scanning Electron Microscope Jeol JSM-6610
Blunt scissors FST 14084-09
Minivent Harvard Apparatus 73-0043 Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps FST 11052-10
Retraction system FST 18200-20 Kit for animals up to 200 g
30 G 12 mm; ½ inch BBraun A210 Fine yellow
Microliter syringe ESSLAB 81201 Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700
6-0 Silk suture Ethicon W1614T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
  2. Taylor, D. A., et al. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat. Med. 4, 929-933 (1998).
  3. Suzuki, K., et al. Cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction using vascular endothelial growth factor-expressing skeletal myoblasts. Circulation. 104, 207-212 (2001).
  4. Suzuki, K., et al. Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function. Circulation. 110, 225-230 (2004).
  5. Robinson, S. W., et al. Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant. 5, 77-91 (1996).
  6. Muller-Ehmsen, J., et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 107-116 (2002).
  7. Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
  8. Dimmeler, S., Zeiher, A. M., Schneider, M. D. Unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair. J. Clin. Invest. 115, 572-583 (2005).
  9. Oettgen, P., Boyle, A. J., Schulman, S. P., Hare, J. M. Cardiac Stem Cell Therapy. Need for Optimization of Efficacy and Safety Monitoring. Circulation. 114, 353-358 (2006).
  10. Krause, K., et al. Percutaneous intramyocardial stem cell injection in patients with acute myocardial infarction: first-in-man study. Heart. 95, 1145-1152 (2009).
  11. Rodrigo, S. F., et al. Intramyocardial injection of bone marrow mononuclear cells in chronic myocardial ischemia patients after previous placebo injection improves myocardial perfusion and anginal symptoms: an intra-patient comparison. Am. Heart J. 164, 771-778 (2012).
  12. Smith, R. R., et al. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation. 115, 896-908 (2007).
  13. Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 2, 173-181 (2009).
  14. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
  15. Malliaras, K., et al. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells. Circulation. , 125-1100 (2012).
  16. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, 763-776 (2003).
  17. Bearzi, C., et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15885-15890 (2009).
  18. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308, 2369-2379 (2012).
  19. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379, 895-904 (2012).
  20. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, 1847-1857 (2011).
  21. Brunt, K. R., Weisel, R. D., Li, R. K. Stem cells and regenerative medicine - future perspectives. Can. J. Physiol. Pharmacol. 90, 327-335 (2012).
  22. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  23. van Laake, L. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction. Stem Cell Res. 1, 9-24 (2007).
  24. Leobon, B., et al. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7808-7811 (2003).
  25. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122, 2419-2429 (2010).
  26. Reinecke, H., Poppa, V., Murry, C. E. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 241-249 (2002).
  27. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, 1307-1314 (2005).
  28. Hamdi, H., et al. Cell delivery: intramyocardial injections or epicardial deposition? A head-to-head comparison. Ann. Thorac. Surg. 87, 1196-1203 (2009).
  29. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marban, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circ. Res. 106, 479-494 (2008).
  30. Kehat, I., et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
  31. van Laake, L. W., et al. Improvement of mouse cardiac function by hESC-derived cardiomyocytes correlates with vascularity but not graft size. Stem Cell Res. 3, 106-112 (2009).
  32. Fernandes, S., et al. Autologous myoblast transplantation after myocardial infarction increases the inducibility of ventricular arrhythmias. Cardiovasc. Res. 69, 348-358 (2006).
  33. Scherschel, J. A., Soonpaa, M. H., Srour, E. F., Field, L. J., Rubart, M. Adult bone marrow-derived cells do not acquire functional attributes of cardiomyocytes when transplanted into peri-infarct myocardium. Mol. Ther. 16, 1129-1137 (2008).
  34. Wei, F., et al. Mesenchymal stem cells neither fully acquire the electrophysiological properties of mature cardiomyocytes nor promote ventricular arrhythmias in infarcted rats. Basic Res Cardiol. 107, 274 (2012).
  35. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  36. Bartunek, J., et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation. 112, 178-183 (2005).
  37. Britten, M. B., et al. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Circulation. 108, 2212-2218 (2003).
  38. Smits, P. C., et al. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J. Am. Coll. Cardiol. 42, 2063-2069 (2003).
  39. Kang, H. J., et al. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet. 363, 751-756 (2004).
  40. Fernandez-Aviles, F., et al. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ. Res. 95, 742-748 (2004).
  41. Vulliet, P. R., Greeley, M., Halloran, S. M., MacDonald, K. A., Kittleson, M. D. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs. Lancet. 363, 783-784 (2004).

Tags

Medicine intramyocardial celleinjektion hjerte podning celleterapi stamceller fibrøst væv
Intramyocardial Cell Levering: Observationer i murine Hjerter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poggioli, T., Sarathchandra, P.,… More

Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (83), e51064, doi:10.3791/51064 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter